Embriogênese somática direta (experimento 2)

No segundo experimento de embriogênese somática direta, realizado no período de outono-inverno, houve alta contaminação das culturas por fungo, o que levou à perda de 21 unidades experimentais, dentre as 35 unidades iniciais de cada tratamento. Portanto, apenas 14 unidades foram avaliadas ao longo de 240 dias. O aumento no tempo de observação de 130 dias para 240 dias deveu-se à ausência de formação de embriões nos explantes do tratamento controle (10 µM 2-iP / 0 µM de 24- epibrassinolídeo). Assim, o tempo foi prorrogado para que tivéssemos certeza quanto aos resultados nulos obtidos nesse tratamento. Nos demais tratamentos, com aplicação do brassinosteróide associado à citocinina, houve formação de embriões a partir de 45 dias. Novamente, não houve formação de embriões nos explantes tratados apenas com 24- epibrassinolídeo, assim como no tratamento com ausência total de hormônios vegetais.

Quanto à formação de estrutura embriogênica, a porcentagem de explantes que formaram essas estruturas, aos 240 dias, foi nula no tratamento sem nenhum dos dois hormônios, enquanto que nos demais tratamentos essa porcentagem variou entre 35,71% e 100%, sendo que o valor de 100% foi obtido para todos os tratamentos com 2-iP associado ao brassinosteóide (Tabelas 4 e 5). Na ausência de 2-iP (Tabela 4) verificou-se associação significativa entre as concentrações de 24- epibrassinolídeo e a presença de estruturas embriogênicas. Na presença de 2-iP (Tabela 5), não houve associação significativa entre a presença de estruturas embriogênicas e as concentrações de 24-epibrassinolídeo.

Tabela 4. Número (porcentagem) de explantes que formaram (Sim) ou não

formaram (Não) estrutura embriogênica aos 240 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolideo (24-epiBr) em ausência de 2-iP, calculados entre as 14 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi menor que 0,0001. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.

24-epiBr (µM) Sim Não

0,00 0 (0,00%) a 14 (100,00%)

0,01 5 (35,71%) b 9 (64,29%)

0,10 10 (71,43%) c 4 (28,57%)

Tabela 5. Número (porcentagem) de explantes que formaram (Sim) ou não

formaram (Não) estrutura embriogênica aos 240 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolideo (24-epiBr) em presença de 2-iP (10 µM), calculados entre as 14 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi igual a 0,0109. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.

24-epiBr (µM) Sim Não

0,00 11 (78,60%) a 3 (21,40%)

0,01 14 (100,00%) a 0 (0,00%)

0,10 14 (100,00%) a 0 (0,00%)

As médias do número de lados dos explantes foliares com estruturas embriogênicas são apresentadas na figura 6. No tratamento sem aplicação de citocinina e brassinosteróide nenhum dos lados dos explantes apresentou formação de estruturas embriogênicas, enquanto que nos tratamentos com diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo e ausência de aplicação da citocinina os valores variam de menos que 0,5 a mais que 1,0. Houve aumento crescente dos valores com o aumento da concentração do brassinosteróide. Nos tratamentos com aplicação de 2-iP associado a diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, todos os lados dos explantes foliares formaram estruturas embriogênicas, enquanto que o tratamento controle (só com citocinina) apresentou em média dois lados do explante com estrutura embriogênica. Embora a aplicação do brassinosteróide em associação com a citocinia tenha aumentado o número de lados do explante com estruturas embriogênicas, novamente não houve correlação entre o número de lados do explante foliar contendo essas estruturas e o número total de embriões.

Figura 6. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr)

no número médio de lados dos explantes foliares com formação de estruturas embriogênicas, quando cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com e sem adição de 2-iP.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 15 30 45 60 90 130 240 0,00 - 0,00 0,00 - 0,01 0,00 - 0,10 0,00 - 1,00 10,00 - 0,00 10,00 - 0,01 10,00 - 0,10 10,00 - 1,00 Tempo (d)

Com relação ao tamanho médio das estruturas embriogênicas formadas nos explantes não houve aparecimento das mesmas no tratamento sem adição dos dois hormônios (Figura 7). Os resultados da aplicação isolada de 24-epibrassinolídeo no meio de cultura reforçam os resultados obtidos no primeiro experimento, já que o brassinosteróide, isoladamente, foi suficiente para promover o aparecimento dessas estruturas, que apresentaram tamanho médio máximo de 0,20 mm. Quando o brassinosteróide foi fornecido em associação com 2-iP o tamanho dessas estruturas, no mínimo, triplicou (0,77 a 1,27 mm, aproximadamente). Contudo, não houve correlação entre o tamanho das estruturas embriogênicas e o número total de embriões.

Quanto à coloração dos explantes e estruturas embriogênicas, após aproximadamente 90 dias todos apresentaram coloração oxidada, sendo esse mesmo resultado obtido no primeiro experimento.

Figura 7. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr)

na estimativa do tamanho das estruturas embriogênicas formadas em explantes foliares, cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com e sem adição de 2-iP.

0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 15 30 45 60 90 130 240 0,00 - 0,00 0,00 - 0,01 0,00 - 0,10 0,00 - 1,00 10,00 - 0,00 10,00 - 0,01 10,00 - 0,10 10,00 - 1,00 Tempo (d)

O número total de embriões somáticos, estimado em contagem visual ao longo dos 240 dias, é apresentado na figura 8. Nessa figura são apresentados apenas os dados obtidos nos tratamentos onde havia presença de 2-iP associado ou não a diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo, já que nos tratamentos sem aplicação da citocinina não houve formação de embriões. Verificou-se que o número total de embriões variou entre 0 para o tratamento que recebeu apenas citocinina e 435 embriões no tratamento com 2-iP e 1,0 µM de 24-epibrassinolídeo. Os resultados dos tratamentos com 0,1 e 1,0 µM do brassinosteróide associado à citocinina diferiram significativamente dos demais aos 240 dias. A partir de 60 dias os dados já apresentavam respostas significativas, sendo que resultados com letras minúsculas distintas diferem entre si com relação ao número de dias do surgimento dos embriões. Dados representados por letras maiúsculas apresentam diferenças, aos 240 dias, entre as concentrações do brassinosteróide. Novamente, o aumento da concentração de 24-epibrassinolídeo tendeu a aumentar o número de embriões, embora tenham sido detectadas diferenças significativas apenas entre os tratamentos com os dois maiores teores do brassinosteróide, em relação aos demais.

Figura 8. Efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) no

número total de embriões somáticos formados em explantes foliares cultivados em meio de cultura para indução de embriogênese somática direta, com adição de 2-iP. Valores com letras distintas diferem entre si ao nível de 5%. Letras minúsculas referem-se aos valores ao longo do tempo, enquanto que letras maiúsculas representam a diferença entre as concentrações de 24-epibrassinolídeo, aos 240 dias.

A porcentagem de explantes que efetivamente produziu embriões (tabela 6) foi diferente da observada na indução das estruturas embriogênicas (tabelas 4 e 5). Assim como no primeiro experimento a porcentagem de estruturas embriogênicas formadas foi maior que a de embriões, quando se compara tratamentos semelhantes. Igualmente ao observado no primeiro experimento, o aumento das concentrações de 24-epibrassinolídeo promoveu a porcentagem de explantes que produziram embriões. Aplicamos o teste exato de Fisher que indicou diferença significativa, ao nível de 5%. De forma semelhante ao observado no primeiro experimento, os explantes que receberam aplicação exclusiva do brassinosteróide não formaram embriões somáticos, portanto não foram submetidos ao teste estatístico, (dados não apresentados).

Tabela 6. Número (porcentagem) de explantes que produziram (Sim) ou não

produziram (Não) embriões aos 240 dias, sob efeito de diferentes concentrações de 24-epibrassinolídeo (24-epiBr) com a presença de 2-iP (10µM), calculados entre as 14 unidades experimentais de cada tratamento. O p-valor foi menor que 0,0001. Letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos ao nível de 5% pelo teste exato de Fisher.

24-epiBr (µM) Sim Não

0,00 0 (0,00%) a 14 (100,00%)

0,01 5 (35,71%) b 9 (64,29%)

0,10 10 (71,43%) c 4 (28,57%)