UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS Mariane Barroso Pereira Genotipagem de Trypanosoma cruzi isolados de pacientes portadores da doença de Chagas CAMPINAS 2016

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FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

Mariane Barroso Pereira

Genotipagem de Trypanosoma cruzi isolados de pacientes portadores da doença de Chagas

CAMPINAS 2016

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Genotipagem de Trypanosoma cruzi isolados de pacientes portadores da doença de Chagas

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências na área de concentração em Clínica Médica.

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ORIENTADOR: Sandra Cecilia Botelho Costa COORIENTADOR: Eros Antonio de Almeida

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA

ALUNA MARIANE BARROSO PEREIRA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SANDRA CECÍLIA BOTELHO COSTA

CAMPINAS 2016

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ORIENTADOR: SANDRA CECÍLIA BOTELHO COSTA COORIENTADOR: EROS ANTONIO DE ALMEIDA

MEMBROS:

1. PROF. DR. SANDRA CECÍLIA BOTELHO COSTA

2. PROF. DR. CRISTINA BRANDT FRIEDRICH MARTIN GURGEL

3. PROF. DR. ANDRÉ FATTORI

4. PROF.DR. EDUARDO DE CASTRO FERREIRA

5.PROF.DR. MAGNUN NUELDO NUNES DOS SANTOS

Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

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Agradeço primeiramente aos pacientes que dedicaram um tempo de sua vida para a realização desse trabalho.

Agradeço à Dra. Sandra Costa e ao Dr. Eros Almeida pelo apoio, incentivo e orientação.

À Irene Corrêa, pelo carinho e pela ajuda nas horas difíceis. Ao CNPq, pelo apoio financeiro.

Aos amigos do laboratório: Gláucia Marcon, Juliana Ferreira, Rodrigo Lima, Mariana Furquim, Aglécio Sousa, Tycha Pavan e Paula Durante, pela companhia, amizade, conversas, desabafos e cafés do dia a dia.

À Amanda Magalhães pela ajuda nas hemoculturas.

Ao Laboratório do IB, principalmente à Profa. Fernanda Gadelha e à Andressa Bruscato pelo apoio e pelo fornecimento do meio de cultura.

Ao Maicon Henrique Cunha, pelo apoio incondicional.

Aos meus pais, Marcos e Dayse e às minhas irmãs Érica e Beatriz por serem a minha base.

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“Não vai demorar que passemos adiante uma grande e bela ciência, que faz arte em defesa da vida.” Carlos Chagas

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A doença de Chagas (DC), descoberta por Carlos Chagas em 1909, é uma enfermidade causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Esta doença afeta milhões de pessoas da América do Sul e Central. Hoje em dia, estima-se que há no Brasil entre 1,9 milhões a 4,6 milhões de pessoas infectadas por esse protozoário. Em 1991, foi lançada uma campanha para eliminação da transmissão vetorial da doença nos países do Cone-Sul, o que resultou na diminuição de casos agudos da doença. Os objetivos do trabalho foram: implantar técnicas de genotipagem e classificar os isolados de T. cruzi presentes nos pacientes portadores da doença de Chagas atendidos pelo Grupo de Estudos em doença de Chagas (GEDoCh); correlacionar com a forma clínica e a procedência dos mesmos, avaliar os resultados da hemocultura e avaliar a eficiência de kits sorológicos.Foram coletados 4 tubos com EDTA de 6mL para a hemocultura e um tubo seco de 4 mL para a coleta do soro. Os exames sorológicos e a genotipagem foram realizados no Laboratório de Diagnóstico de Doenças Infecciosas por Técnicas de Biologia Molecular. Das 54 amostras coletadas, 26 (48%) foram positivas na hemocultura. Amostras de pacientes do gênero feminino obtiveram uma porcentagem maior de hemocultura positiva, assim como em pacientes com forma clínica cardíaca e em pacientes tratados e com tratamento incompleto com o benznidazol. Após a genotipagem em DTUs, a TCII foi a DTU mais prevalente, principalmente em pacientes com a forma cardíaca da DC. Nos testes sorológicos, o teste TESA-cruzi solucionou um caso de sorologia não-reagente e não foi possível correlacionar o tipo de DTU encontrado com os testes sorológicos. A partir desse trabalho, ficou concluído que: a hemocultura positiva foi mais prevalente nos pacientes do gênero feminino e na forma cardíaca, a implantação da técnica de genotipagem foi eficaz e foi possível genotipar os isolados presentes nos pacientes coletados; foram encontrados dois tipos de DTU, sendo a TC III um tipo raro em humanos.

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Chagas disease (CD), discovered by Carlos Chagas in 1909, is a disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. This disease affects millions of people in South and Central America. Nowadays, it is estimated that there are in Brazil between 1.9 million and 4.6 million people infected by this protozoan. In 1991, a campaign was launched to eliminate the vector transmission of the disease in the Southern Cone countries, which resulted in the reduction of acute cases of the disease. The objectives of the study were: to implant genotyping techniques and to classify T. cruzi isolates present in patients with Chagas disease treated by the Chagas Disease Study Group (GEDoCh); correlate with the clinical form and their origin, evaluate the blood culture results and evaluate the efficiency of serological kits. Four tubes were collected with 6mL EDTA for blood culture and a 4 mL dry tube for serum collection. Serological tests and genotyping were performed at the Laboratory of Diagnosis of Infectious Diseases by Techniques of Molecular Biology. Of the 54 samples collected, 26 (48%) were positive in blood culture. Samples of female patients obtained a higher percentage of positive blood culture, as well as in patients with cardiac clinical form and in patients treated with incomplete treatment with benznidazole. After genotyping in DTUs, the TC II was the most prevalent DTU, especially in patients with the cardiac form of CD. In the serological tests, the TESA-cruzi test solved a case of non-reactive serology and it was not possible to correlate the type of DTU found with the serological tests. From this study, it was concluded that: positive blood culture was more prevalent in female patients and cardiac form, the implantation of the genotyping technique was effective and it was possible to genotype the isolates present in the patients collected; two types of DTU were found, with TC III being a rare type in humans.

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Figura 1: Representação esquemática do Trypanosoma cruzi e suas organelas...16

Figura 2: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi...16

Figura 3: Ciclo da doença de Chagas...18

Figura 4: Curva mostrando a parasitemia na fase aguda e crônica e o aumento da titulação de anticorpos...23

Figura 1: Perfil esperado do produto de PCR na genotipagem por LSUrDNA ...32

Figura 6: Perfil esperado na RFLP-PCR da região GPI...32

Figura 7: Perfil esperado na RFLP-PCR da região HSP60...33

Figura 8: Tripomastigotas formando rosetas em repique da hemocultura de um paciente...45

Gráfico 1: Distribuição da forma clínica no total e nos casos onde a hemocultura foi positiva...48

Gráfico 2 :Formas possíveis de transmissão da doença de Chagas de acordo com os prontuários...49

Figura 9A: Localização da procedência dos pacientes atendidos pelo GEDoCh...50

Figura 9 B: Zona endêmica do ciclo da doença de Chagas, marcada em cinza...50

Figura 10: Resultado do teste Tesa-cruzi em pacientes não reagentes para outros métodos sorológicos ...53

Figura 11: Géis de agarose a 3% mostrando os produtos de amplificação da região 24SαrDNA com o padrão de bandas da DTU TC II (125 pb) e TC III (110pb)...55

Figura 12: Gel de agarose a 1,5% mostrando o perfil da RFLP-PCR da região GPI,digerido com a enzima HhaI, com a amostra 4 apresentando padrão de bandas da TC III (4) e o restante com padrão TC II...56

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TC III (314-148)...57 Figura 14 A: Localização geográfica dos perfis genotípicos dos isolados de T.cruzi de pacientes atendidos pelo GEDoCh, DTUs TC II em azul e TC III em rosa...59 Figura 14 B: Distribuição das DTUs TC II e TC III de acordo com o ciclo doméstico em vermelho e silvestre em azul...59

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Tabela 1: Esquema representando a nomenclatura atual das DTUs...30

Tabela 2: Esquema representando o padrão de bandas para determinar as DTUs. 42 Tabela 3:Relação dos pacientes com hemocultura positiva ,o tempo de positividade em dias.e a quantidade de tubos positivos...46

Tabela 4: Distribuição do variável gênero no total e de acordo com a positividade da hemocultura...47

Tabela 5:Distribuição dos pacientes segundo o uso de benznidazol...49

Tabela 6: Resultados sorológicos dos pacientes analisados...51

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DC: doença de Chagas

DTU: Unidades discretas de tipagem EDTA: Ethylenediaminetetraaceticacid

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GPI: glicose 6- fosfato isomerase

HAI: Hemagluinação indireta HSP60: Heat Shock Protein IFI:Imunofluorescência indireta LSU: large subunit

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase rDNA: DNA ribossômico

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1-Introdução...15

1.1-A Doença de Chagas...15

1.1.1-Epidemiologia...15

1.1.2-A doença...19

1.1.3-Tratamento da doença de Chagas...22

1.2-Métodos de diagnóstico...23

1.2.1-Diagnósticos parasitológicos...23

1.2.2-Diagnósticos sorológicos...25

1.2.3-Métodos moleculares...27

1.3-Perfil genotípico do Trypanosoma cruzi...28

1.3.1-Genotipagem do T.cruzi...31 1.3.2-Importância da genotipagem...34 2-Objetivos...35 2.1-Objetivo Geral...35 2.2- Objetivos específicos...35 3- Casuística e Métodos...36

3.1-Coleta das amostras e análise de prontuários...36

3.2-Hemocultura...37

3.3-Extração do DNA...38

3.4-Genotipagem...39

3.5-Sorologia...43

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4.2-Perfil clínico e epidemiológico dos pacientes...47

4.3-Análise das sorologias...51

4.4- Outros diagnósticos...54 4.5-Resultados da genotipagem...54 5-Discussão...60 6-Conclusões...69 7-Referências...70 8- Anexos...83

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1-INTRODUÇÃO

1.1-A Doença de Chagas

1.1.1-Epidemiologia

Em 1909, Carlos Justiniano Ribeiro das Chagas, médico e então pesquisador assistente do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), descobriu em Lassance, interior de Minas Gerais, uma nova doença humana, a tripanossomíase americana, posteriormente denominada de doença de Chagas (1). Essa enfermidade é causada por um protozoário, o Trypanosoma cruzi (T.cruzi), o qual é transmitido quando as fezes contaminadas do vetor triatomíneo entram em contato com o local da picada ou com a mucosa. Essa doença afeta milhões de pessoas, principalmente na América do Sul e na América Central (2,3). Hoje em dia, estima-se que há no Brasil entre 1,9 milhões a 4,6 milhões de pessoas infectadas pelo T.cruzi e essa enfermidade ainda pode ser considerada um grande problema de saúde pública. Isso se deve à grande mortalidade relacionada à doença, também entre os idosos (4–6).

O T. cruzi (figura 1) é um protozoário, pertencente à ordem Kinetoplastida e à família Trypanosomatidae (7). Da família Trypanosomatidae fazem parte dois gêneros de importância médica: Leishmania e Trypanosoma (8). Em seu ciclo, o T.cruzi apresenta quatro formas evolutivas (Figura 2), as quais são identificadas morfologicamente pela posição do cinetoplasto com relação ao núcleo da célula e à emergência do flagelo. No tripomastigota o cinetoplasto situa-se na parte posterior do flagelado e este flagelo emerge da chamada bolsa flagelar, de localização próxima ao cinetoplasto. Nos epimastigotas o cinetoplasto e a bolsa flagelar estão em posição anterior ao núcleo e os amastigotas são formas arredondadas que apresentam flagelos não proeminentes (9). No sangue dos vertebrados, o T.cruzi apresenta-se sob a forma de tripomastigota e, nos tecidos, como amastigotas. Nos invertebrados ocorre um ciclo com a transformação dos tripomastigotas sanguíneos em epimastigotas, que depois se diferenciam em tripomastigotas metacíclicos, resultando nas formas infectantes acumuladas nas fezes do inseto (10,11).

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1 2 3 4 2 ₃ ₄ Figura 2: Representação esquemática do

Trypanosoma cruzi e suas organelas. Fonte: Teixeira et al (12).

Figura 3: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi, no qual as setas mostram a localização do cinetoplasto. 1:forma tripomastigota sanguíneo; 2:amastigosta; 3: tripomastigota metacíclico e 4: epimastigota. Fonte: Fiocruz (13).

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Os mecanismos de transmissão da infecção chagásica para os seres humanos podem ser divididos em primário ou principal e secundário. Os principais mecanismos de transmissão são pelo vetor (figura 3), por transfusão de sangue, por via oral ou por transmissão congênita pela placenta ou através do canal de parto, no momento do nascimento. Mecanismos secundários são considerados como sendo menos frequente, tais como acidentes de laboratório (14,15).

São reconhecidas mais de 140 espécies de triatomíneos transmissores da doença de Chagas, a maioria é selvagem e vivem associados com pássaros e mamíferos (16). Dentre essas espécies há os mais comuns e os principais alvos de programas de controle de vetores: Triatoma infestans nos países do Cone Sul; Rhodnius prolixius na parte norte da América do Sul e anteriormente em vários países da América Central; Panstrongylus megistus no Brasil; Triatoma dimidiata na América Central, sul do México, Colômbia e Equador (17,18). O controle do inseto vetor tem sido historicamente o principal foco em saúde pública para reduzir a prevalência da doença de Chagas. Nas primeiras décadas seguintes a identificação de T. cruzi não havia tratamento e métodos para reduzir a infestação das habitações. Por volta de 1940, houve o desenvolvimento de inseticidas e melhoria das estruturas de habitação para limitar a persistência e propagação do vetor (15). Para reverter a transmissão dessa doença negligenciada, em junho de 1991 na cidade de Brasília, Ministros da Saúde de países do Cone Sul lançaram uma iniciativa com o objetivo de eliminar a transmissão vetorial da doença de Chagas na Argentina, Brasil, Bolívia, Chile, Paraguai e Uruguai. O programa consistiu na eliminação do inseto triatomíneo transmissor através de inseticidas residuais borrifados nas residências. Além de melhorias na triagem de doadores de sangue, a fim de prevenir a transmissão através de transfusão e de melhora no diagnóstico pré-natal para diminuir a incidência da transmissão congênita e garantir um tratamento adequado de recém-nascidos infectados (7,15,19). As taxas de contaminação em bancos de sangue em algumas cidades do continente americano variam de 3% até 53%, indicando que a prevalência de T. cruzi no sangue contaminado excede a prevalência de HIV e hepatite por vírus B e C nos estoques de sangue (20).

A América Latina obteve uma redução significativa da prevalência da doença de 18 milhões para 5,7 milhões com essa iniciativa de controle em 1991(3).

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Os países que obtiveram um controle efetivo da atividade do vetor também apresentaram um significativo declínio da incidência da doença de Chagas, acompanhada por uma redução de sua prevalência (21). Uma vez controlada a transmissão vetorial se faz imprescindível a manutenção da vigilância sanitária (22). Porém, novos desafios surgiram e estes incluem os recentes surtos da doença de Chagas na Amazônia devido à transmissão oral, através de alimentos contaminados (23).

A transmissão do T.cruzi por via oral é provavelmente o mecanismo mais frequente entre os animais no ciclo silvestre, considerando que várias espécies de mamíferos silvestres, tais como pequenos primatas, frequentemente ingerem insetos, neste caso, os triatomíneos que transmitem T. cruzi (14). Em seres humanos houve surtos de transmissão pela via oral, em que os casos mais comuns envolveram a ingestão de sucos contaminados ou alimentos crus. Para evitar esses casos de transmissão oral, devem-se adotar melhorias da higiene na preparação de refeições e de gestão ambiental como medida preventiva (24).

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1.1.2-A DOENÇA

A doença de Chagas apresenta-se classicamente numa fase aguda ou inicial, sendo seguida por uma fase crônica que pode ser categorizada em formas indeterminada, cardíaca, digestiva ou cardiodigestiva com diferentes manifestações clínicas (26). Essa enfermidade é uma das principais causas de doenças cardíacas e umas das principais causas de mortes relacionadas com problemas cardiovasculares em áreas endêmicas localizadas na América Latina (27). Além disso, em locais onde a transmissão da doença foi interrompida, ela está associada com o aumento do risco de mortalidade entre os idosos (6). Esse aumento no risco de mortalidade é mais comum na fase crônica da doença (28).

FASE AGUDA

Casos agudos de doença de Chagas são habitualmente produzidos pela picada de triatomíneos infectados, quando eles perfuram a pele para sugar o sangue e, simultaneamente depositam as fezes contendo tripomastigotas de T. cruzi (7). Essa fase também pode ocorrer devido à transmissão do Trypanosoma cruzi a um receptor do órgão ou reativação de infecção crônica relacionada com estados de imunossupressão (26). A principal característica dessa fase é a grande quantidade de parasitas circulantes no sangue periférico (4,29).

A fase aguda inicia entre 6 a 10 dias após a infecção e tem a duração de cerca de 4-8 semanas (23). Ela é normalmente assintomática, porém em aproximadamente 5% dos casos há a presença de sintomas (30). Entre estes se encontra febre, mal-estar, hepatomegalia, linfadenopatia, lesão na pele (chagoma) entre outros. Na maioria dos casos a resposta imune do indivíduo controla a replicação do parasita e os sintomas desaparecem (3,31). Já as manifestações clínicas são variáveis entre os pacientes durante os surtos da doença de Chagas transmitidos por via oral e esta variação é provável que dependa não só da resposta imunitária, mas também da quantidade de T.cruzi inoculada (32). Além disso, os sintomas da fase aguda por via oral são diferentes dos sintomas por via vetorial,

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como edema facial, gengivite, tosse seca, eritema nodoso, inchaço, e edema de membros inferiores (33).

FASE CRÔNICA

Após 4-8 semanas de infecção, as manifestações clínicas agudas desaparecem e o número de tripomastigotas na corrente sanguínea cai, sendo raramente detectados no sangue periférico (7,17). Nessa fase, o portador permanece por toda vida e ela é caracterizada por quatro formas: indeterminada, cardíaca, digestiva e cardiodigestiva (34).

FORMA INDETERMINADA

A forma indeterminada é caracterizada por ser a forma assintomática da doença de Chagas e está presente em cerca de 60 a 70 % dos pacientes infectados em zona endêmica sem controle da transmissão vetorial (35). Essa forma é confirmada por testes sorológicos ou parasitológicos positivos; eletrocardiograma (ECG) normal; exames radiológicos normais do tórax, esôfago e cólon (26).

FORMA CARDÍACA

A cardiopatia chagásica é a consequência clínica mais importante e a mais grave da infecção pelo T. cruzi. Resultados de estudos epidemiológicos indicam que 10% a 30% dos indivíduos que são soropositivos para a infecção pelo T. cruzi têm algumas alterações eletrocardiográficas e os sintomas aparecem de 10 a 30 anos após a infecção inicial (7,26,36,37). As principais características clínicas da cardiopatia são: anormalidades no ecocardiograma, arritmias, síncope, disfunção ventricular esquerda e insuficiência cardíaca (3).

A cardiopatia chagásica crônica é a principal responsável pela elevada morbimortalidade da doença de Chagas, com grande impacto social e médico

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trabalhista (5,29,38). De acordo com o II Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, estima-se que em 2015 havia de 428.098 a 1.007.290 de pessoas com a forma cardíaca (4).

FORMA DIGESTIVA

A forma digestiva manifesta-se principalmente pelo acometimento do esôfago e do intestino grosso, levando ao aparecimento de megaesôfago e megacólon, respectivamente (29). Essa forma clínica é mais comumente encontrada na parte sul da Amazônia e raramente na parte norte da América do Sul e América Central (30,34,36,39). É observada em 1/3 dos pacientes chagásicos e estima-se que exista de 142.699 a 335.763 pacientes no Brasil com essa forma em 2015 (4,17,40). No Brasil, o megaesôfago é a manifestação digestiva mais comum da doença de Chagas (41).

Dentre os sintomas dos portadores do megaesôfago citamos a disfagia com odinofagia, combinado com dor epigástrica, regurgitação e desnutrição, em casos graves. Já o megacólon afeta o segmento sigmóide, reto ou cólon descendente, ou uma combinação, e produz obstipação prolongada, distensão abdominal e obstrução intestinal, ocasionalmente devido ao fecaloma ou volvo de sigmóide (34).

FORMA CARDIODIGESTIVA

A associação de doença cardíaca com clínica de megaesôfago ou megacólon, ou ambos definem a forma cardiodigestiva da doença de Chagas. Na maior parte dos países, o desenvolvimento de megaesôfago geralmente precede a cardiopatia e o cólon, mas a prevalência exata da forma cardiodigestiva não é completamente conhecida (34,36,42). No Brasil, essa forma é menos frequente que a forma cardíaca (43).

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1.1.3 TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS

A doença de Chagas é considerada a mais negligenciada das doenças tropicais, um fato que pode ser demonstrado dentro do contexto de tratamento específico. Desde a década de 1970, apenas dois fármacos foram disponibilizados no mercado para o tratamento da doença, que são o benznidazol e nifurtimox (40). No Brasil, apenas o benznidazol é utilizado e liberado para o tratamento da doença (28).

O tratamento com os medicamentos atualmente utilizados proporciona taxas de cura de quase 100% em crianças e cerca de 60% em crianças e adultos com infecção recente. Para adultos, embora faltem evidências que garantam o sucesso dessa terapia nas diferentes circunstâncias, o tratamento específico pode ser instituído na forma crônica recente. Para essa finalidade considerou-se como recente o período de cinco a doze anos, após a infecção inicial (29,44).

O principal problema no uso do medicamento em adultos é a alta taxa de efeitos adversos como: hipersensibilidade, incluindo dermatite com erupções cutâneas, mialgias, artralgias, e linfadenopatia; polineuropatiae púrpura trombocitopênica e agranulocitose (44). Além disso, não se sabe se o tratamento em pacientes com infecção crônica, o parasita é eliminado do organismo, ou se apenas há uma redução da carga parasitária (36).

A avaliação do efeito do tratamento contra a infecção por T. cruzi requer uma compreensão clara sobre a combinação de variáveis. As principais são os métodos de diagnósticos utilizados (parasitológico, moleculares e testes sorológicos), a fase de infecção (aguda ou crônica) e o tempo decorrido entre o tratamento e a aplicação do teste para avaliar a eficácia ou a falha terapêutica (45).

Como há essa dúvida quanto à eficácia do tratamento, é importante a descoberta de novos fármacos. Mas como não há novos medicamentos se fazem necessário o aperfeiçoamento do tratamento atualmente disponível, como o benznidazol e nifurtimox e os doentes tratados com estes medicamentos devem ser rigorosamente monitorizados durante o seguimento (44).

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1.2 MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

O diagnóstico da doença de Chagas é realizado por métodos que demonstram a presença do parasita no sangue, direta ou indiretamente, pela visualização do parasita em lâmina ou isolamento em meio de cultura, pela detecção de anticorpos anti-T. cruzi no soro (figura 4) e por testes moleculares (46). O método utilizado depende da fase da doença em que o indivíduo de encontra, já que na fase aguda há uma alta parasitemia e na fase crônica uma baixa parasitemia (47).

1.2.1 DIAGNÓSTICOS PARASITOLÓGICOS

O diagnóstico parasitológico na fase aguda da doença de Chagas é realizado pela demonstração de formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi em amostras de sangue periférico diretamente ao exame microscópico (9,36). Isso é possível, já que o T.cruzi é encontrado comumente na circulação periférica durante quatro a oito semanas após a infecção (9,48). As técnicas mais utilizadas são baseadas no exame de amostras frescas diretamente ou após coloração de esfregaços de sangue finos ou grossos, ou incluir métodos de concentração mais sensíveis, tais como o método de Strout e micro hematócrito (48). Recomenda-se a realização simultânea de diferentes modalidades de exames parasitológicos diretos. Quando os resultados do exame a fresco e de concentração forem negativos na primeira coleta, devem ser realizadas novas coletas até a confirmação do caso ou

Figura 5: Curva mostrando a parasitemia na fase aguda e crônica e o aumento da titulação de anticorpos (fonte: Ministério da Saúde (11)).

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desaparecimento dos sintomas da fase aguda, ou ainda confirmação de outra hipótese diagnóstica (4).

Os parasitas podem também ser visualizados em esfregaços de sangue corados com Giemsa ou podem ser cultivados com o uso de hemocultura em meio especializado. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido uma ferramenta de diagnóstico sensível na fase aguda e é o melhor teste para a detecção precoce da infecção no receptor de um órgão de um doador infectado ou após a exposição acidental (3).

Na fase crônica da infecção chagásica, os parasitas podem ser localizados por métodos indiretos, tais como o xenodiagnóstico e a hemocultura, os quais são altamente específicos, mas pouco sensíveis, além de serem procedimentos laboriosos. Assim, na fase crônica, o diagnóstico da doença se baseia em testes sorológicos (9,49).

HEMOCULTURA

O T.cruzi é um protozoário facilmente cultivado em inúmeros meios acelulares contendo componentes como sais, proteínas e derivados da hemina. O meio mais utilizado para a hemocultura é o meio Liver Infusion Tryptose (LIT), no qual é utilizado para a incubação do sangue do paciente a 28ºC. A cultura é analisada por até 180 dias e a observação de formas flageladas de T. cruzi é definido como resultado positivo (9,40,50). Além do uso como forma de diagnóstico, ela também é utilizada para isolar o parasita para análises posteriores (51).

Essa técnica é específica, porém pouco sensível em casos de baixa parasitemia (52,53). Para melhorar a sensibilidade, é válido aumentar o volume de sangue coletado, aumentar o tempo de observação, diminuir o tempo entre a coleta e o processamento da amostra (9,47). Para minimizar a seleção do parasita, as culturas devem ser mantidas em tubos individuais em laboratório, durante um curto período de tempo e os parasitas devem ser cultivados por duas passagens sucessivas em meio LIT (54).

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XENODIAGNÓSTICO

O xenodiagnóstico é um dos exames parasitológicos aplicados à forma crônica e aguda, no qual o objetivo é isolar o parasita através das fezes do inseto vetor. Colocam-se triatomíneos, criados em laboratório e alimentados com sangue de aves, na pele de indivíduos suspeitos para sugar sangue durante 30 minutos. Posteriormente, examinam-se as fezes desses insetos para verificar a presença de formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas do T.cruzi (9,40,47). Assim como a hemocultura, o método é específico, porém pouco sensível (20 a 50% de positividade) além de laborioso (7,36,55). Para aumentar a positividade, recomenda-se um número maior de inrecomenda-setos aplicados e sua repetição (47).

1.2.2 DIAGNÓSTICOS SOROLÓGICOS

O diagnóstico sorológico da infecção chagásica baseia-se na detecção de anticorpos anti-T.cruzi das classes IgM e IgG no soro do paciente, dependendo da fase da infecção. Os testes em geral apresentam uma alta sensibilidade e especificidade no diagnóstico laboratorial da infecção chagásica. Do ponto de vista prático, três ensaios convencionais são amplamente utilizados: ensaio imunoenzimático (ELISA), ensaio de imunofluorescência indireta (IFI) e o ensaio de hemaglutinação indireta (HAI). Atualmente, o uso de pelo menos dois ensaios diferentes para confirmar o diagnóstico da doença é recomendado (55,56).

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

A imunofluorescência indireta é uma das técnicas sorológicas mais utilizadas para o diagnóstico da doença de Chagas. A reação de IFI baseia-se na interação do próprio T. cruzi (formas epimastigotas) com os anticorpos contra esses parasitas presentes no soro. O resultado é visualizado em microscópio de

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fluorescência, pois se utiliza um conjugado ligado a isotiocianato de fluoresceína, que servirá como revelador da reação antígeno e anticorpo (9,57).

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

O teste ELISA utiliza o conceito básico de imunologia em que um antígeno se liga a um anticorpo específico, o que permite a detecção de pequenas quantidades de antígenos, tais como proteínas, peptídeos, hormônios, ou anticorpo numa amostra de fluido (58). Nos testes para doença de Chagas geralmente empregam as formas epimastigotas do T. cruzi como antígeno, mas o uso de antígenos recombinantes aumenta a sensibilidade e a especificidade do teste (59).

HEMAGLUINAÇÃO indireta(HAI)

A reação de HAI se baseia na aglutinação de hemácias sensibilizadas com antígeno T. cruzi, em presença de soro contendo anticorpos contra esse parasita. A leitura é feita, a olho nu, com a placa de microtitulação colocada contra a luz ou em um espelho próprio. O teste pode ser tanto quantitativo quanto qualitativo (57).

WESTERN BLOT

Western blot é uma técnica usada para identificar proteínas específicas a partir de uma mistura complexa de proteínas extraídas a partir de células. A técnica utiliza três elementos para realizar esta tarefa: (a) separação por tamanho, (b) a transferência para um suporte sólido, e (c) a marcação de proteínas alvo, utilizando um anticorpo primário e secundário (60). Um kit que utiliza esse método é o TESA-cruzi (Trypomastigote Excreted-Secreted Antigens-bioMérieux) que utiliza antígenos excretados pela forma tripomastigota. É um teste considerado sensível e específico para a doença de Chagas e não ocorre reação cruzada com outras doenças

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parasitárias, como a leishmaniose (61). No entanto, não é uma técnica a ser utilizada em grande escala, apenas para confirmar a infecção por T.cruzi, devido ao alto custo (40,62).

1.2.3 MÉTODOS MOLECULARES

A reação em cadeia da polimerase (PCR) consiste na amplificação in vitro de fragmentos de DNA de T. cruzi presentes em amostras de sangue, soro ou tecidos do paciente infectado. Esta técnica é de alta sensibilidade, pois é capaz de detectar quantidades de DNA de um único parasito (63). O diagnóstico é realizado pela observação de fragmentos de tamanho molecular esperados, revelados através da eletroforese do produto de amplificação em géis de agarose ou poliacrilamida (56).

RFLP-PCR

Os polimorfismos de fragmento de restrição (RFLP) carregam a sua definição em seu nome. Um fragmento de restrição é uma região amplificada do DNA que foi clivado por uma proteína chamada enzima de restrição ou endonucleases de restrição (64). Como pode haver variações na sequência de nucleotídeos, essa técnica é utilizada para identificar a distribuição de sítios de clivagem dentro da mesma espécie. Nesse caso, os fragmentos de DNA obtidos pela digestão diferem no tamanho (65).

(28)

1.3. PERFIL GENOTÍPICO DO T.CRUZI

O T. cruzi é um parasita antigo, e estima-se que divergiu de seu ancestral comum mais recente de 3-4 milhões de anos atrás, e, como tal, apresenta considerável diversidade genética (51). A primeira observação sobre a variabilidade deste parasita vem de Carlos Chagas, onde em 1909, observou um dimorfismo (esguio e formas robustas) nos tripomastigotas encontrados na corrente sanguínea. A partir dessas observações iniciais, a variabilidade genética em T. cruzi tem sido demonstrada tanto em nível de proteína e de DNA (66).

Estudos sobre polimorfismos intra-específicos de T. cruzi sugere que a reprodução sexual é rara ou ausente e que a estrutura da população é clonal (em que a progênie é geneticamente idêntica, ou muito semelhante, à linhagem parental). Assim, cada clone representa uma linhagem que se reproduz por divisão binária e permanece inalterado durante um grande número de gerações até ocorrer mutações (66,67). No entanto, essa variedade também pode ser explicada pela distância geográfica (isolamento das populações), especiação críptica1 e da seleção natural (68).

Apesar dos avanços técnicos, sua estrutura populacional está longe de ser completamente compreendida, pois o T. cruzi é considerado uma espécie heterogênea e é composta por um conjunto de linhagens. A heterogeneidade do parasita tem sido extensivamente estudada por métodos biológicos, bioquímicos, moleculares e poderia explicar as diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas e as diferenças geográficas na morbidade e mortalidade (34). Com base nesses estudos, a população do parasita foi dividida em certo número de linhagens evolucionárias, igualmente denominados Unidades Discretas de Tipagem (DTU) (69).

A classificação por DTUs é amplamente utilizada como uma referência em estudos epidemiológicos (70). Anteriormente, o táxon T.cruzi era dividido em duas linhagens geneticamente distintas, as quais receberam a denominação T.cruzi I e

1

Espécies crípticas são aquelas que, apesar de serem morfologicamente idênticas ou muito parecidas, constituem unidades evolutivas independentes.

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T.cruzi II (TCI e TCII). Posteriormente foi proposto que a linhagem II fosse subdividida em cinco sub-linhagens (IIa - IIe) (71). Recentemente, esta nomenclatura (Tabela 1) foi revista da seguinte forma: TC I, TC II (ex-TcIIb), TC III (IIc), TC IV (TcIIa), TC V (TcIId) e TC VI (TcIIe) (69). A mudança foi realizada de acordo com as características moleculares e eco epidemiológicas e pela patogenicidade do parasita (72).

Diferentes DTUs são mais prevalentes em determinados locais geográficos e em diferentes vetores. O TCI tem uma ampla distribuição e também é responsável pela transmissão em pacientes chagásicos do norte do Amazonas. TC II, TCV e TCVI são mais comuns em países do Cone Sul e estão associados aos ciclos domésticos. Além disso, TCV e VI parecem estar mais intimamente associadas com a transmissão doméstica e TCIII e IV são recolhidos principalmente em ciclos silvestres da floresta tropical (70,73–75).

Além da distribuição geográfica, as DTUs foram correlacionadas com a forma clínica. Na Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Equador, Paraguai, Peru e Uruguai a doença de Chagas é caracterizada pela presença de cardiopatia e alterações digestivas (76). Em estudos feitos por Flórez et al (77) e Higo et al (78) foram sugeridos que a forma digestiva é mais prevalente na parte sul da América do Sul e que isso se deve a presença de alelos associados à essa forma mais do que em outras áreas. Já a forma cardíaca é distribuída igualmente em toda a América Latina e a única forma sintomática encontrada na Colômbia, Costa Rica, Equador, El Salvador, Guatemala, Honduras, Nicarágua, Panamá e Venezuela (76,78).

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Tabela 4: Esquema representando a nomenclatura atual das DTUs. (Adaptado de Zingales et al(79))

DTU Abreviação Equivalência

T. cruzi I TC I T.cruzi I e DTU I

T. cruzi II TC II T.cruzi II e DTU IIb

T. cruzi III TC III Z3/Z1 ASAT,Z3-A,DTU IIC e T.cruzi III

T. cruzi IV TC IV Z3, Z3-B, e DTU IIa

T. cruzi V TC V Bolivian Z2, rDNA ½, clone 39, e DTU IId

(31)

1.3.1- GENOTIPAGEM DO T. CRUZI

A genotipagem do T. cruzi pode ser efetuada, tanto diretamente a partir de amostras clínicas (biópsias, sangue ou tecidos) quanto isolando o parasita por hemocultura ou xenodiagnóstico (51). Geralmente se opta pelo isolamento do parasito pela hemocultura por ser uma técnica específica apesar da baixa sensibilidade (9,29).

Um grande número de técnicas de genotipagem tem sido desenvolvido para caracterizar a diversidade genética do T. cruzi com diferentes características, como facilidade experimental, reprodutibilidade, subjetividade e transmissibilidade (51). Dentre as técnicas para se determinar as DTUs são encontradas as que se focam nas variações genéticas, nas diferenças de mobilidade das isoenzimas, na amplificação aleatória de DNA polimórfico, nos polimorfismos, nas análises de microssatélite, na temperatura de melting entre outros (51,78,80–84). De acordo com Zingales (79) o ideal seria uma técnica de fácil reprodutibilidade e indicou o estudo de Lewis et al (85), que realizou um ensaio triplo no qual empregou a rDNA PCR (24Sα rDNA) e RFLP-PCR das regiões HSP60 (Proteína de choque térmico) e GPI (glicose 6- fosfato isomerase).

RNA RIBOSSÔMICO DO T.CRUZI: LSU (24Sα RDNA)

Uma característica singular do T.cruzi é a organização do seu RNA ribossômico. Tanto a subunidade menor (SSU) quanto à subunidade maior (LSU) são consideravelmente maiores do que em outras espécies de eucariotos. Especificamente, a LSU contém dois RNAs com elevado peso molecular (24Sα/24Sβ) e seis RNAs de baixo peso molecular (S1-S6). Juntando a 24Sα e 24Sβ e três das espécies de RNA de baixo peso molecular (S2, S4 e S6), correspondem ao RNA 28S de eucariotas superiores (66,86).

A amplificação por PCR da região 24Sα se mostra eficaz, já que há um grande dimorfismo entre os isolados de T.cruzi possibilitando a identificação das DTUs (87). Estima-se que a região alvo existe em cerca de 60 000 cópias por célula

(32)

e três alelos distinguem: 110 pb (TCI, TCIII e TCV), 125 pb (TCII, TC VI) e 120 pb (TC IV). No DTU TCV, pode aparecer duas bandas, uma de 100 pb e outra de 125 (7,85,88,89). O esquema de padrão de bandas está evidenciado abaixo na figura 5:

ENZIMA GLICOSE 6-FOSFATO ISOMERASE: GPI

A glicose-6-fosfato isomerase (GPI) é uma enzima importante envolvida na glicólise que catalisa a isomerização reversível de D-glicose-6-fosfato a D-frutose-6-fosfato e participa da glicólise como a segunda enzima da via glicolítica. Os diferentes genótipos do locus dessa isoenzima são DTU-específicas (90).

Os produtos de PCR de todos os alelos GPI partilham um local de restrição que produz fragmentos de digestão pela enzima HhaI. Assim, só é possível visualizar o polimosfismo após a digestão com essa enzima, como mostra a figura 6 abaixo (85,91).

Figura 6: Perfil esperado do produto de PCR na genotipagem por LSUrDNA (Adaptado de: Lewis et al(85))

Figura 7: Perfil esperado na RFLP-PCR da região GPI (Adaptado de: Lewis et al(85)).

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HSP60 (HEAT SHOCK PROTEIN)

A família HSP60 de chaperonas, por vezes chamadas de chaperoninas, possui um formato de dois anéis em forma de barril, formando uma cavidade que proporciona um ambiente protegido no qual um polipeptídio pode se dobrar até que todas as regiões hidrofóbicas sejam posicionadas em seu interior. Esse processo previne a agregação entre as proteínas (92,93). Esse é um mecanismo natural das células, como as proteínas são sintetizadas nos ribossomos, elas devem dobrar-se em sua conformação nativa. Algumas vezes isso ocorre espontaneamente, mas na maioria das vezes ocorre com a assistência de enzimas e complexos especializados chamados chaperonas (94).

As chaperoninas são encontradas em eucariotos, associados às mitocôndrias e cloroplasto; e também estão presentes em bactérias (92,95). Essas estruturas aumentam substancialmente a sua quantidade quando a célula sofre um choque térmico. Essa elevação da temperatura ocasiona a perda estrutural das proteínas e assim, a presença de chaperoninas se faz de grande importância (92). O T. cruzi utiliza essas chaperoninas e outros tipos de chaperonas como forma de proteção, pois sofre estresse de temperatura quando transita entre o hospedeiro vertebrado e o invertebrado (92). Assim como a região GPI, o polimorfismo da região HSP60 pode ser visualizado após a clivagem, só que pela enzima de restrição EcoRV. O padrão de bandas obtido após a PCR e após a digestão está representado na figura 7:

Figura 8:Perfil esperado na RFLP-PCR da região HSP60 (Adaptado de: Lewis et al(85)).

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1.3.2 IMPORTÂNCIA DA GENOTIPAGEM

Compreender a diversidade genética de qualquer agente microbiano patogênico é crucial, especialmente para a investigação epidemiológica e para estudos de diagnóstico, evolutivos e básicos (85). Especialmente em estudos voltados para a doença de Chagas, já que o T. cruzi é extremamente heterogêneo e amplamente distribuído no Brasil (96).

A identificação precisa do T. cruzi e de suas respectivas linhagens são importantes para o diagnóstico e compreensão de sua epidemiologia, além de poder ser relevante para fornecer um prognóstico da progressão da doença ou as decisões de tratamento diferenciais com base na DTU infectante (96–98).

Ao longo dos anos, várias abordagens têm sido utilizadas para caracterizar a estrutura da população de T. cruzi, para definir o número de subgrupos relevantes (79). Apesar da variedade de estudos, com alvos variados e de diferentes conclusões, avaliar o perfil genotípico do parasito ainda é de grande importância, mesmo que restrito ao campo da pesquisa.

(35)

2-OBJETIVOS

2.1-OBJETIVO GERAL

Avaliar o perfil genotípico do T.cruzi em portadores da doença de Chagas atendidos pelo Grupo de Estudo em Doença de Chagas (GEDoCh) do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

2.2-OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Isolar o T. cruzi a partir da hemocultura de amostras de portadores crônicos da doença de Chagas;

- Implantar a técnica de genotipagem de T. cruzi no Laboratório de Diagnóstico de Doenças Infecciosas por Técnicas de Biologia Molecular;

- Caracterizar as DTUs doT. cruzi isolados

- Avaliar a eficiência de kits sorológicos comerciais e comparar com o perfil genotípico encontrado.

- Correlacionar os resultados com a procedência dos pacientes e formas clínicas apresentadas.

(36)

3-CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1-COLETA DAS AMOSTRAS E ANÁLISE DE PRONTUÁRIOS

Para participar da pesquisa foi convidado todo indivíduo adulto atendido pelo Grupo de Estudos em Doença de Chagas (GEDoCh), situado no Hospital de Clínicas da Unicamp.Ao voluntário que demonstrasse interesse, era apresentado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) no qual constava toda informação sobre a pesquisa, inclusive os objetivos, a justificativa e o número do processo do Comitê de Ética. Após a leitura e a compreensão do TCLE, o voluntário concordando com tudo, assinava o Termo de Consentimento (Parecer do Comitê de Ética aprovado sob o número 144.101).

No total foram coletadas 54 amostras de sangue entre fevereiro de 2013 a dezembro de 2015. De cada paciente foram coletados 28 ml de sangue em quatro tubos com EDTA de 6 ml cada e 4 ml em tubo seco. Após a coleta, o sangue foi encaminhado imediatamente para o Laboratório de Diagnóstico de Doenças Infecciosas por Técnicas de Biologia Molecular para os procedimentos posteriores.

Dados dos pacientes contidos nos prontuários foram coletados entre 2015 e 2016. As variáveis analisadas foram: idade, gênero, procedência, forma clínica, métodos de diagnóstico, contato com o vetor, familiar portador da doença, transfusão de sangue, tratamento com benznidazol e tratamento cirúrgico.

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3.2-HEMOCULTURA

A hemocultura do T.cruzi consiste em cultivar o sangue em meio LIT (Liver Infusion Tryptose) e assim isolar o parasita para diagnóstico ou para utilizá-lo em outra técnica. A técnica foi baseada em Chiari e Luz (50,52), com algumas modificações. Os procedimentos foram realizados assim que as amostras chegaram ao laboratório para melhorar a sensibilidade da técnica (52).

Os tubos com EDTA foram colocados em centrífuga refrigerada a 4 º C e centrifugados a 3.500 rpm por 10 minutos para o descarte do plasma.Após a retirada do plasma, 3 ml de meio de cultura foi colocado em cada tubo e a amostra foi centrifugada novamente. O sobrenadante foi descartado e acrescentado 6 ml de LIT e a hemocultura foi colocada em estufa a 28ºC para cultivar o parasita.

A leitura da hemocultura foi realizada em microscópio óptico quinzenalmente até o parasita ser visualizado ou até completar 120 dias de cultura. Assim que o parasita foi observado, um repique foi realizado para eliminar as hemácias. A leitura do repique foi feita semanalmente. Após verificar a presença do parasita em toda lâmina, 200µl do repique foi aliquotado para a extração de DNA.

O meio de cultura foi gentilmente cedido pelo Laboratório de Bioenergética e Oxidações Biológicas, situado no Instituto de Biologia da Unicamp, sob responsabilidade da Profa. Dra. Fernanda Ramos Gadelha.

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3.3-EXTRAÇÃO DO DNA

Os isolados das hemoculturas positivas foram submetidos à extração do DNA do T.cruzi através de um método in house utilizando fenol/clorofórmio, onde 200 µl do repique foi adicionado a 200 µl de tampão da proteinase K (10mM Tris HCL, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0,4 % SDS) e 1 µl de proteinase K (10mg/ml) e colocado em banho-maria a 55ºC por 2 horas.

Após o tempo de incubação, foi adicionado 100 µl de fenol e 100 µl de clorofórmio e a amostra foi colocada em banho de gelo por 10 minutos e após esse período foi centrifugada a 15000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e o processo de adição de fenol/clorofórmio, banho de gelo e centrifugação foi repetida por três vezes.

Após a última transferência do sobrenadante, foram adicionados 20 µl de acetato de sódio (3 M) e 900 µl de etanol absoluto e a amostra foi colocada em freezer a -20ºC por 24 horas. Após esse período, a amostra foi centrifugada e o sobrenadante descartado, restando o pellet que foi ressuspendido em 20 µl de água ultra pura (Milli-Q). Após o processo de extração, as amostras foram quantificadas em espectrofotômetro (NanoDrop 1000®) e diluídas à uma concentração previamente estabelecida de 200 ng/µl de DNA.

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3.4-GENOTIPAGEM PELA PCR E RFLP-PCR

Após a extração do DNA do parasita, as amostras foram submetidas à genotipagem utilizando a técnica baseada no artigo de Lewis et al (85), porém com algumas alterações. Para conseguir delinear qual DTU o parasita isolado pertencia, foram necessários três ensaios de PCR (LSU, GPI e HSP60) e em duas reações os produtos da PCR foram digeridos por enzimas de restrição (GPI/HhaI; HSP60/EcoRV). As reações foram realizadas na Mastercycler Gradient da Eppendorf® seguindo as temperaturas descritas no artigo e utilizou-se o como reagente para a PCR, o Go Taq® Green Master Mix.

Para verificar a qualidade da metodologia, foi utilizada uma cepa do T.cruzi, a cepa Y, que é sabidamente pertencente ao DTU TC II. A cepa foi cedida gentilmente pelo Laboratório de Bioenergética e Defesas Antioxidantes em Trypanosoma cruzi. Em todas as reações do protocolo foram incluídos o DNA da cepa Y como controle. Os detalhes das três reações estão descritos a seguir e os padrões das bandas estão dispostos na tabela 2.

PCR LSU RDNA

Nessa reação foram utilizados os primers D71 (5’ AAGGTGCGTCGACAGTGTGG3’) e D72 (5’ TTTTCAGAATGGCCGAACAGT3”)que amplificam a região 24SαrDNA do T.cruzi. As etapas no termociclador foram:desnaturação do DNA a 94° C por 3 minutos, seguida por 27 ciclos (94 °C de desnaturação, anelamento de 60°C e extensão com 72°C, todos com 1 minuto cada) e extensão final de 72° por 5 minutos. O gel de eletroforese foi utilizado numa concentração de 3% de agarose e o padrão de bandas das DTUs para essa reação foi de 110 pares de base (pb) para o TC I e III, 125 pb para TC II e VI, 120 pb para TC IV e 110 ou 110 +125 pb para TC V.

(40)

RFLP-PCR GPI

Os primers utilizados na reação foram SO1 (5’

GGCATGTGAAGCTTTGAGGCCTTTTTCAG3’) e SO2 (5’

TGTAAGGGCCCAGTGAGAGCGTTCGTTGAATAGC3’). Essa reação em cadeia da polimerase teve desnaturação inicial de 94°C por 3 minutos, 32 ciclos com 94°C de desnaturação por 45 segundos, 65°C de anelamento por 45 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto, seguindo por uma extensão final a 72°C por 10 minutos. Os produtos da PCR (1264 pb) foram verificados em gel de agarose a 1,5%. Esses foram digeridos pela enzima HhaI, onde 10 µl do produto de PCR foi adicionado a um tubo de centrifugação juntamente com 0,25 U/ µl dessa enzima e incubado a 37°C por quatro horas em banho-maria. O gel de eletroforese para verificar o padrão das bandas foi realizado na mesma concentração do gel para verificar a amplificação. O padrão das bandas para TC I e III foi de duas bandas, para o TC II, IV foi de 3 bandas e TCV e VI de 4 bandas.

RFLP-PCR HSP60

Foram utilizados os primers HSP60 (HSP60-f 5’

GTGGTATGGGTGACATGTAC3’ e HSP60-r 5’ CGAGCAGCAGAGCGAAACAT 3’) nessa etapa e a reação foi padronizada da seguinte maneira: desnaturação por 3 minutos a 94°C, quatro ciclos com 94°C por 30 segundos, 64° de anelamento por 30 segundos e extensão de 72°C por 1 minuto. Após 4 ciclos a reação teve seguimento de mais 28 ciclos, mantendo a mesma temperatura e tempo para a desnaturação e extensão do ciclo anterior, com a diferença na temperatura de anelamento que foi de 60°C por 30 segundos. A extensão final foi de 72° C por 10 minutos. Logo após o fim da reação, os produtos da PCR (432-462 pb) foram checados em gel de eletroforese a 1,5% de agarose para verificar se houve amplificação de DNA. Tendo amplificado, 10 µl do produto de PCR foi adicionado a um tubo de centrifugação juntamente com 0,25 U/ µl da enzima EcoRV e incubado a 37°C por quatro horas em banho-maria. O padrão de bandas foi verificado em agarose a 3%, no qual os grupos TC I, TCII e TC

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IV apresentam 1 banda, o TCIII apresenta duas bandas e os grupos TC V e VI possuem 3 bandas.

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Tabela 5: Esquema representando o padrão de bandas para determinar as DTUs

Adaptado de: Lewis et al, 2009

TCI TC II TCIII TC IV TC V TC VI 24SαrDNA 110pb 125pb 110pb 120pb 110ou 110+125 125pb GPI/HhaI 2 bandas (817+447) 3 bandas ( 490+447+253) 2 bandas (817+447) 3 bandas (490+447+253) 4 bandas (817+490+447+253) 4bandas (817+490+447+253) HSP60/EcoRV 1 banda (432/462) 1 banda (432/462) 2 bandas (314+148/118) 1 banda (432/462) 3 bandas (432/462+314+148/118) 3 bandas (432/462+314+148/118)

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3.5-SOROLOGIA

As amostras de soro coletadas dos pacientes foram submetidas aos testes sorológicos, utilizando os seguintes kits comerciais: ELISA cruzi, Chagatest (ELISA recombinante v.4.0) e TESA-Cruzi.

As amostras coletadas nos tubos secos foram centrifugadas a 3.500 rpm por 10 minutos para a coleta do soro e esses foram armazenados em freezer a -20° C. No dia do procedimento, as amostras foram retiradas do freezer e colocadas em temperatura ambiente. Assim que descongelaram, os soros foram centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos para serem utilizados nos kits sorológicos.

ELISA-CRUZI

O kit ELISA-cruzi (bioMérieux®) foi utilizado de acordo com as orientações do fabricante. O antígeno utilizado pelo fabricante foi retirado de formas epimastigotas da cepa Y. A reação foi lida em espectrofotômetro de microplacas utilizando filtro com comprimento de onda de 450nm. De acordo com o fabricante, a amostra era considerada reagente se o valor de teste (VT) fosse maior que 1, não reagente quando menor que 0.8 e duvidoso entre 0.8 e 1.

CHAGATEST (ELISA RECOMBINANTE V.4.0)

Também foi realizado o teste sorológico com o kit Chagatest de acordo com as instruções do fabricante (Wienerlab®) e por ser recombinante, o kit é sensibilizado com seis antígenos (SAPA,1,2,13,30 e 36) retirados da forma epimastigota e tripomastigota. A reação foi lida em espectrofotômetro de microplacas utilizando filtro com comprimento de onda de 450nm. As amostras foram consideradas reativas quando apresentaram absorbância maior ou igual ao Cut-off e não reativas quando apresentaram valor abaixo do Cut-off. Esse valor era

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estabelecido de acordo com o valor da absorbância da média das absorbâncias dos controles negativos, acrescidos de 0,200.

TESA-CRUZI

O kit TESA-cruzi (bioMérieux) foi utilizado de acordo com as orientações do fabricante e em duas amostras de pacientes com sorologia duvidosa/negativa de acordo com os testes aplicados no Hospital de Clínicas da Unicamp. O teste consiste em tiras com proteínas antigênicas TESA de T. cruzi que foram separados por eletroforese e fixados nas membranas de nitrocelulose. As bandas de 120 e 200 kDa são observados em reações positivas e estão ausentes em reações negativas (61).

3.6-ANÁLISE DOS DADOS

Realizou-se uma análise descritiva dos dados coletados e estes foram organizados em tabelas, gráficos e figuras, pelo Microsoft Excel®.Os mapas contendo os dados de procedência geral e dos isolados genotipados foram confeccionados no Google Maps®.

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4-RESULTADOS

4.1-HEMOCULTURA

A hemocultura foi realizada em 54 amostras e foi positiva em 26, totalizando 48%. Em média, o parasita foi observado 44 dias após a inoculação da amostra do paciente em meio de cultura (tabela 3), onde o menor tempo para observar o parasita foi de 15 dias e o maior de 120 dias. Em 54% dos pacientes, em apenas um tubo da hemocultura o parasita pode ser visualizado e em 20% dos pacientes todos os tubos foram positivos. Na figura 8, uma foto do repique de um dos pacientes estudados, mostrando a forma epimastigota do T.cruzi.

Figura 9:Tripomastigostas formando rosetas em repique da hemocultura de um paciente. Aumento de 40x em microscópio ótico

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Tabela 6: Relação dos pacientes com hemocultura positiva ,o tempo de positividade em dias.e a quantidade de tubos positivos. Paciente Dias Tubos positivos

1 39 1/3 2 45 2/3 3 22 2/3 4 29 1/4 5 57 1/4 6 71 1/4 7 15 3/3 8 29 3/3 9 29 1/4 10 29 4/4 11 43 1/4 12 57 2/4 13 29 4/4 14 120 1/4 15 71 1/4 16 57 1/4 17 57 1/4 18 29 1/4 19 29 2/4 20 64 1/4 21 85 3/4 22 64 1/4 23 92 1/4 24 43 4/4 25 71 1/4 26 29 4/4

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4.2-PERFIL CLÍNICO E EPIDEMIOLÓGICO DOS PACIENTES

O perfil dos pacientes foi analisado de acordo com as informações contidas nos prontuários e correlacionado com alguns resultados obtidos no laboratório. Os dados referentes ao gênero e a positividade dos mesmos na hemocultura são apresentados na tabela 4. No total, foram coletadas mais amostras do gênero feminino e a hemocultura positiva foi também mais prevalente nesse gênero. A média de idade dos pacientes foi de 53 anos e dentre os indivíduos com hemocultura positiva, a média foi de 54,5 anos.

Tabela 7:Distribuição do variável gênero no total e de acordo com a positividade da hemocultura

Foi avaliada a forma clínica dos pacientes e os valores encontrados estão dispostos no gráfico 1.Dentre o total de amostras coletadas (54) e hemoculturas positivas (26), a forma cardíaca foi a mais prevalente, sendo encontrada em 10 pacientes com culturas positivas dos 19 coletados com essa forma (52%). Dentre os pacientes portadores da forma digestiva, apenas 25% apresentou hemocultura positiva, sendo dois indivíduos do gênero feminino e um masculino. Considerando as outras formas clínicas, a porcentagem de hemocultura positiva foi semelhante, sendo aproximadamente de 55%.

Feminino Masculino Total

Amostras incubadas 32 (59%) 22(41%) 54(100%)

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Como o presente estudo não incluiu ou excluiu pacientes que fizeram o uso de medicamentos para o tratamento da doença de Chagas, esses dados foram analisados pelas informações contidas nos prontuários médicos (tabela 5). A maioria dos pacientes, aproximadamente 60%, não utilizou o benznidazol e cerca de 20% não conseguiu finalizar o tratamento por apresentar reações adversas. Dentre os pacientes que tiveram resultado positivo na hemocultura, os pacientes que fizeram o tratamento até o final e os que interromperam obtiveram uma porcentagem mais alta do que os que não fizeram.

Foi avaliado se os pacientes precisaram de algum tratamento ou procedimento cirúrgico devido à progressão da doença de Chagas. Dos 54 pacientes analisados, apenas 18 necessitaram de alguma intervenção, sendo que desses 18, 14 fizeram tratamento cirúrgico no cólon ou no esôfago. Os quatro pacientes restantes colocaram marcapasso. Dentre os pacientes com hemocultura positiva, 76% não necessitaram de tratamento cirúrgico.

0 5 10 15 20 25 30 35 Hemocultura positiva Amostras

Gráfico 1:Distribuição da forma clínica no total e nos casos onde a hemocultura foi positiva

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Tabela 5: Distribuição dos pacientes segundo o uso de benznidazol

Amostras Hemocultura positiva

Sim 11 7 (63%)

Não 33 13 (39%)

Incompleto 10 6 (60%)

Foram tabulados e dispostos no gráfico 2 os antecedentes para a doença de Chagas, de acordo com o contato com o vetor, familiar portador da doença e se já foi submetido à transfusão de sangue. Aproximadamente 35% dos pacientes possuíam ao menos um familiar com a doença e 30% relataram que teve contato com o transmissor da doença. Dos 54 pacientes, dois necessitaram de transfusão sanguínea em algum período da vida, mas em apenas um a doença de Chagas foi comprovadamente transmitida pela via transfusional. Na figura 9 A, um mapa foi confeccionado para mostrar a procedência dos pacientes, e foi colocado juntamente um mapa mostrando a zona endêmica (figura 9B).

Gráfico 2: Formas possíveis de transmissão da doença de Chagas de acordo com os prontuários 20 17 2 33 3 52 1 34 0 0 10 20 30 40 50 60

Familiar Vetor Transfusão

(50)

Figura 9 A: Localização da procedência dos pacientes atendidos pelo GEDoCh

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4.3-ANÁLISE DAS SOROLOGIAS

A sorologia foi analisada pelos resultados presentes no prontuário e pelos kits utilizados durante a pesquisa. A maioria dos pacientes possui resultado positivo nos testes sorológicos, tanto no pesquisado em prontuário (ELISA e IFI), quanto no realizado através de dois kits de ELISA, conforme disposto na tabela 6. Amostras dos dois pacientes considerados não-reagentes para a doença de Chagas de acordo com os testes sorológicos foram submetidos ao teste TESA-cruzi, e em apenas um foi considerado positivo (figura 10).

Tabela 6: Resultados sorológicos dos pacientes analisados

Paciente HC (ELISA e IFI) Elisa-cruzi Chagatest

1 Reagente - -

2 Reagente Reagente Reagente

8 Reagente - -

14 Reagente - -

17 Reagente - -

(52)

Legenda: (-) sem amostra

25 Reagente - -

32 Não reagente Não reagente Não reagente

34 Não reagente Não reagente Não reagente

(53)

Figura 10: Resultado do teste Tesa-cruzi em pacientes não reagentes para outros métodos sorológicos.

(54)

4.4-OUTROS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Nas análises dos prontuários, pode se constatar em amostras de cinco pacientes onde os métodos de diagnóstico parasitológicos e moleculares foram necessários além dos métodos sorológicos. Em dois pacientes com resultado não reagente no teste sorológico foi realizada uma PCR para confirmar o diagnóstico. No paciente infectado pela via transfusional, foi realizado o xenodiagnóstico e a hemocultura para verificar a eficácia do tratamento com o medicamento benznidazol. O exame parasitológico direto foi utilizado em dois casos onde houve reagudização da doença, um por tratamento quimioterápico e outro por reativação gestacional. Destes cinco casos, a hemocultura foi positiva em três.

4.5-RESULTADOS DA GENOTIPAGEM

Nas figuras 11 a 13 abaixo, estão dispostos os géis das três etapas do processo de genotipagem. Na tabela 7 foram dispostos os dados dos pacientes que tiveram a hemocultura positiva e que foram genotipados os parasitas isolados. Nas figuras 14 A e B, foram correlacionados os resultados das DTUs e os locais de origem dos pacientes. De todas as amostras analisadas, apenas uma apresentou um padrão de bandas que é identificado em DTUs pertencentes ao grupo TCIII e nas 25 restantes os padrões das bandas identificam o grupo TCII.

(55)

Legenda: M(marcador de peso molecular 100pb), Y (cepa Y), 1 a 4 (amostras dos isolados), B(branco) 125 pb

110 pb

Figura11: Géis de agarose a 3% mostrando os produtos de amplificação da região 24SαrDNA com o padrão de bandas da DTU TC II (125 pb) e TC III (110pb)

(56)

Legenda: M(marcador de peso molecular), Y (cepa Y), 1 a 7 (amostras dos isolados), B (branco)

817-447 pb 490-447-253 pb

Figura 12: Gel de agarose a 1,5% mostrando o perfil da RFLP-PCR da região GPI, digerido com a enzima HhaI, com a amostra 4 apresentando padrão de bandas da TC III (4) e o restante com padrão TC II.

(57)

Legenda: M (marcador de peso molecular), Y(cepaY), 1 a 5(amostras dos isolados), B (branco)

432-462 pb

314-148 pb

Figura 10: Géis de agarose a 3% mostrando perfil da RFLP-PCR da região HSP60, digerido com a enzima EcoRV, apresentando padrão de bandas da TC II (432-462) e TC III (314-148)