UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Ciências Morfológicas - PCM
DESENVOLVIMENTO DE CULTURAS
TRIDIMENSIONAIS MULTICELULARES PARA O ESTUDO DE INTERAÇÕES CELULARES NO
MICROAMBIENTE HEMATOPOÉTICO
ANA PAULA DANTAS NUNES DE BARROS
Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas
Orientador: Maria Isabel Doria Rossi Radovan Borojevic
Programa Avançado de Biologia Celular Aplicada a Medicina Banco de Células do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro
Março 2007
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
DESENVOLVIMENTO DE CULTURAS
TRIDIMENSIONAIS MULTICELULARES PARA O ESTUDO DE INTERAÇÕES CELULARES NO
MICROAMBIENTE HEMATOPOÉTICO
ANA PAULA DANTAS NUNES DE BARROS
Tese apresentada como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas
Revisada por:
Profa. Maria Eugênia Leite Duarte – Dep. de Histologia e Embriologia, ICB, UFRJ
Avaliada por:
Profa. Adriana Bonomo – Instituto de Microbiologia, UFRJ e Instituto Nacional do Câncer
Profa. Christina Maeda Takiya – Dep. de Histologia e Embriologia, ICB, UFRJ
Prof. Marcelo Felippe Santiago – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ
Suplentes:
Profa. Maria Eugênia Leite Duarte
Profa. Vivian Rumjanek
Barros, Ana Paula Dantas Nunes de.
Desenvolvimento de culturas tridimensionais multicelulares para o estudo de interações celulares no microambiente hematopoético / Ana Paula Dantas Nunes de Barros. Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Ciências Biomédicas, 2007.
xi, 121 p. il.
Tese de Mestrado - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, 2007.
1.Cultura Tridimensional 2.Medula Óssea 3.Interações Celulares
4. Nicho subendosteal 5.Tese (Mestrado-UFRJ/ICB)
Aos meus pais por acreditarem em mim e possibilitarem que eu continue em busca
dos meus sonhos.
E a cada dia novo e imprevisível por vir.
“É verdade que não podemos encontrar a pedra filosofal, mas é bom que ela seja procurada; procurando-a, descobrem-se muitos bons segredos que se não procuravam”
Bernard Fontenelle
Agradecimentos
¾ Aos meus pais por acreditar em mim e me incentivar a cada passo desta jornada nada simples que é a vida científica.
¾ À minha irmã por todo o companheirismo nas horas mais animadas e nas mais difíceis também.
¾ Ao Hugo, meu sobrinho, por ser tão amoroso e compreensivo, liberando o computador para que eu pudesse escrever esta tese.
¾ Às minhas amigas Ellen, Maithê e Renata que muito me apoiaram ao longo destes anos e um agradecimento em especial à Manuela que além do apoio me presenteou com o belíssimo layout da capa.
¾ À Isabel por toda a paciência, dedicação, confiança, toques profissionais, incentivos sociais, piadas, lições de vida e empréstimos literários, que me ensinam a cada dia como me tornar além de uma boa profissional , uma pessoa melhor.
¾ Ao Leandro, pela ajuda nos PCRs, pelas conversas, cada dia mais loucas, saídas inusitadas e amizade ABSOLUTAMENTE inegável.
¾ À profa. Maria Eugênia Leite Duarte pela excelente revisão.
¾ Ao prof. Radovan sem o qual este trabalho não teria sido possível.
¾ À Luciana Garzoni por todo o apoio nas microscopias eletrônicas.
¾ À Prof. Nazareth Meirelles por ter permitido a utilização de seu laboratório para a realização dos processamentos de microscopia eletrônica.
¾ À Prof.Christina Takiya por ter me orientado nos processamentos de histologia e ter me recebido com tanta boa vontade no seu laboratório.
¾ Meu eterno agradecimento ao Prof. Marcelo Santiago pelos ensinamentos em microscopia confocal que foram essenciais no desenvolvimento deste trabalho.
¾ A Ivone Otazu que criou toda a estrutura dos PCRs no BCRJ e deixou muitas saudades quando seguiu sua jornada para os Emirados Árabes.
¾ A todos os companheiros de bancada: Leandra, Leandro, Daiana, Karina, Carol Pedrosa, Dani, Carol, Natália e Dani Bahia (jamais será esquecida!) todo o pessoal da Ivone (Guilherme, Fabiano, Marcela e Carol), do banco de células e transplante de medula óssea especialmente ao Gabriel (que sempre me socorria na ausência de seringas e filtros!!!).
¾ Sumário
1. Introdução ...1
1.1. Hematopoese e Microambiente Medular...1
1.1.1.Células tronco mesenquimais e organização do microambiente hematopoético...7
1.2. Migração na medula óssea ...9
1.3. O Nicho Subendosteal………...16
1.3.1. Ancoragem e quiescência...17
1.3.2. Auto-renovação...21
1.4. O Nicho Vascular...28
1.5. Modelos in vitro tridimensionais...30
1.6. Técnicas de culturas 3D ...36
1.7. Esferóides (Multicellular Tumor Spheroids, MCTS)...38
2. Objetivos ...41
3. Material e Métodos ...42
4. Resultados ...50
5. Discussão ...76
6. Conclusões Gerais ...94
7. Bibliografia ...95
8. Anexos ...109
RESUMO
A manutenção de células-tronco hematopoéticas (HSC) depende do microambiente tridimensional da medula óssea (MO). Com o objetivo de estabelecer um modelo in vitro 3D representativo do nicho subendosteal humano de HSC, células-tronco mesenquimais (MSC) de MO humana, induzidas para a linhagem osteogênica, foram cultivadas como agregados esféricos (esferóides) sobre os quais MSC não induzidas foram distribuídas, formando esferóides mistos com populações segregadas. O padrão de matriz extracelular foi semelhante ao observado in vivo, com colágeno I exclusivamente na região central de pré-osteoblastos. Células CD34+ de sangue de cordão (SC) ou de MO foram co-cultivadas e migraram para o interior dos esferóides, atingindo um platô em 24h, que se deveu a uma circulação contínua destas células. Elas localizaram-se na interface das duas populações e um maior percentual de células em quiescência foi observado.
Portanto, o modelo de esferóide misto é representativo do nicho subendosteal de HSC, orientando sua migração e mantendo a quiescência.
ABSTRACT
The maintenance of hematopoietic stem cells (HSC) depends of a tridimensional bone marrow (BM) microenvironment. In order to establish a 3D in vitro model that mimics the human HSC subendosteal niche, osteoblastic induced BM mesenchymal stem cells (MSC) were cultured as spheroid aggregates and non-induced MSC were plated onto these cell aggregates, forming mixed spheroids with both populations segregated. The extracellular matrix pattern was similar to what is described in vivo, with collagen I synthesis exclusively in the pre-osteoblast central region. Cord blood (CB) or BM CD34+ cells were co-cultured and migrated into the spheroids reaching a plateau at 24h that was due to a continuous circulation of these cells. They localized at the interface between the two layers and a higher percentage of quiescent cells were observed. Therefore, the mixed spheroid model mimics the HSC subendosteal niche, guiding the HSC migration and maintaining them quiescent.
Lista de Abreviaturas
2D Bidimensional 3D Tridimensional 5-FU Fluorouracil
AGM/PAE Aorta-Gonada-Mesonefrons/Para-Aorta-Esplancnopleura Ang-1 Angiopoietina-1
BMP-4 Bone Morphogenetic Protein-4 BSA Éster albumina sérica bovina BSS Balanced Saline Solution
BSS.CMF Balanced Saline Solution. Calcium and Magnesium Free CFSE 5-(e 6-)-carboxifluoresceína diacetato succinil
CFU-e Colony Forming Unit-Erithrocyte CFU-F Colony Forming Unit-Fibroblast
CFU-GM Colony Forming Unit-Granulocyte Macrophage CFU-S Colony Forming Unit-Spleen
CM-DiI Cell TrackerTM Chloromethylbenzamido FACs Fluorescence Activated Cell Sorter FAKs Focal Adhesion Kinasis
FGF-4 Fibroblast Growth Factor-4 FITC Fluorescein Isothiocyanate GAGs Glicosaminoglicanos
HA/TCP Hidroxiapatita / tricálcio fosfato HSC Célula Tronco Hematopoética Ig Imunoglobulina
LT-HSC Long Term-Hematopoietic Stem Cell MCTS Multicellular Tumor Spheroids
MEC Matriz Extracelular MMPs Metaloproteinases
MO Medula Óssea
MSC Célula Tronco Mesenquimal NCI National Cancer Institute
NOD/SCID Non-Obese Diabetes Severe Combined Immunodeficient mice
OP Osteopontina
PBS Phosphate Buffered Solution
PE Phyco-Eritryn
PTx Toxina Pertussis Sca-1 Stem Cell Antigen-1 SCF Stem Cell Factor
SDF-1 Stromal Derived Factor-1 SFB Soro Fetal Bovino
Shh Sonic Hedgehog
SLAM Signaling Lymphocyte Activation Molecule ST-HSC Short Term-Hematopoietic Stem Cell VCAM Vascular Cell Adhesion Molecule VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 VLA Very Late Antigen
1. Introdução
1.1. Hematopoese e Microambiente Medular
A hematopoese é o processo de formação de todas as células sanguíneas, compreendendo as populações mielóides, linfóides e progenitores em diversos níveis de comprometimento com estas linhagens (Dorshkind, 1990). Todas as células hematopoéticas derivam de uma única célula, a célula- tronco hematopoética (HSC, hematopoietic stem cell), caracterizada por sua capacidade de auto-renovação ilimitada e de diferenciação para as várias linhagens hematopoéticas (Kondo et al., 2003).
Durante o desenvolvimento embrionário a formação de células sanguíneas se divide em duas fases: hematopoese primária e secundária (Godin e Cumano, 2002). A hematopoese primária é o primeiro momento de surgimento de células hematopoéticas, no qual apenas ilhotas de eritrócitos são produzidas no saco vitelino, isso ocorre por volta do dia 7,5 no desenvolvimento murino, e, embora ainda possa existir algum questionamento sobre se este surto inicial contribui ou não para a hematopoese definitiva (Kumaravelu et al., 2002), há uma forte tendência na literatura de acreditar que a hematopoese do saco vitelino seja transitória (Godin e Cumano, 2002;
Göthert et al., 2005).
A hematopoese secundária se origina na região Aorta-Gonada- Mesonefrons/Para-Aorta-Esplancnopleura (AGM/PAE) por volta do dia 10,5 no desenvolvimento murino ou 30º dia de desenvolvimento em humanos, e ela dá origem a todas as linhagens hematopoéticas, eritrócitos, granulócitos, linfócitos e plaquetas, e é neste momento que a HSC definitiva surgiria (revisado em Godin e Cumano, 2002; Dazzi et al., 2006). Nos momentos seguintes existe uma transferência do sítio de hematopoese através da migração da HSC para outros órgãos ao longo do desenvolvimento, nos quais encontra um nicho apropriado que sustente a hematopoese. Primeiro há transferência para o fígado fetal (10,5-12 dias de desenvolvimento murino), em seguida para o timo, baço, omento e medula óssea (MO) (14-16 dias de desenvolvimento murino).
Após a colonização da MO há diminuição na produção de células
hematopoéticas nos demais órgãos e 4 dias após o nascimento a medula se torna o órgão hematopoético preferencial (Godin et al., 1999; Tada et al., 2006). Esta transição dos sítios de hematopoese durante a vida fetal é dita ser regulada por mudanças no microambiente, que criam ambientes mais atraentes para a manutenção da hematopoese e, condizente com isto, em 2006, Tada e colaboradores demonstraram que a mudança de sítio de hematopoese é precedida por uma mudança na observação de co-localização do par VCAM- 1/fibronectina. Segundo estes autores, a hematopoese sempre ocorre em órgãos que apresentam esta co-localização e nos momentos de transição há perda desta co-localização no órgão abandonado, quando as moléculas passam a ser expressas em regiões espacialmente isoladas. No entanto, a migração específica das HSC para a MO durante o desenvolvimento embrionário parece depender da quimiocina SDF-1α/CXCL12, pois este processo é severamente inibido em camundongos SDF1-/- (Ara et al., 2003).
As HSC murinas foram caracterizadas pela expressão de c-Kit e Sca-1 (stem cell antigen-1) e ausência de antígenos específicos das linhagens hematopoéticas (Lin-), células KSL (Morrison et al., 1995). Já as HSC humanas têm sido identificadas pela expressão da glicofosfoproteína CD34, que se acredita ser uma molécula de adesão. A fração CD34+ da MO humana constitui uma população heterogênea e representa cerca de 1,5% das células mononucleares (Krause et al., 1996). A subpopulação de células CD34+ que não expressa CD38 (CD34+CD38-) é enriquecida em HSC, sendo capaz de reconstituir a hematopoese de hospedeiros imunodeprimidos, como os camundongos NOD/SCID (Civin et al., 1996).
A hematopoese é um processo hierárquico e ordenado onde as células- tronco de longa duração (LT-HSC, Long Term-Hematopoietic Stem Cell) dão origem a células iguais a si (auto-renovação) e a progenitores altamente proliferativos de curta duração que vão sucessivamente perdendo a capacidade de auto-renovação, dando origem a HSC capazes somente de reconstituir transitoriamente a hematopoese (ST-HSC, Short Term- Hematopoietic Stem Cell) e progenitores multipotentes que progressivamente
perdem o potencial de diferenciação, se comprometendo com determinada linhagem hematopoética (Kondo et al., 2003). A manutenção da propriedade de célula-tronco só é possível devido à manutenção de um pool de HSC em estado quiescente, evitando assim que a cada ciclo celular ocorra encurtamento dos telômeros (seqüência protetora do genoma). Este encurtamento de telômeros evidencia o envelhecimento celular pois gera um número fixo de ciclos ao longo da vida de uma célula. As HSC possuem alto potencial replicativo, logo devem ser mantidas quiescentes prevenindo encurtamento de telômeros e mantendo sua capacidade de reconstituição de da hematopoese (Suda et al., 2005).
As HSC possuem desta forma uma impressionante tarefa, originar todas as diferentes linhagens hematopoéticas e manter um pool de progenitores quiescentes. Acredita-se que ela realiza esta tarefa através de decisões binárias que vão progressivamente restringindo a possibilidade de fenótipos finais, ou seja, as decisões não são realizadas apenas na HSC e conforme a célula hematopoética prossegue na cascata, as decisões ficam “marcadas”.
Existe uma pequena plasticidade principalmente nos progenitores mais jovens, porém, quanto mais avançadas na cascata, menor a chance de retorno, culminando com um fenótipo diferenciado irreversível (Kondo et al., 2003). Esta restrição progressiva se dá no contexto celular interno e é fundamental na decisão do destino celular. Por contexto interno refere-se principalmente à organização da cromatina. A cada decisão realizada ao longo do processo de diferenciação a cromatina é modificada, podendo sofrer metilação, fosforilação, acetilação ou retirada desses radicais, de forma que sua organização espacial se torna menos ou mais acessível a determinados fatores, mudando assim a capacidade de resposta da célula hematopoética ao seu ambiente externo (Berger, 2000).
No caso do sistema hematopoético um grande regulador do estado da cromatina é IKAROS, subunidade de um complexo chamado NURD que deacetila histonas. IKAROS é fundamental na embriogênese, durante a formação do sistema hematopoético, sendo expresso tanto na região de
hematopoese primitiva, saco vitelino, quanto em áreas de hematopoese definitiva como fígado fetal. Em adultos, ainda há a expressão de IKAROS em populações da MO enriquecidas em HSC e linfócitos. Estudos com camundongos nocautes para IKAROS mostraram que este é fundamental na manutenção do pool de HSC e na linfopoese B e T, bloqueando a diferenciação mielóide, pois impede a acetilação da cromatina (Georgopoulos, 2002).
Quanto a conformação de cromatina, na manutenção da auto- renovação, uma família de possíveis fatores relevantes são os repressores da família PcG que formam multicomplexos que interagem com a cromatina, existem 2 tipos de complexos, o Eed possuí atividade enzimática de acetilação e metilação, enquanto o Bmi-1 antagonizam o remodelamento efetuado pelo complexo SWI-SNF (Iwama et al., 2004). Em 2004, pode-se entender melhor o papel de Bmi-1 na hematopoese, observou-se que células KLS de animais nocautes para Bmi-1 apresentavam uma redução no número e tamanho de colônias mulitinhagem que formavam em ensaios de colônia, apresentando uma diferenciação limitada (apenas neutrófilos e macrófagos) com perda acelerada de potencial de diferenciação e expansão ineficiente de progenitores.
Em seguida, estudando a superexpressão de Bmi-1, observou-se um aumento de 56-80 vezes no número de colônias multilinhagem, demonstrando a retenção do potencial de diferenciação em diversas linhagens, estas células quando transplantadas apresentaram um enorme potencial de repopulação, 35 vezes maior que o controle, colocando desta forma Bmi-1 como um dos responsáveis downstream importantes para auto-renovação, reprimindo modificações na cromatina (Iwama et al., 2004).
Para a existência de uma hematopoese funcional há a necessidade da formação de células diferenciadas com simultânea manutenção do pool de progenitores. Para isso, além do impedimento da diferenciação, também é necessário um controle da divisão celular que permita formar células-filhas que dêem origem a células hematopoéticas funcionais e outras que mantenham o pool multipotente indiferenciado. Existem duas possibilidades de divisão celular que explicariam tal fenômeno, a primeira é a divisão simétrica na qual a célula
mãe daria origem a duas células-filhas idênticas entre si, sejam elas idênticas a célula mãe (auto-renovação) ou dois progenitores multipotentes sem capacidade de auto-renovação. Neste caso haveria a necessidade da coordenação destas duas possibilidades para manter o pool de células-tronco.
A segunda possibilidade é a divisão assimétrica, a mais aceita, onde a HSC daria origem a uma HSC igual a si (LT-HSC) e a uma célula filha progenitora multipotente com reduzida capacidade de auto-renovação (ST-HSC), que iria então seguir a cascata de proliferação e diferenciação. Isto é possível quando o eixo da mitose se modifica de forma que uma das células filhas sofre influencia de um outro nicho que não o da célula mãe (assimetria ambiental) ou se previamente à divisão celular a célula-mãe reorganiza um grupo de mediadores de sinalização (proteínas ou RNA) apresentando-os em uma localização assimétrica no citoplasma de forma que após a divisão as células filhas herdam diferentes componentes (assimetria seccional). Este processo foi bem descrito durante o desenvolvimento embrionário principalmente de drosófilas (Brummendorf et al, 1999; revisado em Fuchs et. al., 2004), mas acredita-se que em mamíferos a divisão assimétrica das HSC se deva a uma assimetria ambiental (Ho , 2005).
Em adultos, toda essa cascata de diferenciação ocorre na MO de forma organizada espacial e hierarquicamente, sendo que a HSC quiescente se localiza na região subendosteal (Calvi et al., 2003; Nilsson et al., 2001; Zhang et al., 2003) e conforme esta segue pela cascata de diferenciação há deslocamento em direção aos seios venosos centrais, região rica em populações em estado final de diferenciação que então atravessam o endotélio atingindo finalmente a corrente sanguínea (Fig.1) (Kondo et al., 2003;
Taichman et al., 2005). Ao longo deste trajeto existem nichos para cada estágio de desenvolvimento (Schofield, 1978). Estes nichos são compostos pela interação dos progenitores hematopoéticos com as células do estroma medular, a matriz extracelular e fatores de crescimento, que geram sinalização intracelular e estabelecem determinado comportamento/fenótipo celular (Nilsson et al., 1997; Reya et al., 2001; Taichman et al., 2005).
Figura 1. Nicho subendosteal e cascata de diferenciação restritiva hematopoética.
Esquema mostra a organização espacial das células em diferenciação, com as populações mais diferenciadas mais próximas da região central da medula. Em detalhe, imagem por microscopia confocal das células-tronco hematopoéticas humanas transplantadas, em amarelo, localizadas no nicho subendosteal de camundongos NOD/SCID irradiados, entre o osso e células mesenquimais derivadas de MO humana previamente implantadas na cavidade medular, em verde. Núcleos em azul. (Montagem a partir de Taichman, 2005; Muguruma et al., 2006).
O estroma da MO é heterogêneo e inclui células reticulares (progenitoras mesenquimais e adventícias), osteoblastos, células acumuladoras de gordura, endotélio e células de origem hematopoética, como macrófagos (Fig.2). Os principais componentes da matriz extracelular da MO são colágeno tipo I (osso trabecular), tipo IV, proteoglicanos (ex: heparan sulfato), glicosaminoglicanos (ex:ácido hialurônico), fibronectina e laminina (na cavidade medular) (Weiss et al., 1984; Friedenstein et al., 1976; Pittenger et al., 1999; Nilsson et al., 1998). Acredita-se que o microambiente tenha papel fundamental na regulação das funções celulares uma vez que as células interagem entre si e com a matriz, através de uma série de moléculas de
adesão, e essas inter-relações geram sinais intracelulares que alteram os padrões de expressão gênica em ambas as populações, levando assim a geração de nichos específicos, responsáveis pelo controle da quiescência, proliferação e diferenciação dos progenitores hematopoéticos (Nilsson et al., 2001; Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003).
Figura 2. Os diferentes tipos celulares que compõem o estroma da MO, reparar que estes se encontram entre grande número de células hematopoéticas (Fonte: Greep e Weiss, 1973).
1.1.1. Células-tronco mesenquimais e organização do microambiente hematopoético
Os trabalhos pioneiros de Friedenstein (1976), demonstrando a presença, na MO, de uma população de células aderentes fibroblastóides clonogênicas, denominadas unidades formadoras de colônias de fibroblasto (CFU-F, Fibroblast-colony forming unit), sugeriram a hipótese, confirmada posteriormente, de que o estroma da medula também seria dependente de uma população de células-tronco quiescentes e multipotentes que geraria progenitores comprometidos com as diferentes linhagens celulares que
compõem o estroma medular. Esta população tem sido denominada, na literatura, de células-tronco mesenquimais (MSC, mesenchymal stem cells) ou células-tronco estromais da MO (revisado em Bianco et al., 2001 e Minguell et al., 2001).
As MSC representam 0,01-0,0001% das células nucleadas na MO, porém possuem um papel fundamental na hematopoese já que dão origem às células que constituem grande parte do nicho hematopoético. Por ser um progenitor pluripotente é capaz de originar todas as populações celulares do sistema músculo-esquelético (células musculares, osteoblastos e condroblastos) e alguns grupos discutem até mesmo seu potencial de originar populações não mesodérmicas como neurônios e hepatócitos (Pittenger et al., 1999; Kopen et al., 1999; Sato et al., 2005).
Recentemente, Miura e colaboradores produziram um ossículo ectópico no dorso de camundongos, utilizando cerâmica em pó (hidroxiapatita associada a fosfato de cálcio, HA/TCP) e MSC humanas expandidas em cultura.
Observou-se, após 8 semanas, a formação de um ossículo apresentando uma MO organizada e funcional, ao contrário de quando eram colocadas MSC induzidas para a via osteogênica por 2 semanas ou osteoblastos trabeculares, quando só era formado osso. A análise das populações presentes mostrou que as populações mesenquimais eram humanas e as populações hematopoéticas eram do receptor murino. Além disso, a utilização das células hematopoéticas retiradas da MO do ossículo em transplante para camudongo imunodeficiente mostrou que elas tinham a mesma capacidade de pega e sustentação de hematopoese que o controle de células de MO do fêmur, ou seja, o ossículo sustentava a LT-HSC (Miura et al., 2006). Estes achados estenderam os resultados obtidos anteriormente pelo mesmo grupo e confirmaram a propriedade primordial e exclusiva das MSC da MO de organizar um microambiente hematopoético, uma vez que MSC de ligamento dentário não foram capazes de formar tecido hematopoético quando injetadas, com HA/TCP, no subcutâneo de camundongos imunodeprimidos (Shi et al., 2005).
Apesar de existirem diversos grupos estudando esta população celular mesenquimal, ainda não se tem descrito um marcador ou grupo de marcadores imunofenotípicos satisfatórios para identificá-la (Dazzi et al., 2006). As MSC da MO têm sido isoladas com base em sua propriedade de adesão ao plástico, capacidade de se diferenciar nas três linhagens mesodérmicas (osteoblasto, condrócito e adipócito) e ausência de marcadores de células hematopoéticas, como CD45, CD14 e CD34 (Dominici et al., 2006). Diversos grupos têm demonstrado sua localização na parede de vasos, estando relacionada com os chamados pericitos. Um dos trabalhos mais marcantes mostrou que células Stro-1+ isoladas imuno-magneticamente de culturas de MSC humanas se mostraram positivas para α-actina de músculo liso e CD146 (que é expressom por pericitos) e quando transplantadas com HA/TCP no dorso de camundongos construíam um ossículo ectópico com MO funcional, mostrando assim que células com fenótipo condizente com o de pericitos teriam propriedades de MSC (Bianco et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003). Em 2006, um trabalho foi publicado com o objetivo de obter culturas de longa duração de células mesenquimais de diferentes órgãos, baseadas no principio de adesão ao plástico. E foi observado que todos os órgão de camundongos adultos possuíam tais células, com capacidade de diferenciação para osso e adipócitos, porém com diferenças na eficiência de diferenciação dependendo do órgão obtido. Os autores então testaram se estas células estaria associadas a vasos sanguíneos, comuns a todos os órgãos. Foram testadas células obtidas de glomérulo (estrutura capilar) e artéria aorta (vaso de grande calibre) e em ambos os casos houve diferenciação para as linhagens mesenquimais testadas, ou seja, as células perivasculares de ambas as estruturas tinham propriedades de MSC (Silva-Meirelles et al., 2006).
1.2. Migração na MO
A MO é um órgão muito dinâmico, pois as células hematopoéticas migram intensamente. Além da migração durante o processo de diferenciação, as HSC freqüentemente saem da medula para o sangue periférico, sendo capazes de retornar e ocupar seus nichos na região subendosteal. Logo, as HSC circulam, mesmo em condições fisiológicas (Wright et al., 2001).
A principal via de migração para a medula é pelos seios venosos da região central desta (Nilsson et al., 2001) e a migração para o microambiente medular envolveria quatro etapas básicas: rolamento sobre o endotélio, migração transendotelial, migração transmedular e fixação em seu nicho (Fig.3) (revisado por Nilsson et al., 2006). Os mecanismos envolvidos neste processo ainda não foram completamente esclarecidos. A célula progenitora interage com o endotélio via selectinas-P, selectina-E e VLA-4 com conseqüente adesão superficial e sucessivo rolamento sobre o endotélio, facilitando o encontro com gradientes quimiotáticos (Alon et al., 1995; Hidalgo e Frenette, 2004). Este gradiente quimiotático é formado principalmente pela produção da quimiocina SDF-1α pelas células estromais da MO (Nilsson et al., 2001; Sanz- Rodriguez et al., 2001; Teixido et al., 1992). A interação com seu receptor, CXCR-4, expresso pelos progenitores hematopoéticos, gera um aumento, nestes, da afinidade dos pares LFA-1/ICAM1, VLA-5/fibronectina e da expressão e afinidade da integrina VLA-4 para VCAM1 e fibronectina, estimulando, assim, a adesão celular e a migração transendotelial e ecotaxia (homing) (Peled et al., 2000; Sanz-Rodriguez et al., 2001). O par SDF- 1α /CXCR4 deve ser mantido em estado ativado nas células hematopoéticas na MO para que estas fiquem retidas em seus nichos, pois a interrupção desta ativação, por exemplo, através de tratamento com toxina pertussis (Ptx) que bloqueia a proteína Gi associada a CXCR4, gera uma forte leucocitose e mobilização das HSC para o sangue periférico (Papayannopoulou et al., 2003).
A importância de integrinas β1, principalmente VLA-4, no processo de migração das HSC para a MO tem sido defendida por diversos grupos de pesquisadores uma vez que foi demonstrado que: (i) camundongos deficientes nesta molécula não apresentam migração para a medula após transplante de HSC; (ii) a administração de anticorpo anti-VLA-4 induz mobilização de HSC; e (iii) o papel de VLA4 é dominante em relação a outras integrinas (Papayannopoulou et al., 1993 e 2001; Vermeulen et al., 1998; Potocnik et al., 2000). Outra interação importante cujo bloqueio por anticorpos neutralizadores desencadeia mobilização é a do par CD44/ácido hialurônico (Vermeulen et al.,
1998), um par bastante interessante tendo em vista a grande presença de ácido hialurônico nas rotas migratórias durante todo o desenvolvimento do embrião, devido a sua capacidade de criar um ambiente pericelular hidratado permissivo a migração (Toole et al., 1997).
Outros membros da família α de integrinas como α5 e α6 associando-se a β1 integrina também parecem estar envolvidos na migração de HSC, porém com papel secundário, através de interação com fibronectina e laminina, respectivamente, mas suas contribuições não são um consenso entre os grupos (Carstanjen et al., 2005; Qian et al., 2006).
Figura 3. Homing da HSC para a MO, seguindo suas quatro etapas básicas:
rolamento sobre o endotélio (1), migração transendotelial, (2) migração transmedular (3) e fixação em seu nicho (4) (Nilsson et al., 2006).
No entanto, em 2002 um estudo de migração de progenitores hematopoéticos em cultura 3D de estroma de MO murina levantou algumas questões em relação aos mecanismos já descritos (Bug et al., 2002). Neste estudo observou-se que a migração era dependente de Rho, Rac e cdc42 (família Rho de pequenas GTPases) e independente de integrinas α4, α5, β1, β2 ou de CXCR4. Em acordo com o descrito, Soede e colaboradores (2000) haviam observado que uma linhagem de leucemia mieloide murina, que não expressa CXCR4 e, portanto, não responde ao SDF-1α (CXCL12) , se disseminava normalmente in vivo. Além disso, outros autores observaram que a deleção de α4 ou α5 integrinas não foi capaz de bloquear a migração de
progenitores hematopoéticos para a MO (Kondo et al., 2003). A importância da família Rho de pequenas GTPases já foi confirmada in vivo, pois não só as células de camundongos nocautes para Rac1 são incapazes de reconstituir a hematopoese medular de camundongos irradiados, como esses animais apresentam enorme déficit na migração fisiológica para a medula e a região subendosteal (Cancelas et al., 2005).
Ainda não foi descrita a dinâmica de funcionamento dessas diferentes moléculas de adesão e quimiocinas durante o processo migratório, porém Bonig e colaboradores em 2006 demonstraram em modelo murino duas vias compensatórias de migração, uma dependente da interação α4 integrina/VCAM1 e a outra de CXCR4/SDF-1α. O bloqueio de uma das vias era ineficiente, pois a outra mantinha a taxa de migração. Somente o bloqueio duplo surtia efeito significativo, demonstrando assim a dinâmica e complexidade no processo de migração das HSC (Bonig et al., 2006).
Quanto ao papel das metaloproteases, é sabido que leucócitos utilizam proteases endógenas para degradar componentes das junções endoteliais, o que permitiria a projeção de pseudópodos por entre as células endoteliais e posterior migração (Cepinskas et al., 1999). Embora metaloproteinases (MMPs) pareçam ter papel durante a mobilização de progenitores hematopoéticos para o sangue periférico, acredita-se que essas proteases sejam liberadas por neutrófilos (Papayannopoulou, 2004). O papel de MMPs na migração de progenitores hematopoéticos para a medula é desconhecido. Em 2004, foi demonstrado que células CD34+ de sangue de cordão secretam MMP-9, uma gelatinase que, entre outras moléculas, degrada colágeno IV. Curiosamente, não foi observada expressão de MMP-9 em células CD34 de MO, que também apresentaram menor eficiência de migração em comparação com células de sangue de cordão em ensaios transwell, sendo assim os autores propuseram que esta enzima poderia ter papel importante no homing (Rao et al., 2004b).
A mobilização das HSCs de seu nicho na MO para a circulação, classicamente induzida por tratamento com fator estimulador de colônias de
granulócitos (G-CSF, granulocyte-colony stimulating factor), parece depender da modificação do gradiente de SDF-1α, tanto por diminuição de expressão quanto pela clivagem por proteases (elastase, catepsina G, catepsina K e CD26) (Petit et al., 2002; Christopherson et al., 2003; revisado por Lapidot et al.,2005), nestes trabalhos a capacidade das células propriamente ditas ou seus sobrenadantes de clivar SDF-1 foi testada, em ensaios de cultivo com substrato cromogênico ou até isolamento de fragmentos protéicos por HPLC e análise por espectrometria de massa, verificando a presença e caracterizando os fragmentos, desta forma verificou-se que SDF-1 é clivado no seu domínio N-terminal perdendo sua atividade. Sendo que, elastase e catepsina G também são capazes de clivar CXCR4 (Lapidot et al.,2005). Posteriormente, ensaios de migração ou homing demonstraram o efeito funcional sobre a célula, por exemplo foi observado que a inibição de CD26 aumenta em 30% o homing de HSC murinas para a medula do receptor. Ensaios com CD34 humana em condições de inibição de CD26 mostraram aumento da migração destas em gradiente de SDF-1 (Christopherson et al., 2003; Lapidot et al.,2005) . Porém, existem outros mecanismos, como a já mencionada atividade de metaloproteinases, também parecem ter papel relevante na modulação da migração das HSCs, embora ainda não completamente esclarecidos em humanos (Lapidot e Petit, 2002; Papayannopoulou, 2004; Rossi et al., 2005).
Em 2006, Katayama e colaboradores demonstraram a importância do Sistema Nervoso Simpático (SNS) na mobilização das HSC. Sua ação parece ser mediada por neurônios noradrenérgicos através da produção de β-antagonistas e β2-agonistas, cujo balanço afeta os osteoblastos que são então modulados, retendo ou liberando as HSC (mobilização). G-CSF induz, entre outros fenômenos, a liberação de β2-agonistas pelos neurônios, que por sua vez suprime a atividade dos osteoblastos, diminuindo a expressão de diversos genes como Runx2, colágeno-I e CXCL-12, esta última sendo responsável pela mobilização das HSC. Desde 2002 já havia sido descrita a presença de receptores de diversos neuropeptídeos em osteoblastos (Togari, 2002).
Este conceito parece inovador, porém já em 1968, Calvo descreveu a presença de fibras nervosas na MO e, em 1990, Yamazaki e Allen
descreveram os chamados complexos neuro-reticulares através de estudos ultraestruturais que seriam junções comunicantes entre neurônios e células do estroma da medula, porém nenhuma função, naquela ocasião, foi atribuída a esta interação. Até que ponto o SNS estaria modulando o comportamento dos osteoblastos e células estromais que participam da manutenção das HSC permanece um mistério. No entanto, como N-caderina, uma molécula de adesão expressa em neurônios, é também expressa na subpopulação de células que reveste internamente as trabéculas ósseas, as bone-lining cells (Zhang et al., 2003), que são células estromais comprometidas com a linhagem osteoblástica (Balduíno et al., 2005) e que são capazes de interagir com as HSC, suspeita-se que esta subpopulação seja selecionada e ativada por neurônios dentre os demais osteoblastos. Este, portanto é um campo bastante interessante que deve se desenvolver nesses próximos anos (Li et al., 2006).
Também em 2006, Kollet e colaboradores demonstraram a influência de osteoclastos na mobilização de HSC. A administração de RANKL gerou um quadro de osteoclastogênese, com aumento de expressão de proteases como MMP-9 e catepsina K, levando a mobilização das HSC. Em camundongos transgênicos para a proteína tirosina fosfatase,epsilon (PTPε), que apresentam osteoclastos e macrófagos não funcionais, observou-se que a administração de RANKL não era mais capaz de induzir mobilização, demonstrando assim a importância direta dos osteoclastos no processo. Como a produção de RANKL está relacionada com inflamação e reparo tecidual, foi sugerido este pode ser um mecanismo de mobilização para situações de emergência (Purton e Scadden, 2006).
A migração espontânea das HSCs tem aplicação clínica e pode ser amplificada pela utilização de fatores de crescimento associados ou não a drogas citorredutoras. O conhecimento dos mecanismos envolvidos na mobilização das HSCs da MO para o sangue periférico tem grande importância na clínica, pois cerca de 20% dos pacientes apresentam mobilização insuficiente, o que compromete o resgate hematológico pós-quimioterapia de altas doses (Knudsen et al., 1998).
A capacidade de migração para a MO de diferentes fontes de HSC varia.
Assim, enquanto as células progenitoras de sangue periférico mobilizado e sangue de cordão umbilical migram rapidamente para a MO, as células derivadas de MO parecem apresentar menor capacidade de migração. No caso das células progenitoras de sangue periférico, esta capacidade se reflete na prática clínica, onde se observa rápido enxerto e recuperação precoce da hematopoese (Bonig et al, 2006). Entre as hipóteses propostas para explicar estas diferenças funcionais, recentemente, verificou-se que CXCR4, o receptor da quimiocina SDF-1α, que faz parte dos receptores do tipo serpentina associados à proteína G, pode ser incorporado em microdomínios de membrana enriquecidos em gangliosídios (GEMs) ou rafts lipídicos, o que, em HSC, potencializa a migração para a MO. Esta associação de CXCR4 em microdomínios de membrana pode ser estimulada por microvesículas ou produtos de plaqueta, presentes na leucaférese (Wysoczynski et al., 2005).
1.3. O Nicho Subendosteal
As células hematopoéticas migram pela MO em busca de seus nichos, no caso das HSC, o seu nicho específico é na região subendosteal. A região subendosteal apresenta, além da camada de osteoblastos, uma camada de células reticulares subendosteais e osteoclastos, que não formam uma camada celular, mas que se encontram esparsamente dispostos ao longo do endósteo, em sítios de reabsorção óssea (Balduíno et al., 2005; Rossi et al., 2005;
Muguruma et al, 2006; Purton e Scadden, 2006). A ligação com este nicho é fundamental para a manutenção da quiescência e a auto-renovação das HSC, mas, na verdade, ela parece ser bem mais complexa e dinâmica do que previamente pensado e é possível imaginar que isto afete a formação dos nichos de HSC, modificando a migração e a auto-renovação destas. Células da linhagem osteogênica (bone lining cells), que se encontram em diferentes graus de ativação, recobrem a superfície interna do osso compacto e a superfície do osso trabecular. O pólo basal está aderido firmemente à superfície óssea, enquanto o lado apical interage com as células do sistema hematopoético, especialmente com as HSC (Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003). As características e a função das células reticulares subendosteais são pouco conhecidas, pois, em geral, não há uma distinção muito clara entre estas e as demais células reticulares que constituem o estroma medular. Só recentemente, trabalhos experimentais com infusão de MSC de MO na cavidade medular mostraram a localização destas na região subendosteal, em íntimo contato com as HSC (Muguruma et al., 2006).
Não está bem claro que fatores, presentes nesta região, a tornam tão especial, porém sabe-se que os osteoblastos são fundamentais na regulação do pool de HSC (Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003). Experimentos com linhagens osteoblásticas capazes de sustentar hematopoese apontam para a necessidade de contato físico entre as células, pois meio condicionado não tem o mesmo efeito sobre progenitores hematopoéticos (Nelissen et al., 2000).
Alguns trabalhos têm indicado diversas interações moleculares realizadas entre HSC e células deste nicho que poderiam ser responsáveis por sua localização, controle de quiescência e auto-renovação.
1.3.1. Ancoragem e quiescência
A ancoragem das HSC ao nicho subendosteal parece ser intermediada por receptores dependentes de cálcio, íon abundante na parede óssea (Adams et al., 2006), interações do tipo osteopontina/β1 integrinas (Nilsson et al., 2005), a forma transmembranar do fator de células-tronco (tm-SCF, Stem Cell Factor) e seu receptor, c-kit, expresso pelas HSC (Driessen et al., 2003), Angiopoietina-1/Tie-2 (Arai et al., 2004) e co-localização de N-caderina (Zhang et al., 2003).
O papel de Ca2+ e de tm-SCF na localização das HSC no nicho subendosteal foi demonstrado em modelos murinos. Observou-se que a ausência tanto do receptor de Ca2+ nas HSC (Adams et al., 2006), quanto de tm-SCF no microambiente medular (Driessen et al., 2003), não afeta a migração para a medula (a migração transendotelial e transmedular ocorrem normalmente), porém não há localização das HSC no nicho subendosteal, mostrando assim que essas moléculas regulam especificamente a ancoragem das HSC. As vias que, ativadas, seriam responsáveis por esta localização específica ainda não estão descritas. Porém, Cancellas e colaboradores, em 2005, demonstraram que camundongos nocautes condicionais para Rac1 apresentavam deficiência na localização das HSC no nicho subendosteal, sem alterações significativas na migração para a medula nem na manutenção da hematopoese em condições fisiológicas, mostrando assim que esta via estaria fortemente relacionada com a localização das HSC no seu nicho (Cancelas et al., 2005).
A Osteopontina (OP) é uma glicoproteína fosforilada que, na MO, se localiza preferencialmente na superfície endosteal, é secretada por osteoblastos e fica preferencialmente ligada a elementos da matriz extracelular.
O papel desta molécula na localização das HSC no nicho subendosteal ficou evidente pela distribuição marcantemente aberrante das HSC na MO de camundongos OP-/-. Verificou-se que as HSC aderem especificamente à OP, principalmente via β1-integrinas, apesar de existirem outros ligantes possíveis
como CD44, αvβ3, αvβ5 e α4β7 (Nilsson et al., 2005) e, ainda, que OP reduz sua proliferação (Nilsson et al., 2005; Haylock e Nilsson, 2006) e apoptose, ao mesmo tempo que aumenta o seu número no nicho subendosteal (Haylock e Nilsson, 2006; Stier et al., 2005). A via de sinalização de OP ainda não foi descrita, porém já foi demonstrado que ela induz, em células CD34+ mobilizadas de sangue periférico, diminuição da expressão de Notch-1 (Haylock e Nilsson, 2006; Iwata et al., 2004), cuja via está relacionada com auto-renovação das HSC (Stier et al., 2005; Karanu et al., 2000; Duncan et al., 2005), como veremos.
O trabalho de Arai e colaboradores, em 2004, mostrou não somente a localização específica de Ang-1 no nicho subendosteal, como também a presença de HSC Tie-2+, receptor de Ang-1, que expressavam ainda N- caderina e eram capazes de reter BrdU por longos períodos, um fenótipo idêntico ao de HSC quiescentes descrito por Zhang e colaboradores em 2003.
Estes achados sugerem que a interação Ang-1/Tie2 seria não somente importante para a ancoragem das HSC no seu nicho, mas também para indução de quiescência (Arai et al., 2004).
As vias de sinalização por trás do processo de quiescencia ainda não estão totalmente elucidadas, porém existem dois mecanismos possíveis já descritos para Tie-2. O primeiro é direto e baseado na propriedade de Tie-2 como um receptor tirosina cinase, que desta forma poderia, uma vez ativado através da ligação com Ang-1, ativar a via de Pi3-k (fosfatidil inositol-3 cinase)/Akt. Akt, por sua vez, tem como um de seus alvos p21, proteína esta fundamental no controle de ciclo celular, levando a estabilização desta e possivelmente inibindo a continuação do ciclo celular. A outra possibilidade é uma ação indireta de Tie-2 devido a sua ação estimuladora dos níveis de expressão de β1-integrina e N-caderina, também via Akt (Arboleda et al., 2003) e, consequentemente, aumentando a adesão celular (Suda et al., 2005).
Deve-se lembrar que β1-integrina é o ligante de osteopontina que já teve sua ação na indução de quiescencia comprovada (Nilsson et al., 2005) e que
N-caderina é um dos marcadores no nicho subendosteal das bone-lining cells, que interagem com as HSC (Zhang et al., 2003).
A presença de N-caderina no nicho subendosteal, intermediando a ligação das HSC com os osteoblastos que revestem o osso trabecular, pode ter um significado direto na regulação do comportamento das HSC. A N-caderina, através de interação homotípica, forma junções aderentes, onde β-catenina se liga à porção citoplasmática da molécula de caderina e se associa também com α-catenina e α-actina, formando um complexo estável com o citoesqueleto.
Nesta conformação a β-catenina fica aprisionada, impossibilitada de se translocar para o núcleo e consequentemente ativar a via canônica de Wnt (Fig.4) (Shoval et al., 2007). Logo, pode-se levantar a hipótese de que a presença de N-caderina esteja diretamente relacionada com o bloqueio da via de Wnt e que isto seja importante na quiescencia da célula, já que a via de Wnt parece ser importante no processo de expansão das HSC (Reya et al., 2003), como veremos.
Além disso, a organização da membrana celular também parece se correlacionar com o estado de quiescência das HSC. Foi demonstrado que as HSC quiescentes murinas (população KSL) não apresentam microdomínios (rafts) lipídicos de membrana plasmática, ao contrário de progenitores proliferativos e HSC estimuladas por citocinas. Curiosamente, se as HSC forem mantidas em 2-β-mercaptoetanol, um inibidor da formação de rafts lipidicos, é possível mantê-las ex vivo em estado quiescente por até 5 dias, com viabilidade de 50%. Esta população multipotente foi capaz de se auto-renovar, pois, após transplante, deu origem a hematopoese de longo prazo em camundongos irradiados (Yamazaki et al., 2006).
Figura 4. Esquema da via de Wnt. A β-catenina pode estar associada a membrana ligada a complexo de caderina (seqüestrada) ou livre no citoplasma. No citoplasma ela é rapidamente fosforilada pelo complexo de GSK3β e em seguida degradada via proteassoma. A via de Wnt quando ativada leva ao bloqueio do complexo de GSK3β desta forma mantendo β-catenina livre no citoplasma, neste estado ela é translocada para o núcleo onde se complexa com TCF e induz a expressão de genes alvos da via de wnt.
(Fonte:http://glycoforum.gr.jp/science/word/proteoglycan/PGB04E.html)
Recentemente, Lacorazza e colaboradores identificaram um fator de transcrição MEF/ELF4, que parece ser um regulador de ciclo celular nas HSC.
Em uma série de experimentos in vitro e in vivo, eles demonstraram que a perda de expressão de MEF diminui a taxa de proliferação de HSC estimuladas por citocinas e provoca um acúmulo de células em Go in vivo. A indução de quiescência aumenta a resistência dos animais MEF-/- a agentes mieloablativos e, curiosamente, permite uma recuperação hematopoética mais rápida (Lacorazza et al., 2006), o que sugere que, embora quiescentes em condições fisiológicas, após quimioterapia as HSC MEF-/- são capazes de proliferar rapidamente. Isto implica que diferentes mecanismos e vias regulam a
proliferação das HSC em condições de homeostasia ou de regeneração (Passegué e Wagers, 2006).
1.3.2. Auto-renovação
A auto-renovação é um fenômeno que pode ser dividido em 2 processos: manutenção da célula progenitora indiferenciada e indução de proliferação. Ou seja, a auto-renovação implica na entrada das HSC no ciclo celular sendo assim antagônico a quiescencia. O controle de auto-renovação das HSC, como a maior parte dos fenômenos biológicos, possui na realidade diversos moduladores que conjuntamente produzem o efeito final. Alguns dos suspeitos incluem Notch-1 e sua ligação com seu receptor, Jagged-1 (Stier et al., 2002; Karanu et al., 2000; Duncan et al., 2005), ativação da via canônica de Wnt, ou seja, dependente de β-catenina (Reya et al., 2003; Chiba et al., 2004;
Murdoch et al., 2003), BMP-4 e Sonic Hedgehog (Bhardwaj et al., 2001).
A sinalização por Wnt é uma das mais citadas como responsável pela expansão do pool de HSC (Duncan et al., 2005). Os genes Wnt codificam uma série de glicoproteínas que agem, em geral, como agentes insolúveis, pois se agregam à lipídeos na membrana celular (palmitato), potencializando sua ação devido a concentração da molécula (Cadigan e Nusse, 1997; Willert et al., 2003), alem disso são altamente conservados e agem de forma parácrina ou autócrina, porém como apresentam isolubilidade, agem apenas em regiões de justaposição de membrana (Murdoch et al., 2003 e Cadigan e Nusse, 1997). A família protéica de Wnt possui vários membros e duas possíveis vias de sinalização distintas que podem ser ativadas, via canônica ou não canônica, dependendo do membro da família e do receptor envolvidos. A via canônica, após ligação de Wnt com um receptor frizzled, provoca liberação de β-catenina do citoesqueleto e translocação desta para o núcleo, onde forma um complexo com TCF/LEF originando um fator de transcrição que modula a expressão de diversas moléculas, entre elas ciclina D1 e c-myc (Fig.4) (Mulroy et al., 2002).
Em experimentos com camundongos nocautes condicionais para c-myc foi verificado acúmulo de HSC no nicho subendosteal. Havia, concomitantemente, aumento da expressão de N-caderina e integrinas. Além disso, também foi
verificado que após a divisão das HSC, a célula filha que mantém alta expressão de c-myc e baixa expressão de moléculas de adesão entra em proliferação e diferenciação, sugerindo que c-myc seja fundamental na regulação da saída do nicho subendosteal e expansão do pool (Wilson et al., 2004).
A via não canônica não está tão bem descrita, porém sabe-se que ela envolve ativação de proteína G e fosfolipase C, levando a liberação de cálcio intracelular, e ativação de PKC (Wang e Malbon, 2003).
Análises da expressão de diferentes membros da via de Wnt em tecidos hematopoéticos durante o período fetal murino permitiu a observação de Wnt5a (que utiliza principalmente a via não canônica) e Wnt10b (via canônica) no saco vitelino no dia 11 e no fígado fetal no dia 14, condizente assim com o momento de expansão das HSC. Além disso, os autores estudaram o efeito de meio condicionado enriquecido em Wnt-1, 5a ou 10b no comportamento de HSC isoladas de fígado fetal e observaram uma significativa expansão no número de células e unidades formadoras de colônias, 7, 8 e 11 vezes respectivamente em relação ao controle (Austin et al., 1997).
Trabalhos com progenitores hematopoéticos humanos chegaram a resultados semelhantes. Em ensaios de co-cultura de células CD34 com células estromais de primata transfectadas com Wnt-5a, 2b ou 10b, observou- se expansão do número de células CD34+ e de colônias mielóides de granulócito e macrófago e de eritrócitos (CFU-GM, granulocyte macrophage- colony forming unit e BFU-e, erithrocyte-burst forming unit) em todos os casos (Van Den Berg et al., 1998). Em 2003, o grupo de Weissman, em um belo trabalho demonstrando a contribuição da via canônica de Wnt na auto- renovação de HSC, observou que a transfecção de HSC com gene de β- catenina constitutivamente ativa levava a expansão celular, mantendo sua propriedade de HSC, já que o transplante destas células em camundongos irradiados letalmente levou a reconstituição da hematopoese de longa duração.
O bloqueio de β-catenina diminuiu a proliferação e aumentou a morte celular,
comprovando o efeito da ativação da via canônica de Wnt (Reya et al., 2003).
Curiosamente, em 2004, um grupo do Japão publicou um trabalho contradizendo o trabalho de Weissman. Neste trabalho, eles transfectaram células estromais de MO humana com Wnt5a (via não canônica) ou Wnt3a (via canônica) e analisaram o co-cultivo destas células com células CD34+ de sangue de cordão umbilical. Eles observaram que os co-cultivos com Wnt5a foram responsáveis por um aumento do número de cooblestone (áreas de interação das HSC com o estroma de MO), de células CD34 e de unidades formadoras de colônias (CFC) após 2 semanas, que se mantinha por até 35 dias. Já células transfectadas com Wnt3a induziram efeito parecido com o controle, com exceção de um aumento no número de células CD34+ e de CFC, porém com uma enorme diminuição de cooblestone. Após 35 dias o número de colônias foi menor em relação ao controle, levando-os a sugerir que Wnt3a não seria responsável pela expansão das HSC (Chiba et al., 2004). Neste mesmo ano, Cobas e colaboradores publicaram um trabalho com nocautes condicionais para β-catenina na MO mostrando que a ausência desta não impossibilita a auto-renovação ou a capacidade de formação das linhagens hematopoéticas diferenciadas (Cobas et al., 2004).
A literatura desta forma apresenta incongruências no que diz respeito ao papel de Wnt sobre as HSC, mas um dos pontos mais citados realmente é a importância de Wnt-5a na expansão do pool de HSC. Em 2003 foi publicado um trabalho demonstrando in vivo a importância desta molécula. Neste trabalho, camundongos imunodeficientes irradiados que recebiam injeção intraperitoneal de meio condicionado com Wnt5a em dias alternados por 2 semanas antes do transplante com células humanas CD34+CD38-Lin-, apresentaram, após 14 dias, enxerto de células hematopoéticas humanas, inclusive de células CD34+CD38-, quatro vezes maior que os controles que não receberam Wnt5a. Ensaios funcionais in vitro mostraram que as células da MO de animais tratados com Wnt-5a possuíam um maior número de unidades formadoras de colônia em comparação com o controle, mostrando o papel desta molécula na expansão do pool de progenitores hematopoéticos humanos. Curiosamente, em ensaios com transplantes de HSC murinas
nenhum efeito de Wnt5a foi observado, sugerindo que a regulação de hematopoese por Wnt é espécie-específica (Murdoch et al., 2003).
Sonic Hedgehog (Shh) e BMP-4 têm um papel mais obscuro, porém em 2001 foi relatado que progenitores hematopoéticos de sangue de cordão humano eram expandidos e tinham sua capacidade de repopular a medula de camundongos imunodeficientes ampliada se mantidas em cultura na presença de Shh ou BMP-4. A inativação destas moléculas através de anticorpos neutralizadores contra BMP-4 (noggin) ou Shh induziu, no primeiro caso, inibição do efeito tanto do estímulo por Shh quanto por BMP-4, enquanto no segundo caso apenas o estímulo por Shh foi inibido, demonstrando assim que o efeito de Shh é dependente da via de BMP-4, porém o inverso não é verdadeiro (Bhardwaj et al., 2001).
Notch é uma proteína transmembranar bem conservada, que se ativa quando ligado ao seu receptor Delta ou Jagged. Esta interação leva a clivagem e liberação do fragmento intracelular de Notch, o qual entra no núcleo e forma um complexo com CBF-1, modulando a expressão de uma série de genes alvo (Artavanis-Tsakonas et al.1995). Ele é visto como um dos fatores implicados na auto-renovação das HSC, pois já havia sido observado que sua superexpressão em HSC induzia imortalização, com manutenção da sua capacidade de reconstituição de hematopoese (Varnum-Finney et al., 2000).
Em 2005, Duncan e colaboradores, trabalhando com camundongos transgênicos onde GFP foi associado a CBF-1 (gen Notch reporter), demonstraram que as células GFP+ se localizavam preferencialmente associadas a trabéculas ósseas. Além disso, observaram, na MO, que 68% das células de uma fração enriquecida em HSC (side population) estavam com a via de Notch ativa em comparação com no máximo 12% das células diferenciadas, como linfócitos B e estas ainda apresentavam menor intensidade de expressão de GFP. Quando cultivadas em metilcelulose para análise de unidades formadoras de colônia-, não houve diferença no número de colônias formadas por células KSL GFP+ e KSL GFP-, porém as células GFP+ foram
capazes de formar um maior percentual de colônias multilinhagem, ou seja, mantiveram-se mais indiferenciadas em relação às células GFP-, que não expressavam Notch. Neste mesmo trabalho, usando camundongos transgênicos com duplo reporter, para Notch (CBF-1 associado a GFP) e para Wnt (TCF/LEF associado a β-galactosidase), os autores observaram que na MO destes animais o número de células duplo positivas na região trabecular era grande (85% das células β-galactosidade+ também eram GFP+). Quando realizaram transplantes com HSC onde a via de Notch havia sido bloqueada através de transfecção de HSC com dominantes negativos, ou seja, com a porção intracelular inativa, observaram uma diminuição de 70% na pega dos transplantes. No entanto, estas células eram capazes de responder ao estímulo com Wnt3a, pois quando cultivadas com este fator aumentavam a taxa de proliferação, mostrando que o efeito de Wnt3a é independente de Notch.
Porém, estas células diferenciaram com maior rapidez, indicando que a manutenção do estado indiferenciado é papel de Notch. Logo, na realidade, Notch e Wnt agiriam sinergicamente no controle da auto-renovação, controlando processos distintos de forma não acoplada (Duncan et al., 2005).
Porém assim como wnt, a literatura de notch também apresenta incongruências, em 2005 um trabalho com nocautes condicionais para jagged- 1 e notch-1 foi realizado e surpreendentemente não houve nenhum déficit na hematopoese destes animais, mesmo o duplo nocaute não apresentou deficiências, inclusive quando desafiado por tratamento mieloablativo (5-FU).
As HSC nocautes para notch-1 foram utilizadas em transplantes com camundongos receptores nocautes para jagged-1, e este teve uma recuperação normal de hematopoese (Mancini et al., 2005). Uma possibilidade de explicação para tantas controvérsias seria que talvez haja redundância do sistema, pois existem descrições em outros modelos de diversas vias que se cruzam para controle de um único processo (Silver e Rebay, 2005).
A decisão entre auto-renovação ou diferenciação é um processo refinado e complexo e algumas moléculas envolvidas neste controle já foram descritas acima, mas provavelmente outras mais podem ter papel importante,
como o ácido retinóico. Estudos in vitro, onde as HSC foram tratadas com ácido retinóico, mostraram uma manutenção destas em estado indiferenciado por maiores períodos de tempo, aumentando assim a capacidade de reconstituir a hematopoese de camundongos transplantados, em comparação com células controle cultivadas sem o ácido retinóico. Inclusive, transplantes sucessivos demonstraram que as células mantidas em ácido reninóico originaram maior número de gerações em comparação com células frescas, demonstrando assim que o ácido retinóico estimula a auto-renovação das HSC (Purton et al., 2000 e 2006).
Pode-se então reunir estes dados designando ao nicho subendosteal três propriedades básicas: ancoragem, indução de quiescência e auto- renovação. Por definição quiescência e auto-renovação seriam propriedades temporalmente excludentes, assim, as HSC passariam por ciclos de auto- renovação intercalados por períodos de quiescência, desta forma o nicho subendosteal seria dinâmico e possuiria diferentes facetas temporais e espaciais (Wilson e Trumpp, 2006). Curiosamente, as via moleculares descritas na literatura para quiescência não se sobrepõem com as descritas para auto- renovação fortalecendo assim a hipótese de fenômenos temporal e/ou espacialmente excludentes.
Alguns grupos, recentemente, vêm apresentando um outro ponto de vista, um aspecto metabólico, quanto ao nicho subendosteal. A região subendosteal é um nicho hipóxico, no qual residem as HSC, em geral quiescentes (baixa atividade metabólica) enquanto, as regiões mais centrais da medula, nicho vascular, são ricas em oxigênio, e apresentariam progenitores hematopoéticos altamente proliferativos (Suda et al, 2005). A sobrevivência das HSC em condições de hipoxia, com baixa disponibilidade de energia, seria na realidade necessária, pois a prevenção de senescência depende da inibição de estresse oxidativo ocasionado por espécies reativas de oxigênio (ROS), e isso é melhor alcançado em condições de hipoxia e baixa atividade metabólica.
Sabe-se que as em geral, células-tronco, apresentam baixa taxa de fosforilação oxidativa e altos níveis de glicólise anaeróbica para síntese de ATP (Suda et
al., 2005). Sabe-se ainda que as HSC apresentam altos níveis de expressão de ATM, proteína que mantém a estabilidade genética, ativando pontos de checagem do ciclo celular, bloqueando o ciclo e ativando a apoptose em casos de dano ao DNA devido a instabilidade de telômeros ou estresse oxidativo.
Camundongos nocautes para ATM apresentam apenas HSC proliferativas, nunca quiescentes, o que levava a esgotamento da população e parada da hematopoese, este efeito era independente da telomerase e pôde ser revertido com o tratamento dos camundongos com anti-oxidantes, mostrando assim a importância de ATM, uma proteína responsiva a estresse oxidativo na manutenção da quiescencia, sendo assim esta hipótese se torna interessante apesar de ainda pouco estudada (Ito et al, 2004).
Deve-se destacar que o nicho subendosteal possui duas populações celulares estromais descritas, os osteoblastos e as células mesenquimais subendosteais, sendo que a HSC ficaria exatamente entre as duas (Fig.5).
Logo, a realização de estudos para determinar qual das duas populações seria preferencial no controle de qual fenômeno e em qual momento seria importante, pois possivelmente nos permitiria entender a dinâmica do nicho.
Talvez seja exatamente um equilíbrio de influencias “opostas” dessas duas populações que seja responsável pelas propriedades funcionais e o dinamismo do nicho subendosteal.
“Todo o progresso observado nos últimos anos no campo do nicho das HSC claramente indica que a expansão clonal substancial das HSC in vitro inquestionavelmente requer mais do que coquetéis de citocinas, ao invés disso requer uma reconstrução tridimensional do nicho, incluindo as células apropriadas e matriz extracelular para permitir a geração da sinapse no nicho da HSC” (Wilson e Trumpp, 2006).
Figura 5. Nicho subendosteal e seus mediadores. (A) Nicho subendosteal possui dois componentes estromais, entre os quais a HSC se localiza, na face óssea os osteoblastos (bone lining cells) e voltado para o centro da medula as células mesenquimais subendosteais. (B) Diversos mediadores moleculares já foram descritos no controle das funções do nicho subendosteal, porém qual das duas populações estromais é a responsável pela produção de quais fatores, permanece um mistério.
(fonte: Moore e Lemishka , 2006; Wilson e Trumpp, 2006).
1.4. O Nicho Vascular
O nicho subendosteal está bastante consolidado quanto ao seu papel na manutenção das HSC, porém recentemente foi demonstrado que a ablação do endotélio através de anticorpo anti-VE caderina leva a interrupção da hematopoese, demonstrando a importância do nicho vascular para este processo (Avecilla et al., 2004). O endotélio dos sinusóides medulares se distingue do de outros órgãos, porque na medula há a expressão de citocinas como SDF-1α/CXCL12 e moléculas de adesão como E-selectina e VCAM-1 (Wilson e Trumpp, 2006). Em concordância com o conceito de nicho vascular, Li e colaboradores demonstraram em 2004 que culturas primárias de endotélio eram capazes de manter a população de HSC. Em seguida, um trabalho foi publicado descrevendo uma combinação de marcadores da família SLAM (Signaling Lymphocyte Activation Molecule), CD150, CD244 e CD48, que eram diferencialmente expressos nas HSC em diferentes graus de
