AULA PRÁTICA 03-06- ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA 2010

(1)

UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ

Curso:

Biotecnologia – 4

oo

_período

Professora

: Maria Luiza F. Rodrigues

Disciplina

: Microbiologia Industrial

AULA PRÁTICA 03, 04, 05 E 06: ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA

ÁGUA E INDICADORES

Amostragem

Amostragem :Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto:Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a

representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a ser examinado.ser examinado. TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS):

TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS):

Inocule uma série de três tubos contendo 10 ml, sendo 9 ml do meio Caldo Lauryl Sulfato Inocule uma série de três tubos contendo 10 ml, sendo 9 ml do meio Caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST) ou Caldo Peptona e 1 ml da amostra de água. Incube a 37

Triptose (LST) ou Caldo Peptona e 1 ml da amostra de água. Incube a 37ºº_{C por 48 horas.}_{C por 48 horas.} A presença de gás no tubo de Duhran, indica teste presuntivo positivo. Anote o número de A presença de gás no tubo de Duhran, indica teste presuntivo positivo. Anote o número de testes positivos.

testes positivos.

TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS: TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS: Trans

Transfira 1,0 fira 1,0 mL de mL de todos os tubos do todos os tubos do teste presuteste presuntivo que deram resultantivo que deram resultado positivo parado positivo para tubos contendo 9 ml do meio E.C (

tubos contendo 9 ml do meio E.C (Escherichia coli Escherichia coli ).).

Incube os tubos na estufa a

Incube os tubos na estufa a 44,544,5 oo_{C por 48 horas.}_{C por 48 horas.} A presença de gás no tubo

A presença de gás no tubo de Duhran indica teste positivo.de Duhran indica teste positivo. Anote os números de tubos positivos.

Anote os números de tubos positivos.

DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME: DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME:

Inocule através da alça de platina, a partir de um dos tubos positivos de meio E.C, uma placa Inocule através da alça de platina, a partir de um dos tubos positivos de meio E.C, uma placa com meio EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), meio SS e meio Mac Conkey. Incube as com meio EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), meio SS e meio Mac Conkey. Incube as placas invertidas de 24-48 horas á 37

placas invertidas de 24-48 horas á 37 00_C._C.

Colônia típica: nucleada com ou sem brilho metálico. Colônia típica: nucleada com ou sem brilho metálico.

Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa. Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa. Colete uma colônia da placa e faça

(2)

COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA ANÁLISE DE ÁGUAS

Meio Caldo Lauryl Triptose Triptose...20g Lactose...5g Fosfato de potássio dibásico...2,75g Fosfato de potássio monobásico...2,75g Cloreto de sódio...5g Lauryl sulfato de sódio...0,1g Água destilada...1000ml PH final = 6.8 Meio EC Triptose...20g Lactose...5g Fosfato de potássio dibásico...4g Fosfato de potássio monobásico...1,5g Cloreto de sódio...5g Sais biliares...5g Água destilada...1000ml PH final = 6.9 EMB Agar peptona...10g Lactose...5g Sacarose ...5g Fosfato de potássio dibásico...2g Eosina ...13,5g Azul de metileno...0,065g Agar ...2g Água destilada...1000ml PH final = 6.8

EMB agar: este meio é utilizado para a diferenciação deE. coli e Enterobacter aerogenes.

Aspecto das colônias:

Escherichia coli : colônias esverdeadas, com brilho metálico e geralmente com centro mais

escuro.

Enterobacter aerogenes: colônias com aspecto mucóide, com o centro amarreonzado.

Patógenos que não fermentam a lactose: colônias transparentes.

SSA: este meio é seletivo para o isolamento de Salmonella e Shigella de alimentos ou outras

fontes. Os microrganismos gram positivos e os coliformes são inibidos pela ação dos sais biliares.

Aspecto das colônias:

Salmonella e Shigella: organismos não fermentadores da lactose presentam colônias

incolores e transparentes.

Escherichia coli : apresentam colônias de cor vermelha.

Enterobacter sp e Proteussp: apresentam colônias de cor rosa, creme ou branca.

McConkey agar: este meio é seletivo para bactérias gram negativas e serve para o isolamento de coliformes, Salmonella e Shigellade alimentos e outras fontes.

Aspecto das colônias: Qualquer organismo capaz de fermentar a lactose com a produção de ácidos, forma colônias vermelhas em meio agar McConkey (agar vermelho neutro-sais biliares), devido à viragem do indicador em pH baixo.

(3)

Resultados

Após o crescimento das colônias nos meios seletivos descritos acima (48 horas), faça a coloração de gram com as culturas para notar as formas celulares e anote na tabela abaixo as suas observações.

Resultados obtidos após 48 horas de crescimento em meio seletivo

Meios seletivos Aspecto das colônias Observações EMB

SSA McConkey

Características dos microrganismos nos meios EMB, SSA e MacConkey

Microrganismo Meio EMB Meio SSA Meio MacConkey

Escherichia coli Colônias pequenas, de cor

verde metálico brilhante

Colônias pequenas redondas de cor rósea

Colônias de cor rosa-avermelhada pois fermentam a lactose Enterobacter aerogenes Colônias grandes, nucleadas e espalhadas, de cor rosa escuro

Colônias de aspecto cremoso de cor rósea

Colônias de cor rosa-avermelhada pois fermentam a lactose

Salmonella sp Colônias pequenas e

transparentes

Colônias transparentes que podem apresentar núcleo central de cor preta

Colônias transparentes ou amareladas pois não fermentam a lactose

Klebsiella sp Colônias grandes, gomosas,

com núcleo central escuro que se espalham na placa

Colônias gomosas, espalhadas, de cor rósea a alaranjado

Colônias de cor rosa-avermelhada pois fermentam a lactose

Serratia marcerans

Colônia roxo azuladas, gomosas, planas, com cresciemnto espalhado

Colônias pequenas, transparentes ou leitosas

Proteus morgani Colônias pequenas e

transparentes

Colônias espalhadas transparentes que podem ter o núcleo mais escuro

COLORAÇÃO DE GRAM 1 - Introdução

(4)

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

2 - Descrição da técnica

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada

(5)

com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%. A técnica da coloração de Gram não é infalível e pode-se fazer o teste do hidróxido de potássio (KOH). Em uma lâmina de microscopia adicionam-pode-se duas gotas de uma solução de KOH a 3%. Com o auxílio de uma alça de semeadura coleta-se uma colônia isolada da bactéria e mistura-coleta-se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos. Se a bactéria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que será observado como fios viscosos. Se a bactéria for Gram-positiva não haverá a formação de fios.

3 - Procedimentos

3.1 - Preparo do esfregaço

Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

3.2 - Aplicação do corante primário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Remover o corante da lâmina com água destilada, com auxílio de um conta-gotas.

3.3 - Aplicação do fixador

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Remover o fixador da lâmina com água destilada, com auxílio de um conta-gotas.

(6)

3.4 - Descoloração

Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento deve ser realizado até o momento que não desprenda mais a cor violeta do esfregaço.

3.5 - Aplicação do corante secundário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica (safranina); deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água, com auxílio de um conta-gotas, e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

3.6 - Microscopia