DISTÚRBIOS HEMOSTÁTICOS E ATIVIDADE DAS
ENZIMAS QUE HIDROLISAM NUCLEOTÍDEOS E
NUCLEOSÍDEO DE ADENINA EM CÃES INFECTADOS
COM Rangelia vitalii
TESE DOUTORADO
CARLOS BRENO VIANA PAIM
Santa Maria, RS, Brasil 2012
CÃES INFECTADOS COM Rangelia vitalii
Carlos Breno Viana Paim
Tese
apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Medicina Veterinária
Preventiva, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como
requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Medicina Veterinária
Orientadora: Prof.ª Sonia Terezinha dos Anjos Lopes
Santa Maria, RS, Brasil 2012
A Comissão examinadora, abaixo assinada,
Aprova a Tese de Doutorado
DISTÚRBIOS HEMOSTÁTICOS E ATIVIDADE DAS ENZIMAS QUE
HIDROLISAM NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEO DE ADENINA EM
CÃES INFECTADOS COM Rangelia vitalii
elaborada por
Carlos Breno Viana Paim
Como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Medicina Veterinária
Comissão Examinadora
:Sonia Terezinha dos Anjos Lopes, Dra. (UFSM)
(Presidente/orientadora)
Silvia Gonzalez Monteiro, Dra. (UFSM)
Alexandre Krause, Dr. (UFSM)
Marta Frescura Duarte, Dra. (ULBRA)
Angela Patrícia Medeiros Veiga, Dra(IFC)
Quero expressar minha gratidão às pessoas que de alguma forma deram sua colaboração, estímulo e empenho para que esta tese se tornar-se uma realidade, sem correr algum risco do merecido reconhecimento, torna-se um desafio, pois foi uma obra construída por um conjunto de pessoas. Desta forma, dedico algumas palavras de agradecimento àqueles que contribuíram de forma direta ou indireta na sua elaboração.
À Deus por ter me dado a vida e por permitir que sinta sua presença através das pessoas, que me amparam nos momentos difíceis, me dão força para superar as dificuldades e me mostram o caminho a ser seguido.
A Universidade Federal de Santa Maria, de forma especial ao Programa de Pós-Graduação pelo incentivo institucional que possibilitou a realização de mais uma etapa em minha vida profissional.
A professora Sonia Lopes um misto de orientadora e amiga, um exemplo de profissionalismo, por compartilhar o seu conhecimento científico, acreditar e incentivar o meu crescimento profissional.
A todos os integrantes do grupo de pesquisa do LACVET/UFSM, pela convivência, acolhimento, troca de experiências e participação, tão fundamental para realização deste trabalho.
Agradeço a minha família e a família de minha esposa por estarem sempre presentes fazendo parte de minhas conquistas.
Por fim, agradeço a minha esposa Cristina e minha filha Francine pelo estímulo, apoio, paciência, compreensão e presenças constantes, durante o desenvolvimento desta obra.
“... E ainda que tivesse o dom da profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse Amor, nada seria... Agora, pois, permanecem a fé, a esperança e o amor, estes três; mas o maior destes é o Amor”.
Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria
DISTÚRBIOS HEMOSTÁTICOS E ATIVIDADE DAS ENZIMAS QUE
HIDROLISAM NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEO DE ADENINA EM
CÃES INFECTADOS COM Rangelia vitalii
AUTOR: Carlos Breno Viana Paim
ORIENTADORA: Profª. Drª.Sonia Terezinha dos Anjos Lopes Data e Local da Defesa: Santa Maria, 17 de agosto de 2012
O parasito Rangelia vitalii é o agente etiológico da rangeliose, uma enfermidade que cursa com uma grande variedade de sinais clínicos, incluindo desordens hemostáticas caracterizadas por sangramentos. Entretanto, as causas das alterações no processo hemostático nessa doença ainda não foram esclarecidas. O objetivo deste estudo foi avaliar os distúrbios hemostáticos através da produção de megacariócitos e contagem de plaquetas, a coagulação sanguínea, a atividade plaquetária e determinar a atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeo de adenina em plaquetas de cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Para este estudo, 12 cães foram separados em dois grupos: Grupo A foi composto por cinco cães saudáveis, e grupo B com sete cães infectados experimentalmente com R. vitalii. Após inoculação, os animais foram monitorados quanto à parasitemia por esfregaço sanguíneo. O parasito foi encontrado no interior de hemácias, neutrófilos e monócitos cinco dias pós-inoculação (PI). As coletas de sangue para a realização da contagem plaquetária, testes de coagulação e mensuração da agregação plaquetária foram realizadas nos dias 0, 10 e 20 PI. Nos dias 10 e 20 PI, após esse procedimento, os cães foram anestesiados para coleta do aspirado de medula óssea com a finalidade de avaliar a produção de megacariócitos. Para avaliar a atividade das ectonucleotidases e adenosina desaminase, as coletas de sangue foram realizadas nos dias 12 e 21 PI. Este estudo demonstrou redução (P<0,01) no número de plaquetas entre o grupo infectado em relação ao controle. Os tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativado não apresentaram diferença significativa entre animais infectados e controles. Ocorreu aumento (P<0,01) do número de megacariócitos no grupo infectado quando comparado com o controle. Foi observado uma diminuição (P<0,01) na agregação plaquetária em cães infectados por R. vitalii. A hidrólise de ATP, ADP, AMP e desaminação da adenosina foram reduzidas (P<0,01) no dia 12 PI quando comparadas com o grupo controle. No dia 21 PI, a atividade da adenosina desaminase manteve-se reduzida (P<0,01), enquanto que ocorreu aumento (P<0,05) na atividade da ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase). A partir dos resultados, pode-se concluir que a rangeliose é responsável por grave trombocitopenia na fase aguda da infecção, a qual pode estar associada ao sequestro e/ou destruição imunomediada e, que alterações no sistema purinérgico contribuem para a ocorrência das desordens hemostáticas observadas na infecção pelo parasito R. vitalii.
Palavras – chave: rangeliose, megacariócitos, trombocitopenia, coagulação, adenosina,
Doctoral Thesis
Postgraduate Program in Veterinary Medicine
Universidade Federal de Santa Maria
DISTÚRBIOS HEMOSTÁTICOS E ATIVIDADE DAS ENZIMAS QUE
HIDROLISAM NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEO DE ADENINA EM
CÃES INFECTADOS COM Rangelia vitalii
AUTHOR: Carlos Breno Viana Paim
ADVISER: Profª. Drª. Sonia Terezinha dos Anjos Lopes Place and Date of Defense: Santa Maria, August 17th, 2012
The parasite Rangelia vitalii is the etiologic agent of rangeliosis, a disease that leads to a wide variety of clinical signs, including hemostatic disorders characterized by bleeding. However, the causes of this process have not been established. The aim of this study was to evaluate the production of megakaryocytes, platelet count, clotting time, platelet activity and to determine the activity of enzymes that hydrolyze nucleotides and adenine nucleosides in platelets of dogs experimentally infected with R. vitalii. For this study, 12 dogs were separated in two groups: Group A was composed by five healthy dogs, and group B composed by seven dogs experimentally infected with R. vitalii. After inoculation, the animals were monitored by blood smears. The parasite was found within erythrocytes, neutrophils and monocytes five days post-inoculation (PI). Blood collection to perform platelet count, coagulation tests and measurement of platelet aggregation was performed on days 0, 10 and 20 PI. On days 10 and 20 PI, after this procedure, the dogs were anesthetized for collecting bone marrow samples to evaluate the production of megakaryocytes. To measure the activity of ectonucleotidases and adenosine deaminase, blood samples were collected on days 12 and 21 PI. Blood samples were stored in tubes containing EDTA to quantification of platelets, evaluation of platelet aggregation and measurement of enzymatic activity. The blood was stored in tubes containing citrate for realization of the clotting time. This study revealed a reduction (P<0.01) of platelet numbers in the infected group when compared to control group. Prothrombin time and active partial thromboplastin time showed no significant difference between infected and control animals. There was an increase (P<0.01) in the number of megakaryocytes in infected group when compared with control group. A reduction (P<0.01) of platelet aggregation was observed in dogs infected with R. vitalii. The hydrolysis of ATP, ADP, AMP and deamination of adenosine decreased (P<0.01) on day 12 PI. On day 21 PI, the activity of adenosine deaminase remained reduced (P<0.01), whereas it was observed an increase (P<0.05) in NTPDase levels. From these results, we can conclude that rangeliosis is responsible for severe thrombocytopenia during the acute phase of infection, and this can be due to splenic sequestration and/or immune-mediated thrombocytopenia. Also, alterations in purinergic system contribute to the occurrence of hemostatic disorders observed in this disease.
Figura 1 – Cão com presença de hemorragia na orelha, esfregaço de sangue periférico com a presença de R. vitalii em leucócitos. ... 13 Figura 2 - Fluxo de cisalhamento gerando plaquetas nos sinusóides da medula óssea . 16 Figura 3 - Ligantes e receptores envolvidos na adesão plaquetária. ... 19 Figura 4 - Cascata de coagulação. Via intrínseca e extrínseca. ... 22 Figura 5 - Intestinos. Presença de hemorragia na mucosa e sangue digerido no colo. .. 24 Figura 6 - Via da sinalização purinérgica. ... 25 Figura 7 - Principais enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos. ... 27
ADA – Adenosina desaminase ADP – Difosfato de adenosina AMP – Monofosfato de adenosina ATP – Trifosfato de adenosina
EDTA – Ácido etileno diamino tetracético dissódico FvW – Fator de Von Willebrand
GP – Glicoproteínas
NTPDase – Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase PCR – Reação em cadeia da polimerase
PI – Pós-infecção
R. vitalii – Rangelia vitalii TP – Tempo de protrobina
TTPa – Tempo de tromboplastina parcal ativado TXA2 – Tromboxano A2
1
INTRODUÇÃO ... 12
2
OBJETIVOS ... 30
2.1 Objetivo geral ... 30
2.2 Objetivos específicos ... 30
3 Artigos ... 31
3.1 Artigos 1: Thrombocytopenia and platelet activity in dogs experimentally infected with Rangelia vitalii ... 31
3.2 Artigo 2: Activities of ectonucleotidases and adenosine deaminase in platelets of dogs experimentally infected with Rangelia vitalii ... 39
4
DISCUSSÃO ... 46
5
CONCLUSÕES ... 50
5.1 Artigo 1 ... 50 5.2 Artigo 2 ... 506
IMPORTÂNCIA DO TRABALHO ... 51
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 52
“Nambiuvú”, “peste do sangue”, “febre amarela dos cães” são alguns dos nomes dados à rangeliose, uma doença causada pelo protozoário Rangelia vitalii, pertencente ao filo Apicomplexa, ordem Piroplasmorida. Esta enfermidade é exclusiva de cães e pouco descrita na literatura (PESTANA, 1910; CARINE & MACIEL, 1914; LORETTI & BARROS, 2005).
Um dos primeiros relatos dessa afecção ocorreu ainda no início do século passado, em 1908, e foi denominada “nambiuvú” ou febre amarela dos cães, sendo descritos os sinais clínicos de apatia, temperatura elevada, icterícia e hemorragias da pele e narinas nos animais infectados (CARINI, 1908). Em 1910, foi realizada a taxonomia do parasito, nomeando o agente causador como Piroplasma vitalii (PESTANA, 1910). Quatro anos mais tarde, ocorreu nova publicação sobre a doença, propondo que o piroplasma causador da doença passasse a ser chamado de Rangelia vitalii (CARINI & MACIEL, 1914).
Não existe consenso sobre o ciclo de vida e a taxonomia desse organismo até o momento. É descrito que seu ciclo de vida consiste de uma fase de desenvolvimento intraeritrocitária e outra extraeritrocitária, ocorrendo no citoplasma de células endoteliais (LORETI & BARROS, 2005). Uma hipótese é de que o protozoário seja transmitido pelos carrapatos ixodídeos Rhipicephalus sanguineus e/ou Amblyomma aureolatum, tendo como base infestações concomitantes encontradas em cães afetados e, especialmente, na estação do ano em que ocorre a patologia (LORETTI & BARROS, 2004). Porém, até o momento nada foi comprovado.
A filogenética da R. vitalii através da análise molecular, tendo como referência fragmentos 18S rRNA e da proteína de choque térmico 70 (hsp70), ampliada por PCR (reação em cadeia da polimerase), foi recentemente realizada em estudo de amostras de sangue provenientes de cinco cães suspeitos de infecção pelo parasito. A análise inferida resultou na descrição de uma nova sequência genética classificada dentro do gênero Babesia, e concluiu que o R. vitalii agente etiológico da rangeliose é uma espécie válida de piroplasma. Entretanto, ratifica a necessidade de novos estudos do gênero Rangelia (SOARES et al., 2011).
A rangeliose possui três formas clínicas: aguda, subaguda e crônica. A primeira manifesta sinais clínicos de apatia, anorexia, febre, fraqueza e mucosas pálidas que rapidamente se tornam ictéricas. Nesse caso, a morte ocorre entre três a cinco dias. A forma subaguda caracteriza-se por sinais semelhantes, associados a hemorragias pela boca, nariz e pele (Figura 1A); daí a denominação “nambiuvú”, palavra indígena que significa “orelha que sangra”. Já na forma crônica o animal apresenta apenas picos febris (KRAUSPENHAR et al., 2003; FIGHERA et al., 2010).
Os achados hematológicos incluem evidência de anemia hemolítica imunomediada, caracterizada por anemia regenerativa com esferocitose e eritrofagocitose (KRAUSPENHAR et al., 2003). Os animais infectados naturalmente apresentam anemia macrocítica hipocrômica, anisocitose e policromasia, leucócitos dentro dos limites fisiológicos e trombocitopenia (FRANÇA et al., 2010).
Tentativas de diagnóstico clínico da infecção pela R. vitalii têm sido fundamentadas no histórico, sinais clínicos, hemograma e resposta favorável à terapia (LORRETI & BARROS, 2004). O diagnóstico definitivo está firmado no esfregaço de sangue periférico onde o protozoário é observado nos macrófagos, neutrófilos (Figura 1B)e eritrócitos (FRANÇA et al., 2010) e na avaliação histopatológica, após a necropsia, onde o protozoário é encontrado nas células endoteliais dos capilares sanguíneos, linfonodos e medula óssea (KRAUSPENHAR et al., 2003; LORETTI & BARROS, 2005; FIGHERA et al., 2010).
Figura 1 – Cão com presença de hemorragia na orelha (A), Esfregaço de sangue periférico com a presença de R. vitalii em leucócitos (seta)(B).
Na necropsia, os achados incluem mucosas pálidas a ictéricas, esplenomegalia, linfadenopatia, medula óssea vermelha preenchendo todo o canal medular. Nos pulmões observa-se acúmulo de líquido. Nos casos mais graves, ocorre presença de espuma amarela na traqueia e grandes brônquios. Todos os cães apresentam algum grau de hemorragia nas vísceras, mucosas e pele (LORETTI & BARROS, 2005; FIGHERA et al., 2010).
Quando ocorre dano a um vaso sanguíneo, os componentes de sua matriz subendotelial são expostos ao sangue (GALE, 2011). A interação dos elementos sanguíneos com a parede vascular que sofre injúria media o processo hemostático (RUMBAUT & THIAGARAJAN, 2010). A hemostasia é o processo fisiológico que interrompe o sangramento no sítio do tecido danificado, enquanto mantém o fluxo sanguíneo normal em outros locais do sistema circulatório. Esse processo é ativado em segundos após a violação da integridade vascular e se mantém localizado. Inicialmente o coágulo sanguíneo é composto por plaquetas e fibrina (GALE, 2011). O dano causado à parede vascular leva à interação complexa de quatro componentes chaves: endotélio vascular, plaquetas, via de coagulação e, finalmente, a fibrinólise (EYRE & GAMLIN, 2010).
O Vaso sanguíneo é composto por três camadas: a camada mais interna composta por células endoteliais, uma membrana basal interna, o músculo liso e a membrana adventícia externamente (Van HINSBERGH, 2001). Somente uma única camada de células endoteliais cobre todo o sistema vascular. A estrutura dessas células e a sua integridade funcional são importantes na manutenção da parede do vaso e na função circulatória, entretanto o endotélio não é inerte. As células endoteliais são dinâmicas e desempenham função metabólica e sintética. Exercem significativas atividades autócrinas, parácrinas e endócrinas, influenciando as células musculares lisas, plaquetas e leucócitos periféricos (GALLEY & WEBSTER, 2004).
Esse endotélio vascular encontra-se estrategicamente localizado na interface entre o tecido e o sangue e, como tal, está em uma posição ideal para modular a função de vários órgãos. Em condições normais, proporciona uma superfície não trombogênica, impedindo que as plaquetas ou outras células sanguíneas se juntem, não ativando a coagulação sanguínea. Uma variedade de fatores anticoagulantes, fibrinolíticos e antiplaquetários são considerados como sendo responsáveis por essa condição (WU & THIAGARAJAN, 1996).
As células endoteliais vivas são necessárias para evitar a formação de trombos, mantendo, assim, a fluidez sanguínea. Isso só é possível porque o endotélio controla o extravasamento de líquidos, solutos, hormônios e macromoléculas, bem como plaquetas e células sanguíneas (Van HINSBERGH, 2011).
Quando o tecido subendotelial torna-se exposto em decorrência de uma perda na continuidade do endotélio, ou quando ocorre a expressão do fator tecidual por macrófagos ativados, a cascata de coagulação é desencadeada, ocorrendo também à ativação plaquetária. Em decorrência do início do processo de coagulação, a fibrina é formada, a qual em conjunto com as plaquetas ativadas forma o tampão plaquetário (Van HINSBERGH, 2011).
Plaquetas que participam ativamente do processo hemostático são fragmentos citoplasmáticos derivados de megacariócitos, com um tempo de maturação de quatro a cinco dias (GEORGE, 2000). Os megacariócitos têm origem de células-tronco comprometidas na proliferação de linhagem de progenitores de megacariócitos localizados dentro da medula óssea (NUTT et al., 2005). Esses progenitores passam por um processo de proliferação e maturação, que finaliza com a liberação de partículas de seu citoplasma na corrente sanguínea. Tais partículas possuem características citoplasmáticas, estruturais e funcionais necessárias para realizar suas funções (PATEL et al., 2005). Um megacariócito pode ser classificado basicamente em três estágios de desenvolvimento: megacarioblasto, pró-megacariócito e megacariócito maduro. O megacarioblasto possui uma elevada proporção núcleo/citoplasma. Nessa fase o núcleo é compacto, lobulado, em forma de rim, o citoplasma é basofílico e seu diâmetro pode atingir o tamanho de 20µm. Na fase seguinte, pró-megacariócitos, grânulos azurófilos começam a ser observados e o núcleo adquire a forma de ferradura. A etapa final de seu desenvolvimento é a de um megacariócito granular (STIFF, 1990).
No megacariócito, a massa citoplasmática forma longas projeções para dentro da microcirculação da medula óssea. Isto, deve-se a essas células estarem localizadas próximas das paredes sinusoidais, o que facilita a saída de segmentos citoplasmáticos para a circulação (BEHNKER & FORER, 1998). As projeções são chamadas de pró-plaquetas (ITALIANO & SHIVDSANI, 2003). A força de cisalhamento do sangue circulante irá causar a sua fragmentação (BEHNKER & FORER, 1998). O megacariócito normal pode ser facilmente reconhecido ao ser aspirado da medula óssea devido às suas características morfológicas: tamanho grande, citoplasma abundante e núcleo grande (ZUCKER-FRANKLIN & PHILIPP, 2000). São as maiores células
hematopoiéticas que residem na medula óssea, o seu tamanho pode variar entre 20 e 100µm (LEVINE et al., 1982). Os megacariócitos constituem menos de 0,1% da população das células da medula óssea (STIFF, 1990).
A trombopoietina, uma citocina produzida predominantemente no fígado, é o principal hormônio envolvido no controle da diferenciação dos megacariócitos (KAUSHANSKY, 2005). O estágio final de seu desenvolvimento é caracterizado pela liberação de plaquetas para os espaços sinusoidais (Figura 2). Cada megacariócito pode produzir entre 1000 e 1500 plaquetas (STIFF, 1990).
Figura 2 - Fluxo de cisalhamento gerando plaquetas nos sinusóides da medula óssea (adaptado de Geddis e Kaushansky, 2007)
A megacariopoiese e os megacariócitos podem ser afetados por inúmeras patologias, as quais podem causar disparidade de diferenciação, proliferação e maturação dessas células na medula óssea (SUN et al., 2000). Infecções por vírus, micoplasma, rickettsias e protozoários podem levar a lesão de medula com consequente redução na produção de megacariócitos e trombocitopenia (BAHNER et al., 1997).
As plaquetas foram descritas pela primeira vez por observações de Bizzozero no final de 1800. Esse pesquisador não só identificou as plaquetas como corpúsculos distintos dentro do sangue, mas também demonstrou que as plaquetas são responsáveis pela formação de trombos dentro de áreas danificadas do endotélio vascular (HARRISON, 2004). São as plaquetas os menores componentes do sangue, seu tamanho pode variar de 2 a 4µm e são consideradas fragmentos citoplasmáticos de megacariócitos, com um tempo de maturação de quatro a cinco dias. Seu período de
vida é de aproximadamente 10 dias na circulação periférica (JOHNS, 2004). Após esse tempo serão eliminadas por fagocitose mediada por macrófagos (KAUSHANSKY, 2008). Com base em observação através de microscopia eletrônica, a plaqueta pode ser dividida em três zonas anatomicamente distintas: membrana, citoesqueleto e organelas (Quadro 1) (JOHNS, 2004). A membrana consiste de uma bicamada de fosfolipídeos típica que contém glicoproteínas de membranas (WHITE & CLAWSON, 1980). Possui um sistema de canais abertos e invaginações, fazendo com que a superfície de contato com o ambiente plasmático seja igual ou superior ao de células com dimensões maiores (POLASEK, 2006). Também é na membrana que estão presentes receptores de glicoproteínas tais como, GPIb, GPIIb, GPIIIa, GPIX (JOHNS, 2004). O citoesqueleto é composto por microtúbulos e microfilamentos. Esses servem para manter a forma discoide deste fragmento celular e fornecer capacidade contrátil. Finalmente a terceira região anatômica, a das organelas, está constituída basicamente por grânulos (JOHNS, 2004).
Após ocorrer um dano à parede vascular, as plaquetas são submetidas a uma resposta em série, altamente regulada e funcional que inclui: adesão, ativação, reação de liberação e agregação decorrente da exposição à superfície pró-coagulante. O objetivo é a rápida formação de um tampão hemostático que obstrui o local do dano, prevenindo a perda de sangue (HARRISON, 2004).
As Plaquetas não interagem com a parede vascular intacta em circunstâncias fisiológicas. Entretanto, quando a parede vascular sofre injúria e o endotélio é rompido, ocorre uma rápida e complexa interação entre plaquetas circulantes e estrutura subendotelial exposta. Essa interação é mediada por vários receptores celulares posicionados sobre a superfície das plaquetas ou células endoteliais e proteínas adesivas como o fator de von Willebrand (FvW) e o fibrinogênio, resultando, finalmente, na adesão das plaquetas à parede vascular (LÖWENBERG et al, 2010).
O FvW é uma glicoproteína adesiva sintetizada pelos megacariócitos e células endoteliais, sendo continuamente secretada ou destinada para estocagem em organelas no endotélio, denominadas de corpos Weibel-Palade ou α-grânulos dos megacariócitos e plaquetas (RUGGERY, 1999). É por meio da ligação de colágeno, plaquetas e FvW, que este irá servir como uma molécula ponte entre as plaquetas e a matriz subendotelial, mediando a adesão de plaquetas à parede do vaso (WARE & HEISTAD, 1993). O FvW é o principal determinante proteico de adesão plaquetária, que inicialmente ocorre em forma de uma camada simples (GENTRY, 2000).
Quadro 1 – Anatomia das plaquetas
Zona Estrutura primária Componentes Função
Membrana
Membrana plasmática
Mucopolissacarídeos para absorção de proteínas
pró-coagulantes do plasma Adesão e agregação plaquetária Membrana plaqueta Microtúbulos e microfilamentos
para estrutura e suporte Submembrana Receptor de glicoproteínas (GP)
Citoesqueleto Microfilamentos Manter a forma e
promover contração Organelas Alfa grânulos Albumina Alfa-2 antiplasmina C1 inibidor de esterase Fator plaquetário 4 (PF4) PF4 baixa afinidade Beta tromboglobulina Fator de crescimento Fibrinogênio Fator V Fibronectina VWF antigeno Adesão primária e secundária e agregação de plaquetas Corpos densos ATP ADP Serotonina Cálcio Fonte promotora de energia, adesão de plaquetas (Adaptado de Johns, 2004).
O FvW facilita a adesão inicial através da ligação de glicoproteínas do complexo GPIb, GPIX e GPV (Figura 3), especialmente em condições elevadas de cisalhamento. Essas interações permitem que as plaquetas desacelerem o suficiente possibilitando que outras ligações possam ocorrer, resultando em uma aderência estática (BOLTON-MAGGS et al., 2006).
Após a adesão, as plaquetas são ativadas por inúmeros agonistas como difosfato de adenosina (ADP) e colágeno presente no local da injúria. Esses ativam as plaquetas, através da ligação com receptores específicos localizados sobre a sua membrana. A ocupação dos receptores leva a um aumento na concentração de cálcio intracelular (VARGA-SZABO et al., 2009). O aumento do cálcio livre leva a uma mudança na conformação desses fragmentos celulares (GRYGLEWSKI, 2008). A mudança na conformação faz com que as plaquetas passem de uma forma discóide para esférica
(GENTRY, 2000). Na fase inicial, são emitidos pseudópodes, logo em seguida, há um rearranjo das proteínas do seu citoesqueleto (actina e miosina), transformando esses fragmentos celulares normalmente discóides em esferas espiculadas e compactas com longas extensões dendríticas que facilitam sua adesão (GEORGE, 1990).
Figura 3 - Ligantes e receptores envolvidos na adesão plaquetária (adaptado de Jackson, 2007).
A ligação do FvW subendotelial ao complexo GPIb-V-IX localizado na membrana da plaqueta é insuficiente para mediar adesão estável. Entretanto, é fundamental para manter as plaquetas em contato íntimo com a superfície vascular danificada na fase inicial do processo hemostático. A adesão da plaqueta leva a sua ativação através de uma cascata metabólica interna (FURIE & FURIE, 2007).
Sinais intracelulares são desencadeados com objetivo de deslocar integrinas das plaquetas para um estado de alta afinidade e induzir a liberação de mediadores secundários como ADP e tromboxano A2 (TXA2). Esses agonistas em conjunto com a trombina contribuem para a ativação celular, estimulando receptores que juntamente com a proteína G, ocasionam eventos sinalizadores para induzir a ativação total (FURIE & FURIE, 2007). O ADP tem papel fundamental no processo de ativação, agindo sobre os receptores purinérgicos P2X1, P2Y1 e P2Y12, localizados na superfície das plaquetas, que agem sinergicamente na mudança da conformação, prolongando a ativação e tornando-a irreversível (GACHET, 2008).
O TXA2 é produzido a partir do ácido araquidônico oriundo dos fosfolipídeos localizados na membrana plaquetária, através da fosfolipase A2 citoplasmática. O ácido
araquidônico é metabolizado pela ciclo-oxigenase-1 (C0X-1) daí para prostaglandina e TXA2. Essa molécula atua sobre a ativação plaquetária, agindo sobre receptores de superfície específicos (PAPATHANASIOU et al, 2009). A fosfolipase A2 é estimulada pelo aumento do cálcio intracelular (GRYGLEWSKI, 2008).
Durante a mudança de forma das plaquetas, os grânulos contidos em seu citoplasma são centralizados e seus conteúdos são liberados no lúmen do sistema de canais abertos, e posteriormente são liberados para o exterior, em um processo chamado de reação de secreção (GRYGLEWSKI, 2008). As plaquetas ativadas aumentam a secreção de substâncias biologicamente ativas armazenadas ou recém sintetizadas dentro dos seus grânulos (JENNINGS, 2009). Duas principais populações de grânulos estão evidentes em plaquetas não ativadas; eles diferem em estrutura, conteúdo, cinética de exocitose e função. Esses grânulos servem como vesículas secretórias, liberando seus componentes para o fluido extracelular. Eles também possuem a função de liberar moléculas para a membrana plasmática das plaquetas (RUMBAUT & THIAGARAJAN, 2010).
Os alfa-grânulos contêm a maioria dos fatores plaquetários envolvidos na hemostasia, incluindo grandes peptídeos, como trombosponina; p-selectina; fator plaquetário 4 e beta-tromboglobulina e fatores envolvidos na coagulação (Fator V, XI, XIII, fibrinogênio, FvW e cininogênios). Além disso, possuem moléculas de adesão que atuam na interação plaquetária com a parede vascular, tais como fibronectina e vitronectina. A membrana dos alfa-grânulos contém glicoproteínas como a GPIb, GPVI, GPIIb/IIIa e P-selectina que, durante a ativação, serão expressas sobre a membrana das plaquetas (MAYNARD et al., 2007).
Os grânulos densos possuem elevada concentração de cálcio, fosfato, nucleotídeos de adenina (trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP)) e serotonina. Também contêm moléculas de adesão: GPIb, GPIIb/IIIa e P-selectina. Durante a ativação plaquetária, as proteínas de membrana dos grânulos densos são incorporadas à membrana plasmática das plaquetas e o seu conteúdo é liberado para o meio extracelular. O ADP e o ATP contidos nos grânulos densos estão envolvidos primariamente no processo hemostático (CLEN et al., 2000).
A ativação plaquetária é um fator crítico para que ocorra a agregação das plaquetas, pois ADP, TXA2 e fibras colágenas são mediadores potentes nesse processo. O TXA2 promove agregação de plaquetas através da estimulação de proteínas-G acopladas aos receptores na membrana das plaquetas. A ligação TXA2 aos seus
receptores leva a ativação da fosfolipase C que induz a expressão do complexo-G responsável por mediar agregação plaquetária (ARMSTRONG & GOLAN, 2007).
As plaquetas não devem somente ser hábeis para desenvolver contato adesivo, mas também sustentar esse contato com o local da injúria, o que ocorre através da formação de agregados (BRASS et al., 2005). A agregação envolve a interação plaqueta a plaqueta e é necessária para que ocorra uma hemostasia efetiva após a adesão inicial de plaquetas ao local da injúria (VARGA-SZABO et al., 2009). A principal molécula envolvida na agregação é a proteína de membrana do complexo GPIIb-IIIa. Essa é uma integrina presente em grande quantidade nas plaquetas, tanto sobre sua membrana plasmática como nos alfa-grânulos (NIIYA et al., 1987). A ativação plaquetária através de seus agonistas induz mudança na conformação do complexo GPIIb-IIIa, o qual torna-se competente para ligar-torna-se ao fibrinogênio (MA et al., 2007). Assim, a agregação de uma plaqueta a outra ocorre através de uma ponte da molécula de fibrinogênio com o complexo GPIIb-IIIa funcional (ARMSTRONG & GOLAN, 2001). Finalmente, a membrana da plaqueta transforma-se em uma superfície rica em fosfolipídeos sobre ativação. Essa superfície carregada negativamente é necessária para montagem da ativação dos fatores de coagulação que, por sua vez, é requerida para geração de trombina. As plaquetas formam uma forte ligação entre o processo de hemostasia primária e secundária (LÖWENBERG & MEIJERS, 2010).
A hemostasia primária refere-se à agregação e formação do tampão plaquetário. As plaquetas são ativadas e, como resultado, elas se aderem ao local da injúria vascular, e também uma a outra tamponando a área com dano, como descrito anteriormente. Já a hemostasia secundária refere-se à deposição de fibrina insolúvel, a qual é gerada através da cascata proteolítica da coagulação (Figura 4). A fibrina insolúvel forma uma malha que é incorporada em torno do tampão de plaquetas. Esta malha serve para fortalecer e estabilizar o coágulo sanguíneo. Esses dois processos ocorrem simultaneamente e estão mecanicamente interligados (GALE, 2011).
O objetivo da hemostasia secundária (cascata de coagulação) é a formação de um coágulo de fibrina estável no local da injúria vascular. Essa cascata de coagulação é uma sequência de eventos enzimáticos. A maioria dos fatores que participam dessa cascata é sintetizada no fígado e circula como pró-enzimas que são proteoliticamente clivadas, tornando-se ativadas por fatores ativados que as precedem na cascata de coagulação. Essa reação de ativação é catalítica, ampliando o processo rapidamente e
gerando grande quantidade de fibrina no local da lesão (ARMSTRONG & GOLAN, 2001).
Figura 4 - Cascata de coagulação. Via intrínseca e extrínseca (adaptado de Adams e Bird, 2009).
O objetivo da hemostasia secundária (cascata de coagulação) é a formação de um coágulo de fibrina estável no local da injúria vascular. Essa cascata de coagulação é uma sequência de eventos enzimáticos. A maioria dos fatores que participam dessa cascata é sintetizada no fígado e circula como pró-enzimas que são proteoliticamente clivadas, tornando-se ativadas por fatores ativados que as precedem na cascata de coagulação. Essa reação de ativação é catalítica, ampliando o processo rapidamente e gerando grande quantidade de fibrina no local da lesão (ARMSTRONG & GOLAN, 2001).
A cascata de coagulação tem sido dividida tradicionalmente em via extrínseca e intrínseca, tal divisão é resultado de testes “in vitro” (ARMSTRONG & GOLAN, 2001). Entretanto, essa descrição clássica tem sido largamente ignorada, já que não está relacionada com o processo que ocorre “in vivo”. Contudo, esse conceito permanece ainda útil para o entendimento da ação de anticoagulantes e dos estudos da cascata da coagulação (CURRY & PIERCE, 2007).
A via intrínseca é ativada “in vitro” pelo fator XII (fator de Hageman), enquanto que a via extrínseca é iniciada “in vivo” pelo fator tecidual, uma lipoproteína expressa por leucócitos ativados, células endoteliais ativadas, células musculares lisas subendoteliais e fibroblastos subendoteliais no local da injúria vascular (ARMSTRONG & GOLAN, 2001).
A hemostasia é um processo dividido em: (a) hemostasia primária que começa imediatamente após a lesão endotelial e é caracterizada por vasoconstrição, adesão e agregação plaquetária, resultando na formação de um tampão de plaquetas, (b) hemostasia secundária ou coagulação e (c) fibrinólise (KRIZ et al., 2009). Esse processo é mantido através do equilíbrio entre coagulação e fibrinólise (HUANG et al., 2001). Cães infectados pela R. vitalii apresentam alterações no seu processo hemostático, podendo desenvolver doença hemorrágica, semelhante à observada em casos de coagulação intravascular disseminada (FIGHERA, 2007).
Em estudo de 10 casos de infecção por R vitalii no período de 2000 a 2003, foi observada presença de petéquias generalizadas nas mucosas oral e vaginal, sangramento nasal e cavidade oral, hematêmese, melena, diarreia com sangue. Sangramento persistente ou intermitente a partir da pele das pontas e margens das orelhas e sangramento profuso após venopunção (LORETI & BARROS, 2005).
Estudo retrospectivo realizado em 35 cães submetidos à necropsia no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria demonstrou que todos os animais apresentaram algum grau de hemorragia, vista com maior frequência nas vísceras do que na mucosa e pele. Hemorragia intestinal foi um achado frequente, sendo em forma de petéquias e sufusões (Figura 5). Em muitos casos o conteúdo intestinal estava tingido de sangue. Estrias de sangue foram observadas nas fezes ou estas eram pastosas ou negras. Hemorragias foram observadas no pulmão, coração, mucosas, tegumento, pâncreas, omento, bexiga, cavidade nasal, estômago, rim, vesícula biliar e adrenal (FIGHERA et al., 2010).
Em cães infectados naturalmente com R. vitalii foi observada diminuição acentuada no número de plaquetas em todos os animais ( FRANÇA, 2010). Afecção na medula óssea, trombocitopenia imunomediada, coagulopatia de consumo e sequestro esplênico são algumas das alterações responsáveis pela redução do número de plaquetas circulantes (WONG & THOMAS, 1998). Portanto, justifica-se a contagem de megacariócitos para descartar lesão de medula óssea, como causa de redução no número de plaquetas observada no sangue periférico de cães com rangeliose. Assim
como, a realização de provas de coagulação, mensurando de TP e TTPa para indicar a presença de coagulopatia de consumo.
Figura 5 - Intestinos. Presença de hemorragia na mucosa e sangue digerido no colo (fonte Fighera et al., 2010).
As plaquetas com seus agentes autócrinos ATP e ADP liberados de seus grânulos desempenham importante papel na hemostasia. Vários receptores e agonistas de plaquetas são reconhecidos por induzir ativação plaquetária, incluindo a ligação de nucleotídeos extracelulares aos receptores purinérgicos de superfície celular do tipo P2 de duas famílias distintas estruturalmente, P2X e P2Y (YEGUTKIN, 2008). P2X é ativado por ATP, enquanto P2Y pode ser ativado por ATP e ADP (GACHET, 2008). Assim, a hidrólise de nucleotídeos é fator importante no processo hemostático.
Drury e Györgi, em 1929, descreveram as potentes ações de nucleotídeos, nucleosídeos e adenosina sobre o coração e vasos sanguíneos. Em 1970, foi apresentada evidência do ATP como um neurotransmissor em nervos que inervam o intestino e, em 1972, o termo purinérgico foi descrito e a hipótese de neurotransmissão purinérgica foi proposta por Burnstock. A partir daí, trabalhos apresentaram os nucleotídeos extracelulares como moduladores do sistema endócrino, exócrino, dos mecanismos vasculares e hemostáticos, músculos esqueléticos e das células imunes e inflamatórias (BURNSTOCK & KNIGHT, 2004).
Nucleosídeos são glicosilaminas provenientes da ligação de um núcleo base a um açúcar. Como exemplos dessas moléculas pode-se citar: a citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e inosina. Os nucleosídeos quando fosforilados por quinases
específicas originam nucleotídeos (ATKINSON et al., 2006). Os nucleotídeos extracelulares de adenina e seu nucleosídeo derivado, adenosina, são importantes moléculas sinalizadoras que possuem a capacidade de influenciar a reatividade plaquetária (BURNSTOCK, 2002).
A exposição de plaquetas à baixa concentração de ADP resulta em uma agregação inicial reversível sem liberação dos produtos dos grânulos. Concentrações elevadas de ADP induzem liberação dos constituintes dos grânulos e síntese de prostaglandinas, originando uma resposta bifásica característica, com agregação irreversível (RUMBAUT & THIAGARAJAN, 2010). O ATP em baixa concentração aumenta a produção de colágeno, TxA2 e trombina, induzindo agregação plaquetária (SOSLAU YOUNGPRAPAKORN, 1997). Entretanto, quando em alta concentração é inibidor da agregação promovida pelo ADP, provavelmente pelo ATP ser hidrolisado a adenosina (BIRK et al., 2002). A Adenosina, produto da degradação de nucleotídeo daadenina, desempenha funções dependentes do tipo de receptor em cada tecido (BOROWIEC et al., 2006).
A sinalização purinérgica é dependente das interações entre nucleotídeos extracelulares e receptores de superfície celular (Figura 6) que pertencem a duas famílias estruturalmente distintas: os receptores acoplados a proteína G (P2Y) e os receptores ligados a canais de cálcio (P2X) (FREDHOLM et al., 1994).
Os receptorers P2X compreendem sete subtipos de receptores (P2X1 até P2X7). Já os P2Y são classificados em uma subfamília de receptores que estão predominantemente ligados à proteína Gq (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6 e P2Y11) e, por consequência, são ativados pela fosfolipase C e, em outra subfamília, acoplados a nGi (P2Y12, P2Y13 e P2Y14), que inibem a adenil ciclase (YEGUTKIN, 2008).
Quatro subtipos de receptores P1 foram clonados, chamados A1, A2A, A2B e A3. Todos receptores P1 de adenosina são proteínas transmembranas, acopladas à proteína G (BURNSTOCK, 2006).
A sinalização purinérgica envolve três componentes essenciais: uma fonte de nucleotídeos de adenina, receptores específicos, através dos quais os nucleotídeos exercem seus efeitos, e as enzimas ectonucleotidases, responsáveis pelo controle dos níveis dessas moléculas no meio extracelular (ROBSON et al., 2001). Nucleotídeos extracelulares modulam uma multiplicidade de funções teciduais incluindo: desenvolvimento, fluxo sanguíneo, inflamação e resposta imune. Esta sinalização via nucleotídeos extracelulares tem sido reconhecida por muitas décadas como um mecanismo de sinalização entre células (BURNSTOCK & KNIGHT, 2004).
A concentração desses nucleotídeos extracelulares, e as respostas celulares a essas moléculas, devem ser reguladas após exercerem seus efeitos, com a finalidade de manter níveis fisiológicos. Isso é realizado por um complexo multienzimático chamado de “ectonucleotidases” (Figura 7) (ZIMMERMANN, 2001). No esquema principal de hidrólise de nucleotídeos estão incluídos papéis para as enzimas, E-NTPDase (ecto-nucleotídeo trifosfato difosfoidrolase), 5’-ecto-nucleotidase e adenosina desaminase (ADA) (YEGUTKIN, 2008).
O “pool” de nucleotídeos na corrente circulatória é gerado a partir de diferentes fontes, incluindo exocitose de plaquetas, cisalhamento de hemácias, ativação das células (plaquetas e células endoteliais) e lise celular (MORRELL et al., 2005). Como um aspecto comum as ectonucleotidases, é sua capacidade de hidrolisar nucleotídeos tri e difosfato, com exceção do monofosfato, requerendo concentração milimolar de Ca2+ e Mg2+ para atividade máxima (PEARSON & CARLETON, 1980).
No sangue, a hidrólise desses nucleotídeos é regulada pela cascata das ectonucleotidases, que é iniciada pela NTPDase e finalizada pela 5’-nucleotidase. Os produtos da hidrólise dessas enzimas (ATP e ADP) irão ativar seletivamente receptores P1 e P2 (COLGAN, et al., 2006). A família da NTPDase é composta de oito tipos de enzimas, NTPDase 1, 2, 3 e 8 que estão tipicamente localizadas na superfície celular,
com sua face catalítica expressa extracelularmente. Já as NTPDase 5 e 6 exibem localização intracelular, enquanto que as NTPDase 4 e 7 estão situadas intracelularmente (MALISZEWSKI et al., 1994).
Figura 7 - Principais enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (adaptado de Yegutkin, 2008).
No sangue, a hidrólise desses nucleotídeos é regulada pela cascata das ectonucleotidases, que é iniciada pela NTPDase e finalizada pela 5’-nucleotidase. Os produtos da hidrólise dessas enzimas (ATP e ADP) irão ativar seletivamente receptores P1 e P2 (COLGAN, et al., 2006). A família da NTPDase é composta de oito tipos de enzimas, NTPDase 1, 2, 3 e 8 que estão tipicamente localizadas na superfície celular, com sua face catalítica expressa extracelularmente. Já as NTPDase 5 e 6 exibem localização intracelular, enquanto que as NTPDase 4 e 7 estão situadas intracelularmente (MALISZEWSKI et al., 1994).
A NTPDase 1 é a principal ectonucleotidase na superfície vascular (ENJYOJI, et al., 1999). A NTPDase 2 está associada à vasculatura (ZIMMERMANN, 1999). A reação
fosfohidrolítica da NTPDase 1 está limitada à resposta de ativação plaquetária, que é dependente da liberação parácrina de ADP e ativação de receptor purinérgico específico (ROBSON, et al, 2000).
A cascata das ectonucleotidases que é iniciada pelas NTPDase é finalizada pela 5’-ectonucleotidase, que hidrolisa nucleotídeos monofosfato (AMP), em adenosina (ZIMMERMANN, 1992). Tem sido demonstrado que a adenosina inibe a agregação plaquetária através do estímulo da geração de AMPc (HILLARY et al., 2011).
A 5’-nucleotidase é uma enzima glicosil fosfatidilinositol (PGI) que está fixada na superfície da membrana celular. É a principal responsável pela formação de adenosina extracelular e a subsequente ativação de receptores de adenosina (P1)(ZIMMERMANN, 1999). Está presente nos rins, fígado, encéfalo, pulmão, endotélio vascular, plaquetas e células do sistema imune (COLGAN, 2006).
A adenosina desaminase, referida como ADA, é uma importante enzima desaminante, pertencente ao metabolismo purinérgico, que converte de forma irreversível adenosina em inosina. Essa enzima tem sido encontrada em uma grande variedade de tecidos de mamíferos, como intestino, timo, tecidos linfoides e não linfoides (CRISTALLI et al., 2001).
A adenosina media uma grande variedade de funções fisiológicas através da ativação de pelo menos quatro receptores de superfície celular denominados A1, A2A, A2B e A3. Cada subtipo de receptor apresenta uma propriedade ligante única e um modelo distinto de expressão tecidual (RALEVIC & BURNSTOCK, 1998). Esse composto é altamente ativo possuindo uma variedade de efeitos sobre os tecidos, incluindo músculo cardíaco, artérias coronárias, células musculares lisas, plaquetas, estando também envolvido em reações imunes e inflamatórias. Através da interação com os receptores A2A, a adenosina tem função de inibir a agregação plaquetária (MACKENZIE et al., 1994).
Estudos com as enzimas NTPDase, 5’-ectonucleotidase e ADA demonstraram que essas enzimas estão envolvidas no mecanismo de tromboregulação em várias patologias (SCHETINGER et al., 2007). Na esclerose múltipla (SPANEVELLO et al., 2010) e tripanossomíase (OLIVEIRA et al., 2011), alterações nessas enzimas contribuem para a ocorrência de diáteses hemorrágicas.
Portanto, justifica-se a contagem de megacariócitos para descartar lesão de medula óssea, como causa de redução no número de plaquetas observada no sangue periférico de cães com rangeliose e a realização de provas de coagulação, mensurando
de TP e TTPa para indicar a presença de coagulopatia de consumo. Assim como, mensurar a atividade das enzimas que participam da sinalização purinérgica, que são responsáveis por modular os efeitos dos nucleotídeos e nucleosídeo é importante para determinar a agregação das plaquetas em animais infectados por R. vitalii. Tal avaliação não está ainda descrita na literatura.
2.1 Objetivo geral
Investigar os distúrbios de hemostasia em cães infectados experimentalmente com Rangelia vitalii.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1 Artigo 1:
- Quantificar o número de plaquetas circulantes em cães infectados com R. vitalii; - Realizar a contagem de megacariócitos da medula óssea em cães infectados com R. vitalii;
- Avaliar a agregação plaquetária em cães infectados com R. vitalii;
- Avaliar parâmetros de coagulação sanguínea tais como tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa) em cães infectados com R. vitalii;
2.2.2 Artigo 2:
- Verificar a atividade das enzimas NTPDase, 5’-ectonucleotidase e adenosina desaminase nas plaquetas em cães infectados com R. vitalii.
Os resultados desta tese estão sob a forma de dois artigos científicos. Os itens materiais e métodos, resultados, discussão e referências bibliográficas encontram-se nos artigos científicos.
3.1 Artigos 1:
Thrombocytopenia and platelet activity in dogs experimentally infected with Rangelia vitalii
Carlos Breno V. Paim, Francine C. Paim, Aleksandro S. Da Silva, Raqueli T. França, Marcio M. Costa, Claudio A. M. Leal, João F. Soares, Marcelo R. C. Schetinger,
3.2 Artigo 2
Activities of ectonucleotidases and adenosine deaminase in platelets of dogs experimentally infected with Rangelia vitalii
Carlos Breno V. Paim, Aleksandro S. Da Silva, Francine C. Paim, Raqueli T. França, Marcio M. Costa, Viviane C. G. Souza, Victor C. Pimentel, Jeandre A. Jaques, Cinthia M. Mazzanti, Daniela B. R. Leal, Silvia G. Monteiro, Maria Rosa C. Schetinger,
A seguir serão realizadas considerações a respeito dos resultados dos dois artigos apresentados nessa tese de doutorado. O objetivo do primeiro artigo foi avaliar a trombocitopenia, coagulação sanguínea e atividade plaquetária. Enquanto, no segundo artigo objetivou-se mensurar a atividade das enzimas que modulam a concentração de ATP, ADP, AMP e adenosina em plaquetas de cães experimentalmente infectados com R. vitalii.
O primeiro relato de diátese hemorrágica em cães decorrentes de infecção por R. vitalii, data do início do século passado (PESTANA, 1910). Entretanto, somente durante as últimas décadas é que essa patologia retorna a despertar interesse na comunidade científica.
Na rangeliose, sinais de alterações hemostáticas podem ser observados na forma de petéquias generalizadas nas mucosas oral e vaginal, sangramento nasal e oral, hematemese, melena e diarreia com sangue, além de sangramento através da pele das orelhas (LORETI & BARROS, 2005). Somado a isto, pode ser observada hemorragia em vísceras como: estômago, intestino, pulmão, coração, rim, bexiga, vesícula biliar, pâncreas e adrenal (FIGHERA et al., 2010).
Os resultados encontrados no primeiro artigo corroboram com os achados de França et al. (2010), pois apresentaram redução no número de plaquetas em animais infectados, quando comparados aos controles, nos dias 10 e 20 PI. De acordo com a literatura, as causas de trombocitopenia podem ser: lesão de medula óssea, trombocitopenia imunomediada, coagulação intravascular disseminada e sequestro esplênico (WONG & THOMAS, 1998).
É importante ressaltar que os megacariócitos originam as plaquetas circulantes (PATEL et al., 2005). No primeiro artigo, a avaliação dos aspirados de medula óssea demonstraram que a contagem de megacariócitos nos animais infectados foi acompanhada de um aumento que chegou a 55% no dia 20 PI em animais infectados pela R. vitalii. Esse resultado possui alta relevância, pois descarta a possibilidade de a trombocitopenia, nessa patologia, ser decorrente de alteração na megacariopoiese.
As infecções graves e a inflamação, na maioria das vezes, levam a alterações hemostáticas, que podem variar de alterações laboratoriais insignificantes até
coagulação intravascular disseminada grave (LEVI et al., 2010). Esses sangramentos anormais são reconhecidos clinicamente quando lesões na mucosa, serosa, feridas e locais de punção venosa sangram por períodos prolongados, formando hematomas. As anormalidades mais frequentes no exame são: contagem de plaqueta diminuída, TP e TTPa prolongados (ORDOG et al., 1985).
É relevante chamar a atenção que, nos resultados apresentados no artigo I ocorreu redução na contagem plaquetária no dia 10 PI no grupo infectado. Essa trombocitopenia manteve-se até o dia 20 PI. Entretanto, não ocorreu alteração significativa nos valores de TP e TTPa nos animais parasitados por R. vitalii, quando comparados com o grupo controle.
Sabe-se que na coagulopatia de consumo os valores de TP e TTPa estão aumentados (ORDOG et al., 1885), fato que não foi observado neste trabalho, portanto, descartou-se que a origem da trombocitopenia em cães com rangeliose pudesse ser decorrente de coagulação intravascular disseminada. Assim, a trombocitopenia neste estudo pode estar associada à destruição imunomediada e sequestro decorrente do aumento esplênico ou vasculite. Esplenomegalia e vasculopatias são aspectos morfológicos observados na infecção por R. vitalii (FIGHERA, et al., 2010).
O limite fisiológico da contagem plaquetária é variável entre as diversas espécies animais, estando entre 100.000 a 800.000/µL (TRALL, 2007).Na trombocitopenia inferior a 100.000/µL, a possibilidade de sangramento está aumentada. Entretanto, o limite no qual predispõe ao aparecimento desse sinal clínico ainda é controverso (VANDERSCHUEREN et al., 2000). Animais com trombocitopenia não apresentam hemorragia espontânea até que a contagem de plaquetas esteja entre 50.000 e 10.000/µL (TRALL, 2007).
Estudo avaliando a relação entre contagem plaquetária e risco de sangramento em pacientes com trombocitopenia sugere que aproximadamente 7.000/µL de plaquetas fornecem suporte para manter a hemostasia endotelial. O risco de sangramento não aumenta substancialmente até a contagem de plaquetas atingir 10.000/µL (SLICHTER, 2004). Essas observações permitem suspeitar que as diáteses hemorrágicas observadas na infecção por R. vitalii não tenham como única causa a trombocitopenia.
Cabe ressaltar que, em resposta à lesão vascular, as plaquetas estabelecem interações adesivas com as estruturas subendoteliais expostas. Elas se ativam através do contato com substâncias trombogênicas, ligando-se a moléculas adesivas solúveis,
tornando-se reativas à continuação da agregação de mais plaquetas (RUGGERI et al., 1999).
No artigo I dessa tese, foi evidenciado distúrbio na agregação plaquetária, sendo que a diminuição ocorreu no grupo de cães infectados nos dias 10 e 20 PI. Esse achado mostra que a habilidade das plaquetas se aderirem à superfície lesionada e também umas às outras, para promover a formação do trombo plaquetário em resposta a um agente agonista, esteve comprometida no grupo de cães infectados por R. vitalii.
Grandes quantidades de ATP e ADP estão presentes em eritrócitos, plaquetas e outras células teciduais, podendo deixar esses locais por dano físico ou exocitose. Sabe-se que a ADP interage com receptores P2Y sobre plaquetas e induz agregação plaquetária, contribuindo assim, com a hemostasia normal. Já o ATP pode reagir com receptores P2X impedindo esse mecanismo (STAFFORD et al., 2003).
Este tipo de sinalização é dependente da liberação dos nucleotídeos e nucleosídeos, do seu metabolismo por enzimas que atuam extracelularmente e pela presença dos receptores que se ligam seletivamente aos nucleotídeos resultantes e transportam o sinal para o interior da célula (GOUNARIS, 2002)
No artigo II desse estudo pode-se destacar que há redução na hidrólise de ATP e ADP pelas enzimas NTPDases nas plaquetas dos animais infectados no dia 12 PI. Isso pode ser associado à redução na expressão dessas enzimas, decorrente de um efeito compensatório pelo aumento desses nucleotídeos na corrente circulatória. Entretanto, no dia 21 PI o ADP aumentou em cães infectados por R. vitalii. Este achado pode ser devido a infecção ter passado para um estágio crônico.
Foi ainda realizada a determinação da hidrólise do AMP nas plaquetas, pela 5’-ectonucleotidase, onde observou-se redução desse nucleotídeo em animais infectados no dia 12 PI. Entretanto, a atividade da ADA esteve reduzida em plaquetas no grupo infectado, independente do dia em que foi realizada a avaliação dessa enzima. Esses achados indicam que a modulação de nucleotídeos e nucleosídeos esteve alterada no decorrer da doença.
A redução na atividade da 5’-ectonucleotidase pode ter contribuído com o aumento nas concentrações extracelulares de AMP. Já a elevação da ADA pode ser atribuída à resposta fisiológica, devido ao aumento da concentração de adenosina extracelular.
As ectonucleotidades NTPDase, 5’-ectonucleotidases e a ADA são enzimas que modulam o mecanismo hemostático, exercendo função importante na agregação
plaquetária (ZIMMERMANN, 1999). A atividade dessas enzimas foi encontrada alterada em diversas patologias, contribuindo para ocorrência de transtorno no processo hemostático dessas doenças (SCHETINGER, et al., 2007).
Correlação positiva foi encontrada entre o a contagem de plaquetas (Artigo I) e a hidrólise de ATP (r=0,87), ADP (r=0,91) e AMP (r=0,83) e a desaminação da ADA (r=0,93) (Artigo II), no dia 12 PI em cães com R. vitalii. Estudos têm demonstrado atividade oposta de ADP e ATP quanto à indução da agregação plaquetária. O ADP funciona como agonista da agregação, enquanto que o ATP é antagonista desse efeito (PARK & HOURANI, 1999). Entretanto, a ADA tem função de inibir a agregação plaquetária (MACKENZIE et al., 1994). Assim, pode-se afirmar que a redução na atividade da NTPDase, 5’-nucleotidase e ADA contribuiu para redução da agregação plaquetária na rangeliose, favorecendo a ocorrência de diátese hemorrágica nos cães infectados.
No artigo I foi observado tendência de aumento no número de plaquetas no dia 20 PI. Entretanto o artigo II demonstrou redução ainda maior na atividade da ADA nesse dia, fato que indica uma quantidade ainda mais elevada de adenosina no meio extracelular. Isso evidencia que, apesar do aumento das plaquetas, ainda ocorre uma forte interferência da adenosina na agregação das plaquetas, reforçando a hipótese de que o sangramento observado nessa patologia ocorre em virtude de um desequilíbrio entre plaquetas e atividade enzimática.
5.1 Artigo 1
O aumento da contagem de megacariócitos observado em aspirados de medula óssea de cães infectados com R. vitalii descarta dano na medula como causa de trombocitopenia nessa patologia.
Grave trombocitopenia ocorre na fase aguda da infecção por R. vitalii em cães.
Os valores de TP e TTPa em cães portadores de rangeliose descartam a ocorrência de coagulopatia de consumo durante a fase aguda da doença.
A redução na contagem de plaquetas no sangue periférico de cães infectados por R. vitalii, na fase aguda da doença, sugere sequestro ou/e trombocitopenia imunomediada.
A redução na agregação plaquetária sugere diminuição da liberação de ADP pelas plaquetas, contribuindo para as alterações hemorrágicas na rangeliose.
5.2 Artigo 2
A hidrólise de AMP, ADP, ATP e desaminação da adenosina foram alterada durante a infecção por R. vitalii.
A redução da atividade da NTPDase, 5’-ectonucleotidase e ADA em plaquetas de cães portadores de rangeliose, durante o período de infecção, pode ser relacionada a trombocitopenia.
O aumento da atividade enzimática da NTPDase e da 5-nucleotidase no dia 21 PI pode ser atribuído a um aumento compensatório no número de plaquetas.
O aumento nas concentrações de adenosina desaminase, um inibidor da agregação plaquetária, pode contribuir para hemorragias em cães infectados por R. vitalii.
Este estudo apresenta relevância científica, pois demonstra pela primeira vez, alterações na atividade das enzimas que participam da cascata purinérgica em cães infectados por R. vitalii, tornando-se evidente que essas enzimas estão implicadas na fisiopatologia da doença, contribuindo para ocorrência das diáteses hemorrágicas.
Procedeu-se ao estudo da sinalização purinérgica a contagem de plaquetas no sangue periférico de cães infectados por R. vitalii e observou-se acentuada trombocitopenia nestes cães. Entretanto, durante a avaliação de megacariócitos em aspirados foi encontrado um aumento no número destas células. Este resultado é importante, pois descartou que a redução no número de plaquetas no sangue periférico em cães com rangeliose tenha sido decorrente de afecções nos megacarióciotos ou na megacariopoiese, levando a acreditar que a trombocitopenia é decorrente da destruição das plaquetas circulantes, possivelmente por processos imunomediados.
Outro aspecto a ser considerado neste estudo diz respeito à mensuração do TP e TTPa. Neste trabalho não foi observada diferença significativa nestes testes de coagulação sanguínea entre os grupos infectado e controle. Isto é relevante, uma vez que demonstra que as alterações hemorrágicas na infecção por R. vitalii não podem ser atribuídas a coagulopatia de consumo.
Por fim, é importante chamar a atenção para redução da agregação plaquetária e as alterações na hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeo observadas neste trabalho, o que tornou evidente a contribuição da sinalização purinérgica nas diáteses hemorrágicas em cães infectados por R. vitalii.
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