COLIFORMES FECAIS NÃO EXISTEM
Daniel Adolpho Cerqueira(1)
Biólogo - Mestre em Microbiologia pela UFMG - Responsável pelo Controle Microbiológico da COPASA - MG. Professor convidado para o Curso de Especialização em Engenharia Sanitária e Ambiental da UFMG.
Mário César de Sá Horta
Engenheiro Civil com Especialização em Engenharia Sanitária pela Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG. Coordenador do Laboratório Metropolitano de Belo Horizonte - COPASA - MG.
Endereço(1): Setor de Análises Microbiológicas Laboratório Metropolitano COPASA
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RESUMO
Os níveis de poluição fecal dos ambientes aquáticos têm sido avaliados bacteriologicamente através do parâmetro Coliformes Fecais. Esse parâmetro tem sido obtido por meio do teste da temperatura elevada. Nesse teste a amostra é semeada em meios de cultura baseados na lactose como fonte de carbono e incubada à temperatura de 44,5 ± 0,2 oC por 24 horas . Essa temperatura é o fator de diferenciação entre os sub grupos fecais (termotolerantes) e não fecais (termosensíveis). Entretanto as últimas pesquisas têm mostrado que esse fator de diferenciação não tem sido suficiente para essa finalidade. A imprecisão desse teste tem levado à assunção do parâmetro coliformes fecais-termotolerantes como índice suficiente para avaliação da poluição fecal de ambientes aquáticos. A espécie termotolerante Escherichia coli é de origem fecal, humana e animal, em percentuais confiáveis para sua utilização como parâmetro de definição da poluição fecal e risco sanitário para a utilização de fontes de água. Outras espécies dos gêneros Klebsiella e Enterobacter, entretanto, embora sejam agrupadas como coliformes fecais têm sido isoladas de ambientes aquáticos não poluídos por matéria fecal. A simplicidade e sensibilidade dos testes cromofluorogênicos, atualmente disponíveis, justificam a implantação da E. coli como parâmetro de escolha conforme estabelecido pela Organização Mundial da Saúde em seus Guias para o Controle da Qualidade da Água para Consumo Humano de 1995.
PALAVRAS-CHAVE: Coliformes Fecais - Termotolerantes, Escherichia Coli, Poluição
Fecal.
INTRODUÇÃO
O parâmetro coliformes fecais não existe. O que se tem informado como coliformes fecais até hoje pelos laboratórios é uma leitura dos coliformes termotolerantes.. Esse
sub-grupo inclui aqueles coliformes que desenvolvem-se à temperatura elevada - 44,5 ± 0,2 o
C - sejam de origem fecal ou ambiental.
Coliformes termotolerantes devem incluir a Escherichia coli e espécies dos gêneros
Klebsiella e Enterobacter. Desses, apenas a E. coli tem presença garantida nas fezes,
humanas e animais homeotérmicos com percentuais em torno de 96 a 99%. Os demais gêneros participam com percentuais que variam entre 3 e 8% em fezes animais a 3 a 4% em fezes humanas.
Os coliformes que desenvolvem à temperatura elevada (44, 5 ± 0,2 oC) termotolerantes -e qu-e não são E. coli, como Kl-ebsi-ella -e Ent-erobact-er comum-ent-e são isolados d-e ambientes não poluídos por matéria fecal como solo, vegetais e ambientes aquáticos naturais.
O Grupo Coliforme e seus Subgrupos
Desde o final do século passado e início deste, os cientistas e autoridades em saúde pública têm recomendado a utilização de uma espécie de bactéria isolada de material fecal humano como parâmetro de avaliação bacteriológica da contaminação da água.
Naquela época esse microrganismo nomeado como Bacterium coli, foi posteriormente renomeado como Bacillum coli e ainda, mais tarde, Escherichia coli (Waite, 1997 ). O critério cultural proposto para detecção e identificação desse “bacilo Gram negativo, não esporulado, aeróbio/anaeróbio “era, naquela época somente baseado em sua capacidade de “fermentar a lactose com produção de ácido e gás em até 48 horas a 35 oC “.
Esse microrganismo tem sido utilizado como parâmetro bacteriológico pelos serviços de abastecimento no controle da qualidade da água.
Com o desenvolvimento da Microbiologia Sanitária, vários estudos têm mostrado que esse critério permite a detecção de uma série de microrganismos tanto de origem fecal como ambiental.. Ao longo dos anos, vários gêneros da família Enterobacteriaceae, como
Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter foram isolados de amostras de água a partir do
mesmo critério anteriormente atribuído apenas à Escherichia coli (Geldreich, 1997). O coliforme mais comumente isolado de amostras de água não poluída por fezes tem sido o Enterobacter aerogenes, enquanto a Escherichia coli tem sido mais isolada de amostras de água poluída por fezes. Outras espécies desses e dos demais gêneros (Klebsiella e
Citrobacter) tem sido isoladas de uma e outra origem. Dessa forma esse parâmetro foi
artificialmente classificado como grupo “coli-aerogenes“ e, mais tarde, coliformes.
Considerando, que apenas os microorganismos de origem fecal deviam ser utilizados como indicadores da qualidade da água, vários testes foram propostos para a diferenciação entre os coliformes de origem fecal e aqueles de outras origens. Dentre esses testes, a quantidade de gases formados (H2 e CO2) , a utilização de vários açúcares, produtos de catabolismo como indol e acetoína, foram propostos como critérios de separação entre os sub-grupos fecais e não fecais.
Entretanto com a dificuldade em se utilizar esses diferentes testes nos exames de rotina adotou-se um que era apenas baseado na suposta capacidade dos coliformes de origem fecal fermentarem a lactose à temperatura de 44,5 oC. Esse teste, denominado
temperatura elevada foi sendo utilizado como critério suficiente para a detecção de
coliformes fecais. Estudos mais avançados têm revelado ser esse critério insuficiente para essa finalidade (Duncan,1988).
Outros estudos mostraram que mínimas variações dessa temperatura podem ser suficientes para invalidação do teste. Mostraram que populações expressivas de bactérias não coliformes, heterotróficas, interferem decisivamente no teste. E, ainda, que algumas linhagens de Escherichia coli são incapazes de produzir gás em lactose tanto a 35 como em 44,5 oC, o que determinam resultados falso-negativos.(Dufour, 1977). Estima-se em 12% o percentual de coliformes que não produzem gás nos testes de fermentação da lactose e entre 15 e 20% a faixa percentual de coliformes que não desenvolvem colônias com o brilho metálico típico nos meios tipo Endo (Evans et al, 1981).
Ramteke et al (1992) avaliando águas naturais em diferentes regiões da Índia, encontraram que 96 a 99% dos coliformes termotolerantes eram E. coli em águas superficiais enquanto que em águas subterrâneas esse percentual descia para 54 a 61%. Observaram, também, que uma grande diversidade na microbiota das regiões tropicais contribui para a redução da eficiência do teste para coliformes termotolerantes . Niemi et al (1997) verificaram que em despejos industriais altas concentrações de espécies coliformes termotolerantes não fecais interferiram seriamente na detecção de E. coli, recomendando o uso dessa espécie como parâmetro de avaliação da contaminação de águas naturais.
Coliformes termotolerantes dos gêneros Klebsiella e Enterobacter têm sido isolados de águas pristinas e de despejos de fábricas de papel. (Bagley et al , 1978). Espécies do gênero Klebsiella têm sido isoladas de ambientes aquáticos sem qualquer perturbação sanitária e, principalmente, das superfícies internas de canalização de água potável, formando biofilmes que as mantêm persistentes nesses ambientes por vários meses, inclusive proporcionando condições de proliferação. (McFeters et al, 1984; Parker et al, 1997).
Os Guias da Organização Mundial da Saúde de l995, definem a Escherichia coli como parâmetro de escolha na avaliação bacteriológica de fontes de abastecimento. Esses guias alertam que algumas espécies coliformes podem sobreviver e, ainda, proliferar em ambientes aquáticos tropicais. Waite, em seu artigo “Regulamento para Água de Consumo - Uma Perspectiva Européia (1997) escreve que “..Por razões mais pragmáticas que científicas, a prática de se monitorar através do parâmetro coliformes fecais ou termotolerantes em lugar da espécie fecal Escherichia coli tem ganho larga adoção”.
Perspectivas
Toda ciência, até pela sua sobrevivência, deve ser dinâmica. A Microbiologia Ambiental e Sanitária tem evoluído, e nesses últimos dez anos experimentou grande progresso em função das tecnologias emergentes. A detecção e identificação simples e rápida da E. coli para fins de monitoramento de mananciais tem sido possível nesses últimos 5 anos através dos testes cromo-fluorogênicos baseados em expressões enzimáticas dessa, e de
Avaliações da sensibilidade e confiabilidade desses testes têm sido feitas em todo o mundo e, principalmente em climas tropicais e subtropicais os perfis de ocorrência de coliformes termotolerantes e de E. coli apresentam contornos característicos que mostram, cada vez mais, a qualidade do uso dessa espécie como parâmetro de definição de impactos fecais.
Dessa forma, é tempo de acertos nos conceitos e terminologias que melhor representem os objetivos sanitários e ambientais de medições da contribuição fecal. Coliformes fecais, como parâmetro, não existem. O parâmetro que melhor avalia o nível de poluição fecal dos ambientes de simples processamento e que encontra-se já padronizado e devidamente documentado é a Escherichia coli. Para complementar esse parâmetro e melhorar os laudos microbiológicos no sentido de definir tanto a poluição fecal quanto a possibilidade de sua origem utiliza-se o parâmetro Enterococcus (Charriere et al, 1994).
Em futuro próximo devem ser padronizados e simplificadas as técnicas de detecção e identificação de outros parâmetros microbiológicos para funções similares a que eram atribuídas aos “coliformes fecais “como o Clostridium perfringens. Esse microrganismo, por ser esporulado informa sobre poluições fecais mais remotas que aquelas indicadas pela presença de E. coli assim como pode assegurar ausências de microrganismos patogênicos de maior persistência que essa espécie. Outro parâmetro a ser assimilado é Colifagos, que são vírus bacteriófagos de E. coli e podem informar sobre a eficiência do tratamento da água na remoção dos Enterovírus e outros vírus como o da Hepatite de veiculação hídrica.
Detecção de E. coli
Atualmente, devido aos sistemas e testes de substratos cromogênicos, específicos para algumas espécies utilizadas como parâmetros indicadores, a detecção de E. coli tornou-se mais simples que a de coliformes termotolerantes (ex-fecais). Por dispensar o uso de temperatura elevada (44,5 ± 0,2 oC) que exige controle rígido de sua variação o teste para
E. coli utiliza meios aos quais são incorporados substratos que possam ser hidrolizados
por enzimas específicas da espécie (Allen, 1997).
Comumente são empregados substratos como β- D-glucoronida ao qual são incorporados radicais cromogênicos como o 5-bromo-4 cloro-3 indolil ou 4-metilumbeliferil . Existem, atualmente, várias formas de apresentação comercial desses substratos, pulverizados ou desidratados. Comumente aqueles pulverizados apresentam maior facilidade de uso enquanto são mais caros que aqueles desidratados que exigem etapas de pesagem, hidratação, esterilização e estocagem refrigerada para uso. (Thomas et al, 1997).
Essas detecções podem ser no formato Presença-Ausência ou no formato de Quantificação, tanto através do Número mais Provável quanto por filtração por membrana. A precisão e limite de detecção são superiores nos testes de substratos cromogênicos por serem esses processos dependentes de enzimas constitutivas da espécie.(APHA, 1995).
Em fezes humanas a contribuição da E. coli é praticamente de 100%. (Figura 1) Esse percentual foi obtido em recente estudo sobre o Perfil de Coliformes Termotolerantes e de Escherichia coli em Diferentes Amostras de Água (Cerqueira et al, 1998). As espécies
fecais não E. coli como algumas dos gêneros Klebsiella e Enterobacter são de ocorrência variável e não apresentam características fisiológicas ainda disponíveis que possam ser identificadas em sistemas “in vitro” de detecção. Os percentuais de ocorrência desses gêneros em fezes humanas e animais têm sido avaliados em vários estudos. (Tabela 2).
Figura 1: Percentual de E. coli em Fezes Humanas.
% Termotolerantes em Fezes 0 20 40 60 80 100 F1 F3 F5 F7 F9 F11 F13 F15 F17 F19 F21 F23 F25 F27 F29
Fonte: Perfis de Ocorrências de Coliformes Termotolerantes e de E. coli em Diferentes Amostras de Água. Cerqueira et al, 1998.
Tabela 1: Percentuais dos gêneros de coliformes em fezes humanas e animais. Animal
(#examinado) E. coli Klebsiella spp
Enterobacter/ Citrobacter Frango (11) 90 1 9 Vaca (15) 99,9 -- 0,1 Ovelha (10) 97 -- 3 Cabra (8) 92 8 --Porco (15) 83,5 6,8 9,7 Cão (7) 91 -- --Gato (7) 100 -- --Cavalo (3) 100 -- --Homem (26) 96,8 1,5 1,7 Média (%) 94,5 1,9 2,6
Fonte: Escherichia coli: The Fecal Coliform. A P. Dufour. Special Technical Publication 65, American Society for Testing and Materials, pg 48-58, 1977.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Coliformes Totais não são, definitivamente, parâmetro de avaliação das condições sanitárias de ambientes aquáticos. Devido à sua simplicidade de processamento e larga documentação de uso esse parâmetro deve continuar sendo aplicado em avaliações dos processos de tratamento e da integridade das unidades de distribuição dos sistemas de abastecimento. Coliformes Termotolerantes, anteriormente assumidos como fecais, não é parâmetro sensível para uma avaliação criteriosa da exposição de ambientes aquáticos às poluição fecal, humana e animal. Nesse sentido, uma vasta documentação técnico-científica sustenta a utilização da espécie Escherichia coli. O teste convencional para a determinação de coliformes termotolerantes (ex-fecais) mostra-se inviável devida à
dificuldade em se manter a variação máxima de 0,2 oC nas estufas e banho-marias e inespecífico considerando que engloba espécies ambientais dos gêneros Klebsiella e
Enterobacter. Dessa forma recomenda-se a utilização de coliformes para avaliação de
processo de tratamento e da E. coli como parâmetro de avaliação bacteriológica da água na fonte. É aconselhável a inclusão de parâmetros microbiológicos auxiliares como Clostrídios sulfito - redutores e Colifagos para otimizar o controle da qualidade da água dos sistemas de abastecimento.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Allen, M. A, The Public Health Significance Of Bacterial Indicators In Drinking Water. In:
Coliforms and E. coli: Problem or Solution? D. Kay e C. Fricker Ed. London, p.176-181. 1997.
2. APHA, AWWA, WEF. Standard Methods for the Examination of Water and wastewater,19a. ed.Washington,1995.
3. Bagley S.T., R. J. Seidler, H. W. Talbot, and J. E. Morrow. Isolation of Klebsiella from Within Living Wood. Appl, Environm. Microbiol.,1978;36(1):178-185.
4. Cerqueira, D. A, De Brito, L. L., Galinari, P. A, G. C. M. Amaral. Perfis de Ocorrências de Coliformes Termotolerantes e de E. coli em diferentes Amostras de Água, 1998.
5. Charriere, G., D. A, A, Mossel, Beaudeau and Leclerc, H. Assessment of The Marker Value of Various Components of The coli-aerogenes group of Enterobacteriaceae and of a selection of Enterococcus spp. For The Official Monitoring of Drinking Water Supplies. Journal of Applied
Bacteriology, p. 336- 344, 1994.
6. Ducan I.B.R. Waterborne Klebsiella and Human Diseases. Toxicity Assessment-Na International
Journal, 1988; 3(5):581-5981988.
7. Dufour. P. Escherichia coli: The Fecal Coliform. Special Technical Publication 65, American Soc. 1977.
8. Evans T. M. C. E. Waarvick, Ramon J. Seidler and M. W. LeChevallier. Failure Of The Most-Probable Number Technique to Detect coliforms in Drinking Water and Raw Water Supplies, Applied
and Environmental Microbiology, Jan, p. 130-138, 1981.
9. Geldreich E. E. Coliforms: A New Beginning To An Old Problem, IN: Coliforms and E. coli:
Problem or Solution?. D. Kay e C. Fricker Ed. London, p. 3-11, 1997.
10. McFeters G. A, Effects Of Aquatic Environmental Stress On Enteric Bacterial Pathogens And Coliforms, In: Coliforms and E. coli: Problem or Solution? D. Kay e C. Fricker Ed. London, p. 235-242. 1997.
11. Niemi, R. M.S.I. Niemela, K. Lahti & J. S. Niemi, Coliforms And E. coli In Finnish Surface Waters. In: Coliforms and E. coli: Problem or Solution? D. Kay e C. Fricker Ed. London, p. 112-119.1997. 12. OMS, Guias Para la Calidad Del Agua Potable, Vol. 1: Recomendaciones, Genebra,1995.
13. Parker P. J., D. M. Holt, J. S. Colbourne & C. W. Keevil, Does Klebsiella oxytoca Grow In The Biofilm Of Water Distribution Systems? CAMR , UK.The 1997 In: Coliforms and E. coli: Problem
or Solution? D. Kay e C. Fricker Ed. London, p. 189-194, 1997.
14. Ramteke P. W. , Bhattacharjee, S. P. Pathak and N. Kaira. Evaluation of coliforms as Indicators Of Water Quality in India. Journal of Applied Bacteriology, (72)p. 352-356. 1992.
15. Thomas, B. R. Williams, S. Foster & P. Grant - Development And Evaluating Of a New System For The Simultaneous Enumeration Of Coliforms And E. coli Celsis Ltd 1997 In: Coliforms and E. coli:
Problem or Solution? D. Kay e C. Fricker Ed. London, p. 40-48, 1997.
16. Waite, W. M. Drinking Water Quality Regulation - European Perspective. In: Coliforms and E.
