ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK.

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK.. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. Aline Augusti Boligon. Santa Maria, RS, Brasil. 2010.

(2) 2. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK.. por. Aline Augusti Boligon. Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Controle e Avaliação de Insumos e Produtos Farmacêuticos, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.. Orientadora: Profª. Drª. Margareth Linde Athayde. Santa Maria, RS, Brasil 2010.

(3) 3. Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK.. elaborada por Aline Augusti Boligon. como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. COMISSÃO EXAMINADORA: Margareth Linde Athayde, Drª. (Presidente/Orientador). Eloir Paulo Schenkel, Dr. (UFSC). Adair Roberto Soares dos Santos, Dr. (UFSC). Santa Maria, 30 de março de 2010.

(4) 4. AGRADECIMENTOS. A Deus por ter estado sempre presente na minha vida. A Universidade Federal de Santa Maria pelas oportunidades oferecidas. Ao. Programa. de. Pós-Graduação. em. Ciências. Farmacêuticas. pela. oportunidade e por oferecer subsídios necessários para o desenvolvimento dos experimentos. A CAPES pela bolsa concedida. A Professora Doutora Margareth Linde Athayde, pela orientação, apoio e amizade, de maneira indispensável, durante todos os passos para a realização dessa dissertação, dedico meu carinho e admiração. Aos professores do Curso de Pós-Graduação pelos conhecimentos compartilhados. durante. minha. formação,. disponibilidade. e. atenção,. mas. principalmente pela constante amizade e incentivo de todos, meus mais sinceros agradecimentos. Aos professores João Batista Teixeira da Rocha, Sydney Hartz Alves, Marli Matiko Anraku de Campos, Ademir Farias Morel e Adair Roberto dos Santos pelo auxílio na realização das análises. A Bióloga Mestre em Botânica Nelci Rolim Basto Zacchia, pela identificação do material vegetal. A todos os alunos, graduação e pós-graduação, do Laboratório de Fitoquímica, pelo convívio, amizade, colaboração e aprendizado. Aos meus pais Glória Maria e Sérgio, exemplos de vida, pelo amor, dedicação e por me ensinarem a ter caráter e a lutar. Aos meus irmãos e suas famílias pela amizade e pelos bons momentos de convivência. Ao meu noivo Giancarlo, por estar ao meu lado, me ouvir e me apoiar nos momentos difíceis e compartilhar comigo as vitórias. A todos aqueles, citados ou não, que contribuíram direta ou indiretamente para a realização dessa dissertação os mais sinceros agradecimentos..

(5) 5. RESUMO Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Universidade Federal de Santa Maria. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE FLAVONÓIDES E TERPENÓIDES OBTIDOS DAS FOLHAS E DA CASCA DO TRONCO DE SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK. AUTORA: ALINE AUGUSTI BOLIGON ORIENTADORA: MARGARETH LINDE ATHAYDE Data e Local da Defesa: Santa Maria, 30 de março de 2010. A família Rhamnaceae é composta por cerca de 58 gêneros e aproximadamente 900 espécies. A espécie Scutia buxifolia Reissek, é conhecida popularmente como coronilha, é uma planta nativa da América do Sul, com uma dispersão que compõe o estado do Rio Grande do Sul no Brasil, Argentina e Uruguai. A decocção das cascas do tronco e folhas é utilizada popularmente como cardiotônica, hipotensora e diurética. O presente trabalho objetivou isolar e identificar flavonóides e triterpenos presentes em S. buxifolia bem como analisar a capacidade de capturar radicais livres. As cascas do tronco e as folhas de S. buxifolia foram coletadas em outubro de 2007 no município de Dom Pedrito–RS. O material está depositado no herbário do Departamento de Biologia da UFSM catalogado sob o número de registro SMBD 10919. O material vegetal foi seco, moído e macerado utilizando como solvente etanol:água (70:30, v/v). Fez-se fracionamento do extrato bruto com solventes orgânicos de polaridades crescentes (CH2Cl2, AcOEt, n-BuOH). Na fração AcOEt das folhas caracterizou-se os flavonóides quercetina, quercetina 3-0-rhamnosídeo, quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo e rutina. Da fração CH2Cl2 das cascas do tronco, os esteróides β-sitosterol e estigmasterol, e o triterpeno lupeol. Os compostos isolados foram analisados por 1H-RMN e 13C-RMN e seus dados espectroscópicos foram comparados com os obtidos da literatura. Os compostos isolados foram quantificados por CLAE. O extrato bruto e as frações de S. buxifolia foram investigadas quanto a peroxidação lipídica, atividade antioxidante e conteúdo de fenóis totais. O conteúdo de fenólicos totais variou de 141,09 ± 0,71 a 323,47 ± 2,62 mg/g para as cascas do tronco e de 72,09 ± 0,50 a 383,34 ± 2,31 mg/g para as folhas de S. buxifolia. O extrato bruto e as frações provocaram uma queda acentuada na produção de TBARS com IC50 de 2,93 ± 2,17 a 40,46 ± 2,51 µg/mL para as folhas e 0,66 ± 0,17 a 27,3 ± 1,23 µg/mL para a cascas do tronco. Para o ensaio do DPPH a ordem de captação de radicais livres foi: AcOEt > n-BuOH > CH2Cl2 > extrato bruto, para as duas partes da planta.. Palavras – chave: Scutia buxifolia; Rhamnaceae; flavonóides; DPPH; TBARS; CLAE..

(6) 6. ABSTRACT Master’s Degree Dissertation Postgraduate Program in Pharmaceutical Sciences Federal University of Santa Maria. ANTIOXIDANT ACTIVITY OF FLAVONOIDS AND TERPENOIDS OBTAINED FROM THE LEAVES AND STEM BARK OF SCUTIA BUXIFOLIA REISSEK.. AUTHOR: ALINE AUGUSTI BOLIGON ADVISER: MARGARETH LINDE ATHAYDE Date and Place of the Defense: Santa Maria, March 30th, 2010.. The Rhamnaceae family is composed of some 58 genera and about 900 species. Scutia buxifolia Reissek species, popularly known as coronilha, is a local plant from South America, with a dispersion that comprise Rio Grande do Sul state in Brazil, Argentina and Uruguay. The stem bark and leaves decoction are popularly used as cardiotonic, antihypertensive and diuretic. This work aims to isolate and identify flavonoids and triterpenes present in Scutia buxifolia and analyze ability to capture free radicals. Stem bark and leaves of S. buxifolia were collected in October 2007 in Dom Pedrito-RS (coordinates 30º 59'09''S and 54º27'44''W). The material is deposited in the herbarium of the Department of Biology UFSM cataloged under the registration number SMBD 10919. The dried plant material was ground and macerated using ethanol: water (70:30, v/v) as solvent. The crude extract was fractionated with solvents of increasing polarity (CH2Cl2, AcOEt, n-BuOH). In AcOEt fraction of the leaves was characterized quercetin, quercetin 3-0-rhamnosíde, quercetin 3-0-β-Dglucopyranoside and rutin, and the CH2Cl2 fraction of stem bark the steroids β-sitosterol and stigmasterol, and the triterpene lupeol. The compounds were analyzed by 1H-NMR and 13CNMR and spectroscopic data were compared with those obtained from the literature. The compounds were quantified by HPLC in the fraction used for insolation. The crude extract and fractions of S. buxifolia were investigated for lipid peroxidation, antioxidant activity and total content of phenols. The total phenolic content ranged from 141.09 ± 0.71 to 323.47 ± 2.62 mg/g for stem bark and 72.09 ± 0.50 to 383.34 ± 2.31 mg/g for leaves of S. buxifolia. Crude extract and fractions caused a sharp fall in TBARS production with IC50 from 2.93 ± 2.17 to 40.46 ± 2.51 µg/mL for the leaves and 0.66 ± 0.17 to 27.3 ± 1.23 µg/mL for the stem bark. The order of capture of free radicals was: AcOEt > n-BuOH > CH2Cl2 > crude extract, for the two parts of the plant.. Key words: Scutia buxifolia; Rhamnaceae; flavonoids; DPPH; TBARS; HPLC..

(7) 7. LISTA DE FIGURAS. FIGURA 1 - Núcleo fundamental dos flavonóides .....................................................20. FIGURA. 2. -. Scutia. buxifolia. Reissek. (coronilha). –. Aspecto. geral. da. planta..........................................................................................................................22. FIGURA 3 - Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (1) scutianina A, (2) scutianina B, (3) scutianina C, (4) scutianina D, (5) scutianina E, (6) scutianina H.................................................................................................................................24. FIGURA 4 - Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (7) scutianina I, (8) scutianina F, (9) scutianina J, (10) scutianina K, (11) scutianina L, (12) scutianina M...............................................................................................................25. PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA 4.1. FIGURE 1 - Antioxidant activities of crude extract and dichloromethane, ethyl acetate and. butanolic. fractions. from. the. stem. bark. of. Scutia. buxifolia…………………………………………………………………....……………...…31. FIGURE 2 - Antioxidant activities of crude extract and dichloromethane, ethyl acetate and. butanolic. fractions. from. the. leaves. of. Scutia. buxifolia.…………………………………………………..…………………………………31. FIGURE 3 - Effects of different concentrations of crude extract, ethyl acetate, dichloromethane, and butanolic fractions from the stem bark on Scutia buxifolia on Fe (II) (10µM)-induced TBARS production in brain homogenates. The samples were incubated for 1h with Fe (II) and the plant extracts or without (basal). Data show means ± SEM values average from 3 to 4 independent experiments performed in duplicate……………………………………………………………………………………..32.

(8) 8. FIGURE 4 - Effects of different concentrations of crude extract (A), ethyl acetate (B), dichloromethane (C), and butanolic (D) fractions from the leaves on Scutia buxifolia on Fe (II) (10µM)-induced TBARS production in brain homogenates. The samples were incubated for 1h with Fe (II) and the plant extracts or without (basal). Data show means ± SEM values average from 3 to 4 independent experiments performed in duplicate……………………………………………………………………………………..32. FIGURE 5 - Flavonol compounds isolated from Scutia buxifolia. 1 R = OH; 2 R = 3-ORha; 3 R = 3-O-Glc; 4 R = 3-O-Glc (6”→1”’)-Rha......................................................32. FIGURE 6 - High performance liquid chromatography phenolic profile of ethyl acetate fraction from the leaves: 1 – quercetin, 2 – quercitrin, 3 – isquercitrin, and 4 – rutin. …………………………………………………………….................................................33. PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA 4.2. FIGURA 1 - Cromatograma das cascas do tronco (A), das folhas (B) e das soluções de referência (C). .......................................................................................................38. FIGURA 2 - Compostos isolados da fração em diclorometano das cascas do tronco de S. buxifolia.............................................................................................................38.

(9) 9. LISTA DE TABELAS. PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA 4.1. TABLE 1 – Total phenolics (TP) contents and antioxidant activities (IC50/DPPH) for the stem bark and leaves...........................................................................................31. TABLE 2 – Tested concentrations in the TBARS assay and IC50 (µg/mL) values for crude extract and fractions from the leaves and stem bark of Scutia buxifolia….…..32. TABLE 3 – Flavonols composition of Scutia buxifolia leaf ethyl acetate fraction…....32. PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA 4.2. TABELA 1 - Quantificação de esteróides na fração em diclorometano das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia. *Resultados expressos na média ± D.P. de três determinações............................................................................................................38.

(10) 10. LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS. 1. H-RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio. 13. C-RMN – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13. Abs – Absorbância AcOEt – Acetato de etila ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária BuOH – n-Butanol CC – Cromatografia em coluna CCD – Cromatografia em camada delgada CG-MS – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas CH2Cl2 – Diclorometano DPPH – 1,1-diphenyl-2-picrilhydrazyl EB – Extrato bruto EtOH – Etanol Fig. – Figura GF254 – Gel de sílica com indicador de fluorescência para λ 254 nm HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência MeOH – Metanol min. – Minutos OMS – Organização Mundial da Saúde TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico UV – Ultravioleta λ – Comprimento de onda.

(11) 11. LISTA DE ANEXOS. Anexo 01: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina..............................58 1 Anexo 02: Espectro de H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina..................................................................................................................59. Anexo 03: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina-3-0ramnosídeo.................................................................................................................60 Anexo 04: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina-3-0ramnosídeo.................................................................................................................61 Anexo 05: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): quercetina 3-0-β-Dglicopiranosideo..........................................................................................................62 Anexo 06: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): quercetina 3-0-β-Dglicopiranosideo..........................................................................................................63 Anexo 07: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): rutina......................................64 Anexo 08: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): rutina.......................................65 Anexo 09: Espectro de 13C-RMN (100 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol + estigmasterol..............................................................................................................66 Anexo 10: Espectro de 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): Mistura de β-sitosterol + estigmasterol..............................................................................................................57. Anexo 11: Artigo publicado: Revista Saúde..............................................................68. Anexo 12: Artigo aceito para publicação: Revista Saúde.........................................73.

(12) 12. SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................13 2 OBJETIVOS ........................................................................................................16 2.1 Objetivo geral ....................................................................................................16 2.2 Objetivos específicos........................................................................................16 3 REVISÃO DA LITERATURA...............................................................................17 3.1 Importância das plantas para o desenvolvimento de fitoterápicos..............17 3.2 Espécies reativas de oxigênio e Estresse Oxidativo .....................................18 3.3 Metabólitos secundários ..................................................................................19 3.3.1 Definição ..........................................................................................................19 3.3.2 Função e Importância.......................................................................................19 3.4 Descrição da planta ..........................................................................................21 3.4.1 Descrição da família Rhamnaceae...................................................................21 3.4.2 Descrição da espécie Scutia buxifolia Reissek ................................................21 3.4.3 Compostos isolados de Scutia buxifolia ...........................................................22 3.4.4 Atividades biológicas descritas para Scutia buxifolia .......................................26 4 PUBLICAÇÕES CIENTÍFICAS ...........................................................................27 5 DISCUSSÃO GERAL ..........................................................................................40 6 CONCLUSÕES....................................................................................................47 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................48.

(13) 13. 1. INTRODUÇÃO. O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas é tão antigo quanto a civilização humana e, por um longo tempo, compostos de origem mineral, vegetal e animal foram as principais fontes de drogas para a população. Foi a partir de estudos clínicos, farmacológicos e químicos das plantas, baseados na medicina tradicional, que surgiram os primeiros fármacos utilizados pelo homem, como o ácido acetilsalicílico, digitoxina, morfina, quinina e pilocarpina (BUSS et al., 2003; MANN, 2000; NEWMAN et al., 2000; SNEADER, 1996). A biodiversidade dos vegetais constitui uma grande riqueza em potencial para a saúde humana. As plantas são fontes de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais são utilizados para síntese de inúmeros fármacos. Embora cerca de 100.000 compostos oriundos de plantas tenham sido identificados, as fontes de metabólitos secundários parecem ser inesgotáveis em relação às possibilidades de se encontrar novas e diferentes estruturas com atividades importantes à terapêutica e à agricultura (YUNES, CALIXTO, 2001), uma vez que, apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal e somente para algum efeito especifico (FERREIRA, 1998). Aproximadamente 25% de todos os fármacos prescritos mundialmente foram originários de plantas, sendo que 121 destes compostos continuam em corrente uso (LOZOYA, 1997). Além disso, dos 252 fármacos considerados como essenciais pela Organização Mundial da Saúde (OMS), 11% são exclusivamente originados de plantas. Compostos naturais também são passíveis de sofrerem modificações estruturais, possibilitando o planejamento racional de novas moléculas e obtenção de estruturas mais eficazes e seguras, ou mesmo com outras propriedades farmacológicas até então não esperadas (RATES, 2001). O Brasil possui a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (DIAS, 1996), porém apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foram estudadas em busca de compostos bioativos e 1100 espécies foram avaliadas em suas propriedades medicinais. Destas, 590 plantas foram registradas no Ministério.

(14) 14. da Saúde para a comercialização (ORTEGA et al., 1989). Devido a grande diversidade de espécies, aumentam-se as chances de identificação de substâncias do metabolismo vegetal com atividades farmacológicas e descobrimento de novos alvos biológicos. Portanto, muitas patologias que hoje permanecem sem um tratamento adequado, poderão vir a ser tratadas de forma mais eficiente, a partir de novos e potentes fármacos de origem vegetal (SIMÕES et al., 2004). Nos últimos anos cresceu consideravelmente o interesse por terapias alternativas e pelo uso terapêutico de produtos naturais, principalmente aqueles obtidos de plantas (YUNES, CALIXTO, 2001). Este comportamento pode ser explicado pelo fato de que grande parcela da população não tem acesso aos tratamentos convencionais e, na crença errônea de que os produtos naturais não produzem efeitos colaterais. A OMS estima que no ano de 2020 a população mundial chegará a 7,5 bilhões de pessoas e que destas 75% viverão em paises em desenvolvimento, os quais consomem hoje menos de 15% do mercado total de medicamentos. Essas observações indicam que, no futuro, esta população dependerá ainda mais das plantas medicinais. Visando diminuir o número de excluídos dos sistemas governamentais de saúde, a OMS recomenda aos órgãos responsáveis pela saúde pública de cada país, que realizem levantamentos regionais das plantas utilizadas na medicina popular tradicional estimulando o uso daquelas que tiverem comprovado sua eficácia e segurança terapêutica (LORENZI, MATOS, 2002). As plantas da família Rhamnaceae apresentam uma variada classe de constituintes químicos, como alcalóides ciclopeptídicos (MOREL et al., 1995; MARCHAND et al., 1968), flavonóides, antocianinas, taninos, esteróides e triterpenos (SHAH et al., 1985). Os alcalóides ciclopeptídicos são bastante difundidos na medicina popular no tratamento de várias moléstias, tais como: disenteria, hipertensão arterial (KLEIN, RAPOPORT, 1968) e vários tipos de infecções (SHAH et al., 1985). Por exemplo, as cascas do tronco da planta Scutia buxifolia, conhecida popularmente como coronilha, contém matéria tintorial e serve para a preparação de uma tintura utilizada como tônico do coração (WASICKY et al., 1964). Esta dissertação apresenta seus resultados na forma de artigos científicos, sendo formatada de acordo com os periódicos onde os artigos foram publicados. Contempla também, um item de discussão geral, no qual os resultados são.

(15) 15. interpretados em conjunto, além das conclusões, referências bibliográficas e dos anexos, onde são apresentados os espectros de ressonância magnética dos compostos isolados e demais artigos publicados sobre o tema..

(16) 16. 2. OBJETIVOS. 2.1 Objetivo geral. O objetivo principal desta dissertação foi estudar quimicamente a espécie Scutia buxifolia Reissek (folhas, talos e cascas do tronco).. 2.2 Objetivos específicos. Realizar doseamento de compostos fenólicos no extrato bruto e frações da planta; Avaliar a capacidade captadora de radicais livres pelo método colorimétrico do DPPH; Avaliar a peroxidação lipídica pelo método do TBARS; Isolar metabólitos secundários da planta; Identificar quimicamente o (s) composto (s) isolado (s); Quantificar os compostos isolados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)..

(17) 17. 3. REVISÃO DA LITERATURA. 3.1 Importância das plantas para o desenvolvimento de fitoterápicos. O conhecimento empírico relacionado às plantas medicinais faz com que estas sejam amplamente utilizadas na medicina popular e, sendo o Brasil detentor de uma das floras mais ricas do mundo em matéria prima para fitoterápicos, é indispensável o estabelecimento de bases científicas para o emprego destes vegetais na terapêutica (SIMÕES et al., 2004). Segundo Ferreira (1998) há alguns anos o Brasil já se encontra entre os dez maiores consumidores de medicamentos do mundo, entretanto, a lei das patentes enfraqueceu as perspectivas das indústrias químicas brasileiras. Isto impôs a necessidade de diversificação fazendo com que o segmento de fitoterápicos se torne muito atraente, onde o mercado brasileiro, referente a plantas medicinais, tem movimentado recursos na ordem de 0,7 a 1,0 bilhão de dólares/ano. A transformação de plantas em medicamentos deve visar à preservação da integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a ação farmacológica e segurança de utilização, além de valorizar seu potencial terapêutico, requerendo assim, estudos prévios de modo a desenvolver metodologias analíticas e tecnológicas (MIGUEL, MIGUEL, 1999). As plantas, assim como os animais, têm em substâncias do metabolismo especial, como terpenos oxidados, taninos, fenóis, alcalóides, lignanas, cafeína e aminas, seus principais sistemas antioxidantes (LARSON, 1988; COTELLE, 1996; OKADA et al., 1996). Essas substâncias também contribuem com diversas funções ecológicas de extrema importância nas relações de competição nos ecossistemas terrestres, como polinização, alelopatia, defesa contra herbívoros e patógenos (GOTTLIEB 1989; LANGENHEIN, 1994)..

(18) 18. 3.2 Espécies reativas de oxigênio e Estresse Oxidativo. As células estão continuamente produzindo radicais livres e espécies reativas de oxigênio (EROs) como parte do processo metabólico. As principais EROs relacionadas ao estresse oxidativo são o ânion superóxido (O2-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (HO•). As espécies reativas são moléculas que apresentam um elétron desemparelhado na sua órbita externa. Estas moléculas se caracterizam por ser altamente instáveis e por ter um tempo de vida muito curto. Estas. espécies. reativas. são. normalmente. neutralizadas. pelos. sistemas. antioxidantes presentes nos organismos. Assim o estado de estresse oxidativo pode resultar tanto de um aumento na produção de EROs quanto da redução da capacidade antioxidante celular total. Ou seja, a ocorrência de um dano oxidativo depende de um desequilíbrio entre a produção de EROs e a atividade das defesas antioxidantes (HALLIWEL, 1992; MEAGHER, FITZGERALD, 2000; PENG et al., 2000; SILVA et al., 2005). O estresse oxidativo é uma condição celular ou fisiológica de elevada concentrações de ERO que causa danos moleculares às estruturas celulares, tem sido relacionado à instalação e progressão de diversas doenças degenerativas, através de mutação do DNA, oxidação protéica e peroxidação lipídica (VALKO et al., 2006; VALKO, et al., 2007) com conseqüente alteração funcional e prejuízo das funções vitais em diversos tecidos ou órgãos (HALLIWELL, 1992). No entanto, o efeito deletério do estresse oxidativo varia consideravelmente de um ser vivo para o outro, de acordo com a idade, o estado fisiológico e a dieta (HARMAN, 1992; SIES, 1997). Os organismos aeróbicos são protegidos contra as EROs por um complexo sistema antioxidante endógeno. Além desse sistema de defesa, produtos naturais com atividade antioxidante são importantes para atenuar o dano oxidativo, desta maneira complementando estas defesas (KANTER, 1998; VALKO et al., 2006; VALKO, et al., 2007). Neste sentido, há um interesse crescente pelos efeitos antioxidantes de produtos naturais e do seu papel na saúde e na doença..

(19) 19. 3.3 Metabólitos secundários. 3.3.1 Definição. O conjunto de reações que continuamente ocorrem em uma célula chama-se metabolismo.. Portanto,. os. compostos. químicos. formados,. degradados. e. transformados são chamados de metabólitos. Os constituintes químicos celulares, ou seja, as macromoléculas (lipídeos, proteínas, carboidratos e ácidos nucléicos) são as mesmas para um organismo vegetal e animal. São definidos como integrantes do metabolismo primário, o qual compreende varias reações químicas envolvida na transformação de moléculas de nutrientes em unidades essenciais as células (SANTOS, 1999). Metabólitos secundários são compostos químicos distintos dos intermediários e dos produtos do metabolismo primário. Eles variam de acordo com a espécie e a família e alguns são restritos a determinada família, gênero ou espécie, possibilitando o emprego como marcador taxonômico (BENETT, WALLSGROVE, 1994). Segundo Santos (1999), o metabolismo secundário garante vantagem para a sobrevivência do organismo produtor e permutação da espécie, embora não seja necessariamente essencial. É um metabolismo diferenciado (organelas, enzimas e coenzimas) capaz de produzir, transformar e acumular substâncias não relacionadas de forma direta a manutenção da vida do organismo produtor.. 3.3.2 Função e Importância. Durante muito tempo os metabólitos secundários foram considerados produtos de excreção dos vegetais. No entanto, hoje sabe-se que esta classe de metabólitos possui diversas funções, tais como: proteção contra raios UV; atração de polinizadores e de animais, dispersores de sementes, entre outras (SANTOS, 1999). Segundo o mesmo autor, os metabólitos secundários apresentam atividades biológicas interessantes. Muitos são usados comercialmente na área farmacêutica,.

(20) 20. perfumaria, agronômica, alimentar, entre outras. Pelo elevado número e grande diversidade destes metabólitos vegetais eles despertam interesse de pesquisadores de vários campos da ciência que vêem neles uma promissora fonte de novas moléculas potencialmente úteis ao homem. Os flavonóides compõem uma ampla classe de substâncias de origem natural. Tais compostos possuem uma série de propriedades farmacológicas que os fazem atuar sobre os diversos sistemas biológicos. As propriedades antioxidantes dos flavonóides podem ser benéficas à saúde, por prevenirem a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade, por exemplo (ARAÚJO et al., 2005). Pode-se encontrar flavonóides em diversas formas estruturais. Entretanto, a maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbono em seu núcleo fundamental, constituído de duas fenilas ligadas por uma cadeia de três átomos de carbono entre elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são chamadas núcleos A, B e C, e os átomos de carbono recebem a numeração com números ordinários para os núcleos A e C e os mesmos números seguidos de uma linha (‘) para o núcleo B, como mostra a figura 1 (ZUANAZZI, MONTANHA, 2004).. 5' 6'. 9. 7. A 6 5. O C. 4'. B. 8. 3' 2. 2'. 3. 10. O. Figura 1 - Núcleo fundamental dos flavonóides (adaptado de Zuanazzi, Montanha, 2004). Os fitoesteróides, esteróides das plantas, são semelhantes ao colesterol do ponto de vista estrutural, têm um núcleo esteroidal, um grupo hidroxilo na posição 3beta, e uma dupla ligação na posição 5-6. Contudo, enquanto que no colesterol a cadeia lateral é formada por 8 átomos de carbono, nos fitoesteróides pode conter 9 ou 10 átomos de carbono. Os esteróides mais abundantes das plantas são o βsitosterol, o campesterol e o estigmasterol (ALASALVAR et al., 2003)..

(21) 21. Os esteróides possuem uma grande variedade de benefícios reconhecidos cientificamente para várias doenças físicas, aterosclerose, câncer de próstata e de cólon (RAO, JANEZIC, 1992; NAIR et al., 2006).. 3.4 Descrição da planta. 3.4.1 Descrição da família Rhamnaceae. A família Rhamnaceae abrange plantas com os mais variados hábitos, desde erva até árvores, ocorrendo em florestas tropicais ou subtropicais de todo o mundo (LIMA, 2000). Esta família abrange 58 gêneros com aproximadamente 900 espécies (HEYWOOD, 1993). As folhas são simples, alternadas e normalmente estipuladas. As flores são actinomorficas, bissexual e pentâmeras. O androceu é formado por cinco estames opostos, as pétalas, e revestem o receptáculo floral. O gineceu é composto por pistilo de usualmente 2-4 carpelos e os frutos são drupas. No noroeste da Europa ocorrem dois gêneros com quatro espécies. Todos são arbustos dos quais dois são comuns nessa área, Frangula alnus e Rhamnus catharticus; R. alaternus e R. saxatilis ocorrem, geralmente, no sul e centro da Europa (KUPRIANOVA, ALYOSHINA, 1972; VALDÉS et al., 1987; ERDTMAN et al., 1961).. 3.4.2 Descrição da espécie Scutia buxifolia Reissek. A espécie Scutia buxifolia (Figura 2), conhecida popularmente como coronilha, é uma planta nativa da América do Sul, ocorrendo principalmente no Rio Grande do Sul, Argentina e Uruguai (WASICKY et al., 1964). É uma pequena árvore ou arbusto de até seis metros de altura, com espinhos. Folhas. opostas. até. alternas,. inteiras. ou. com. poucos. dentes,. lustrosas.. Inflorescências em fascículos axilares com flores pequenas e verdes. Floresce entre outubro e janeiro e dá frutos no mês de março..

(22) 22. Scutia buxifolia, pertencente à família Rhamnaceae, é usada popularmente como cardiotônica, hipotensora e diurética através da infusão em água da casca do tronco e folhas (WASICKY et al., 1964).. Figura 2 - Scutia buxifolia Reissek (Coronilha) – Aspecto geral da planta. Disponível em: <http://www.brazilian-plants.com/brsearch.cfm>. Acesso em 10/08/2009.. 3.4.3 Compostos isolados de Scutia buxifolia. Os primeiros relatos sobre a presença de alcalóides na espécie S. buxifolia ocorreram em 1964, quando Wasicky et al. observaram a presença de alcalóides ciclopeptídicos nesta planta. Porém, um estudo mais aprofundado com esta espécie foi realizado em 1967 por um grupo da Universidade de Bonn (TSCHESCHE et al., 1970), que, trabalhando com a raiz da planta coletada em Santa Catarina, isolou um alcalóide peptídico, scutianina A (Figura 3). Além desse alcalóide detectaram a presença de outras bases, o que serviu de incentivo para novas tentativas de isolamento. Mais tarde, pesquisadores da Universidade de Buenos Aires (SIERRA et.

(23) 23. al., 1974), determinaram todos os centros quirais da scutianina A, com exceção da unidade β-hidroxileucina. Tschesche e colaboradores (1974) isolaram da raiz da mesma planta três alcalóides denominados como: scutianina C, scutianinas D e E, estes dois últimos são. diasteroisomeros. Morel e colaboradores, em 1979, isolaram do extrato. metanólico da casca da raiz da espécie S. buxifolia os alcalóides scutianinas B, C, D e E, todos conhecidos, e dois alcalóides novos, scutianinas H e I. As estruturas destes alcalóides foram propostas com base, principalmente, nas fragmentações de seus espectros de massas (Figura 3).. O. O. OO HN. O O. NH HN. N H O. NH. N H O. N Me2N. Me2 N. (1). (2). O. O O O. S. OO. NH S. HN. N O H. HN. N H O. R. HO Me 2 N. Me2N (3). NH. S. (4).

(24) 24. O. O R. OO R. HN. O O. NH. NH. R. HN. N H O. S. N H O. HO Me2N. HO Me2N. (5). (6). Figura 3 – Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (1) scutianina A, (2) scutianina B, (3) scutianina C, (4) scutianina D, (5) scutianina E, (6) scutianina H.. Em 1977, Tschesche e colaboradores isolaram dois novos alcalóides da mesma planta: scutianina G, diasteroisômero das scutianinas D e E. Também foi isolado um dimetil derivado da scutianina A denominado scutianina F. A casca do tronco da S. buxifolia também contém substâncias que pertencem ao grupo dos alcalóides peptídicos. Menezes e colaboradores (1995) isolaram do extrato metabólico das cascas de S. buxifolia, coletada em Santana do Livramento em março de 1993, as scutianinas B, C, D, E, H e um novo alcalóide, a scutianina J. Em continuação ao estudo de MENEZES et al. (1995), foram isolados dois novos alcalóides ciclopeptídicos: scutianina K, com fórmula molecular C34H40N4O5, que possui estrutura similar as scutianinas D, E e G; além desta, foi isolada a scutianina L com fórmula molecular C34H40N4O4 (MOREL et al., 1998) (Figura 4). Em 2005, Morel e colaboradores isolaram um novo alcalóide, a scutianina M (Figura 4) com formula molecular C33H38N4O4; a espectroscopia de 1H e. 13. C e a. rotação ótica deste novo composto sugerem que seja esteroisômero da CondalinaA, isolada como maior alcalóide da Condalia buxifolia (MOREL et al., 2002) e da Araliolina-B, isolada como menor alcalóide das folhas de Araliorhamnus vaginatus (TSCHECHE et al., 1970). Cinco alcalóides conhecidos também foram encontrados, as scutianinas B, C, D, E e F. O material para este estudo foi coletado em São Sepé no ano de 2003..

(25) 25. O O O. O O O. HN. NH. NH. N O. HN. N H O. N. HO. O. Me2N. M e2N. (7). (8). O. O S. O O HN HO. O O. NH. S. HN. N O H. NH. R. N O H. S. OH. HO Me 2 N. Me 2 N. (9). (10). O. O O O HN. N O H. O O. NH HN O. NH. N H. Me2N. Me2N. (11). (12). Figura 4 – Estruturas químicas de alcalóides isolados de S. buxifolia: (7) scutianina I, (8) scutianina F, (9) scutianina J, (10) scutianina K, (11) scutianina L, (12) scutianina M..

(26) 26. 3.4.4 Atividades biológicas descritas para Scutia buxifolia. A atividade antimicrobiana de alguns alcalóides ciclopeptídicos isolados da casca da raiz de S. buxifolia foi relatada por Morel et al. (2005), utilizando o método de bioautografia. O composto com o mais amplo espectro de atividade foi a scutianina E, sendo efetiva contra Staphylococcus aureus ATCC 6538 (25 µg); Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (6,25 µg); Micrococcus luteus ATCC 9341 (6,25 µg); Escherichia coli ATCC 25792 (6,25 µg) e Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 (12,5 µg). Scutianina D apresentou modesta atividade antibacteriana contra M. luteus (25 µg); S. epidermidis (50 µg) e E. coli (50 µg), enquanto a scutianina B só foi ativa contra a E. coli (6,25 µg) e a scutianina M foi inativa contra todas as cepas testadas. Trevisan et al. (2009) investigaram o potencial analgésico das scutianinas B, C e D através do teste de retirada da cauda (tail-flick), as scutianinas foram administradas via intratecal em ratos. A scutianina B (10nmol) induziu efeito antinoceptivo em 15 e 60 minutos após a administração, a scutianina C (10nmol) produziu hiperalgesia em 15 e 60 minutos após a injeção e a scutianina D não apresentou alterações..

(27) 27. 4. PUBLICAÇÕES CIENTÍFICAS. 4.1 – BOLIGON, A. A.; PEREIRA, R. P.; FELTRIN, A. C.; MACHADO, M. M.; JANOVIK, V.; ROCHA, J. B. T.; ATHAYDE, M. L. Antioxidant activities of flavonol derivatives from the leaves and stem bark of Scutia buxifolia Reiss. Bioresource Technology, v. 100, p. 6592-6598, 2009..

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(35) 35. 4.2 – BOLIGON, A. A.; JANOVIK, V.; FELTRIN, A. C.; MACHADO, M. M.; FROHLICH, J. K.; ATHAYDE, M. L. Fitoconstituintes isolados da fração em diclorometano das cascas do tronco de Scutia buxifolia Reissek.. Artigo aceito para publicação: Latin American Journal of Pharmacy.

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(40) 40. 5. DISCUSSÃO GERAL O estudo de plantas medicinais como alternativa na procura de novos agentes. terapêuticos tem se tornado uma ferramenta útil, principalmente nos países que possuem uma grande diversidade vegetal. Os produtos de origem natural contribuem decisivamente para o desenvolvimento da terapia moderna, como exemplo podemos citar os investimentos das indústrias brasileiras e mundiais em pesquisas de novos medicamentos obtidos de plantas. A ausência de estudos químicos sobre S. buxifolia, aliado ao fato da importância do registro químico de espécies utilizadas para fins terapêuticos, motivam o presente trabalho que descreve o estudo fitoquímico e algumas atividades biológicas de Scutia buxifolia Reissek. O screening fitoquímico qualitativo realizado no extrato hidroalcoólico das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia apresentaram resultado positivo para os grupos químicos como alcalóides, flavonóides, compostos fenólicos, esteróides, triterpenos, taninos, heterosídeos cardiotônicos e antaciânicos. Estes resultados encontram-se em conformidade com estudos já realizados na espécie (WASICKY et al., 1964; TSCHESCHE et al., 1977; MOREL et al., 1979; MOREL et al., 1998; MOREL et al., 2005). Após ter verificado os principais compostos presentes nas folhas e nas cascas do tronco de S. buxifolia e tendo em vista a importância dos mesmos, realizou-se algumas atividades farmacológicas e biológicas. As plantas produzem uma variedade de antioxidantes contra danos moleculares provenientes de espécies reativas de oxigênio (EROs), Acredita-se que a grande concentração e a diversidade de antioxidantes presentes nas plantas devese ao fato de as mesmas terem que se proteger dos radicais livres gerados pelo estresse oxidativo imposto pelos raios solares e pela exposição ao oxigênio (SCARTEZZINI, SPERONI, 2000). Existem muitos dados sobre os efeitos antioxidantes de diversos grupos de compostos polifenólicos presentes nos extratos de plantas, como flavonóides, taninos, catequinas, proantocianidinas e alguns ácidos polifenólicos (ACKER et al., 1996). Os polifenóis de origem natural, particularmente os flavonóides, têm uma estrutura ideal para captação de radicais livres, como geralmente são hidroxilados,.

(41) 41. os radicais livres reagem com estas hidroxilas formando radicais estáveis, dessa forma, torna-se um grupo de grande interesse na busca de novos compostos antioxidantes (CHOI et al., 2002; CHO et al., 2003). Os flavonóides são de particular importância. na. dieta. humana,. pois. atuam. como. agentes. antioxidantes,. antiinflamatórios, antifúngicos e antitumorais. Estudos epidemiológicos indicaram que o seu consumo está associado a uma redução no risco de câncer e doenças cardiovasculares (RICE-EVANS et al., 1996; MIDDLETON et al., 2000; TRIPOLI et al., 2007). Os flavonóides freqüentemente ocorrem na forma glicosídica e a hidrólise do polifenol acontece provavelmente no trato gastrointestinal. Estes compostos são multifuncionais e podem agir como agentes redutores e doadores de hidrogênio. Também têm sido propostas propriedades quelantes de metal, particularmente de ferro e zinco, para este grupo de compostos (RICE-EVANS et al., 1996). O doseamento de polifenóis foi realizado com o extrato bruto e as frações diclorometano, acetato de etila e n-butanol das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia, empregando-se o reagente Folin-Ciocalteau, conforme metodologia descrita por Chandra e Mejia (2004), o padrão de referência usado foi o ácido gálico. A maior concentração de compostos fenólicos nas folhas de S. buxifolia foi encontrada na fração acetato de etila, seguida pela fração n-butanol, 383,34 ± 2,31, 249,14 ± 1,53, respectivamente (concentração expressa como miligramas de equivalentes de ácido gálico por grama de cada fração). Para a fração diclorometano e o extrato bruto, o teor de polifenóis foi de 80,94 ± 1,20 e 72,09 ± 0,50 mg/g, respectivamente. As frações acetato de etila e n-butanol das cascas do tronco apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos (323,47 ± 2,62 e 322,69 ± 1,20 mg/g, respectivamente), seguidas pela fração diclorometano e extrato bruto, 166,88 ± 0,66 e 141,09 ± 0,71 mg/g, respectivamente. Os efeitos antioxidantes in vitro dos extratos e frações de S. buxifolia foram avaliados através do ensaio com o radical DPPH, que determina principalmente a capacidade doadora de próton de determinado composto ou associação. O DPPH é um composto radicalar de absorção característica que possui um próton livre, sendo que, na presença de compostos captadores de prótons, a absorção do DPPH diminui significativamente (CONSTANTIN et al., 1990; MENSOR et al., 2001). No presente estudo, as frações acetato de etila e butanólica das cascas do tronco apresentaram os melhores resultados, com IC50 de 4,32 ± 0,62 e 4,35 ± 1,30 µg/mL,.

(42) 42. respectivamente (IC50 = concentração necessária para inibir a atividade oxidante em 50%). As frações acetato de etila e butanólica das folhas também apresentaram boa atividade (6,12 ± 0,83 e 6,50 ± 0,40 µg/mL, respectivamente). As menores atividades foram encontradas para a fração diclorometano e para o extrato bruto, sendo 28,76 ± 0,46 e 29,55 ± 0,54 µg/mL, respectivamente para as cascas do tronco e 28,25 ± 0,36 e 30,54 ± 1,14 µg/mL, respectivamente para as folhas de S. buxifolia. As boas atividades encontradas para a fração acetato de etila podem ser explicadas pela presença de flavonóides nessa fração (TSENG et al., 1997; MENSOR et al., 2001; TUNG et al., 2007). Vários autores relatam a existência de uma correlação positiva entre compostos fenólicos e atividade antioxidante usando ensaios similares (ALONSO et al., 2002; SHYAMALA et al., 2005; CHANDRA, MEJIA, 2004; TURKMEN et al., 2006; TUNG et al, 2007). Porém no caso de S. buxifolia esta correlação não foi bem estabelecida, uma explicação pode ser a presença de outros compostos que interferem no ensaio do Folin-Ciocalteau e/ou a presença de outros compostos não fenólicos com efeitos antioxidantes. Como exemplo, podemos citar que o conteúdo de fenólicos totais na fração em diclorometano e no extrato bruto da casca do tronco que são quase o dobro dos valores obtidos para as mesmas frações das folhas, mas o IC50 dessas quatro frações foram muito semelhantes, variando de 28,25 a 30,54 µg/mL. Vários estudos têm se centrado na utilização terapêutica de compostos antioxidantes naturais que podem proteger uma variedade de patologias humanas, incluindo modelo de neurotoxicidade (PATEL et al., 2007; PEREIRA et al., 2009; WAGNER et al., 2006; WILLIAMS et al., 2004). Fe (II) pode induzir a neurotoxicidade (BOSTANCI, BAGIRICI, 2008) e seus níveis são aumentados em algumas doenças degenerativas (AISEN et al., 1999; QIAN et al., 1997). A eficiência antioxidante do extrato bruto e das frações das folhas e das cascas do tronco foi testada contra Fe (II), um conhecido pró-oxidante. O cérebro é particularmente suscetível a danos causados por radicais livres por causa de seu alto consumo de oxigênio e sua baixa concentração de enzimas antioxidantes e removedoras de radicais livres. Por isso, neste estudo, foram utilizados tecido encefálico de ratos para o ensaio do TBARS. As cascas do tronco causaram diminuição significativa nos níveis de TBARS induzidos por Fe (II). A fração acetato de etila apresentou a maior atividade (IC50 = 0,66 ± 0,12 µg/mL), a fração butanólica e o extrato bruto apresentaram atividades intermediárias (3,18 ± 1,60 µg/mL) e a fração diclorometano demonstrou a menor.

(43) 43. atividade (27,3 ± 1,22 µg/mL). Para as folhas de S. buxifolia a potência inibitória foi na seguinte ordem: acetato de etila (IC50 = 2,93 ± 2,17 µg/mL) > butanólica (4,96 ± 1,56 µg/mL) > diclorometano (8,19 ± 0,94 µg/mL) > bruto extrato (40,46 ± 2,51 µg/mL). A inibição da peroxidação lipídica pelas folhas de S. buxifolia mostrou uma relação com conteúdo de compostos fenólicos das folhas. Os bons resultados encontrados para S. buxifolia podem ser explicados pela presença de flavonóides isolados e quantificados na espécie. Quercetina e suas formas glicosiladas possuem ação antioxidante in vitro e in vivo. Os valores de IC50 de rutina, quercetina e quercitrina frente ao pró-oxidante Fe (II) foram 25,8 µg/mL, 12,2 µg/mL, e 1,4 µg/mL, respectivamente (PEREIRA et al., 2009). Estas moléculas podem atuar diretamente incorporando as reações redox, e indiretamente, por quelação de Fe (II). A fração acetato de etila das folhas apresentou promissoras atividades antioxidantes, por isso, esta fração foi priorizada para o isolamento de substâncias responsáveis por estas atividades. Sucessivos processos cromatográficos com a fração acetato de etila levaram ao isolamento de quatro flavonóides, cujas estruturas foram. identificadas. com. base. nos. dados. espectroscópicos. de. Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (1H-RMN) e de carbono (13C-RMN). e da comparação dos dados com a literatura. O espectro de 1H-RMN da quercetina mostrou dois picos em 6,17 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 6,37 ppm (1H, d, J = 2,0 Hz) consistente com os hidrogênios H-6 e H-8 em um anel e um sistema ABX em δ 7,72 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2 '), 7,62 (1H, dd, J = 8,4, 2,1 Hz, H-6 ') e 6,87 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5 ') correspondentes ao próton do anel-B. O. 13. C-RMN indicou a presença de 15 átomos de carbono, o sinal em δ 177,3 foi. atribuído a uma carbonila em C-4, os outros sinais foram: 165,6 (C-7), 162,6 (C-5), 158,4 (C-9), 148,8 (C-4’), 148,1 (C-2), 146,3 (C-3’), 137,3 (C-3), 124,2 (C-1'), 121,8 (C-6 '), 116,2 (C-5 '), 116,0 (C-2'), 104,6 (C-10), 99,2 (C -6), 94,4 (C-8). Os dados espectrais foram compatíveis com os citados na literatura para quercetina (SLIMESTAD et al., 1995; FOSSEN et al., 1998; LIU et al., 2008). Quercetina 3-0-ramnosídeo (quercitrina) apresentou o mesmo padrão de sinal da aglicona da quercetina, mas a presença de uma metila em dubleto em δ 0,95 (J = 6,0 Hz), juntamente com o acoplamento do próton anomérico em δ 5,34 (J = 1,6 Hz) é indicativo de uma ramnopiranose (MA et al., 2005). O espectro de RMN. 13. C. indicou a presença de 21 átomos de carbono: δ 179,5 (C-4), 165,6 (C-7), 163,3 (C-.

(44) 44. 5), 159,2 (C-9), 149,6 (C-4”), 158,4 (C-2), 146,2 (C-3’), 136,2 (C-3), 122,9 (C-1 '), 122,9 (C-6'), 116,3 (C-5 '), 116,3 (C-2 '), 103,4 (C-10), 99,8 (C-6), 94,7 (C-8), 105,8 (C-1 "), 71,8 (C-2"), 72,1 (C-3 "), 71,9 (C-4"), 71,5 (C-5 ") e 17,6 (C-6"). Os dados estão de acordo com os valores da literatura relatados para a quercetina 3-0ramnosídeo (quercitrina) (MA et al., 2005; LAWRENCE et al., 2003). Quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo (isoquercitrina) apresentou espectros de RMN semelhante ao da quercetina. 1H RMN do composto mostrou sinais em δ 7,70 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,57 (1H, dd, J = 2,0 e 8,4 Hz) e 6,87 (1H, d, J = 8,4 Hz) atribuído a H-2 ', H-6' e H - 5' do anel B, respectivamente. Os sinais restantes da aglicona em δ 6,38 (d, J = 2,0 Hz) e 6,19 (d, J = 2,0) foram atribuídos, respectivamente, para o H-8 e H-6, prótons do anel A, confirmando que esse flavonóide é derivado da estrutura da quercetina (LIU et al., 2008). No entanto, a presença de um sinal em δ 5,23 (1H, d, J = 7,2 Hz), seguido de outros sinais adicionais indicam a presença de uma molécula de açúcar. A hexose foi determinada como uma unidade glicopiranosil vinculada a posição 3 da aglicona pela comparação de próton e carbono com dados da literatura (SLIMESTAD et al., 1995; FOSSEN et al., 1998; LIU et al., 2008). O sinal em δ 178,2 foi atribuído a uma carbonila ligada a C-4, os outros sinais foram: 164,7 (C - 7), 163,6 (C-5), 157,2 (C-9), 148,6 (C-4 '), 158,0 (C-2), 145,3 (C-3 '), 134,2 (C-3), 124,8 (C-1'), 121,8 (C-6 '), 116,2 (C-5'), 114,6 (C-2 '), 101,2 (C - 10), 98,5 (C6), 93,3 (C-8), 102,8 (C-1"), 76,9 (C - 2"), 76,7 (C-3"), 74,3 (C-4"), 69,8 (C-5") e 61,2 (C-6"). O. 13. C-RMN da rutina apresentou 27 átomos de carbono, indicando duas. unidades de açúcar ligadas a quercetina. Os dois sinais de prótons anoméricos em δ 5,75 (d, J = 8,0 Hz) e em δ 5,25 (d, J = 2,0 Hz) foram atribuíveis ao H-1 da glicose e ao H-1 da ramnose, respectivamente. No espectro de. 13. C RMN da rutina, o sinal de. C-6 (δ 68,5) da glicose apresentou uma diferença de 7,3 ppm, em comparação com o sinal em C-6 (δ 61,2) da quercetina 3-0-β-D-glicopiranosídeo, indicando uma ligação 1-6 entre o C3-glicose e a ramnose (RASTRELLI et al., 1995). A identidade deste composto foi confirmada por cromatografia através da comparação com o padrão de rutina e com dados da literatura (SLIMESTAD et al., 1995; FOSSEN et al., 1998; LIU et al., 2008; RASTRELLI et al., 1995). A fração acetato de etila das folhas de S. buxifolia foi analisada por Cromatografia. Líquida. de. Alta. Eficiência. (CLAE),. essa. fração. contém. outros compostos em menor quantidade, além de quercetina (tempo de retenção tR.

(45) 45. 12,4 min), quercetina-3-0-ramnosídeo (tR = 6,4 min), quercetina 3-0-β-Dglicopiranosídeo (tR = 5,3 min) e rutina (tR = 4,8 min). Extratos de origem natural geralmente contêm uma série de componentes químicos diversos que estão presentes em concentrações variáveis, é importante a utilização de métodos cromatográficos para analisar estas misturas complexas. O perfil por CLAE da fração acetato de etila foi obtido, bem como a quantificação de rutina e quercetina baseada nas curvas de calibração obtidas com soluções de referência. Curva de calibração para a quercetina: Y = 30153x - 235135, r = 0,9983; e curva de calibração para rutina: Y = 19217x - 16949, r = 1,000. Quercitrina e isoquercitrina também foram quantificadas, mas elas foram expressas separadamente, como conteúdo em quercetina. O componente principal foi quercitrina, seguido por rutina, quercetina e isoquercitrina. Os dados de isolamento dos flavonóides, sua quantificação por CLAE, a determinação dos teores de polifenóis totais e a avaliação da atividade antioxidante por dois métodos (DPPH e TBARS) originaram a publicação no periódico Bioresource Technology. Da fração em diclorometano das cascas do tronco de S. buxifolia foram isolados o lupeol e uma mistura de esteróides contendo β-sitosterol e estigmasterol. Extratos vegetais normalmente possuem vários triterpenos e o fracionamento por técnicas cromatográficas convencionais dificilmente leva ao isolamento de substâncias puras; normalmente o resultado é uma mistura de triterpenos de difícil resolução. Dados de. 13. C-RMN de triterpenos registrados na literatura mostram que. os deslocamentos dos carbonos sp2, são altamente característicos de cada esqueleto, pelo menos em triterpenos oxigenados em C-3. Isso permite que substâncias possam ser identificadas por dados de. 13. C-RMN, mesmo em misturas. (OLEA, ROQUE, 1990; GALOTTA et al., 2005). Na fração diclorometânica das cascas do tronco e folhas de S. buxifolia foi identificada a presença de β-sitosterol e estigmasterol através de CLAE e CCD. As cascas do tronco apresentaram a maior quantidade destes triterpenos, sendo priorizada para o isolamento da mistura. Foram isolados 48 mg de um composto cristalino branco, a substância apresentou-se como uma mancha única (CCD), de coloração roxa após revelação com o reagente anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100 °C. Através dos espectros de. 13. C-RMN e. 1. H-RMN (páginas 66 e 67). atribuíram-se os deslocamentos químicos e caracterizaram-se os átomos de.

(46) 46. hidrogênio e de carbono que compõem a estrutura dos compostos. Dentre os sinais verificados no espectro de. 13. C-RMN, quatro deslocamentos na região de carbonos. sp2 (121,67; 129,27; 138,30; 140,47 ppm) sugerem duas ligações duplas. Segundo dados da literatura, sinais nestes deslocamentos (121,67 e 140,74 ppm) são característicos de esteróides com uma dupla ligação entre C-5 e C-6 (AHMAD et al., 1992; CHAURASIA et al., 1987; DE-EKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993; ZANON et al., 2008) e em 129,27 e 138,30 ppm são característicos de uma dupla ligação entre C-22 e C-23 na cadeia lateral de esteróides (DEEKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993). Esses deslocamentos químicos são muito importantes na elucidação estrutural de esteróides e são específicos de β-sitosterol e estigmasterol. Estes compostos possuem uma mesma insaturação (∆5), portanto os sinais nos espectros de. 13. C-RMN irão coincidir e assim. os sinais para C-5 e C-6 estarão mais intensos quando comparados com os outros dois sinais referentes a insaturação em ∆22 (que está presente somente no estigmasterol). (DE-EKNAMKUL,. POTDUANG,. 2003).. Por. apresentarem. propriedades muito semelhantes, β-sitosterol e estigmasterol, geralmente são isolados na forma de mistura (CHAVES et al., 2004; DE-EKNAMKUL, POTDUANG, 2003; GOULART et al., 1993; ZANON et al., 2008). O triterpeno lupeol (82 mg) também foi isolado da fração em diclorometano das cascas do tronco de S. buxifolia, esta substância foi caracterizada por cromatografia em camada delgada como um composto cristalino branco apresentando-se como uma manha única, de coloração violácea após revelação com o reagente anisaldeído-sulfúrico e aquecimento a 100 °C. O espectro de. 13. C-RMN mostrou. sinais característicos de uma dupla ligação de compostos com esqueletos derivados do lupeol (109,31 e 151,29 ppm), que conjuntamente com o grupo metila em δC 20,93, são indicativos de grupo isopropenil (C-29, C-20 e C-30, respectivamente) (ALMEIDA et al., 2003; AGUIAR, et al., 2005), permitindo identificar a substância como lupeol. Esses triterpenos, embora comuns no reino vegetal, ainda não haviam sido descritos para a espécie, o que permitiu a publicação do artigo no periódico Latin American Journal of Pharmacy. No anexo desta dissertação, encontram-se mais dois artigos, que também fizeram parte do estudo fitoquímico e das atividades biológicas da planta..

(47) 47. 6 CONCLUSÕES. •. A maior atividade antioxidante, usando o método do DPPH, foi encontrada para a fração butanólica e acetato de etila das cascas e folhas de S. buxifolia.. •. As frações e os extratos brutos das folhas e das cascas de S. buxifolia inibiram a produção do TBARS e apresentaram atividade antioxidante, tais efeitos podem estar relacionados com a presença de compostos fenólicos e de flavonóides.. •. A fração acetato de etila das cascas apresentou a maior inibição da produção de TBARS.. •. Quercetina, quercitrina, isoquercitrina e rutina foram isolados da fração acetato de etila das folhas de Scutia buxifolia. Sendo quercitrina o flavonóide majoritário (18,3%).. •. Lupeol e a mistura de β-sitosterol + estigmasterol foram isolados da fração diclorometânica das cascas de S. buxifolia..

(48) 48. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ACKER, S. A. B. E. et al. Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids. Free Radical Biology and Medicine, v.20, n.3, p.331-342, 1996.. AGUIAR, R. M., DAVID, J. P.; DAVID, J. M. Unusual naphthoquinones, catechin and triterpeno from Byrsonima microphilla. Phytochemistry, v. 66, p. 2388-2392, 2005.. AHMED, M. S. et al. A weakly antimalarial biflavone from Rhus retinorrhea. Phytochemistry, v.58, p. 599-602, 2002.. AISEN, P.; WESSLING-RESNICK, M.; LEIBOLD, E.A. Iron metabolism. Current Opinion Chemical Biololy, v. 3, p. 200-206, 1999.. ALASALVAR, C. F. et al. Turkish Tombul hazelnut (Corylus avellana L.).2.lipid characteristics and oxidative stability. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 51, p. 3797-805, 2003.. ALMEIDA et al. Outros constituintes químicos de Diplotropis ferruginea Benth. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 14, 44-46, 2003.. ALONSO, A. M. et al. Determination of antioxidant power of red and white wines by a new electrochemical method and its correlation with polyphenolic content. Journal Agriculture Food Chemistry, v. 50, p. 3112-3115, 2002.. ARAÚJO, P. W. B. et al. Flavonóides e Hipertensão. Revista Brasileira de Hipertensão 12(3): 188-189, 2005.. BENNET, R. N.; WALLSGROVE, R. M. Secondary metabolites in plant defense mechanisms. New Phytologist., v.127, p. 617-633, 1994.. BOSTANCI, M. O.; BAGIRICI, F. Neuroprotective effect of aminoguanidine on ironinduced neurotoxicity. Brain Research Bulletin, v. 76, 57-62, 2008.. BUSS, A. D.; COX, B.; WAIGH, R. D. In Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 6th ed.; Volume 1: Drug Discovery; Abraham, D. J., Ed.; Wiley: Hoboken, NJ, 2003; Chapter 20, pp 847-900..

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