Diogo Lenzi Capella
ESTUDO DO RANKL, OPG, IL-6 E CTSK EM CISTOS RADICULARES, CERATOCISTOS ODONTOGÊNICOS E
AMELOBLASTOMAS
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), para a obtenção do Grau de Doutor em Odontologia – Área de Concentração em Diagnóstico Bucal.
Orientadora: Profª. Dra. Elena Riet Correa Rivero
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor,
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Capella, Diogo
ESTUDO DO RANKL, OPG, IL-6 E CTSK EM CISTOS RADICULARES, CERATOCISTOS ODONTOGÊNICOS E AMELOBLASTOMAS / Diogo Capella ; orientadora, Elena Riet Correa Rivero, 2018.
83 p.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa
Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Odontologia. 2. Osteoclastogênese. 3. Ameloblastoma. 4. Ceratocisto. 5. Cisto Radicular.
I. Riet Correa Rivero, Elena . II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
Diogo Lenzi Capella
TÍTULO: ESTUDO DO RANKL, OPG, IL-6 E CTSK EM CISTOS RADICULARES, CERATOCISTOS ODONTOGÊNICOS E AMELOBLASTOMAS
Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de
“
ESTUDO DO RANKL, OPG, IL-6 E CTSK EM CISTOS
RADICULARES, CERATOCISTOS ODONTOGÊNICOS
E AMELOBLASTOMAS
”, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina.Florianópolis, 27 de fevereiro de 2018. ________________________ Profª. Drª.
Elena Riet Correa Rivero
,Coordenador do Curso Banca Examinadora:
________________________ Profª. Drª.
Elena Riet Correa Rivero
,Orientadora
________________________ Prof. Dr. Filipe Modolo Siqueira, Universidade Federal de Santa Catarina
________________________
Profª. Drª.
Carolina Amália Barcellos Silva
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________
Profª. Drª.
Aline Cristina Batista Rodrigues Johann
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me mostrar que o ditado “escreve certo por linhas tortas” é uma grande verdade
Aos meus pais, Enio e Beatriz e minha irmã Annelise, que embora distantes, sempre foram presentes. O apoio, carinho, incentivo e bons “fluidos” foram essenciais não só para esta etapa, mas como porto seguro nos momentos mais duvidosos e angustiantes.
A minha esposa Suélen Paravisi Pagliari, companheira incansável nesta difícil jornada. Caminhamos juntos e enfrentamos corajosamente todos os percalços que a vida nos traz, dos mais banais aos mais complicados, com a certeza que venceremos, pois estamos ligados.
À profª Elena, minha orientadora, pelo exemplo de como toda orientadora deveria ser. Sempre presente, clara e objetiva, esteve pronta pra me ouvir e esclarecer minhas dúvidas em qualquer dificuldade. E paciente acima de tudo, pois, apesar de todos os meus defeitos, depositou sua confiaça em mim até o fim.
A todos os professores do Departamento de Patologia, sem exceção. Com vocês ampliei meus conceitos de aprendizagem, pesquisa e ensino. Tentarei levar para minha vida docente um pouco do bom exemplo de todos.
Aos meus colegas por compartilharem experiências de vida tão diferentes, resultando em momentos descontraídos e singulares. Fizeram-me sentir mais jovem e mais enturmado.
Á Universidade Federal de Santa Catarina, que pela primeira vez me acolheu, deu-me oportunidade de ampliar meus conhecimentos, meu mundo e meus anseios para o futuro.
Impossível lembrar de todos aqueles que de forma direta e indireta contribuíram para meu caminho até aqui, entretanto sou consciente que não estou sozinho em meus méritos e derrotas e, em algum momento, grandes pessoas me aconselharam, me apoiaram e até apontaram meus erros. Para estas pessoas, os mais sinceros agradecimentos.
RESUMO
A integridade dos ossos, incluindo a sua morfogênese inicial e a remodelação, requer a regulação e atividade de células de formação (osteoblastos) e células de reabsorção óssea (osteoclastos). O Ligante do Receptor do Ativador Nuclear Kappa b (RANKL) e a Osteoprotegerina (OPG) estão envolvidos na formação, diferenciação e atividade de osteoclastos. Enquanto o RANKL estimula a reabsorção óssea, o OPG inibe a mesma. A interleucina-6 (IL-6) também é diretamente capaz de induzir a diferenciação de osteoclastos e a Catepsina K (CTSK) é especificamente secretada por osteoclastos durante a reabsorção óssea. O desequilíbrio dessas proteínas pode causar a reabsorção óssea em lesões odontogênicas. O objetivo desta pesquisa foi estudar o processo de osteoclastogênese, por meio de marcadores imunoistoquímicos para os antígenos RANKL, OPG, IL-6 e CTSK em 25 cistos radiculares (CR), 25 ceratocistos odontogênicos (CO) e 25 ameloblastomas (AM). A expressão desses biomarcadores foi avaliada pela média percentual da área marcada em 10 campos em microscópico de luz (400x) para cada caso. Foi avaliado a marcação do epitélio e conjuntivo separadamente. Para cada lesão, a intensidade de inflamação foi avaliada e classificada. Para comparar os marcadores nos diferentes grupos, utilizou-se ANOVA e teste t de Student e Teste de Spearman para correlação entre marcadores e área de inflamação, considerando significância estatística para P ≤ 0,05. Nossos resultados demostraram que a expressão de RANKL foi estatisticamente maior em CR e CO quando comparado ao AM no epitélio e no tecido conjuntivo. Nenhuma diferença estatística foi encontrada para a expressão de OPG entre os grupos. Para a expressão de IL-6, diferença estatística foi observada apenas no tecido conjuntivo entre os grupos, com maior expressão no CR e menor no CO. A expressão de CTSK foi estatisticamente maior em AM e CO quando comparado ao CR. Nossos resultados demonstraram que o processo de reabsorção óssea nestas lesões ocorre por meio de diferentes mecanismos. A expressão de RANKL está mais relacionado às lesões do padrão cístico, CR e CO, a expressão de IL-6 está mais relacinada a reabsorção óssea de CR, enquanto que a CTSK é mais expressa nos casos de AM e CO. podendo estar relacionada ao comportamento mais agressivo dessas lesões.
Palavras-chave: Ameloblastoma. Neoplasias Mandibulares. Osteoclastos. Reabsorção Òssea.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Via de sinalização essencial para a osteoclastogênese ... 30 Figura 2 - Papel dos osteoblastos na diferenciação e controle dos osteoclastos ... 31 Figura 3 - Influência da IL-6 em diferentes células ... 34 Figura 4 - Catepsina K na reabsorção óssea ... 36
LISTA DE QUADROS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CO Ceratocisto Odontogênico
AM Ameloblastoma Sólido
RANK receptor ativador do fator de kappa nuclear B
RANKL ligante do receptor ativador do fator de kappa nuclear B OPG osteoprotogerina
IL-6 interleucina-6 CTSK Catepsina K CR Cistos radiculares TO tumores odontogênicos
OMS Organização Mundial da Saúde PTCH1 Drosophila Patched gene
SCNCB Carcinoma nevóide de células basais ou Síndrome de Gorlin
TC Tomografia Computadorizada RM Ressonância Magnética
TCFC Tomografia Computadorizada de Feixe Cônico AMS Ameloblastoma Sólido
AMU Ameloblastoma unicístico
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina TNF Fator de Necrose Tumoral
TRAF-6 Receptores Associados ao Fator de Necrose Tumoral 6 NF-кB Fator Nuclear kappa B
NFATc1 Fator Nuclear de Células T ativadas citoplasmática 1 TNFr receptores de TNF
RNAm RNA mensageiro PTH hormônio da paratireoide DM diabete mellitus
TRAIL Fator de Necrose Tumoral Induzido por Ligante Relacionado a Apoptose
CEB carcinoma epidermóide de boca LPS lipopolissacarídeos
IL-1 Interleucina-1
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa PCR Reação em cadeia da polimerase
CEPSH Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos LPB Laboratório de Patologia Bucal
H&E Hematoxilina & Eosina TA temperatura ambiente
PBS Tampão Fosfato Salino s.p desvio padrão da média OK Odontogenic Keratocyst
RC Radicular Cyst
SMO gene smoothened
MAPK Proteíno-quinases ativadas por mitógenos ATF4 Fator de Transcrição Ativado 4
BMP4 Proteínas Morfogenéticas do Osso 4
CSF-1 Fator estimulante das colônias de macrófagos TRAP fosfatase ácida resistente ao tartarato
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
2 REVISÃO DE LITERATURA... 19
2.1 LESÕES DE ORIGEM ODONTOGÊNICA ... 19
2.1.1 Cistos Radiculares (CR) ... 20
2.1.2 Ceratocisto Odontogênico (CO) ... 22
2.1.3 Ameloblastoma (AM) ... 25 2.2 OSTEOCLASTOGÊNESE ... 28 2.2.1 RANK/RANKL/OPG ... 32 2.2.2 Interleucina-6 - IL-6 ... 33 2.2.3 Catepsina K – CTSK ... 35 3 JUSTIFICATIVA ... 38 3.1 PERGUNTA NORTEADORA ... 38 4 OBJETIVOS ... 38 4.1 OBJETIVO GERAL ... 38 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 38 5 METODOLOGIA EXPANDIDA ... 39 5.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 39
5.2 ASPECTOS ÉTICOS E LEGAIS ... 39
5.3 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS ... 39
5.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS ... 39
5.5 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA E HISTOQUÍMICA ... 41
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 41
6 ARTIGO... 42
7 CONCLUSÕES ... 58
REFERÊNCIAS DA TESE ... 59
1 INTRODUÇÃO
O osso é um tecido conjuntivo composto de osteoblastos (formação óssea), osteócitos (osteoblastos presos dentro das lacunas ósseas), osteoclastos (células da reabsorção óssea), uma matriz extracelular de proteoglicanos e colágeno mineralizado pela deposição de hidroxiapatita de cálcio1. A manutenção da estrutura e função óssea depende de sua constante remodelação e formação. Assim, o desequilíbrio nesse processo está associado a diversas condições patológicas (osteoporose, mieloma múltiplo, artrite reumatóide)2,3.
Muitas citocinas, hormônios e vias de sinalização estão envolvidos na remodelação óssea4. O processo se inicia pelos osteoblastos, que sintetizam e expressam o Ligante do Receptor Ativador do fator de Kappa nuclear B (RANKL) em sua membrana ou no meio extracelular. Este fator liga-se aos precursores de osteoclastos imaturos, derivadas da medula óssea, que expressam em sua membrana o Receptor Ativador do Fator de Kappa Nuclear B (RANK), e assim o osteoclasto se diferencia5,6. Outro fator sintetizado pelos osteoblastos é a osteoprotogerina (OPG), que liga-se também ao RANKL, impedindo a ligação do RANK, funcionando como um regulador da maturação osteoclástica2,7. A interleucina-6 (IL-6) é capaz de induzir diretamente a diferenciação de osteoclastos por meio de um mecanismo independente de RANKL8. Catepsina K (CTSK) é especificamente secretada por osteoclastos durante a reabsorção óssea, sendo uma enzima chave na degradação de proteínas na matriz óssea, incluindo colágenos tipo I9.
Para analisarmos o processo de expansão e destruição do tecido ósseo circundante de lesões osteolíticas dos ossos maxilares, devemos entender os mecanismos que ativam a osteoclastogênese. Dentre lesões osteolícas relativamente comuns nos ossos maxilares temos os Cistos Radiculares (CR), Ceratocisto odontogênico (CO) e o Ameloblastoma (AM)10,11. O CR é o mais comum dos cistos odontogênicos, de origem inflamatória, desenvolvido a partir da necrose pulpar causada por lesões cariosas12. Se não tratado, pode assumir dimensões suficientes para produzir destruição da cortical óssea13. O CO é um cisto intraósseo de origem odontogênica, de desenvolvimento, e seu comportamento clínico é considerado agressivo, uma vez que apresenta crescimento infiltrativo e quando tratado de forma conservadora, apresenta uma alta taxa de recorrência 14–16. Essa suas caraterísticas já o classificaram como tumor odontogênico benigno pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em
200517, entretando, na última classificação da OMS em 201716, voltou a ser designado como cisto. O AM é uma neoplasia odontogênica benigna que apresenta crescimento lento, é localmente invasivo podendo ser descoberto tardiamente com grandes dimensões, resultando em extensas cirurgias e seqüelas graves18. Alguns estudos mostram que RANKL e OPG estão envolvidos em osteólise induzida por cistos e tumores odontogênicos, mas os resultados ainda são controversos19–23. A influência da IL-6 e da CTSK em cistos e tumores odontogênicos ainda é pouco compreendida.
Portanto, neste estudo, o objetivo foi investigar e comparar a imunoexpressão de RANKL, OPG, IL-6 e CTSK entre CR, CO e AM com o objetivo de contribuir com o entendimento dos mecanismos de crescimento destas lesões.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LESÕES DE ORIGEM ODONTOGÊNICA
Durante a odontogênese, existe uma interação entre epitélio e ectomesênquima e células destes tecidos proliferam e se diferenciam formando o germe dentário. Estas células ou seus remanescentes tais como a lâmina dentária, o órgão do esmalte e a bainha epitelial de hertwig, podem dar origem a lesões como os cistos e os tumores odontogênicos (TO)24. Cistos são doenças representadas por uma cavidade patológica revestida por epitélio que usualmente contém em seu interior material líquido ou semi-sólido25. Já as neoplasias representam uma proliferação anormal de tecido cujo crescimento é incordenado em relação aos tecidos normais e que persiste de maneira autônoma mesmo após o término do estímulo que provocou a alteração 26
.
Os cistos odontogênicos são lesões muito frequentes na clínica odontológica27, clinicamente, essas lesões são assintomáticas em seus estágios iniciais, sendo descobertas acidentalmente em radiografias de rotina. De acordo com a etiologia, os cistos são classificados como, de origem inflatamória ou de desenvolvimento28. O cisto radicular (CR) é o mais comum dos cistos odontogênicos, e sua patogênese está relacionada a presença de inflamação na região periapical de um dente com necrose pulpar13.
O ceratocisto odontogênico (CO) é um cisto de desenvolvimento odontogênico que ganhou atenção especial nas últimas duas décadas. Possui características histopatológicas e clínicas próprias, mas é um cisto distinto pelo seu comportamento agressivo e alta taxa de recorrência. Muitas tentativas anteriores foram feitas para classificar esses cistos desde 195629. Anteriormente classificado em cisto odontogênico de desenvolvimento pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 197130 e 199231, o CO foi reclassificado e renomeado como tumor odontogênico ceratocístico na classificação da OMS de tumores de cabeça e pescoço de 200517. Em 2017, a OMS introduziu mudanças conceituais significativas no capítulo de TO da atual classificação de tumores de cabeça e pescoço. Uma das principais mudanças foi a reclassificação do Tumor Odontogênico Ceratocístico, antes categorizado como neoplasia cística benigna17, para Ceratocisto odontogênico, agora como cisto odontogênico32. Apesar de muitas
classificações e nomenclaturas , existem dificuldades na compreensão da verdadeira natureza, identificação e manejo do CO.
Os tumores odontogênicos (TO) formam um grupo complexo com diversos tipos histopatológicos e com comportamentos variados. Algumas lesões são neoplasias verdadeiras que apresentam caráter invasivo e outras podem apresentar características semelhantes à malformações, sendo menos agressivas (hamartomas). Os tumores odontogênicos benignos podem ser compostos por epitélio, por epitélio e ectomesênquima ou ectomesênquima. 32. O ameloblastoma (AM) é o tumor odontogênico epitelial bem conhecido, caracterizado por invadir e expandir localmente o osso e possuir alto risco de recorrência33. Seu tratamento cirúrgico quase sempre está associado a grandes sequelas nos pacientes18.
Como as mudanças de classificação são recentes, ainda não se conhece o real impacto da nova classificação sobre a prevalência de cistos e tumores odontogênicos. Estudos epidemiológicos utilizando a antiga classificação da OMS de 2005 mostravam a prevalência de TO entre 2.17%34 a 3.56%35 entre lesões orais, sendo Ceratocisto Odontogênico (CO) o mais prevalente TO, seguido de Odontomas e AM11,36,37. A definição de CO como tumor produziu um aumento na freqüência e prevalência de TO38. Com a nova classificação, espera-se diminuição da prevalência de TO em geral, ainda com AM entre as lesões mais frequentes e CO entre os mais comuns cistos de desenvolvimento. Visto que CO e AM são lesões que, além de agressivas e deformantes, são epidemiologicamente relevantes, justifica-se mais estudos com a finalidade de elucidar justifica-seus comportamentos biológicos e mecanismos pelo qual essa invasão ocorre.
2.1.1 Cistos Radiculares (CR)
Segundo a OMS, as inflamações periapicais são classificadas em cinco categorias: periodontite apical aguda, periodontite apical crônica ou granuloma apical, abscesso periapical sem fístula, abscesso periapical com fístula e cisto radicular (CR)28. Em uma revisão sistemática de 1993 a 2011, Johnson et al examinaram a freqüência dos cistos e tumores odontogênicos mais comuns, e os CRs representaram 54,6% do total de lesões periapicais39. Em outra revisão de literatura, Nair et al27 apresentaram variação de 6% até 55% em CRs entre biópias de lesões periapicais.
As lesões periapicais tipo granuloma e cisto radicular iniciam-se devido à alterações inflamatórias no periápice . Após a necrose pulpar, a disseminação e a instalação de bactérias no periápice estimulam e ativam os mecanismos imuno-inflamatórios de defesa, com a liberação de mediadores inflamatórios, citocinas e fatores de crescimento. Estudos mostram que Prostraglandina E2 (PGE2)40, Interleucina 1 (IL-1)41, Interleucina-6 (IL-6)42, fator de necrose tumoral (TNF)43 e fatores de crescimento epidérmico (EGF)44 podem estimular a proliferação dos restos epiteliais de malassez. Histologicamente, os cistos radiculares são formados por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso denso, revestida por epitélio pavimentoso estratificado não queratinizado, hiperplasiado por acantose, especialmente em áreas relacionadas à maior infiltrado inflamatório na cápsula de tecido conjuntivo45. Há duas classes distintas de cistos radiculares, o cisto verdadeiro, que possui uma cavidade completamente fechada e circundada por epitélio, e o cisto pocket ou baia, no qual o epitélio reveste uma cavidade com comunicação direta com o canal radicular28,46,47 .
Duas teorias são as mais aceitas para explicar a formação do cisto radicular. A teoria da deficiência nutricional explica que as células epiteliais centrais sofrem necrose e degeneração por se encontrarem distantes da fonte nutricional, atraindo e neutrófilos e exudato para dentro da área necrótica. Assim, microcavidades coalescem para formar uma cavidade cística revestida por epitélio pavimentoso estratificado, contendo restos celulares, infiltrado de leucócitos e exsudato tecidual no seu interior27,48. Já a teoria do abscesso postula que o epitélio em proliferação circunda um abscesso formado por necrose e lise tecidual, devido a natureza inata do epitélio de recobrir superfícies de tecido conjuntivo exposto 49. Poucos estudos tratam sobre o contínuo crescimentos dos CR e acredita-se que estes podem se expandir após reabsorção óssea por osteoclastos estimulados por mediadores inflamatórios (prostagladinas) e citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNF)50–52. É interessante notar que a maioria dos mediadores inflamatórios e citocinas pró-inflamatórias que estimulam a proliferação dos restos de células epiteliais também levam a reabsorção óssea em lesões periapicais inflamatórias.
Após uma adequada terapia endodôntica, a maioria das lesões perirradiculares, exceto os cistos verdadeiros, curam53. Uma vez que as substâncias irritantes nos canais são removidas por instrumentação quimiomecânica e o canal está completamente fechado, todos os componentes inflamatórios irão gradualmente diminuir, pois as células
inflamatórias e algumas células endoteliais e fibroblastos não são mais necessárias e são eliminadas por apoptose 54. No entanto, os cistos verdadeiros são menos propensos a curar com a terapia endodôntica porque não possuem continuidade com a raiz e acredita-se que continuam seu crescimento devido à formação de cristais de colesterol em seu interior, que por sua vez desencadeiam reação de corpo estranho, estimulando a entrada de citocinas e células inflamatórias, principalmente macrófagos, pelo revestimento epitelial em direção ao lúmen cístico 55 . Lesões periapicais extensas podem evoluir, e a cirurgia periapical ou até mesmo a extração do dente envolvido podem ser necessárias para permitir o reparo da lesão. A intervenção cirúrgica é recomendada apenas se, ao final de um tempo de dois anos de controle clínico-radiográfico, os resultados demonstrarem insucesso do tratamento conservador, seja pela presença de sinais radiográficos como aumento da lesão, ou ainda pela presença de sintomatologia e sinais clínicos56. A atividade osteolítica destas lesões está diretamente relacionada a patogênese apical, e ainda há duvidas se a osteoclastogênese é induzida pelo epitélio odontogênico em proliferação ou pelas mesmas citocinas inflamatórias que induziram este epitélio a formar o cisto54.
2.1.2 Ceratocisto Odontogênico (CO)
A origem histológica do CO ainda não foi estabelecida definitivamente. Embora a maioria dos pesquisadores aceite a lâmina dentária como origem, também é sugerida que sua origem seja apartir da camada basal do epitélio bucal, pois o epitélio do tumor apresenta paraqueratina semelhante ao epitélio da mucosa bucal. O estímulo para a proliferação celular permanece desconhecido57.
Lesões múltiplas de CO frequentemente estão associadas à síndrome do carcinoma nevóide de células basais ou Síndrome de Gorlin (SCNCB). Esta é uma síndrome rara, autossômica dominante, com história familiar bem definida, que afeta igualmente homens e mulheres58. Foi descrita em 1960 por Gorlin e Goltz59, sendo caracterizada pela presença de múltiplos carcinomas basocelulares, COs nos maxilares, cistos epidermóides em pele, costela bífida, manchas na planta dos pés e palma das mãos, entre outras alterações60,61. O CO pode ser uma das primeiras manifestações da SCNCB, ocorrendo, geralmente, nas primeiras décadas de vida62.
múltiplas e elevada taxa de recorrência, (cerca de 20% a 60% dos casos). Quando não associado, geralmente ocorre como lesão única, e com menor índice de recorrência63.
A alteração genética mais importante relatada no CO é no gene PTCH1 (Drosophila Patched gene). O PTCH1 é um gene que codifica uma proteína transmembrana da via de sinalização hedgehog, e tem um papel importante no desenvolvimento embrionário e no câncer. Vários estudos demonstraram que mutações no gene PTCH1 podem estar presentes em pacientes com a SCNCB64–66. Alguns autores têm demonstrado que mutações no gene PTCH1 estão associadas a um subgrupo de COs com maior atividade proliferativa, podendo estar relacionada a um fenótipo de maior tendência à recidiva66.
Com relação à incidência, as lesões ocorrem da primeira a nona décadas de vida (maior prevalência em segunda e terceira décadas), havendo predileção pelo sexo masculino. A mandíbula é mais envolvida que a maxila, e cerca de metade das lesões ocorrem em região de ângulo mandibular, estendendo-se para ramo ascendente. O CO tende a crescer no sentido ântero-posterior, pelos espaços medulares do osso, sem causar expansão de cortical óssea evidente; assim, pode se tornar lesões extensas antes do diagnóstico67. Geralmente assintomáticas, as lesões são descobertas por radiografia de rotina, embora lesões maiores e secundariamente infectadas possam estar associadas à dor, tumefação, rompimento de cortical óssea e envolvimento de estruturas adjacentes68.
Radiograficamente, o CO pode apresentar aspectos variados, podendo ser encontrado como imagem radiolúcida unilocular ou multilocular, de tamanho variado, geralmente com margens lobuladas e demarcadas por delicado halo radiopaco (corticalizadas). Essa lesão pode causar deslocamento dentário, porém a reabsorção radicular não é comum. Lesões maxilares tendem a ser menores e uniloculares, e quando grandes, podem expandir e envolver o seio maxilar. Pode haver dente incluso envolvido na lesão, conduzindo à hipótese diagnóstica para cisto dentígero68–70. A Avaliação por Tomografia Computadorizada (TC) e Ressonância Magnética (RM) pode ser importante para a delimitação mais precisa e determinação da relação da lesão com estruturas nobres71. Avaliação por Tomografia Computadorizada de Feixe Cônico (TCFC – “cone beam”) não está indicada, pois quando a avaliação de tecidos moles é necessária, como no caso de lesões císticas e tumorais, deve-se optar pela Tomografia Computadorizada de Feixe em Leque (equipamentos médicos) ou pela Ressonância Magnética72.
por tecido conjuntivo fibroso, revestida por epitélio pavimentoso estratificado, fino e uniforme, com camada de paraceratina corrugada e camada basal de células colunares/cuboidais dispostas em paliçada. A junção epitélio-conjuntivo é plana, com frequentes áreas de desgarramento epitelial. Ilhas, cordões epiteliais e pequenos cistos satélites podem ser encontrados na cápsula fibrosa. Fitas de paraceratina descamada são observadas no lúmen73. É comum a perda das características epiteliais típicas em lesões intensamente inflamadas74. É relatada maior frequencia de cistos satélites, ilhas de epitélio odontogênico na cápsula fibrosa e maior número de figuras de mitose no epitélio nos casos relacionados à SCNCB60.
O CO apresenta elevado índice de recidiva após remoção cirúrgica conservadora (2,5% a 62,5%) 32. Esta recidiva pode ocorrer até 10 anos após o tratamento, sendo mais comum nos cinco primeiros anos 32; 33
. Por esse motivo, o paciente deve ser cuidadosamente acompanhado após o tratamento, considerando a eventual presença de cistos após o tratamento 34; 35.
As propostas de tratamento para o CO são diversificadas e inúmeras abordagens cirúrgicas – conservadoras e agressivas – são sugeridas. Além da erradicação da lesão, as abordagens terapêuticas buscam diminuir a recidiva e a morbidade, considerando-se ainda a idade do paciente, tamanho e localização da lesão, envolvimento de tecidos moles e histórico de tratamento anterior75,76.
O tratamento conservador inclui: 1) enucleação (seguida ou não de tratamento adjuvante), 2) marsupialização e 3) descompressão75,77. Tratamentos adjuvantes visam diminuir o índice de recidiva após tratamentos conservadores, e a aplicação da solução de Carnoy e de nitrogênio líquido são opções amplamente utilizadas77–80, além de novas opções que estão sendo descritas, como a aplicação de solução de iodofórmio81. A marsupialização prévia à enucleação propicia a redução do tamanho da lesão, e visa preservar estruturas anatômicas importantes como osso, tecidos moles e dentes envolvidos na lesão82–84. A enucleação pode ser seguida de curetagem ou ostectomia periférica, que visam à remoção do osso adjacente, eliminando epitélio remanescente e/ou cistos satélites80,85. Modalidades mais agressivas como a ressecção marginal podem ser utilizadas em lesões multiloculadas com perfuração de cortical óssea e envolvimento de tecidos moles ou ainda em lesões que recidivaram após tratamento conservador 77,86. Apesar de todas as opções de tratamento descritas, ainda não existe um consenso sobre a melhor opção de tratamento87.
O CO é uma lesão que passou por diversas modificações em sua classificação, sendo inicialmente chamado de cisto dentígero, cisto primordial e cisto folicular. A partir de 1950 pesquisadores perceberam que alguns cistos tinham recorrência após a remoção cirúrgica conservadora, principalmente o chamado cisto primordial. Em 1956, Philipsen utilizou pela primeira vez a nomenclatura “ceratocisto odontogênico” para definir qualquer cisto odontogênico que apresentasse ceratinização (ortoceratina ou paraceratina) no epitélio29. Posteriormente, novos estudos foram realizados e somente lesões que apresentavam paraceratinização passaram a ser denominadas ceratocisto odontogênico, classificado então como um cisto odontogênico de desenvolvimento pela OMS88. O comportamento biológico agressivo do ceratocisto odontogênico, diferente de outros cistos odontogênicos, e o fato de que algumas lesões estarem associada a uma mutação ou inativação do gene PTCH1 (Drosophila Patched) foram as principais argumentações para sua classificação como neoplasia cística benigna em 200517. Na última classificação dos tumores de cabeça e pescoço da OMS, o CO voltou a ser classificado como cisto e não como tumor. Essa mudança foi justificada pelo fato de que a perda de heterozigosidade do gene PTCH1 não eram exclusivas de CO89,90. Outro fator que contribui para sua classificação como cisto foi referente às lesões que respondem bem a marsupialização, características normalmente não associadas à neoplasia82,84.
2.1.3 Ameloblastoma (AM)
O Ameloblastoma (AM) é definido pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como um tumor benigno de origem epitelial com estroma fibroso e maduro 32. Pode surgir dos restos da lâmina dentária, de um órgão do esmalte em desenvolvimento, do revestimento epitelial de um cisto odontogênico ou das células basais da mucosa33. Embora sua etiologia não seja definida, acredita-se que a desregulação de diversos genes no desenvolvimento normal de um dente possa fazer parte da sua patogênese91.
O AM é classificado em três diferentes variantes clinicopatológicas: AM sólido (AMS) ou convencional, AM periférico e AM unicístico (AMU)32. Embora raro, o AM é o segundo TO mais comum, representando 13 a 58% de todos os casos88. Entre os TOs diagnosticados em dois Laboratórios de Histopatologia da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), o AM foi a segunda lesão mais
freqüente representando 23% de todos os casos diagnosticados (61% AMS e 39% AMU)37.
A forma sólida ou multicística é descrita como a mais frequente. Estudos recentes relatam que essa variante representa de 33% a 65% dos ameloblastomas92,93.
AMU é uma variante do AM que se apresenta como um cisto e representa entre 23 a 63% de todos os casos93,94. É uma lesão expansiva, porém usualmente não infiltra osso adjacente95.
O AM extra-ósseo/periférico é o correspondente extra-ósseo do AMS, compreende entre 0,6 a 2% dos casos 92–94.
O AMS, também denominado AM multicístico ou AM convencional, apresenta pico de prevalência entre a 3ª e 7ª décadas de vida sem predileção significativa por sexo ou cor de pele94,95. Já a idade média para o AMU é menor, sendo de 16 anos em casos associados a dente não-erupcionado, e de 35 anos na ausência deste92–94.
A maioria dos casos envolve a mandíbula, especialmente a região posterior de ângulo e ramo e se caracteriza clinicamente por um aumento de volume assintomático, que pode atingir grandes dimensões se não tratado18.
Radiograficamente, o AM pode apresentar-se como uma radiolucidez unilocular ou multilocular91. O quadro mais típico do AMS é de uma lesão radiolúcida multilocular, com aspecto descrito como “bolhas de sabão” ou “favos de mel”, dependendo do tamanho das lojas ósseas em seu interior. O AMU manifesta-se como uma lesão radiolúcida unilocular bem definida 95.
Histologicamente, vários subtipos do AM são conhecidos, porém esta variação não interfere no comportamento clínico da lesão. O AMS folicular e plexiforme são os mais comuns, seguidos pelo padrão acantomatoso. Menos comuns são os tipos desmoplásico, de células granulares e de células basais91,96.
O AMS folicular compreende ilhotas de epitélio odontogênico que lembram o epitélio do órgão do esmalte, dispersas em um estroma de tecido conjuntivo fibroso. As células periféricas são morfologicamente colunares, alongadas e alinhadas em uma única camada dispostas em paliçada, com núcleos hipercromáticos e polarizados lembrando os ameloblastos. As células centrais podem se arranjar frouxamente, lembrando o retículo estrelado do órgão do esmalte91,96.
O AMS plexiforme é formado por extensos cordões de epitélio odontogênico anastomosados. Também possuem células periféricas que
lembram ameloblastos e células centrais arranjadas frouxamente91,96. Para o AMU são consideradas duas variantes histopatológicas: luminal e mural. A variante luminal é uma lesão cística revestida parcial ou totalmente por epitélio de aspecto ameloblástico. As células epiteliais basais são cilíndricas ou colunares, arranjadas em paliçada com polarização nuclear invertida. As células suprajacentes mostram-se dispostas frouxamente como no retículo estrelado. Nesta variante o tumor está confinado à superfície luminal do cisto. No entanto, podem ocorrer extensões intraluminais do tumor projetadas para a luz cística. Na variante mural, a parede do cisto é infiltrada pelo epitélio ameloblastomatoso, que exibe padrão folicular ou plexiforme91,96.
As opções de tratamento para o AM variam desde terapias conservadoras, incluindo enucleação e curetagem até ampla ressecção em bloco97. Os fatores que devem ser considerados na escolha do tratamento são: tipo do tumor (sólido ou unicístico), aspectos histológicos e radiográficos, localização, tamanho e idade do paciente18.
Considerando o tipo do tumor, o AMS exibe índice de recidiva de até 95% após simples curetagem96, e de até 31% após curetagem e crioterapia98. Abordagens conservadoras podem deixar ilhas tumorais remanescentes no osso, o que irá configurar recorrências futuras. O ideal é a excisão cirúrgica com adequada margem de segurança, de 1,0 cm 98 a 3,0 cm 99 além dos limites radiográficos.
O AMU frequentemente recebe o diagnóstico clínico de cisto dentígero e é tratado com enucleação, tendo sua real natureza revelada somente com o exame histopatológico. Para a variante luminal, nenhum tratamento posterior à enucleação é necessário. Já para a variante mural, a possibilidade de reintervenção para ressecção local deve ser considerada32. A taxa de recidiva dos AMU do tipo mural varia em 20% a 25% 100. Algumas vezes, AMU envolvendo o ramo de a mandíbula não requere ressecção e respondem bem à enucleação cuidadosa e aplicação de Solução de Carnoy101. Cirurgia com aplicação de nitrogênio líquido (crioterapia) após enucleação é outra modalidade de tratamento inovadora para grandes lesões de AMU e que podem desempenhar um grande papel na prevenção da recorrência deste tumor102. Tratamentos de forma conservadora, como descompressão e enucleação com osteotomia periférica complementar e longo prazo de acompanhamento são aconselhados em casos AMU em crianças103. O acompanhamento por um longo período de tempo dos pacientes com AM é essencial, uma vez que recidivas foram documentadas em até dez anos após o tratamento inicial104.
2.2 OSTEOCLASTOGÊNESE
O osso é um órgão rígido e dinâmico que é continuamente moldado e reparado. Uma vez formado, o osso sofre um processo denominado de remodelação que envolve reabsorção e síntese; e isso ocorre em microescala em todo o esqueleto105,106. A integridade dos ossos, incluindo a sua morfogênese inicial e a remodelação óssea, requer a regulação e atividade de células de formação (osteoblastos) e células de reabsorção óssea (osteoclastos). A descoordenação entre estes 2 tipos de células pode resultar em anormalidades esqueléticas severas, caracterizadas por uma massa óssea diminuída (por exemplo, osteoporose) ou aumentada (por exemplo, osteopetrose)107. Foi demonstrado que osteoblastos e osteoclastos podem se comunicar por meio de citocinas, contato célula-célula ou contato da célula com a matriz óssea108. Estudos mostram que essa comunicação pode ocorrer em vários estágios de maturação celular e até induzir apoptose celular4,109.
O osteoblasto é diferenciado apartir das células tronco mesenquimais diferenciadas pela ação de fatores de transcrição como o RUNX2, Osterix, Fator de Transcrição Ativado 4 (ATF4) e Proteínas Morfogenéticas do Osso 4 (BMP4)110. Osteoblastos já diferenciados iniciam o estímulo à osteoclastogênese pela expressão de Fator estimulante das colônias de macrófagos (CSF-1) para aumentar o número de células progenitoras de osteoclastos que ainda não estão maduros. Simultaneamente, na membrana dos osteoblastos, é produzida uma citocina relacionada ao Fator de Necrose Tumoral (TNF) chamada Ligante do Receptor do Ativador Nuclear Kappa b (RANKL – do inglês Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-b ligand) 111,112. RANKL também pode ser liberado no meio extracelular e se liga ao Receptor Ativador do Fator Nuclear Kappa b (RANK – do inglês Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-b) na superfície das células pré-osteoclásticas e, junto com o CSF-1, induz a expressão de genes que tipificam a linhagem de osteoclastos 5,113.
O RANK é um receptor transmembrana (de superfície celular) do tipo 1 da família do Fator de Necrose Tumoral (TNF) que está presente em células precursoras de osteoclastos, células dendríticas, fibroblastos e células T. RANK humano é um peptídeo de 616 aminoácidos. A ativação do RANK pelo RANKL é seguida por sua interação com membros da família dos Receptores Associados ao Fator de Necrose
Tumoral 6 (TRAF -6 do inglês Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factors), levando à ativação do Fator Nuclear kappa B (NF-кB). Esta ativação aumenta os níveis da proteína c-Fos que interage com Fator Nuclear de Células T ativadas citoplasmática 1 (NFATc1) que está relacionada com o processo de maturação osteoclástica2,7, demonstrada na Figura 1.
A cascata de sinalização do RANK é complexa e pouco compreendida e seu papel na osteoclastogênese e na proliferação de células tumorais está sendo investigado na tentativa de descobrir um futuro alvo para as terapias antitumorais2.O RANKL é um peptídeo de 317 aminoácidos da família do TNF expresso como uma citocina de membrana celular ou liberado como fator solúvel por diversos tipos celulares, como os linfócitos T e osteoblastos114–116. Enquanto a forma ligada à superfície celular é mais comum e expressa por vários tipos celulares, a forma secretada é mais comum às células T ativadas e linhagens celulares de carcinoma de células escamosas117.
Os efeitos biológicos do RANKL são produzidos quando ele se liga ao RANK na superfície dos pré-osteoclastos resultando na fusão, diferenciação, ativação e sobrevivência de osteoclastos19,115,118. A completa diferenciação dos osteoclastos requer a ligação de RANKL das células osteoblásticas e da proteina RANK na membrana dos percussores osteoclásticos 2,7 (Figura 2). Experimentos in vivo com RANKL promovem a ativação de osteoclastos, ocasionando perda óssea e causando severa hipercalcemia sérica, enquanto a deleção de RANKL resulta na ausência de osteoclastos maduros e subsequente desenvolvimento de osteopetrose138. A deleção de RANK em roedores gera um fenótipo idêntico ao dos animais deficientes em RANKL. Estes achados demonstram que o RANKL é um fator pró-reabsortivo 142.
O osteoclasto maduro e multinucleado é ativado e polarizado e, em resposta à ativação do RANK pelo seu ligante, sofre mudanças estruturais que o preparam para reabsorver osso, como os rearranjos do citoesqueleto de actina e a formação de uma junção entre a superfície óssea e a membrana basal para formar um compartimento selado120. Este vacúolo externo se acidifica pela exportação de íons de hidrogênio gerados pelo complexo Adenosina Trifosfato 6i (ATP6i)121. A secreção continua com a exportação das enzimas líticas como fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e pró-catepsina K (pro-CATK) no espaço de reabsorção (lacunas de Howship). Os produtos de degradação (fragmentos de colágeno, cálcio e fosfato solubilizados) são removidos do espaço de reabsorção e liberados para a circulação. A atividade de
osteoclastos maduros e sua participação em sucessivos ciclos de reabsorção óssea é regulada também pelos osteoblastos, que secretam, no meio extracelular, a Osteoprotegerina (OPG), que age diretamente no RANK e, uma vez ligada, bloqueia o mecanismo RANK/RANKL e impede diferenciação osteoclástica122.
A OPG é um peptídeo de 380 aminoácidos que pertence à família de receptores do TNF, e, em contraste com todos os outros receptores TNF, carece de domínios citoplasmáticos e de membrana e é secretado como proteína solúvel7,115. OPG é um receptor que atua como antagonista do RANKL7. É produzido por numerosos tipos celulares, incluindo células inflamatórias, osteoblásticas e endoteliais. É considerado um receptor inibitório para RANKL, pois bloqueia a interação RANK/RANKL, inibindo o estágio terminal de diferenciação osteoclástica e, assim resultando numa diminuição da reabsorção óssea (Figura 2) 114,119.
Estudos in vitro demonstram que os efeitos da OPG incluem inibição da diferenciação e fusão osteoclástica; assim como, a estimulação da apoptose de osteoclastos, reduzindo desse modo a capacidade de reabsorção óssea7,114,115. A administração de OPG em roedores inibe a osteoclastogênese, ativação de osteoclastos e a reabsorção óssea, resultando em um fenótipo osteopetrótico114. Por outro lado, a deleção de OPG foi associada com acentuada osteoclastogênese, aumento da reabsorção óssea e osteoporose massiva7,114.
O equilíbrio entre RANKL e OPG é regulado por citocinas e hormônios. As alterações da razão RANKL / OPG são críticas na patogênese das doenças ósseas resultantes do aumento da reabsorção óssea123. Na osteoporose pós- menopausa, a diminuição do estrogênio diminui a expressão de OPG em osteoblastos124. Exposição crônica de glicocorticóide125, ativação de células T auto-imunes (por exemplo, artrite reumatóide) 126 e tumores malignos ósseos (mieloma, metástases ósseas)127,128 aumentam a razão de RANKL/OPG e promovem a osteoclastogênese, acelerando a reabsorção óssea e induzindo a perda óssea.
Fonte: Boyce BF, Xing L. Biology of RANK, RANKL, and osteoprotegerin.
Arthritis Res Ther. 2007;9 Suppl 1:S1. Review107.
Figura 2- Papel dos osteoblastos na diferenciação e controle dos osteoclastos
Fonte: Goldring SR, Goldring MB. Eating bone or adding it: the Wnt pathway
2.2.1 RANK/RANKL/OPG
RANKL e OPG são membros da familia do fator de necrose tumoral (TNF) e dos receptores de TNF (TNFr) respectivamente. A ligação dessas proteínas ao RANK não apenas regula a formação, ativação e sobrevivência dos osteoclastos na modelagem óssea normal mas também a remodelação em várias outras condições patológicas caracterizada por aumento do turnover ósseo. Há evidências do papel RANKL/OPG em vários tecidos e doenças130. Em artrite reumatóide, as células T sinoviais expressam RANKL e há uma expressão excessiva de RNA mensageiro (RNAm) de RANKL e OPG nos sinóvios dos pacientes com artrite reumatoide no local da reabsorção óssea131,132. Na osteoporose, foi mostrado uma relação dose e tempo dependente do RNAm de OPG com 17-estradiol 133. Portanto mulheres em menopausa ou que realizaram ovariectomia mostraram uma menor expressão de OPG em comparação com o grupo tratado com estrogênio134,135. Em metastases ósseas, as células tumorais aumentam a razão RANKL/OPG por expressão direta ou estimulam células T, osteoblastos e células endoteliais produzirem RANKL. Ainda podem estimular a reabsorção com o aumento do hormônio da paratireoide (PTH), aumentando a remoção óssea e o crescimento do tumor136.
Estudos in vitro e in vivo mostram que o equilíbrio RANK/RANKL/OPG é essencial para a vida dos osteoclastos e ainda, como mediadores de doenças ósseas, são importantes alvos moleculares para o diagnóstico e intervenção terapêutica137. Chuang et al.138 foram os primeiros a relatarem a expressão de RANK, RANKL e OPG em carcinoma epidermóide de boca (CEB). Utilizando amostras de CEB sem invasão de osso e com invasão do osso, e comparando com amostras de mucosa oral normal, encontraram imunomarcação citoplasmática para RANK e RANKL para as células cancerosas de ambos os grupos. No entanto, a imunomarcação para OPG foi fraca ou ausente em ambos.
Kumamoto et al139 revelaram que ameloblastomas benignos e malignos expressaram RANKL e OPG predominantemente em células estromais . Esse padrão de expressão sugere que essas moléculas possam ter um papel na regulação do metabolismo ósseo local com indução do estroma via parênquima. Andrade et al.19 avaliaram a expressão destes marcadores no epitélio e no estroma de tumores odontogênicos e não encontraram diferenças na imunoexpressão epitelial entre as lesões. No estroma, obtiveram valores de OPG maiores
comparados aos de RANKL em tumor odontogênico cístico calcificante e tumor odontogênico adenomatóide e níveis de RANKL maiores que OPG em tumor odontogênico epitelial calcificante, mixoma odontogênico e fibroma ameloblástico, indicando que a diferença entre estes marcadores poderia estar relacionada com o processo de invasão e reabsorção óssea tumoral. Em estudo in vitro, Qian et al140 apresentou células de ameloblastoma cultivadas induzindo células de medula óssea de coelho neonatal a se diferenciarem em osteoclastos com expressão de RANKL e OPG . Silva et al.21encontraram, na maioria das suas amostras de AM, níveis de RANKL maiores que da OPG, divergindo de CO e cisto dentígero que apresentaram maiores níveis de OPG. Matos et al20 encontraram maiores marcações de RANKL em AM e CO em comparação com folículos dentários, CRs e cistos dentígeros, que apresentaram níveis maiores de OPG. Em contrapartida, Tekkesin et al23 avaliaram RANKL e OPG em AM, CO e CRs e não verificaram diferenças estatisticamente significativas. Nonaka et.al141 encontraram RANKL<OPG e RANKL=OPG em casos de CO não associados e associados e à síndrome de Gorlin respectivamente.
A razão RANKL/OPG pode ser usada como marcador biológico de prognóstico como também ser importante para avaliação de novas drogas para doenças ósseas119. Entretanto, estudos realizados até o presente momento com o intuito de caracterizar o sistema de citocinas reguladoras da reabsorção óssea (RANK, RANKL e OPG) de forma comparativa em tumores e cistos odontogênicos invasivos como AM e CO são conflitantes e com pequenas amostras.
2.2.2 Interleucina-6 - IL-6
A Interleucina-6 (IL-6) é uma citocina pró-inflamatória secretada por macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. Sua produção pode ser estimulada por lipopolissacarídeos (LPS), Interleucina-1(IL-1) e Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α)142. Esta citocina pode também ser produzida localmente por células osteoblásticas em resposta ao hormônio paratireoidiano143. A IL-6, na presença de CSF-1, liga-se a progenitores osteoclastos para estimular a osteoclastogênese8 e fornecem uma via alternativa (ou seja, independente de RANKL) da formação de osteoclastos. É possível que IL-6 não sejam uma via clássica, mas pode ser clinicamente importante em condições inflamatórias8.
numerosos modelos de doenças em animais. Observa-se redução da susceptibilidade de sintomas com o bloqueio de IL-6 por meio de supressão gênica ou administração de anti-IL-6 em modelos de artrite reumatóide144,145, lúpus eritematoso sistêmico146, esclerose sistêmica147, miopatias inflamatórias148, uveoretinite autoimune experimental149 e encefalomielite autoimune experimental145. A Figura 3 apresenta os efeitos da IL-6 em diferentes células.
Figura 3 - Influência da IL-6 em diferentes células
Fonte: Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T. IL-6 in inflammation, immunity, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014 Sep 4;6(10):a016295 150.
Em relação às lesões bucais, vários estudos examinaram a relação entre o tamanho de lesões periapicais e o nível de IL-6. Gazivoda et al151 e Martinho et al152 isolaram células inflamatórias de lesões periapicais humanas e concluíram que lesões periapicais maiores têm maiores níveis de IL-6, e que a IL-6 pode induzir a formação de osteoclastos e reabsorção óssea. Sequenciamento genético da IL-6 através de reação em cadeia da polimerase (PCR) comprovou associação entre
polimorfismos do gene IL6-174 e aumento das bacterias Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis em pacientes com periodontite153,154.Pripatnanont et. al.155encontraram expressão mais elevada de IL-6 relacionada com o tamanho do AM e com a espessura da parede do cisto em CO.
2.2.3 Catepsina K – CTSK
A catepsina K (CTSK do inglês Cathepsin K) é encontrada abundantemente em osteoclastos, localizada em seus lisossomos e na lacuna reabsortiva da superfície óssea156. Encontra-se também em células gigantes multinucleadas, fibroblastos sinoviais, condrocitos e células epiteliais. A grande capacidade da CTSK em degradar o colágeno tipo I e tipo II, em qualquer região da molécula, e sua atuação em pHs ácido e neutro, fazem com que essa enzima tenha um papel importante na degradação de osso e cartilagem9, conforme mostra a Figura 4.
A CTKS é uma protease com importate atividade colagenolítica, pois hidrolisa de forma eficiente os maiores componentes orgânicos da matriz óssea e do tecido cartilaginoso articular 156. A CTSK é praticamente inexistente em pele, enquanto fibroblastos dérmicos de cicatrizes cirúrgicas apresentam forte expressão citoplasmática de CTSK 157
. Isto sugere que CTSK seja importante para a dinâmica do equilíbrio entre a síntese e degradação de matriz pelas células mesenquimais.
Figura 4 - Catepsina K na reabsorção óssea
As pesquisas da relação da CTKS em doenças sistêmicas ainda são incipientes. Foi encontrado alta expressão de CTSK em células semelhantes a fibroblastos ao longo da sinovia da artrite reumatóide inflamada159. CTSK também foi expressa em estroma de melanomas160 , carcinoma de células escamosas161 e carcinomas basocelulares162. No câncer de mama, é bem documentado o papel da CTSK na progressão tumoral através da promoção da capacidade de invasão de células tumorais epiteliais, pois este têm uma alta propensão de metástases para o tecido ósseo163. Recentemente encontrou-se expressão de CTSK em carcinoma de células escamosas de língua164. Esta enzima pode potencialmente participar da invasão de células tumorais no sítio primário ou metastático, mediando a degradação extracelular de proteínas da matriz extracelular163. Observou-se que não apenas tumores malignos apresentavam expressão de CTSK. Células gigantes multinucleadas de lesão central e periférica de células gigantes, lesões de querubismo e cisto aneurismático também são fortemente positivas para CTSK165. Santos et. al. 166 demonstraram maior expressão da CTSK em cistos radiculares comparados com granulomas periapicais. Na última década, intensos esforços de pesquisa visam o desenvolvimento de inibidores da CTSK para o tratamento da osteoporose e outros distúrbios associados à perda óssea patológica167. Odanacatib, um inibidor altamente seletivo da CTSK, foi eficaz no tratamento da osteoporose168. A administração de inibidores da CTSK efetivamente reduziu a expansão das lesões periapicais induzidas em ratos169.
Cabe salientar que, em cistos e tumores odontogênicos, a ação da CTSK no processo de crescimento e reabsorção óssea ainda é pouco aboradada na literatura.
3 JUSTIFICATIVA
As proteínas osteoclastogenicas como RANKL/OPG, IL-6 e proteínas geradas por osteoclastos, como a CTKS, podem desempenhar um papel importante no processo de crescimento e reabsorção óssea em lesões de origem odontogênica. O conhecimento acerca dos diferentes mecanismos de crescimento entre lesões císticas e tumorais pode ajudar a entender o comportamento mais ou menos agressivo de algumas lesões, sejam elas císticas, como o CR e CO, ou tumorais, como o AM, com a finalidade apresentar dados para futuros potenciais terapêuticos na inibição da atividade osteoclástica destas lesões.
3.1 PERGUNTA NORTEADORA
A imunoexpressão de RANKL/OPG, IL-6 e CTSK apresenta diferença entre CR, COs e AM?
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GERAL
Estudar a imunoexpressão de RANKL/OPG, IL-6 e CTSK em CR, COs e AM.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a expressão imunohistoquímica das proteínas, RANKL e OPG em CR, CO e AM e verificar se existe diferença na expressão de marcação dessas proteínas entre as lesões;
Avaliar a relação RANKL/ OPG nas lesões em estudo;
Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína IL-6 em CR, CO e AM e verificar se existe diferença na expressão de marcação dessas proteínas entre as lesões;
Avaliar a expressão imunohistoquímica da proteína CTSK em CR, CO e AM e verificar se existe diferença na expressão dessas proteínas entre as lesões;
Quantificar e correlacionar o infiltrado inflamatório com a expressão dessas proteínas nas lesões
5 METODOLOGIA EXPANDIDA 5.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O estudo proposto é de natureza básica, observacional, descritivo e retrospectivo.
5.2 ASPECTOS ÉTICOS E LEGAIS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (CEPSH) da UFSC (Número do Parecer: 1.285.803; CAAE: 49115915.5.0000.0121) (ANEXO 1).
5.3 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras utilizadas neste estudo foram selecionadas dos arquivos do Laboratório de Patologia Bucal (LPB) da UFSC. A seleção dos casos foi feita com base no diagnóstico histopatológico e na análise das lâminas coradas em Hematoxilina & Eosina (H&E). Os critérios de inclusão foram casos de cistos radiculares, ceratocistos odontogênico e ameloblastomas sólidos. As 25 amostras de CO foram de casos não relacionadas à SCNCB. Foram selecionadas 25 amostras de AM sólido. 5.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
As amostras foram submetidas à técnica de imunohistoquímica. Foram incluídos controles positivos para todos os anticorpos, sendo estes: medula óssea (RANKL/OPG), granulomas periapicais (IL-6) e lesão central de células gigantes (CTKS). O controle negativo de todas as reações foi realizado pela omissão do anticorpo primário. Desparafinização dos cortes foi em um banho em xilol por 18 horas em temperatura ambiente (TA) e depois imersas durante 5 minutos em 3 banhos de xilol em temperatura ambiente (TA). Após, na fase se reidratação, foram realizados 3 banhos em álcool etílico absoluto, 90%, 80% e 70% respectivamente. As lâminas foram submetidas a dois banhos de 5 minutos cada em água destilada. Para realizar o bloqueio da peroxidase endógena, as lâminas foram imersas na solução de peróxido de hidrogênio 6% com álcool metílico durante 20 minutos e, posteriormente, novamente submetidas à solução de peróxido de hidrogênio 6% com ácido metílico durante 10 minutos. A reativação
antigênica foi realizada mantendo-se as lâminas em solução de tampão citrato 0,01M, pH 6,0 pré aquecido em banho-maria durante 40 minutos em temperatura constante de 95 a 98ºC. Posteriormente, os anticorpos primários (Quadro 1) foram incubados em câmara úmida, durante 18 horas em 1°C. Para os os anticorpos anti- RANKL, anti-OPG e anti-IL-6 os cortes foram posteriormente incubados com anticorpo secundário anti-cabra conjugado com biotina na concntração de 1:500 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) durante 60 minutos. A reação avidina-biotina-peroxidase foi realizada com o kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Os cortes subtidos ao anticorpo anti-CTSK foi utilizado o polímero conjugado com imunoglobulinas anti-camundongo (EnVision / HRP, Dako) incubado durante 30 minutos . Os cortes foram submetidos a coloração com a solução cromógena DAB (Biocare, CA, EUA), com exposição dos cortes por no máximo 5 minutos. Posteriormente foram submetidas a contracoloração com Hematoxilina de Harris e montagem com Entellan (Merck, Alemanha). Entre as etapas, as lâminas foram lavadas em solução de Tampão Fosfato Salino (PBS), durante 5 minutos.
Quadro 1 - Anticorpos utilizados.
Anticorpo Clone Fabricante Dilução Controle
RANKL policlonal Santa Cruz Biotechnol ogy 1:200 medula óssea OPG policlonal Santa Cruz Biotechnol ogy 1:200 medula óssea IL-6 policlonal Santa Cruz Biotechnol ogy 1:50 granuloma periapical Cathepsin K monoclon al Santa Cruz Biotechnol ogy 1:1000 lesão central de células gigantes Fonte: o autor
5.5 ANÁLISE IMUNOHISTOQUÍMICA E HISTOQUÍMICA
A análise das reações imunohistoquímicas foi realizada utilizando o software ImageJ 1.45q (National Institutes of Health, Maryland, EUA) a partir de imagens capturadas com câmera fotográfica (Cannon, A620) acoplada a microscópio de luz (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), com magnitude de 400X.
Como todos os anticorpos apresentam marcação citoplasmática, a avaliação foi obtida através da média da porcentagem da área marcada (pixels positivos) em relação à área total em cada campo (pixels totais), em 10 campos consecutivos para cada caso. Foi avaliado a marcação do epitélio e conjuntivo separadamente. Quando foi avaliado somente o componente epitelial, removeu-se da imagem a porção referente ao estroma e quando foi avaliado somente o estroma, removeu-se da imagem a porção referente ao tecido epitelial. Essas exclusões foram realizadas com auxílio do programa ImageJ, onde era possível selecionar essas porções e removê-las das imagens. Foram escolhidas áreas que representassem padrões histológicos clássicos de cada lesão. Para análise da inflamação em cada grupo foram avaliados os cortes de cada caso corados em hematoxilina e eosina. As células inflamatórias foram contadas em três áreas separadas em cada caso. A média desta contagem foi relacionada com os seguintes critérios conforme Bosio et. al.170 : (0) inflamação ausente, 0–10 células inflamatórias / área; (1) inflamação leve, 11–25 células inflamatórias / área; (2) inflamação moderada, 26-65 células inflamatórias / área; e (3) inflamação severa, mais de 65 células inflamatórias / área.
5.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A comparação dos marcadores entre os grupos foi feita utilizando o teste ANOVA com post hoc de Tukey. Os resultados foram apresentados como média da porcentagem de áreas coradas ± o desvio padrão (s.p). Também se comparou áreas de RANKL com OPG em cada grupo de lesões com o teste t de Student. A correlação entre inflamação e os marcadores foi realizada com o teste de Spearman. Valores de P ≤ 0,05 foram considerados para dados com significância estatística.
6 ARTIGO
Artigo formatado conforme normas da revista Journal of Oral
Pathology & Medicine (acessadas em 23/01/2018)
Title Page
IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION OF RANKL, OPG, IL-6 AND CTSK IN RADICULAR CYSTS, ODONTOGENIC KERATOCYSTS AND AMELOBLASTOMAS.
Authors: Diogo Lenzi Capella, Elena Riet Correa Rivero
Diogo Lenzi Capella
Postgraduate Program in Dentistry Health Sciences Center
Federal University of Santa Catarina Florianópolis, Santa Catarina, Brazil E-mail:diogocapella@hotmail.com
Corresponding author: Elena Riet Correa Rivero,
Department of Pathology Health Sciences Center
Federal University of Santa Catarina Campus Universitário–Trindade
CEP: 88040-370–Florianópolis, SC, Brazil Phone: +55 (48) 37215068.
Fax: +55 48 37219542. E-mail: riet.elena@gmail.com
ABSTRACT
It is well know that the mechanisms growth of odontogenic cysts and tumors differ according to the nature of each lesion. However little is known about the mechanisms of osteoclastogenesis of these lesions. Receptor activator of nuclear factor-K b ligand (RANKL) and Osteoprotegerin (OPG) are involved in formation, differentiation and
activity of osteoclasts. The Interleukin-6 (IL-6) is also directly capable of inducing osteoclast formation and the Cathepsin K (CTSK) is specifically secreted by osteoclasts during bone resorption. The imbalance of these proteins could cause the bone resorption activity in odontogenic lesions. The aim of this study was to evaluate the osteoclastogenesis process by means of immunohistochemical markers for RANKL, OPG, IL-6 and CTSK antigens in 25 Radicular Cysts (RC), 25 Odontogenic Keratocysts (OK) and 25 Ameloblastomas (AM). The expressions of these biomarkers were evaluated and measured by the mean percentage of the marked area in 10 fields in microscopic light (400x) for each case. The epithelial and connective tissue was evaluated separately. The intensity of inflammation was also evaluated in all cases. To compare the markers in the different groups, the ANOVA and Student’s t test were used. The Spearman test was performed to evaluate the correlation between markers and intensity of inflammation. RANKL was statistically higher in RC and OK when compared to AM in epithelium and connective tissue. No statistical difference was found for OPG between the groups. For IL-6, a statistical difference was observed only in connective tissue between groups, with higher expression in RC and lower in OK. CTSK was statistically higher in AM and OK when compared to RC. No correlation was found betwwen the markers and presence of inflammation. Our results demonstrated that the bone resorption process in these lesions occurs through different mechanisms. Expression of RANKL is more related to cystic pattern lesions such as RC and OK, IL-6 is more expressed in RC and the expression of CTSK is more related with AM and CO cases, being probably associated to the aggressive behavior of these lesions.
Key-words: Ameloblastom. Mandibular Neoplasms.Osteoclasts. Bone Resorption.
INTRODUCTION
Bone is a connective tissue composed by osteoblasts (bone formation), osteocytes (osteoblasts trapped within the gaps), osteoclasts (bone resorption), an extracellular matrix of proteoglycans and mineralized collagen by the deposition of calcium hydroxyapatite1. The maintenance of bone structure and function depends on its constant remodeling and formation. Thus, imbalance in this process is associated
with several pathological conditions (osteoporosis, multiple myeloma, rheumatoid arthritis)2,3.
Many cytokines, hormones and signaling pathways are involved in bone remodeling4. The process is initiated by osteoblasts, which synthesize and express the Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand (RANKL) on its membrane or in the extracellular medium. This factor binds to the bone marrow-derived immature osteoclast precursors that express the Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B (RANK) on its membrane, leading to the differentiation of osteoclast 5,6
. Another factor synthesized by osteoblasts is Osteoprotogerin (OPG), which also binds to RANKL, preventing the binding of RANK, acting as a regulator of osteoclast maturation2,7. Interleukin-6 (IL-6) is capable of directly inducing the formation of osteoclasts through a mechanism independent of RANKL8. Cathepsin K (CTSK) is specifically secreted by osteoclasts during bone resorption, being a key enzyme in the degradation of proteins in the bone matrix, including collagen type I9.
The understanding about the mechanisms related to osteoclastogenesis is essential to analyze the process of expansion and destruction of the surrounding bone tissue in osteolytic lesions of maxillary bones. Among relatively common osteolytic lesions in the maxillary bones we have the Radicular Cyst (RC), Odontogenic Keratocyst (OK) and Ameloblastoma (AM)10,11. CR is the most common odontogenic cysts, with inflammatory etiology, developed from pulpal necrosis caused by carious lesions12. If it is untreated, it may assume sufficient size to produce expansion and destruction of the cortical bone13. OK is an intraosseous development odontogenic. The infiltrative growth of this lesion is associated with a high rate of recurrence after conservative treatment14–16. These characteristics already classify the OK as a benign odontogenic tumor17, however it returned to the classification of cyst for World Health Organization (WHO) in 201716. AM is a benign odontogenic neoplasm that presents slow and locally invasive growth, , resulting in extensive surgeries treatment with severe sequelae for the patients 18. Some studies have shown that RANKL and OPG are involved in osteolysis induced in cysts and odontogenic tumors. However have no consensus among authors in relation to the role of these proteins in the process of osteoclastogenesis of these lesions 19–23.The influence of IL-6 and CTSK on odontogenic cysts and tumors is still poorly understood.
Therefore, the aim of this study was to investigate the immunoexpression of RANKL, OPG, IL-6 and CTSK in RC, OK and
