Efeitos da suplementação de leucina no aumento de força e massa muscular em indivíduos jovens submetidos ao treinamento de força : estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo

Faculdade de Ciências Aplicadas

ISABEL THOMAZI DE ANDRADE

EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE LEUCINA NO AUMENTO DE

FORÇA E MASSA MUSCULAR EM INDIVÍDUOS JOVENS SUBMETIDOS

AO TREINAMENTO DE FORÇA: ESTUDO RANDOMIZADO,

DUPLO-CEGO E CONTROLADO POR PLACEBO

LIMEIRA 2016

ISABEL THOMAZI DE ANDRADE

EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE LEUCINA NO AUMENTO DE

FORÇA E MASSA MUSCULAR EM INDIVÍDUOS JOVENS SUBMETIDOS

AO TREINAMENTO DE FORÇA: ESTUDO RANDOMIZADO,

DUPLO-CEGO E CONTROLADO POR PLACEBO

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas da Universidade Estatual de Campinas, como requisito parcial para obtenção do título de Mestra em Ciências do programa Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Área de Concentração: Nutrição

Orientação: Prof.ª Patrícia Lopes de Campos-Ferraz

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida por Isabel Thomazi de Andrade e orientada pela Prof.ª Drª. Patrícia Lopes de Campos-Ferraz

LIMEIRA 2016

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Aplicadas

Renata Eleuterio da Silva - CRB 8/9281

Andrade, Isabel Thomazi de,

An24e AndEfeitos da suplementação de leucina no aumento de força e massa muscular em indivíduos jovens submetidos ao treinamento de força : estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo / Isabel Thomazi de Andrade. – Limeira, SP : [s.n.], 2016.

AndOrientador: Patrícia Lopes de Campos-Ferraz.

AndDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas.

And1. Leucina. 2. Suplementação alimentar. 3. Hipertrofia. 4. Força. 5. Treinamento de força. I. Campos-Ferraz, Patrícia Lopes de. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Aplicadas. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Effects of leucine supplementation on mescle mass and strength in young adults submitted to resistance training : a randomized, double bling,

placebo-controlled study Palavras-chave em inglês: Leucine Supplementary feeding Hypertrophy Strength Resistance training

Área de concentração: Nutrição

Titulação: Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo Banca examinadora:

Patrícia Lopes de Campos-Ferraz [Orientador] Adriane Elisabete Antunes de Morais

Marina Yazigi Solis

Data de defesa: 24-08-2016

Programa de Pós-Graduação: Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

FOLHA DE APROVAÇÃO Autor(a): Isabel Thomazi de Andrade

Título: Efeito da suplementação de leucina no aumento de força e massa muscular em

indivíduos jovens submetidos ao treinamento de força: estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo.

Natureza: Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas da Universidade

Estatual de Campinas, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Data da defesa: 24/08/2016

Comissão Examinadora

Prof. (a) Dr. (a) Patrícia Lopes de Campos-Ferraz Prof. (a) Dr. (a) Adriane Elisabete Antunes de Morais Prof. (a) Dr. (a) Marina Yazigi Solis

A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos a Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo, seus alunos e funcionários, por ceder os espaços e equipamentos durante a realização da pesquisa. Agradeço a Faculdade de Ciências aplicadas da UNICAMP por me receber no programa de pós-graduação e acreditar neste projeto.

Agradeço imensamente a todos os colaboradores da pesquisa, que estiveram ao meu lado, me apoiaram e me auxiliaram na longa coleta de dados, dia-a-dia, finais de semana, feriados, noites frias etc. São eles: Victoria Hevia, Felipe Gregório, Gabriel Avellar, Monique Cajueiro, Juarez Alves, Rodrigo Leite e Luiz Riani.

Agradeço minha orientadora, por acreditar em meu potencial e me guiar durante toda esta etapa de minha vida.

Expresso meus singelos agradecimentos ainda:

Aos professores Bruno Gualano, Guilherme Artioli e todos os colegas do Grupo de Pesquisa em Nutrição & Fisiologia Aplicada por gentilmente me receberem na EEFE e oferecer suporte material e científico durante todas as etapas desta pesquisa. Ao Vitão que gentilmente se ofereceu em me auxiliar na análise estatística, na edição e finalização do documento escrito. Ao Manuel Lixandrão por me ajudar com as imagens da ultrassonografia. Em especial, agradeço ao Prof. Hamilton Roschel, pelo tempo e paciência em me auxiliar na parte prática e teórica de toda a pesquisa, desde o projeto inicial até sua conclusão.

Ao meu namorado, pelo respeito, companheirismo e principalmente pela infinita paciência, tolerância e flexibilidade, que nos manteve unidos e quase totalmente sãos, nesta difícil e importante etapa de minha vida.

E por último, agradeço meus queridos voluntários, que foram tão corajosos, persistentes e resistentes para aguentar até o final do estudo, sem me abandonar. Sem vocês nada seria possível.

RESUMO

ANDRADE, I. T. Efeitos da suplementação de leucina no aumento de força e massa

muscular em indivíduos jovens submetidos ao treinamento de força: estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. 2016. 60f. Dissertação (Mestrado em

Ciências) – Faculdade de Ciências Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas, Limeira. 2016.

A hipertrofia muscular é uma resposta fisiológica caracterizada pelo aumento da área de secção transversa do músculo, resultado da síntese de novas estruturas envolvidas na contração muscular. O treinamento de força (TF) é amplamente conhecido por promover certas adaptações, podendo ocasionar um aumento na síntese proteica muscular e, em longo prazo, no ganho de força e massa muscular esquelética. Estudos in vitro e com modelos animais demonstram que a leucina isolada é capaz de estimular a síntese proteica no período pós-absortivo (jejum) de forma dose dependente. Estudos com a suplementação crônica de leucina, em conjunto de TF ainda são escassos, sendo estes muitas vezes não controlados adequadamente, sem avaliações dietéticas dos sujeitos, com duração inadequada ou não controlados por placebo isonitrogenado. O objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto da suplementação diária de 10g de leucina em jovens saudáveis e submetidos a 12 semanas de treinamento de força, quanto ao ganho de força e massa muscular de membros inferiores, utilizando alanina como placebo. Antes e após o experimento foram realizados os seguintes testes: teste de força máxima (1-RM) no aparelho leg press, teste de resistência de força (RF) no aparelho leg press, análise da área de secção transversa muscular via ultrassonografia e avaliação do consumo dietético de calorias, carboidratos, proteínas e gorduras. 37 indivíduos finalizaram todas as etapas da pesquisa. A análise do Modelo Misto revelou um significante efeito principal de tempo (p<0,0001) para o 1-RM e AST muscular via ultrassonografia, porém não foi identificado um efeito de grupo ou interação (p>0,05). Para o teste de RF foi identificado apenas uma tendência no efeito principal de tempo. Não foi encontrado efeito de interação para esta variável. O consumo proteico médio se manteve acima da recomendação da ACSM de 1,2g/kg peso, não havendo diferenças significativas intra ou intergrupo. Os principais achados foram que o TF foi efetivo em aumentar força e massa muscular de membros inferiores nos grupos suplementados com leucina ou placebo, em magnitude semelhante. Em jovens saudáveis, treinados e com consumo proteico acima de 1,2g/kg peso, a suplementação de leucina isolada não foi capaz de trazer benefícios adicionais sobre a força e hipertrofia muscular esquelética. Novas pesquisas são necessárias a fim de se averiguar o efeito da suplementação de leucina em outras populações, e/ou com aportes calórico/proteicos inferiores.

ABSTRACT

ANDRADE, I. T. Effects of leucine supplementation on muscle mass and strength in

young adults submitted to resistance training: a randomized, double blind, placebo-controlled study. 2016. 60f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Ciências

Aplicadas, Universidade Estadual de Campinas, Limeira. 2016.

Muscle growth is the physiological response characterized by an increase in the muscle cross sectional area as a result of an augmentation in the synthesis of new structures involved in muscle contraction. Resistance training is recognized as a strategy that may promote muscle protein synthesis and, in the long run, gain in strength and muscle mass. It has been established both in animal and in vitro studies that ingestion of leucine alone is capable of improving protein synthesis in the postabsorptive state, in a dose-dependent manner. Studies with chronic leucine supplementation along with resistance training are scarce, and many times do not have proper control or evaluation of the subject's diets, use short resistance training protocols, or do not use isonitrogenous placebo. The purpose of the present study was to evaluate the impact of 10g of leucine or the equivalent nitrogen dose of alanine (placebo) on strength and muscle mass in young and healthy individuals, when submitted to a 12-week resistance training routine. Before and after the end of the experimental protocol, all volunteers underwent the following analysis: maximum dynamic strength (1-RM) and repetitions to failure for the incline leg press, muscle cross sectional area (CSA) and nutritional analysis of protein, carbohydrate e fat intake. A total 37 subjects finished the study. The Mixed Model analysis showed a significant main effect of time (p<0,0001) for 1-RM and muscle CSA, however it found no significant group or interaction effect for these variables (p>0,05). For the repetitions to failure test, it was found only a main effect of time tendency. Average protein intake was above ACSM recommendation of 1,2g/kg BW at all times, and there was no significant within-subject or between-subject effect for this variable. The study's main finding was the resistance training protocol improved muscle strength and size similarly among groups, regardless of supplementation. In young and active individuals, consuming a high protein diet (>1,2g/kg BW), leucine supplementation was not able to augment muscle function and development. New studies are required to speculate the possible benefits of leucine in other settings, as in the presence of diseases, catabolic states or when protein intake does not meet the requirements.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Ilustração do desenho experimental da pesquisa...26

Figura 2- Fluxograma dos sujeitos da pesquisa...35

Figura 3 - Valores absolutos e deltas (pré – pós) de força dinâmica máxima (1-RM)...36

Figura 4 - Valores absolutos e deltas (pré – pós) do teste de resistência de força (RF)...37

Figura 5 - Valores absolutos e deltas (pré – pós) da área de secção transversa muscular (AST)………38

Figura 6 - Valores de consumo energético relativizado pelo peso corporal...39

Figura 7 - Valores de consumo proteico relativizado pelo peso corporal...39

Figura 8 - Valores de consumo proteico por refeição...40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Resumo dos testes de força aplicados na pesquisa...30 Tabela 2 - Características dos grupos nas variáveis independentes com seus respectivos níveis

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAs - aminoácidos

AAEs - aminoácidos essenciais

ACSM – American College of Sports Medicine AST - área de secção transversa

BCAAs - branched chain amino acids - aminoácidos de cadeia ramificada BP- balanço proteico

CEPEUSP - Centro de Práticas Esportivas da Universidade de São Paulo CHO - carboidratos

CV- Coeficiente de variação

DEXA - Dual-energy X-ray absorptiometry - densitometria óssea DP – desvio padrão

DPM- Degradação proteica muscular

EEFE - Escola de Educação Física e Esporte EF – exercício de força

eIF4E - fator de iniciação eucariótico-4E eIF4G- fator de iniciação eucariótico 4G FCA - Faculdade de Ciências Aplicadas GORD - gorduras

IMC- índice de massa corporal

LABMEN - Laboratório de Metabolismo do Exercício e Nutrição LEU - leucina

MHCs – Miosinas de cadeias pesadas mRNA - RNA mensageiro

PLA – placebo PTNA – proteínas

p70S6k_{- proteína cinase ribossomal S6 de 70 kDA}

RDA - Recommended Dietary Allowance - Dose Diária Recomendada RF – Resistência de força (teste)

SPM – síntese proteica muscular TE- tamanho de efeito

TF - treinamento de força

US - ultrassonografia computadorizada

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas USP - Universidade de São Paulo

VET - Valor energético total VL- Músculo Vasto lateral

WP - Whey protein - proteína do soro do leite

1-RM - 1 repetição máxima (teste de força dinâmica máxima) 4E-BP1- proteína 1 ligadora do fator de iniciação eucariótico 4E

SUMÁRIO 1- INTRODUÇÃO...14 2- OBJETIVOS...17 2.1- Objetivo Geral...17 2.2- Objetivos Específicos...17 3- REFERENCIAL TEÓRICO...18

3.1 - Efeitos do exercício e alimentação sobre o turnover proteico...19

3.2 – Mecanismos da leucina no turnover proteico...18

3.3 - Efeitos do exercício associado à suplementação de leucina – estudos agudos e crônicos...20

4- MATERIAIS E MÉTODOS...25

4.1- Comitê de Ética...25

4.2- Desenho Experimental...25

4.3 - Amostra...26

4.3.1 - Composição corporal da Amostra...27

4.4 - Testes de Força Muscular...28

4.4.1 - Teste de força dinâmica máxima (1-RM) ...28

4.4.2 - Teste de Resistência de Força (RF)...29

4.5 - Medida da Área da Secção Transversa (AST) do músculo vasto lateral...30

4.6 - Avaliação Nutricional...31 4.7 - Suplementação e Vendamento ...31 4.8 - Protocolo de Treinamento...32 4.9 - Tratamento Estatístico...33 5- RESULTADOS...34 5.1 - Amostra...34 5.2 - Força Muscular...36

5.2.1 - Força dinâmica máxima (1-RM) ...36

5.2.2 Resistência de força (RF) ...36

5.3Área da Secção Transversa (AST) do músculo vasto lateral ...37

5.4Avaliação Nutricional...38

5.4.1 Consumo energético e proteico relativizado pelo peso corporal...38

5.4.2 Consumo proteico por refeição...39

5.5 Suplementação e Vendamento...41

5.6 Frequência do Treino de Força...42

6 – DISCUSSÃO...43

7- CONCLUSÃO...49

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...50

ANEXOS...59

Anexo 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido...59

Anexo 2 - Planilha de Recordatório Alimentar...63

Anexo 3- Planilha de Controle de Suplementação...64

1 – INTRODUÇÃO

Atletas e praticantes de exercício físico comumente procuram implementar o treinamento de força em suas rotinas, com o objetivo de obter ganhos de força e massa muscular, e em última instância, melhorar o desempenho esportivo. Esse tipo de treino também é amplamente reconhecido como estratégia ideal para promover aumento de força e hipertrofia em diversas populações (Burd et al., 2009; Chodzko-Zajko et al., 2009; Phillips, 2009; Phillips et al., 2010). O treinamento de força (TF) é definido aqui como o conjunto de sessões de exercício de força (EF) realizados de forma sistemática e com cargas controladas, visando a hipertrofia da fibra muscular, resultante da confluência do balanço proteico positivo e da adição de células satélites às fibras musculares (Phillips, 2014).

A fim de atingir satisfatoriamente as adaptações descritas acima, o músculo esquelético utiliza sua 'plasticidade', isto é, da sua capacidade de receber e responder a diferentes estímulos mecânicos, alterando suas características morfológicas, metabólicas e funcionais (Pette, 2002; Widrick et al., 2002; Burd et al., 2009; Kumar et al., 2009). Nesse sentido, o músculo esquelético constantemente equilibra seu estado de anabolismo e catabolismo. O equilíbrio entre estes dois processos é chamado de turnover proteico ou balanço proteico (BP), ou seja, a razão entre o nível de degradação e síntese proteica durante um determinado período. Quando a razão entre a síntese e degradação proteica são equivalentes, o turnover ou BP é considerado neutro. Por outro lado, quando a razão da síntese de proteínas é mais elevada que a taxa de degradação, o turnover é considerado positivo. E por fim, o turnover negativo é considerado quando houver uma redução na síntese de proteínas com ou sem alteração na taxa de degradação, e/ou quando a taxa de degradação proteica for maior que a síntese (Burd et al., 2009; Kumar et al., 2009; Phillips, 2014; Mcglory e Phillips, 2015).

O turnover de proteínas no tecido muscular é bem caracterizado em algumas situações como, por exemplo, o exercício de força e alimentação, em específico, a administração de aminoácidos (AAs), a qual induz um turnover proteico positivo agudo devido a um aumento da taxa de síntese proteica (Phillips, 2014). Da mesma forma, sabe-se que algumas condições, tais como a sepse e o uso agudo de glicocorticoides, induzem um

turnover proteico negativo agudamente (Bonaldo e Sandri, 2013). Devido à óbvia dificuldade

em se realizar investigações em longo prazo que avaliem as alterações no turnover proteico, acredita-se que tais alterações agudas e sucessivas resultem em adaptações crônicas no tecido muscular. Logo, pesquisadores tem especulado que a atrofia muscular, a qual caracteriza

cronicamente condições como a imobilização, o câncer, diversas doenças autoimunes e o envelhecimento, é o resultado de sucessivas diminuições agudas da taxa de síntese proteica e/ou aumento da degradação (Deutz et al., 2011; Mcglory e Phillips, 2015). Da mesma forma, acredita-se que sucessivos aumentos agudos da taxa de síntese proteica e/ou diminuição da degradação, como ocorre com o treinamento de força, a ingestão de aminoácidos e/ou a combinação de ambos, resultem na hipertrofia muscular (Cermak et al., 2012; Luiking et al., 2014; Mitchell et al., 2014; Damas et al., 2015; Morton et al., 2015). Com isso, algumas estratégias visando otimizar este agudo turnover proteico positivo com o treinamento de força tem recebido especial atenção nos últimos anos . Uma das estratégias que tem ganhado destaque é a suplementação de proteínas e AAs (Tipton et al., 2009; Tipton e Phillips, 2013; Atherton et al., 2016).

A leucina é um aminoácido essencial (AAE) que compõe os aminoácidos de cadeia ramificada (do inglês branched-chain amino acids - BCAAs), os quais, diferentemente de outros AAs, não são prioritariamente transaminados, sendo assim desviados para o músculo esquelético (Cynober e Harris, 2006). Diferentemente do BCAAs isoleucina e valina, a leucina possui a capacidade de aumentar a ativação e expressão da proteína alvo da rapamicina em mamíferos (do inglês mammalian target of rapamycin - mTOR) em diversos tecidos, em especial o muscular. A ativação desta proteína é um passo chave no processo de síntese proteica. Em virtude disso, autores na literatura tem consistentemente observado a eficácia da leucina em aumentar a síntese proteica e diminuir a taxa de degradação em modelo de cultura de células musculares de animais; em amostras de tecido muscular incubadas com este aminoácido; via administração intravenosa em humanos; e por fim, via oral (suplementação) tanto em modelos animais quanto em humanos (Buse e Reid, 1975; Anthony et al., 1999; Anthony, Anthony, et al., 2000; Anthony, Yoshizawa, et

al., 2000; Crozier et al., 2005; Escobar et al., 2006; Norton e Layman, 2006; Kraemer et al.,

2009; Tipton et al., 2009; Atherton et al., 2010; Areta et al., 2014). Contudo, é importante ressaltar que os estudos em longo prazo investigando se estes resultados observados agudamente se traduzem em aumentos de força e massa muscular são escassos e seus resultados, controversos.

A grande parte dos estudos encontrados na literatura apresenta resultados conflitantes, muito provavelmente devido às diversas questões nas metodologias utilizadas, tais como a coadministração de diferentes proteínas e AAs; a falta de controle dietético; além de variabilidade nas quantidades das doses, formas de administração, amostras populacionais, protocolos de treino e duração. Mais precisamente, grande parte dos estudos avalia alterações

no metabolismo proteico em resposta a sessões agudas de exercício e suplementação, o que por si só pode não reproduzir os resultados atingidos cronicamente. Por outro lado, aprofundando um pouco mais sobre a administração da leucina, não é claro se múltiplas doses dela ao longo do dia poderiam sustentar ou positivar ou ainda mais o BP, bem como se tais alterações são capazes de trazer benefícios adicionais ao ganho de força e/ ou massa muscular quando em conjunto com TF. Em outras palavras, mesmo quando diante de grandes alterações na síntese proteica muscular (SPM), ainda permanece a dúvida se tal resposta aguda pode ser extrapolada em hipertrofia muscular em longo prazo, e caso confirmada, com qual magnitude isto ocorre (Coburn et al., 2006; Crowe et al., 2006; Dreyer et al., 2008; Mielke et al., 2009; Tipton et al., 2009; Balage e Dardevet, 2010; Ispoglou et al., 2011; Casperson et al., 2012; Norton et al., 2012; Pasiakos, 2012).

O papel da leucina no aumento de força e massa muscular em conjunto com TF ainda não é bastante documentado, havendo escassez de estudos bem controlados investigando sua suplementação crônica e de forma isolada, ou seja, sem a adição de outros suplementos, e contando somente com a proteína dietética habitual como substrato natural de aminoácidos essenciais (AAEs). Tal fato nos levou a dúvidas sobre a real eficácia desta estratégia no anabolismo muscular, tornando necessária a elaboração de um estudo bem controlado para responder adequadamente a essa pergunta. Deste modo, o presente estudo averiguou o impacto da suplementação diária de 10g de leucina sobre a força e massa muscular em jovens saudáveis submetidos a um programa de 12 semanas de TF. Teve-se como hipótese que a suplementação de leucina seria de fato capaz de promover ganho adicional de força e massa muscular nesta população, atuando como um sinérgico ao TF.

2- OBJETIVOS 2.1 – Objetivo Geral

Avaliar o impacto da suplementação diária de 10g de leucina em jovens saudáveis submetidos a um programa de 12 semanas de treinamento de força, quanto ao ganho de força e massa muscular, utilizando o aminoácido isonitrogenado alanina como placebo.

2.2 – Objetivos Específicos

Avaliar as alterações causadas pela suplementação de leucina associada ao treinamento de força de membros inferiores por 12 semanas quanto aos seguintes parâmetros:

A. Aumento na força máxima de membros inferiores;

B. Aumento resistência de força muscular de membros inferiores; C. Aumento da área de secção transversa do músculo vasto lateral (VL).

3- REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Efeitos do exercício e alimentação sobre o turnover proteico

Durante uma única sessão de exercício de força (EF), no período pós absortivo (jejum de 10-12h), observa-se uma manutenção ou mesmo inibição da síntese proteica muscular (SPM) abaixo dos níveis basais (Dreyer et al., 2006; Reidy e Rasmussen, 2016), enquanto o comportamento da taxa de degradação proteica muscular (DPM), nesta mesma situação, ainda carece de consenso (Kumar et al., 2009). Após a sessão do EF, ainda no período pós-absortivo, ocorre um aumento tanto na taxa de SPM quanto na de DPM, as quais atingem pico máximo aproximadamente 3 horas depois do término da sessão, e diminuindo gradativamente ao longo de 24h. Entretanto, durante períodos de jejum, este aumento na SPM ocasionado pelo EF não é suficiente para promover e sustentar um balanço proteico muscular positivo (SPM > DPM) ao final de 24h. Neste contexto, a oferta de AAs no período que sucede o término do EF é fundamental para positivar o BP (Biolo et al., 1995; Biolo et al., 1997; Phillips et al., 1997; Burd et al., 2009; Kumar et al., 2009).

Até o presente momento, acredita-se que alterações na DPM em decorrência de estímulos mecânicos ou nutricionais em indivíduos saudáveis são muito discretas e irrelevantes no anabolismo muscular em longo prazo, não sendo muito investigadas na literatura (Glynn et al., 2010). Portanto, é consenso entre muitos autores que o EF atua como potencializador da SPM em resposta a disponibilidade de aminoácidos, efeito que persiste por até 24h (Tipton et al., 2003; Kumar et al., 2009; Churchward-Venne, Burd e Phillips, 2012; Phillips, 2014). Cabe apontar, contudo, que a quantidade e disponibilidade de AAEs presentes no pool intracelular derivadas da degradação de proteínas corporais não essenciais é limitada, já que parte destes aminoácidos é desviada para oxidação e transaminação, enquanto que outra parte é utilizada para manter a homeostase do pool intracelular. Dessa forma, a oferta exógena de uma quantidade mínima diária de proteína e AAs (como por exemplo, via alimentação) é fundamental para positivar o BP, constituindo uma ferramenta estratégica para maximizar a SPM, e possivelmente incrementar o ganho de força e hipertrofia provocado pelo TF em longo prazo (Tipton et al., 2003; Burd et al., 2009; Kumar et al., 2009; Cermak et al., 2012; Deutz e Wolfe, 2013).

3.2 Mecanismos da leucina no turnover proteico

Inúmeros estudos in vitro e in vivo estudos demonstram o efeito agudo da leucina no metabolismo proteico muscular, tanto como substrato proteico como potente sinalizador e regulador da ativação da SPM (Kimball e Jefferson, 2006; Norton e Layman, 2006; Dreyer et

al., 2008; Drummond e Rasmussen, 2008; Balage e Dardevet, 2010; Li et al., 2011; Haegens et al., 2012; Pasiakos, 2012; Reidy e Rasmussen, 2016).

Descritas na literatura, existem três possíveis vias celulares capazes de explicar os efeitos da suplementação de leucina no metabolismo proteico muscular: 1- Fosforilação e ativação da via de sinalização da mTOR; 2- fosforilação do fator de iniciação eucariótico 4G (eIF4G), mediante via independente da mTOR; 3- atenuação da proteólise via sistema proteassomal e/ou lisossomal; (Anthony, Anthony, et al., 2000; Anthony, Yoshizawa, et al., 2000; Busquets et al., 2000; Mordier et al., 2000; Anthony, J.C. et al., 2002; Anthony, J. C. et

al., 2002; Kadowaki e Kanazawa, 2003; Norton e Layman, 2006; Dreyer et al., 2008; Vianna et al., 2010; Pasiakos, 2012). Dentre estas, as vias 1 e 2 acima são as mais estudadas e melhor

esclarecidas na literatura. Elas envolvem diversos fatores de iniciação (cinases e fosfatases) que regulam o processo da tradução de mRNAs (RNA mensageiros) e codificação da síntese de novas proteínas.

A via da proteína cinase mTOR pode ser ativada por meio de três principais proteínas reguladoras: proteína cinase ribossomal S6 de 70 kDA (p70S6k), proteína 1 ligadora do fator de iniciação eucariótico 4E [eIF4E] (4E-BP1), e o eIF4G. A proteína 4E-BP1 é inibidora do fator de iniciação eucariótico-4E (eIF4E), sendo esta associação repressora da ligação do mRNA. Quando a 4E-BP1 é fosforilada pela mTOR, o eIF4E é liberado para associação do eIF4G, formando o complexo ribossomal eIF4F, o qual regula a iniciação da tradução do RNAm. Logo, a fosforilação da eIF4G por via independente da mTOR possibilita, como descrito acima, a formação do complexo eIF4F (Busquets et al., 2000; Anthony, J.C. et al., 2002; Anthony, J. C. et al., 2002; Bolster et al., 2004; Karlsson et al., 2004; Zanchi e Lancha Jr, 2008; Vianna et al., 2010; Pasiakos, 2012). Cabe apontar quem ambas vias são independentes da insulina, ou seja, apesar deste hormônio exercer papel fundamental na manutenção da SPM, ele não é capaz de manter tal função no período pós-absortivo, atuando sinergicamente com a leucina na promoção da SPM ou na atenuação da DPM (Anthony et al., 1999; Anthony, J.C. et al., 2002; Anthony, J. C. et al., 2002; Norton e Layman, 2006).

3.3 Efeitos do exercício associado à suplementação de leucina – estudos agudos e crônicos

O exercício físico, mais especificamente a contração muscular, é capaz de aumentar a sensibilidade do músculo esquelético a nutrientes, em especial, AAEs. Logo, intervenções capazes de potencializar ou prolongar a SPM no período de recuperação pós EF, tem sido amplamente investigado por pesquisadores. Moore et al. (2009) investigaram o efeito agudo de diferentes doses de albumina (proteína isolada do ovo) na SPM pós EF. Os autores identificaram que, em indivíduos jovens e saudáveis, a SPM atinge patamar máximo com a administração de 20g de proteína (o que corresponde a 8-9g AAEs), ao ponto que doses acima deste valor não trazem benefício adicional (Moore et al., 2009). Outras pesquisas demonstraram resultados semelhantes com 20-25g de proteína isolada do soro do leite (do inglês whey protein isolate – WP), a qual contém naturalmente 2,5-3g de leucina, e é considerada como um suplemento proteico de alta qualidade (Tipton et al., 2009).

A partir destes estudos que avaliam o metabolismo muscular em consequência da ingestão de diferentes protocolos de suplementação proteica, surge o conceito de leucine trigger, o qual refere-se à hipótese de que a concentração intracelular de leucina é de fato o principal gatilho na sinalização da SPM. Logo, proteínas com maior concentração de leucina são mais eficazes em promover alterações na SPM do que proteínas com menor concentração de leucina. Outro ponto de grande importância é a velocidade do aparecimento de leucina no interior da célula muscular, logo, proteínas com rápida digestibilidade, como é o caso do WP, são superiores do que proteínas de digestão mais lenta, como por exemplo a caseína ou mesmo o leite in natura. Em resumo, segundo a leucine

trigger, a velocidade e a amplitude do pico de leucinemia intracelular é o principal fator que

implicará numa maior ou menor sinalização da SPM. Deste modo, até o presente momento é consenso na literatura que, em indivíduos jovens e saudáveis, a ingestão por refeição de 20-30g de proteína de boa digestibilidade e contendo 3-3,5g de leucina, seja a quantidade ideal para maximizar a SPM, quando em conjunto do EF (Phillips, 2014). Por outro lado, o efeito crônico da suplementação de proteína/ AAs, o momento ideal e a distribuição ao longo do dia ainda são objetos de controvérsia. Muitos autores defendem que, ao atingir uma quantidade específica de proteína diária, quaisquer acréscimos de proteína/ AAs não geram respostas adicionais em longo prazo. Cabe destacar que, estas recomendações proteicas não se aplicam em situações como doenças, inflamações e envelhecimento (Pasiakos et al., 2014; Reidy e Rasmussen, 2016).

No entanto, Churchward-Venne et al. (2014) demonstram que doses sub-ótimas de proteína (≈6,5g) são capazes de maximizar a SPM pós EF quando acompanhadas de um acréscimo de 5g de leucina, de forma similar à 20-25g de WP. O aumento no limiar de leucina de 3 para 5g ocorre para compensar a menor aminoacidemia causada pela baixa ingestão proteica (Churchward-Venne et al., 2014). Em outras palavras, a leucinemia plasmática e sua concentração intramuscular são os condutores principais do processo de SPM. A pesquisa foi realizada utilizando 4 protocolos de suplementação, todos após 1 sessão de EF (cadeira extensora unilateral): 25g de WP (contendo natural 3 g de leucina); 6,25g de WP (contendo naturalmente 0,75g de leucina); 6,25g de WP (adicionada de leucina, totalizando 3,0 g de leucina) e 6,25g de WP (adicionada de leucina, totalizando 5,0 g de leucina). Infusão contínua de L –[ring-13_C

6] fenilalanina junto a uma série de biópsias musculares foram realizadas a fim de mensurar a taxa SPM miofibrilar em jejum e pós suplementação, e também em repouso e pós EF de membros inferiores (resposta de suplementação adicionada ao EF). Constatou-se que, no período entre 0-1,5 h pós-prandial, todas as concentrações de suplemento aumentaram a taxa de SPM quando comparadas ao jejum, porém sem diferença estatística entre os tratamentos. Por outro lado, entre 1,5-4,5 h, todos os grupos mantiveram as taxas de SPM elevadas quando comparados ao período basal, porém os grupos suplementos com 25g de WP e com 6,5g de WP + 5g de leucina tiveram taxas ainda maiores e similares entre si, comprovando que uma refeição pobre em proteína pode ser tão efetiva em estimular a SPM, caso seja adicionado de 5g de leucina e a administração de uma dose máxima de proteína, ou de proteína + leucina, pós EF, maximiza a SPM por até 5 horas, ao contrário de apenas 3h, como se acreditava. Interessantemente, em termos de uma alimentação padrão, a SPM máxima é prolongada até o momento da próxima refeição (Churchward-Venne et al., 2014).

Apesar das evidências científicas sobre o papel da leucina na SPM, a literatura ainda carece de estudos que avaliem o efeito crônico deste AA sobre o metabolismo muscular. Até o presente momento foram encontrados somente três estudos com a suplementação crônica de leucina associada a um programa de treinamento em indivíduos jovens, os quais são abordados a seguir. No primeiro estudo, Crowe et al. (2006) investigaram a suplementação de 45mg/kg/dia de leucina ou placebo (amido de milho) durante 6 semanas em atletas de canoagem outrigger (ou canoagem havaiana), onde os sujeitos mantiveram suas rotinas de treinamento habitual. Constatou-se que a suplementação foi capaz de proporcionar melhora significativa em 2 variáveis de força, como maior potência de pico (velocidade da produção de força máxima) e tempo até exaustão (resistência de força) de membros

superiores, sem alterações na composição corporal (analisada aqui inadequadamente por dobras cutâneas) ou trabalho total. Do ponto de vista nutricional, o estudo realizou controle dietético, e os atletas tinham um consumo proteico de 0,85g/kg/dia, o que supre as Dose Diária Recomendada (Recommended Dietary Allowance – RDA) de 0,8g/kg/dia (WHO2007). Por outro lado, cabe apontar que recomendação proteica atual American College

of Sports Medicine (ACSM) para otimizar e promover adaptações musculares é de

1,2-2,0g/kg/dia (Thomas et al., 2016).

Já no segundo estudo, Laboute et al. (2013) analisaram a suplementação de 1,2g de leucina ou placebo (não especificado) em 45 atletas jovens de diferentes modalidades (rugby, futebol, basquetebol, handebol etc.) em reabilitação pós cirúrgica de ligamento ou de tendão patelar. O estudo duplo-cego teve início aproximadamente 190 dias após a cirurgia, durante a reabilitação, a qual teve duração de 2 a 3 semanas e contou com exercícios diários de fortalecimento muscular, corrida, sessões de fisioterapia e outros treinamentos como, cardiorrespiratório hídrico em bicicletas ergométricas e força de membros superiores. A suplementação foi dividida em 1 dose de 330mg pela manhã, 1 dose às 12h e 2 doses à noite. Foram analisados: perímetro muscular da coxa (a 10 e 15cm da patela), força de pico isocinética concêntrica e excêntrica (no aparelho Biodex a 90°/s e 240°/s), salto em distância e gordura corporal via 4 dobras cutâneas. Ambos grupos obtiveram melhoras em todos os parâmetros com relação ao período basal, porém o grupo leucina obteve aumento significativamente maior do que o grupo placebo no perímetro muscular, a 10 cm da patela somente. Com relação aos parâmetros de força, os autores relatam somente tendência de diferença entre os grupos, porém nenhum resultado estatisticamente significativo. Cabe apontar que a curta duração da pesquisa, não sendo possível se obter nenhuma posição sobre o efeito da suplementação com relação a força e a massa muscular nesta população a longo prazo, já que o tempo mínimo para se observar aumento significativos de força e massa muscular de membros inferiores em jovens é de 2 e 6 semanas respectivamente (2009). Apesar de não discutido pelos autores, a amostra foi composta de sujeitos expostos à um trauma e em recuperação pós cirúrgica, possivelmente seguida de um período de imobilização e atrofia muscular do membro em questão. Logo, tal amostra não representa exatamente uma população saudável.

Seguindo o raciocínio descrito acima, Ispoglou et al. (2011) avaliaram o possível ganho de força e massa magra total e de membros (mensurado por densitometria óssea - DEXA), em 26 homens adultos sedentários, submetidos a um protocolo de 12 semanas de TF e suplementação de 4g/ dia de leucina ou placebo (lactose), ambos na forma de pó. As doses

foram administradas em 3 momentos (pela manhã, meio-dia e noite) nos dias de descanso ou em 1 única dose imediatamente após sessão em dias de treino. Todos os sujeitos foram avaliados com relação à volume e intensidade de atividades físicas diárias, via um recordatório de 7 dias, e orientados a manter o mesmo estilo de vida e nível atividade física habitual durante todo o experimento. Ao final do estudo, a suplementação de leucina foi relacionada a um aumento significativamente maior na força total (soma de todos os exercícios) e na força máxima de 5 dos 8 exercícios. Por outro lado, não foi observada nenhuma diferença significativa na composição corporal, especificamente massa magra total ou de membros, entre os grupos leucina e placebo (Ispoglou et al., 2011). Os autores relacionam a falta de efeito inter e intragrupo à duração do estudo, considerando o discreto tamanho de efeito observado em todos os parâmetros da avaliação corporal. Cabe apontar que, segundo a ACSM (2009) e Defreitas et al. (2011), 12 semanas de TF é suficiente para promover aumento de massa muscular, ou seja, possivelmente outra variável tenha interferido com este resultado. Cabe ressaltar que, nesse estudo, os sujeitos consumiram uma baixa quantidade de proteína diária (0,9g/kg peso), ademais, o placebo utilizado não foi isonitrogenado, podendo ter interferido nesses resultados.

Outro ponto relevante a ser discutido nos 2 estudos descritos acima são as baixas doses de suplemento ofertadas. Laboute et al. (2013) utilizaram 2 doses de 330mg e 1 dose 660mg por dia, totalizando 1,220g de leucina, enquanto que Ispoglou et al. (2011) utilizaram 3 doses de 1,33g, totalizando 3,9g de leucina, nos 5 dias de descanso, a serem ingeridos pela manhã, tarde e noite. Como descrito anteriormente, a dose ideal de proteína por refeição para maximizar a SPM em indivíduos jovens é 20-25g ou 0,25g/kg/ refeição, contendo em torno de 3g de leucina (Reidy e Rasmussen, 2016). Assim, as diferentes doses de leucina utilizadas nesses estudos, entre outros problemas metodológicos, prejudicam a comparação entre os seus resultados. Cabe apontar a importância do rápido aumento de AAEs (em especial leucina) no sangue e no músculo, alcançado com esta dose mínima de proteína/AA, estipulada por muitos autores como o limiar de leucina para sinalizar ao máximo a SPM, ao ponto que pequenas doses não causam respostas anabólicas de mesma magnitude (West et al., 2011; Churchward-Venne, Burd, Mitchell, et al., 2012; Morton et al., 2015).

Diferentes doses e formas de administração de leucina e BCAAs vem sendo investigadas, muitas vezes em quantidades significativamente maiores do que a ingestão dietética habitual. Esta alta ingestão pode resultar na redução plasmática de outros AAEs; entretanto, sabe-se hoje que esta redução não é consequência de alterações no transporte de AAs e sim da redução na degradação de proteínas musculares e, portanto, da redução na

liberação de AAs. Até o presente momento, a leucina, assim como os BCAAs, podem ser ingeridos em altas doses por indivíduos saudáveis e concomitantemente a um protocolo de treinamento, não impondo riscos ou prejuízos à saúde (Matthews, 2005). Com base em variáveis plasmáticas e urinárias, Elango et al. (2012) definem que a dose máxima e segura de leucina seja 500mg/kg/dia (≈ 35g/dia), tal qual foi observado aumento na concentração plasmática de amônia com doses além desta. Deste modo, os autores concluem que doses de leucina abaixo de 35g/dia são seguras para consumo, sem impacto hepático ou renal negativo (Elango et al., 2012).

Com base nos estudos disponíveis, nota-se uma carência de protocolos crônicos de TF e suplementação de leucina. Nota-se também lacunas com relação `as dosagens e aos protocolo de suplementação, sendo que grande parte dos estudos utilizam doses únicas e bastante variadas de leucina (1,3-5g de leucina/dia), ou mesmo adicionadas a outros suplementos. No entanto, faltam pesquisam que avaliem se doses múltiplas desse aminoácido, possam trazer benefícios ainda maiores em longo prazo. Diante destes achados, fazem-se necessários estudos bem controlados com suplementação de leucina e TF, com duração mínima de 8 semanas, que verifiquem o efeito adicional desta estratégia no ganho de força e massa muscular. É fundamental que haja um controle dietético antes e após o experimento, assegurando uma oferta mínima adequada de macronutrientes para síntese e manutenção de musculatura esquelética, sendo esta homogênea ao longo da pesquisa. Cabe apontar ainda a importância de um grupo placebo com suplemento isonitrogenado, como é o caso do aminoácido não essencial alanina, para assegurar que quaisquer efeitos significativos sejam em consequência da oferta de leucina e não por conta de um aumento na disponibilidade de nitrogênio, elemento presente em todos os aminoácidos e ausentes nos carboidratos utilizados como placebos nas pesquisas aqui analisadas.

4- MATERIAIS E MÉTODOS 4.1- Comitê de Ética

O presente estudo foi realizado nas dependências e em parceria com a Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo (EEFE-USP), localizada na cidade de São Paulo, sendo este ensaio caracterizado como duplo-cego, randomizado e controlado por placebo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual de Campinas - CAAE: 35521314.0.0000.5404 e cadastrado na plataforma digital ClinicalTrials.gov sob nº NCT02744443.

4.2- Desenho Experimental

Para comparar os ganhos morfológicos e funcionais dos membros inferiores em resposta à administração de leucina, os participantes foram submetidos a 12 semanas de treinamento. Durante 2-3 semanas que antecederam o início do TF e da suplementação, todos os sujeitos foram submetidos a testes de força dinâmica máxima (1 RM – 1 repetição máxima) e testes de resistência de força (RF) no aparelho leg press 45°, ambos antecedidos por 1 ou 2 sessões de familiarizações respectivamente. Um descanso de no mínimo 72 horas foi respeitado entre todas as sessões de testes. Neste período, também foram realizados: medida da área de secção transversa muscular (AST) via ultrassonografia e avaliação da composição corporal via pesagem hidrostática, sendo que o período de 72h de repouso também foi respeitado para as avaliações da AST. Todos os testes foram realizadas no período basal (T1) e ao término do período experimental (T2) (figura 1). Foi solicitado aos participantes que se abstivessem de álcool e exercício físico nas 24h anteriores às avaliações. O horário das avaliações foi padronizado, ou seja, as avaliações pós-intervenção foram conduzidas no mesmo horário das avaliações pré-intervenção. Além disso, foi orientado aos participantes que chegassem ao laboratório para a realização das avaliações pelo menos 2 horas após a última refeição, mas sem que fizessem um jejum maior do que 4 horas.

Figura 1- Desenho Experimental, ilustrando procedimento de testes e período de treinamento e suplementação

4.3- Amostra

A divulgação (por mídias sociais, mailing list e cartazes) e o recrutamento dos sujeitos aconteceu concomitantemente ao andamento do experimento, entre janeiro e dezembro de 2015. Antes de participarem da intervenção, os sujeitos passaram por uma triagem inicial via telefone, para verificar os critérios de elegibilidade. Foram pré-selecionados indivíduos do sexo masculino, entre 18 - 40 anos, isento de doenças ou síndromes crônicas ou lesões ortopédicas que impedissem a prática de treinamento de força, que nunca tivessem utilizado esteróides androgênicos anabolizantes e que possuíssem experiência prévia com TF de membros inferiores há pelo menos 12 meses, sendo esta prática ao menos 1 vez por semana. Indivíduos que estivessem em uso de suplementos nutricionais ergogênicos, incluindo suplementos proteicos ou a base de aminoácidos e também creatina e beta alanina, foram orientados a cessar o uso dos mesmos 3 meses antes do 1º dia de teste da pesquisa. Foram excluídos durante a pré-seleção indivíduos que relatassem estar em dieta para perda ou ganho de peso, atletas competitivos, indivíduos engajados em treinamento e competição de esportes de endurance , como atletismo, triathlon, ciclismo etc. Os que se adequaram aos critérios de elegibilidade foram convidados a comparecer ao Laboratório de Nutrição de Metabolismo da Universidade de São Paulo, quando foram esclarecidos sobre os detalhes do projeto, e solicitados a assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) (anexo 1). Com o objetivo em obter uma amostra homogênea com

PRÉ -  Teste de 1 Repetição Máxima (1-RM) -  Teste de Resistência de Força (RF) -  Avaliação Nutricional -  AST (via US)

12 semanas Início do TF e Suplementação

relação a nível de treinamento prévio e garantir um aporte proteico inicial, após a pré-seleção deu-se início os testes de 1-RM no leg press 45° e as avaliações nutricionais. Assim, foram selecionados indivíduos com força máxima entre 3,5 e 5 vezes o seu peso corporal.

Após o término de todas a avaliações, os voluntários foram randomicamente distribuídos em 2 grupos: Grupo leucina (LEU), suplementado com 10g de leucina (Ajinomoto®, Tóquio, Japão) ou grupo placebo (PLA) suplementado com 10g de alanina (Ajinomoto®, Tóquio, Japão). A randomização foi realizada com auxílio de uma moeda por um pesquisador externo ao experimento.

O número amostral foi determinado com auxílo do software G-Power- Versão 3.1.2, adotando um poder (1 – erro β) de 0,95 e erro α de 0,05. O cálculo foi baseado assumindo um teste F com análise de variância por medidas repetidas e interações intra e inter-grupos. O tamanho do efeito (TE) utilizado no cálculo foi baseado no estudo de Ispoglou

et al. (2011), o qual é a única pesquisa encontrada na base de dados que utiliza protocolo de

suplementação de leucina isolada e TF em jovens saudáveis.

4.3.1 Composição Corporal da Amostra

O percentual de massa gorda e massa magra foi estimado por meio da pesagem hidrostática, localizada no Laboratório de Metabolismo do Exercício e Nutrição (LABMEN), no Centro de Práticas Esportivas da Universidade de São Paulo (CEPE/USP) e teve como objetivo a caracterização da amostra e análise de possíveis alterações de compartimentos corporais durante a pesquisa. Este teste não foi utilizado com propósito de avaliar ganhos ou perdas de massa magra e massa gorda em função do tratamento, pois o teste não é capaz de distinguir tecidos corporais por membros, e somente os tecidos corporais totais.

Os voluntários foram pesados em balança digital, vestindo somente traje de banho, e a altura determinada na posição ereta, com auxílio de estadiômetro. Essas medidas foram utilizadas na determinação do índice de massa corporal (IMC), pela formula: IMC = Peso (Kg)/altura2 (m). Logo em seguida, os participantes foram orientados a entrarem em um tanque e submergirem todo o corpo debaixo da água (previamente tratada e com controle de temperatura), após expiração máxima. Eles foram instruídos a continuar a expiração debaixo da água até que todo o restante de ar fosse eliminado. Neste momento o peso corporal do voluntário debaixo da água foi anotado. Este procedimento se repetiu por até 10 vezes, ou até que as medidas de pesos se estabilizassem, ou seja, não variassem mais do que 30g em 3 mensurações consecutiva. O valor do peso debaixo da água foi então utilizado para estimativa

da densidade corporal, segundo Wilmore e Behnke (1969). Para o cálculo da gordura corporal foi utilizada a fórmula de Siri (1961), e para o volume residual, Goldman e Becklake (1959).

4.4 Testes de Força Muscular

Os procedimentos para as avaliações da força máxima e resistência de força seguiram as orientações da Sociedade Americana de Fisiologistas do Exercício (American

Society of Exercise Physiologists – ASEP) (Brown e Weir, 2001).

Na semana que antecedeu o início dos testes de força, os sujeitos realizaram 1 sessão de familiarização ao teste de 1-RM e 2 sessões de familiarização ao teste de resistência de força, ambas no aparelho leg press 45°. Estes protocolos de testes serão descritos abaixo. Posteriormente, os sujeitos realizaram 2 dias de testes de 1-RM (dia 2 e 3) e 1 teste de resistência de força (dia 4). Comparações entre as medidas obtidas nas 2 sessões de testes de 1-RM foi adotada para a determinação da estabilização das cargas e, consequentemente, de um registro mais fidedigno dos valores de força máxima, considerando uma variação < 5% entre os resultados. Caso contrário, uma terceira sessão de teste foi adicionada. Durante as 3 sessões iniciais os voluntários também realizaram 3 séries de familiarização ao treino na cadeira extensora, a fim de evitar que os sujeitos sofressem qualquer destreino nas semanas de testes. Um descanso de no mínimo 72 horas foi respeitado entre todas as sessões de testes (tabela 1).

4.4.1 Teste de força dinâmica máxima (1-RM)

O teste de 1-RM no aparelho Leg press 45º (Movement Technology ®, Bruden, São Paulo, Brasil) teve como princípio quantificar a força gerada em uma contração máxima de membros inferiores, ou seja, o valor obtido no teste de 1-RM foi considerado 100% da força do indivíduo para este exercício. Respeitou-se os procedimentos propostos pela Sociedade Americana de Fisiologistas do Exercício (Brown e Weir, 2001). Os participantes primeiramente realizaram um aquecimento geral em esteira rolante (Movement Technology ®, Bruden, São Paulo, Brasil) por cinco minutos a 9 km.h-¹, seguido de duas séries de aquecimento específico no leg press 45°, com 3 minutos de intervalo entre as séries. Na primeira série foram realizadas oito repetições com carga a 50% de 1-RM (estimado na sessão

de familiarização) e na segunda, três repetições com carga a 70% de 1-RM (estimado na sessão de familiarização). Três minutos após o término do aquecimento deu-se início ao teste de 1-RM, o qual os sujeitos realizaram 5 tentativas (com três minutos de intervalo entre cada tentativa) a fim de se determinar a carga máxima para a execução de uma única repetição. Foi dados forte encorajamento verbal aos voluntários durante todos o teste.

Para a execução dos movimentos, os sujeitos foram posicionados no aparelho com as escápulas e quadris devidamente apoiados no banco, pernas afastadas na direção dos ombros e os pés posicionados no sentido de evitar que os dedos não fiquem abaixo dos joelhos. Após o devido posicionamento, a máquina foi destravada e o movimento iniciou com a plataforma se deslocando para baixo até que os joelhos encontrassem um ângulo de 90º com relação ao quadríceps, retornando a posição inicial novamente. Com o objetivo de manter a reprodutibilidade do movimento, um íman magnético envolto de um aparato plástico foi posicionado sobre uma fita métrica na barra lateral do aparelho (por onde corre o curso da plataforma) e área da plataforma foi dividida em quadrados iguais com fita autocolante, auxiliando o avaliador a identificar tanto a posição adequada dos pés quanto a amplitude da plataforma a ser movimentada para cada voluntário atingir o ângulo de 90º. O grau de flexão do joelho foi visualmente controlado pelo pesquisador, o qual orientava o sujeito sobre sua execução. Foram consideradas válidas apenas as repetições que cumpriram completamente o

ciclo de movimento.

4.4.2 Teste de Resistência de Força (RF)

O teste de RF teve como finalidade quantificar a capacidade de manutenção da força de membros inferiores no aparelho leg press 45º (Movement Technology ®, Bruden, São Paulo, Brasil). O teste seguiu os mesmos procedimentos de aquecimento e execução dos movimentos utilizados na avalição de 1-RM. No primeiro dia de familiarização ao teste resistência de força os sujeitos realizaram uma série com o máximo de movimentos possíveis (i.e., até atingirem a falha concêntrica) com 70% da carga máxima atingida no teste de familiarização ao 1-RM. No segundo dia de familiarização os sujeitos realizaram duas séries seguindo os mesmos procedimentos, com 2 minutos de intervalo entre cada série. No terceiro dia, a resistência de força foi avaliada e contabilizada pelo número total de repetições da somatória das três séries realizadas no leg press. Foram consideradas válidas apenas as repetições que cumpriram completamente o ciclo de movimento.

Tabela 1- Resumo de testes de força

1-RM Leg press (3 min de intervalo)

Resistência de força Leg press - intensidade: 70% do

1-RM (2 min de intervalo) Cadeira extensora (2 min de intervalo) Dia 1 Familiarização ao teste 1-RM 5 tentativas X Familiarização ao treino

3 tentativas até a falha Dia 2 Teste 1-RM 1

5 tentativas

Familiarização ao teste de resistência de força 1 tentativa até falha

Familiarização ao treino 3 tentativas até a falha Dia 3 Teste 1-RM 2

5 tentativas Familiarização ao teste de resistência de força 2 tentativas até falha

Familiarização ao treino 3 tentativas até a falha

Dia 4 X Teste de resistência de força

3 tentativas até falha

X

4.5 Medida da Área da Secção Transversa (AST) do músculo vasto lateral

Um aparelho de ultrassonografia (US) modo-B, com transdutor vetorial linear e frequência de 7,5 MHz (Samsung, Sonaance R3) foi utilizado para captar imagens no plano axial do músculo vasto lateral (VL) direito, a fim de avaliar alterações morfológicas deste músculo em decorrência do tratamento. Os sujeitos foram orientados a absterem-se de qualquer exercício físico de membros inferiores 72 horas antes do teste. Ao chegarem, os voluntários foram posicionados em decúbito dorsal, com os joelhos estendido, por aproximadamente 20 minutos para que ocorresse a drenagem dos excessos de fluidos da musculatura avaliada. Durante as medidas, os sujeitos foram instruídos a relaxar sua musculatura o máximo possível e suas pernas foram atadas com uma faixa de Velcro® para evitar qualquer rotação de quadril durante a avaliação. Após devidamente posicionados, um pesquisador experiente, por meio de palpação, identificou a cabeça e o epicôndilo lateral do fêmur. A partir do ponto médio, entre os acidentes ósseos, a pele foi demarcada transversalmente com tinta semipermanente a cada 2 cm para realização das medidas (ângulo de 90º com o epicôndilo lateral da tíbia). Orientado no plano axial, o transdutor foi alinhado perpendicularmente ao músculo e movido de uma posição central para uma posição lateral ao longo dos pontos previamente marcados na pele, sem que fosse exercida pressão sobre o tecido nos pontos de medição. As imagens obtidas e gravadas pelo ultrassom foram do sobrepostas a fim de reconstruir a área de secção transversa do músculo VL, seguindo

procedimentos descritos por Reeves et al (Reeves et al., 2004). Posteriormente, a AST foi mensurada com auxílio do software de digitalização de imagens de uso livre (Madena 3.2.5, EyePhysics, Los Paladinos, USA) (Reeves et al., 2004). A validade da ultrassonografia da AST do músculo VL em humanos por este procedimento, denominado image fitting, foi previamente determinada, resultando num erro padrão de 0,37cm2 e coeficiente de variação (CV) de 1,75% (Lixandrão et al., 2014).

4.6 Avaliação Nutricional

Com intuito de certificar um consumo proteico diário adequado de aproximadamente 1,2g/kg como recomendado pela ACSM (Rodriguez et al., 2009), e também detectar possíveis alterações calórico-proteicas durante a pesquisa, foram conduzidas avaliações nutricionais por meio de 3 recordatórios alimentares de 24h (anexo 2), sendo dois dias de semana não consecutivos e um dia de final de semana, tanto período basal quanto ao final do estudo.

Os recordatórios foram aplicados por um único nutricionista treinado. Para auxílio na quantificação das porções alimentares, foi utilizado livro com fotos de utensílios e porções, sob padronização da Tabela para Avaliação de Consumo Alimentar e Medidas Caseiras (Pinheiro et al., 2004) desenvolvida pelo serviço de Nutrição do setor de Lípides, Aterosclerose e Biologia Vascular – Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Os dados das três avaliações serão tabulados por um único avaliador com o auxílio do programa Avanutri Online®. Foi reportado o consumo calórico e proteico diário relativizado pelo peso corporal (kcal/ kg e g ptna /kg, respectivamente), o consumo proteico (g) por refeição e o percentual energético derivado do carboidratos, proteínas e lipídeos. Todos os participantes receberam orientação dietética para não modificarem o consumo alimentar durante todo o período do experimento.

4.7 Suplementação e Vendamento

Os suplementos foram providenciados conforme o modelo duplo-cego. Os sujeitos do grupo leucina (LEU) e placebo (PLA) receberam a cada semana 70g de leucina ou alanina em cápsulas, respectivamente, entregues em sacos plásticos do tipo zip lock, devidamente identificado com o nome do voluntário. Os suplementos foram separados para

cada voluntário de acordo com seu grupo experimental, por um pesquisador externo ao projeto. Conforme reportado por Churchward-Venne et al. (2014), quando acompanhadas de doses sub-ótimas de proteína a dose ideal de leucina para maximizar e prolongar a SMP é de 5g. Logo, todos os voluntários foram orientados a ingerirem 10g de suplemento por dia, dividida em 2 doses de 5g (total de 15 cápsulas por dia), sendo 1 dose imediatamente após o treino (período do qual o tecido muscular está mais sensível à estímulos nutricionais, i.e. AAEs) e outra 8-10h antes ou após o treino. Todos os sujeitos foram orientados a ingerir as 2 doses de suplementos todos os dias, sempre no mesmo horário, e não acompanhado das 2 refeições principais.

Para confirmar e controlar a aderência dos sujeitos, sacos de suplementos com etiquetas adesivas denominadas “DOSE 1” e “DOSE 2” foram entregues aos voluntários, o quais tiveram que retirá-las após ingestão da suplementação e colá-las em uma tabela previamente distribuída (Anexo 3). Além disso, foi solicitado o preenchimento do dia e horário da ingestão de todas as doses. Ao final do estudo, os voluntários foram questionados acerca do suplemento ingerido. A porcentagem de acerto foi comparada entre os grupos como forma de assegurar a eficiência do vendamento. Somente ao final do estudo, o pesquisador gerente teve acesso a quais suplementos cada sujeito ingeriu.

4.8 Protocolo de Treinamento

O treinamento teve duração total de no mínimo 12 e no máximo 13 semanas, com duas sessões semanais de treino. A duração das sessões foi entre 20 e 40 minutos e o intervalo entre as sessões foi de 48 a 96 horas. Os sujeitos realizaram exercícios específicos para os grupos musculares dos membros inferiores nos aparelhos leg press 45° e cadeira extensora. O treinamento seguiu um plano periodizado, de forma a simular programas de treinamento atlético, permitir a progressão de intensidade e prevenir o overtraining. Nas 4 primeiras semanas de treinamento, todos voluntários realizaram três séries de 12-15 repetições máximas. Para garantir que todas as séries fossem compostas de repetições máximas, os voluntários foram instruídos a realizarem contrações até a falha concêntrica. Logo, as cargas foram ajustadas de forma que a falha acontecesse entre 12-15 repetições. Entre a 5ª e 8ª e entre a 9 e a 12ª sessão de treino, os voluntários passaram a realizar quatro séries de 10-12 ou cinco séries de 8-10 repetições máximas, respectivamente. As sessões de treinamento ocorreram sempre sob a supervisão de um dos membros da equipe de pesquisa, previamente treinado e/ou com formação em Educação Física. Todos os treinos, datas e cargas utilizadas

foram anotados em uma planilha desenvolvida para isto (anexo 4).

4.9 Tratamento Estatístico

Os dados foram analisados quanto aos pressupostos básicos da estatística paramétrica (normalidade, homocedasticidade) pelos testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente. Para as variáveis 1-RM, resistência de força, avaliação nutricional, AST muscular e AST de fibras musculares, foi utilizado o Modelo Misto tendo grupo (dois níveis: leucina e placebo) e tempo (dois níveis: pré e pós) como fatores fixos e os sujeitos como fator aleatório, para cada variável dependente. Além disso, também foi empregado o Modelo Misto com 3 fatores (grupo, tempo e refeição) para comparar o consumo proteico entre os grupos (PLA e LEU), refeições (desjejum, almoço e jantar) e tempos (PRÉ e PÓS). Na ocorrência de valores de F significantes, foi conduzido teste post-hoc com ajuste de Tukey para comparações múltiplas. Para comparação das características inicias da amostra e as variações absolutas (PÓS – PRÉ) e relativas ((PÓS – PRÉ)/ PRÉ)*100 de cada variável dependente, foi realizado teste t student para amostras independentes. O teste Exato de Fischer foi utilizado para calcular a taxa de participantes que adivinharam corretamente sua alocação nos grupos e o tamanho do efeito foi calculado por meio do coeficiente de Cohen. As análises dos dados foram conduzidas através do software SAS versão 9.3. O valor de significância adotado foi de

5- RESULTADOS 5.1 Amostra

A figura abaixo descreve, de acordo com as diretrizes CONSORT, quantos sujeitos foram pré selecionados, recrutados e participaram das análises finais deste estudo. Ao total, 113 indivíduos foram pré selecionados como elegíveis e convidados a comparecer ao laboratório para detalhamento do projeto e seleção. Deste total, 49 indivíduos não foram selecionados a participar da pesquisa por não preencherem todos os pré requisitos ou desistiram de participar por baixa disponibilidade de tempo. Após a alocação dos 64 sujeitos nos devido grupos, 3 desistiram da pesquisa por baixa disponibilidade de tempo. Somente 19 indivíduos de cada grupo finalizaram a pesquisa. No grupo leucina, 8 voluntários desistiram por baixa disponibilidade de tempo ou por questões pessoais não relacionadas à pesquisa, 4 sofreram lesões físicas durante à prática de outras atividades, que não permitiram a continuidade destes na pesquisa e 2 indivíduos relataram dor na região lombar e patelar durantes os treinos e foram orientados por seus médicos a descontinuar temporariamente o treinamento. No grupo placebo, 5 indivíduos desistiram por motivos pessoais ou tempo, 1 relatou não preencher os pré requisitos iniciais, 2 se lesionaram fora da pesquisa e 1 sujeito relatou dor lombar que se intensificou durante os treinos, o impedindo de finalizar a pesquisa. Após o término da pesquisa 1 sujeito do grupo placebo foi retirado da análise por não preencher um dos pré requisitos iniciais da pesquisa.

Figura 2- Fluxograma dos sujeitos da pesquisa

Na tabela abaixo são apresentadas as variáveis de perfil dos participantes de ambos os grupos no momento inicial do estudo. Os resultados dos testes t student para amostras independentes e nível de significância de 5%, não demonstraram diferenças significativas em nenhuma das variáveis.

Tabela 2 – Características gerais dos grupos nas variáveis independentes com seus respectivos níveis de significância (p).

Dados apresentados em média ± desvio padrão; 1-RM: força dinâmica máxima ou 1 repetição máxima; kcal: quilocaloria; ptna: proteína.

Pré selecionados como elegíveis=113 Randomizados = 64 Excluídos= 49 Iniciou Intervenção= 33 Não iniciou = 1 ALOCAÇÃO Iniciou Intervenção= 61 Não iniciou = 3 Perda de seguimento OU Interv DesconEnuada= 14 SEGUIMENTO Drop Out: 23 Iniciou Intervenção=28 Não iniciou = 2 Perda de seguimento OU Interv DesconEnuada= 9 Analisados= 19 Excluídos da análise= 0 Analisados= 18 Excluídos da análise= 1 ANÁLISE Analisados: 37 Excluídos: 1 GRUPO LEUCINA=34 GRUPO PLACEBO= 30 N=61 N=38

Variáveis Leucina (n=19) Placebo (n=18) P

Idade 27,8 ± 4,88 27,8 ± 5,16 0,9944 Peso (kg) 78,3 ± 11,5 80,1 ± 10,2 0,625 Estatura (cm) 175,5 ± 6,1 178,6 ± 6,9 0,154 Peso magro (kg) 63,5 ± 8,7 66,6 ± 7,4 0,297 %gord 17,5 ± 5,4 16,0 ± 4,7 0,546 1-RM/ Peso 4,3 ± 0,7 4,6 ± 0,9 0,374 kcal/ kg dia 30,4 ± 9,1 29,4 ± 7,3 0,7134 g ptna/ kg peso 1,5 ± 0,5 1,7 ± 0,6 0,3899 Grupos

5.2 Força Muscular

5.2.1 Força dinâmica máxima (1-RM)

Não foram verificadas diferenças estatisticamente significantes nos valores de 1-RM entre os grupos LEU e PLA no período basal (p=0,6561), demonstrando que a randomização gerou com sucesso grupos similares. A análise do Modelo Misto revelou um significante efeito principal de tempo (p<0,0001), demonstrando que tanto o grupo LEU quanto o PLA aumentaram a força máxima com o treinamento (LEU: +75,5kg, TE: 1,08,

p<0,0001; PLA: +78,1kg, TE: 1,05, p<0,0001). Por outro lado, o Modelo Misto não

identificou um efeito de interação (p=0.8293), demonstrando que não houveram diferenças entre os tratamentos. Similarmente, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes na variação relativa entre os grupos (p=0,7093). A Figura 4 ilustra os dados de 1-RM no exercício leg press.

A B

Figura 3- Painel A- Valores de força dinâmica máxima (1-RM) expressos em média e desvio padrão (DP) dos grupos LEU (n= 19) e PLA (n=18) no período basal (PRÉ) e após intervenção (PÓS). * p<0,05 PRÉ vs. PÓS. Painel B - Média ± DP dos ganhos relativos de força máxima (Δ 1-RM) dos grupos LEU (n= 19) e PLA (n=18).

5.2.2 Resistência de força (RF)

Quando comparados no momento inicial do estudo, os grupos LEU e PLA não apresentaram diferenças significantes para os valores de RF no aparelho leg press 45°

PRÉ PÓS PRÉ PÓS 0 100 200 300 360 420 480 540 1-RM (kg) Placebo Leucina * * Plac ebo Leucina 0 10 20 30 40 Δ 1-RM (%)