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THAÍS DE FANTE
DIETA HIPERLIPÍDICA, INFLAMAÇÃO E PROGRAMAÇÃO METABÓLICA: EFEITOS NA SINALIZAÇÃO DE INSULINA EM CAMUNDONGOS RECÉM-DESMAMADOS E
ADULTOS
Limeira 2015
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Dedico esse trabalho aos meus pais, Lúcia e Aparecido, por me incentivarem a buscar cada um dos meus sonhos com força e coragem, sempre me acompanhando em cada passo.
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Agradecimentos
Agradeço a Deus, por nunca me deixar caminhar sozinha. Por sempre me mostrar o melhor caminho a seguir nos momentos que tive dúvida, e por me ensinar que tudo acontece no seu tempo certo. Como acreditava Galileu, “a ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de Deus, e a mais notável”.
A minha família, meus pais Lúcia e Aparecido, meu noivo Victor, meu irmão Tiago, minha cunhada Fernanda e a caçula peluda da casa Mel, por sempre caminharem ao meu lado. Quem tem uma família ao seu lado tem tudo que precisa para nunca deixar de seguir em frente. Em especial agradeço à minha mãe por acreditar desde quando essa universidade ainda não existia que um dia eu faria parte dela. A todos vocês agradeço pelos brigadeiros e guloseimas quando precisei, pelas conversas, pela preocupação, pelos passeios, pelos sonhos que realizamos juntos e por aqueles que ainda vamos realizar, pelos telefonemas, pelas lambidas e latidos. Agradeço, sobretudo por vocês serem minha definição de família e de amor.
A família que escolhi, meus amigos, que mesmo quando distantes estão sempre presentes no meu coração. Aos desde sempre, aos de hoje, aos que estarão ao meu lado para sempre, agradeço a amizade.
A pessoa que fez esse trabalho possível e que me acolheu com seu enorme coração, minha orientadora, professora e amiga Adriana Torsoni. Agradeço por todo aprendizado desde o primeiro momento de convivência. Pela paciência, compreensão, preocupação, pelo dom de ensinar. Obrigado por ser meu exemplo de que ser professor não é apenas passar aos alunos aquilo que se sabe, ser professor é ter paixão por ensinar, pois só assim é possível despertar nos alunos a paixão por aprender.
A família Labdime agradeço a oportunidade de convivência e aprendizado. A todos os colegas e colaboradores, agradeço pelo companheirismo, pelas conversas, pela ajuda e pela disponibilidade.
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Aos professores Marciane Milanski, Márcio Torsoni e Fernando Simabuco, agradeço pelo acolhimento e pelo exemplo de profissionais que são.
As “Drizets”, Rafaela, Laís, Fernanda, Débora, Marina e Monique, agradeço pela contribuição para a realização desse trabalho, pelos ensinamentos, pelas discussões em grupo e pela convivência.
A Simone, agradeço por toda sua dedicação ao laboratório, e por ser essa pessoa especial que está sempre disponível a ajudar...
A Débora e Monique, e aqui incluo também minha agregada Nathália, minhas ICs ou “pupilas” queridas, agradeço pela responsabilidade que sempre tiveram, pela imensa ajuda, e principalmente pela vontade que possuem em aprender, me permitindo ensinar...
A Tanyara, agradeço pela oportunidade de convivência e amizade, por sua enorme contribuição nesse trabalho, por me ajudar, me ensinar a caminhar sozinha, me acompanhar em diversos experimentos, pelas conversas, pela companhia...
Por último, agradeço em especial minha maior companheira de trabalho dos últimos anos, uma irmã de coração que a Unicamp me deu. Ao mesmo tempo em que somos tão iguais, somos também muito diferentes, e com isso formamos uma boa equipe! Andressa, minha dupla de laboratório e minha amiga de graduação, podemos dizer que crescemos muito durante esses anos. Juntas nós aprendemos, sonhamos, pensamos que não daria certo, conseguimos, comemoramos, erramos, superamos, aprendemos de novo... Sempre decidida, nunca duvidou do caminho que queria seguir. Agradeço muito a você pela imensa contribuição nesse trabalho, pela ajuda nos experimentos e na teoria, pela amizade, pelas risadas, pelas conversas, pelas comilanças, por seu meu exemplo de pessoa “esforçadinha”... Você merece tudo o que conquistou até hoje e muito mais, e eu acredito muito em você!
A FAPESP, FAEPEX, CNPq, agradeço pelo suporte financeiro. A todos, meu muito obrigado!
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“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.” Cora Coralina
xiii RESUMO
O estilo de vida moderno tem levado ao aumento na prevalência de obesidade e suas co-morbidades em gestantes e na população cada vez mais jovem. Muitos dos efeitos do consumo direto de dieta hiperlipídica (DH) no metabolismo de glicose e lipídios já são bem estabelecidos. No entanto, considera-se importante avaliar se o consumo de DH durante períodos críticos do desenvolvimento seria capaz de ativar mecanismos epigenéticos, perpetuando mudanças no metabolismo da prole e criando um ciclo vicioso que não poderia ser interrompido. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito potencial da programação metabólica em prejudicar a sinalização de insulina na prole recém desmamada de mães alimentadas com dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação. Além disso, investigamos se a exposição precoce a um ambiente obesogênico seria capaz de exacerbar o prejuízo no metabolismo de glicose na vida adulta de animais reexpostos à dieta hiperlipídica. Para isso, camundongos fêmeas da linhagem Swiss foram alimentados com dieta controle ou DH durante os períodos de adaptação, gestação e lactação, e os tecidos da prole macho foram analisados nos dias 28 e 82. Os resultados mostram que a prole de mães obesas (HC-O) apresentou maior ganho de peso, adiposidade e ingestão alimentar que a prole de mães controle (CC-O). Além do mais, apresentou prejuízos na sinalização de insulina em tecidos periféricos como fígado, adiposo e músculo, e centrais, como o hipotálamo, provavelmente devido à maior ativação de vias inflamatórias. A reexposição à DH parece agir como um fator agravante para o desenvolvimento do fenótipo obeso, levando a resistência sistêmica à insulina e hiperleptinemia. É válido ressaltar que o tecido adiposo parece ser o tecido mais afetado na prole adulta após a reexposição da dieta (HH-O), o que pode contribuir para a desregulação metabólica observada. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o consumo materno de dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação pode ocasionar alterações no metabolismo glicídico da prole tanto em animais recém desmamados quanto adultos. Por fim, a obesidade materna leva à maior susceptibilidade ao desenvolvimento de obesidade e prejuízos na sinalização de insulina na prole que não podem ser revertidos pelo consumo de uma dieta controle, no entanto, podem ser agravados especialmente quando os animais são reexpostos à DH.
xv ABSTRACT
Modern lifestyle has resulted in an increase in the prevalence of obesity and its comorbidities in pregnancy and young population. Many effects from direct consumption of a high-fat diet (HFD) on glucose and lipid metabolism are well established. However, it is important to assess whether maternal consumption of HFD during critical periods of development can trigger epigenetic mechanisms, perpetuating changes in offspring metabolism and creating a vicious circle that cannot be broken. This study evaluated the potential effect of metabolic programming in impairing the insulin signaling in recently weaned offspring of obese dams. In addition, we investigated if early exposure to obesogenic environment is able to exacerbate the impairment of glucose metabolism in adult life in response to a high-fat diet. For this, Swiss female mice were fed with Stardard chow (SC) or HFD before and during mating, gestation and lactation. Tissues from male offspring were obtained at d28 and d82 to analyze activation of key proteins of inflammatory and insulin signaling pathways by Western Blot. Offspring of obese dams (HC-O) showed greater weight gain, adiposity and food intake than offspring of control dams (CC-O). Furthermore, they showed impairment in insulin signaling in central and peripheral tissues, associated to increased activation of inflammatory pathways. The HFD re-exposure seems to be an aggravating factor in development of obese phenotype leading to systemic insulin resistance and hyperleptinaemia. Moreover, adipose tissue was ultimately the most affected tissue in adult offspring after HFD rechallenged (HH-O) which may have contributed to the metabolic deregulation observed. Together our results suggest that maternal consumption of high-fat diet during pregnancy and lactation can cause changes in glucose metabolism of offspring in both weaned and adult animals. Additionally, maternal obesity leads to increase susceptibility to the development of obesity and impairment in insulin signaling in offspring that cannot be reversed by SC consumption, but can be aggravated especially when re-exposed to HFD.
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LISTA DE FIGURAS
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LISTA DE ABREVIATURAS
AgRP Peptídeo relacionado ao agouti AKT Proteína quinase B
α-MSH Hormônio estimulador α-melanocítico
CART Peptídeo regulado por cocaína e anfetamina DM2 Diabetes mellitus tipo 2
ERE Estresse de retículo endoplasmático FOXO1 Forkhead box protein 01
GLUT4 Transportador de glicose tipo 4 GTT Teste de tolerância à glicose IKK Quinase do inibidor kappa B IR Receptor de insulina
IRS-1 Primeiro substrato do receptor de insulina ITT Teste de tolerância à insulina
JNK Quinase c-Jun N-Terminal NFκB Fator nuclear kappa B
NPY Neuropeptídeo Y
PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase PI3K Fosfoinositídeo 3-quinase
xx POMC Pro-opiomelanocortina
PTP1B Proteína tirosina fosfatase 1B PTT Teste de tolerância ao piruvato
STAT3 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 TLR4 Toll-like receptor 4
xxi SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 01
Mecanismos de resistência à insulina na obesidade 09
OBJETIVOS 13 Objetivo geral 13 Objetivos específicos 13 ARTIGO 14 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 51 REFERÊNCIAS 60 ANEXOS 75
Composição nutricional da dieta hiperlipídica empregada no protocolo
experimental 75
1 INTRODUÇÃO
A obesidade é uma doença de abrangência mundial que atinge diversas faixas etárias, em ambos os sexos e níveis sociais. É caracterizada por um acúmulo demasiado de gordura no corpo, resultante principalmente da combinação entre ingestão excessiva e sedentarismo, que leva a um estado crônico de inflamação subclínica que pode desencadear, dentre diversas outras desordens, resistência à ação da insulina (Tateya, Kim, Tamori, 2013). Dados da Organização Mundial da Saúde (WHO, 2014) apontam que em 2008, mais de 1,4 bilhões de pessoas com 20 anos ou mais já estavam acima do peso sendo que, desses, aproximadamente 200 milhões de homens e 300 milhões de mulheres se encontravam obesos. Além disso, ainda de acordo com esses dados, 42 milhões de crianças menores de 5 anos apresentavam sobrepeso ou obesidade em 2013. Fazendo uma comparação entre as três últimas décadas, o número de indivíduos obesos no mundo passou de 857 milhões para 2,1 bilhões até o ano de 2013, o que demonstra um aumento de cerca de 1,2 bilhões de casos durante esse período (Ng et al., 2014).
Nos Estados Unidos, um país marcado pela rápida expansão das redes fast food, que levaram a população ao consumo de alimentos ricos em gorduras e açúcares, cerca de 35% dos adultos estavam obesos, e aproximadamente 17% das crianças se encontravam com excesso de peso até 2010 (Flegal et al., 2012; Ogden et al., 2012). No Brasil, a situação não é diferente. Dados da pesquisa Vigitel realizada pelo Ministério da Saúde, indicam que a obesidade alcança cerca de 17,5% da população adulta, não diferindo em sua proporção entre homens e mulheres (Brasil, 2013). Além disso, segundo a mesma pesquisa, 50,8% da população apresenta excesso de peso, mostrando que o sobrepeso tem alcançado proporções alarmantes em nosso país.
Os principais problemas observados na população obesa são aqueles relacionados ao desenvolvimento da síndrome metabólica, cuja prevalência tem crescido ao lado das estatísticas da obesidade (Eckel, Grundy, Zimmet, 2005; Ceska, 2007). Essa condição está associada a alguns fatores essenciais como intolerância à glicose, obesidade com aumento da circunferência abdominal, hipertensão e
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dislipidemias, que podem ou não ser acompanhados de outras alterações (Eckel, Grundy, Zimmet, 2005; Levesque, Lamarche, 2005). Um fator preocupante é que o aumento da prevalência da obesidade em indivíduos cada vez mais jovens leva também ao desenvolvimento precoce da síndrome metabólica que ao longo da vida evolui para quadros cada vez mais graves, dentre eles, o agravamento dos riscos cardiovasculares (Miranda et al., 2005; Morrell et al., 2012). Na América do Sul, assim como na maior parte do mundo, o estilo de vida sedentário, associado à prática de hábitos alimentares inadequados tem aumentado cada vez mais o número de indivíduos obesos na população, assim como os casos de doenças associadas à obesidade e câncer (Aballay et al., 2013).
Uma das doenças freqüentemente associadas à obesidade é o diabetes mellitus tipo 2 (DM2), uma doença que pode ser decorrente da evolução do quadro de intolerância à glicose observado entre as características da síndrome metabólica, também associada ao ganho de peso excessivo e ao sedentarismo, e que em 2012 foi responsável por cerca de 1,5 milhões de mortes no mundo (WHO, 2014). Assim como a obesidade, a patogênese da DM2 também está relacionada a um processo inflamatório, que atinge principalmente o sistema nervoso central e alguns tecidos periféricos, evidenciado pelo aumento de marcadores inflamatórios circulantes (Donath, Shoelson, 2011; Esser et al., 2014). Além de ser um fator crucial para o desenvolvimento de DM2, a “síndrome” da resistência à insulina, como pode ser chamada, também está relacionada ao surgimento de doenças cardiovasculares, uma das principais causas de morte no mundo (Meigs, 2003).
Considerando essa forte prevalência da obesidade e suas co-morbidades na população, dentre elas a DM2, estudos têm focado em desvendar quais os principais fatores envolvidos com esse crescente aumento observado nas últimas décadas. Quando pensamos em obesidade, o excesso de calorias consumidas pela ingestão alimentar excessiva, associada ao sedentarismo aparecem como os fatores capazes de explicar o cenário mundial. No entanto, a situação vai muito mais além, pois a obesidade é uma doença de causas complexas e multifatoriais. Além do consumo excessivo de calorias, o desequilíbrio entre os macronutrientes que compõem a dieta,
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principalmente o consumo abusivo de lipídios e carboidratos, também são capazes de favorecer o ganho excessivo de peso (Pataky, Bobbioni-Harsch, Golay, 2010; Temelkova-Kurktschiev, Stefanov, 2012).
Em animais, o modelo de obesidade induzida pelo consumo de dieta hiperlipídica é um dos mais utilizados para o estudo da obesidade e suas co-morbidades, já que essa representa a mudança nos hábitos alimentares da população ocorrida nos últimos anos, decorrente da maior acessibilidade a alimentos ricos em gordura e, por essa razão, mais palatáveis (Speakman et al., 2007). Os ácidos graxos saturados, na maioria das vezes, contribuem com a maior parte da fração lipídica dos alimentos modernos. Hoje, já se sabe que esses ácidos graxos possuem uma capacidade diferenciada dos outros, mono e poliinsaturados, em ativar TLR4, um receptor do sistema imune inato, o que é capaz de gerar uma resposta inflamatória que prejudica a sinalização anorexigênica no hipotálamo (Milanski et al., 2009). Dessa forma, a dieta hiperlipídica rica em ácidos graxos saturados não é apenas capaz de contribuir para o maior consumo calórico em decorrência de sua maior palatabilidade, mas também por meio de alterações em importantes vias moleculares, dentre elas a que envolve a regulação do apetite. Além disso, tais ácidos graxos estão envolvidos com o desenvolvimento das co-morbidades associadas à obesidade, como o desenvolvimento de esteatose hepática não alcoólica e resistência à insulina (Funaki, 2009; Leamy, Egnatvhik, Young, 2013).
A homeostasia energética possui papel fundamental no controle da energia estocada na forma de gordura no organismo, sendo que prejuízos nesse mecanismo podem contribuir para o desenvolvimento e/ou agravamento da obesidade (Velloso, Schwartz, 2011). O hipotálamo é a parte do sistema nervoso central relacionado com o controle da fome e termogênese. Em sua região conhecida como núcleo arqueado (ARC) existem duas subpopulações de neurônios que expressam neuropeptídeos orexigênicos, NPY (neuropeptídeo Y) e AgRP (peptídeo relacionado ao agouti), e anorexigênicos, POMC (propiomelanocortina) que secreta α-MSH (hormônio estimulador α-melanocítico), e CART (peptídeo regulado por cocaína e anfetamina),
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responsáveis pelo controle da fome (Velloso, 2006). Essas regiões são controladas por sinalizadores periféricos do organismo, como os hormônios leptina e insulina.
A leptina é produzida pelo tecido adiposo branco e possui papel essencial no controle da fome e regulação da termogênese. Esse hormônio foi descoberto em 1994, quando foi demonstrado que camundongos mutados para não expressarem o gene ob apresentavam obesidade severa (Zhang et al. 1994). Já a insulina é um hormônio que desempenha diversas funções no organismo, dentre elas a regulação do metabolismo de nutrientes como glicose e lipídios (Saltiel, Kahn, 2001). Esse hormônio é secretado pelas células β pancreáticas em resposta às elevações nos níveis de glicose circulante. Tais hormônios possuem um mecanismo de cross-talk no hipotálamo, onde um favorece a ação do outro, potencializando ambas as ações sobre o controle da fome e da termogênese (Carvalheira et al., 2005). Dessa forma, em situações pós-prandiais, os níveis aumentados de leptina e insulina promovem a ativação da sinalização anorexigênica (POMC/CART) e inibição da orexigênica (NPY/AgRP), o que resulta, portanto, na redução da ingestão alimentar (Schwartz et al., 2000).
Já foi evidenciado na literatura que o consumo de dieta hiperlipídica desencadeia um processo inflamatório no hipotálamo, sendo que a via inflamatória produz mediadores que agem diretamente na via de sinalização insulínica, afetando e bloqueando o sinal, e levando ao desenvolvimento do quadro de resistência à insulina (De Souza et al., 2005). É válido ressaltar que tal resposta não se limita à região hipotalâmica, desencadeando os mesmos efeitos em tecidos periféricos, ainda que mais tardios. O quadro de resistência à insulina tem chamado atenção entre as principais características observadas em indivíduos obesos. O grau subclínico de inflamação (metainflamação) observado durante a obesidade se mostra intimamente relacionado com o quadro de resistência à insulina, já que esse possui mecanismos importantes que resultam na interação entre proteínas inflamatórias, tais como JNK e IKK, e a cascata de sinalização desse hormônio (Ye, 2013). Da mesma forma, indivíduos obesos também se tornam resistentes à ação da leptina, o que pode
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desencadear uma série de mecanismos que reforçam o quadro de obesidade (Jung, Kim, 2013).
Além dos prejuízos diretos que a obesidade pode causar na saúde do indivíduo, recentemente têm sido mostrado que a obesidade materna é capaz de levar a danos irreversíveis no metabolismo da prole. Nos países em desenvolvimento, freqüentemente é observado um maior número de mulheres obesas na população, em comparação aos homens (Kanter, Caballero, 2012). Isso ocorre principalmente em decorrência do maior consumo de alimentos açucarados e do impacto negativo sobre o padrão de atividade física das mulheres ao longo dos últimos anos. Durante a gravidez, a presença de obesidade é relacionada com maiores complicações ao decorrer da gestação como, por exemplo, a presença de hipertensão, diabetes gestacional, e maior período de internação (Sarkar et al. 2007; Crane et al., 2013).
A exposição a diversos fatores durante a gestação, tais como desnutrição, obesidade, diabetes e substâncias farmacológicas são características ambientais capazes de predispor a prole ao desenvolvimento de obesidade (Levin, 2008; Metges, 2009). Essas alterações estariam relacionadas com o conceito de “programação metabólica”, onde diferentes estímulos durante períodos críticos do desenvolvimento seriam capazes de propiciar respostas fisiológicas na prole (Lucas, 1991; Zambrano et al., 2006). Hoje já se sabe que tal programação ocorre pela ativação de mecanismos epigenéticos, alterações que podem não ser visíveis no fenótipo logo após o nascimento, mas que muitas vezes vêm a se manifestar na forma de doenças na vida adulta. Os fatores epigenéticos atuam condicionando a acessibilidade de fatores de transcrição ao genoma, seja por variações no padrão de acetilação e metilação, modificações covalentes nas bases de DNA ou ainda modulando a tradução, por meio da expressão de microRNAs (Dupont, Armant, Brenner, 2009).
Os primeiros estudos a mostrarem que alterações nutricionais durante a gestação eram capazes de predispor o feto a doenças cardiovasculares e obesidade na vida adulta abordaram os efeitos da desnutrição materna durante o inverno da fome holandês que ocorreu entre 1944 e 1945. Esses estudos retrataram que a exposição à fome, principalmente na segunda metade da gestação, possuía forte relação com o
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desenvolvimento de obesidade observada nos filhos na vida adulta. Nesses trabalhos já era apontado que esse fenômeno poderia ocorrer em decorrência de alterações no controle da fome e crescimento, proporcionado pelas regiões hipotalâmicas (Ravelli, Stein, Susser, 1976; Ravelli et al., 1999).
A desnutrição no útero é capaz de prejudicar o desenvolvimento das células β pancreáticas e, conseqüentemente, o metabolismo glicídico (Bertin et al., 2002). Estudos também demonstraram que a prole de fêmeas alimentadas com uma dieta hipoprotéica durante a gestação e lactação desenvolvia mudanças no comportamento alimentar, alterações nos níveis de leptina e metabolismo da glicose, e modificações nas concentrações de triglicérides e colesterol, sendo que essas características poderiam ser ainda exacerbadas pelo consumo de uma dieta hipercalórica pós-natal (Vickers et al., 2000; Zambrano et al., 2006). Além disso, já foi demonstrado que as alterações no metabolismo da glicose na prole poderiam ser tão persistentes que até mesmo a segunda geração seria afetada (Pinheiro et al., 2008). Um estudo demonstrou que a administração de leptina em períodos de gestação e lactação onde as mães estavam submetidas a dietas com restrição protéica melhorou a sensibilidade à insulina da prole, evitando o desenvolvimento do fenótipo de obesidade mesmo quando alimentados com dieta hiperlipídica (Stocker, Arch, Cowthorne, 2005). Esse trabalho sugere que a programação observada na prole pode ser decorrente das alterações nos níveis de leptina observadas nos casos de desnutrição.
Assim como a ingestão insuficiente, a hipernutrição também é capaz de desencadear a programação metabólica na prole. A obesidade materna induzida pelo consumo de dieta hiperlipídica leva as fêmeas ao ganho de peso excessivo durante a gestação, além de mudanças na composição corporal, alterações glicêmicas e do metabolismo lipídico, e modificações no transporte de nutrientes através da placenta (Hartil et al., 2009; Jones et al., 2009).
A gravidez por si só caracteriza um estado inflamatório basal na placenta durante o desenvolvimento fetal (Sacks et al., 2004). Da mesma forma, a obesidade também está associada com um quadro subclínico de inflamação, levando ao acúmulo de macrófagos no tecido adiposo proporcionalmente ao nível de
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adiposidade do indivíduo (Weisberg et al., 2003). Em um estudo onde foi avaliado se o estado inflamatório característico da obesidade poderia intensificar o nível basal de inflamação na placenta durante a gravidez, foi encontrado uma produção exacerbada de mediadores inflamatórios e acúmulo de macrófagos, intensificando a inflamação na placenta de grávidas obesas e abrindo espaço para discussões sobre as repercussões que essa modificação no ambiente uterino pode ocasionar no feto após o nascimento (Challier et al., 2008).
Diversos estudos já abordaram a obesidade materna e suas repercussões no metabolismo da prole. Estudos em animais já demonstraram que, em longo prazo, a alimentação hiperlipídica materna predispõe a prole a elevações na pressão arterial e nos níveis de colesterol total (Elahi et al., 2009). Além disso, o consumo de alimentos ricos em gordura apenas durante a gravidez e lactação já predispõe a prole à resistência a insulina e fígado gorduroso (Gregorio et al., 2010; Ashino et al., 2012). Tal condição ainda pode evoluir para esteatohepatite na prole adulta, em decorrência de disfunção mitocondrial e alterações na lipogênese (Bruce et al., 2009). Recentes estudos de nosso grupo encontraram também alterações no metabolismo lipídico e expressão de microRNAs hepáticos, além de ativação de estresse de retículo no hipotálamo na prole recém desmamada de camundongos com obesidade induzida por dieta durante a gestação e lactação (Benatti et al., 2014; Melo et al., 2014). Na mesma linha, o aumento do risco de ocorrência de doença hepática gordurosa não-alcoólica e doenças metabólicas decorrentes da exposição a excesso de lipídios maternos no desenvolvimento fetal também já foi evidenciado em primatas (McCurdy et al., 2009).
O feto das mães alimentadas com dieta hiperlipídica também apresenta aumento sérico significante de insulina e leptina, acompanhado de alterações na via de sinalização desses hormônios no hipotálamo, apesar de alterações de peso não terem sido observadas (Gupta et al., 2009). No nascimento, os níveis séricos de leptina da prole de mães obesas se apresentam diminuídos, o que já pode gerar logo no primeiro dia após o nascimento um prejuízo no mecanismo de ativação dos neurônios responsáveis pelo controle da fome (Morris, Chen, 2009). Em um estudo que buscou
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descrever os diferentes papéis exercidos pela gestação e lactação na programação metabólica, foi encontrado que a gestação ocasiona modificações mais importantes que a lactação no que se refere a mecanismos epigenéticos, no entanto, em conjunto, a lactação pode potencializar esses efeitos em decorrência de modificações na regulação da leptina (Masuyama, Hiramatsu, 2014).
Em um trabalho que compara na prole também a influência da dieta materna antes da gestação, fica evidenciado que tal fator não é capaz de causar grandes alterações no metabolismo da prole. A dieta materna durante a gestação parece ter maior participação na formação de um fenótipo obeso na prole adulta até mesmo independentemente da dieta consumida no período pós-natal (Howie et al., 2009). A dieta hiperlipídica materna parece desencadear uma programação inadequada na prole adulta, sendo que estes tendem a ganhar mais peso e a apresentar aumento nos níveis de insulina, glicose, ácidos graxos livres e triglicerídeos circulantes, indicativos do desenvolvimento de um quadro de resistência à insulina (Srinivasan et al., 2006; Ashino et al., 2012).
A fim de avaliar a resistência central à leptina, um estudo utilizou o modelo de hipernutrição precoce por redução de ninhada para descrever se a supernutrição na fase inicial da vida pode levar a uma maior susceptibilidade à obesidade e resistência à insulina em decorrência do consumo posterior de dieta hiperlipídica. Os resultados apontam que os animais expostos à supernutrição em decorrência do maior consumo de leite materno já exibem um perfil de resistência à leptina acompanhado do rápido desenvolvimento de obesidade e resistência à insulina após introdução direta de dieta hiperlipídica na vida adulta (Glavas et al., 2010). Além das alterações referentes à leptina, já foi retratado também que a reexposição à dieta hiperlipídica na vida adulta é capaz de resultar em uma forma mais severa de doença hepática do que nos animais mantidos em dieta controle (Bruce et al., 2009). Outro estudo demonstrou também que a prole que possui um segundo contato com a dieta hiperlipídica é capaz de apresentar maior ganho de peso e desenvolver maiores adipócitos, demonstrando uma resposta mais deletéria nesses animais (Kruse et al., 2013). Desse modo, acredita-se que a programação metabólica em decorrência da
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dieta materna possa prejudicar outros mecanismos moleculares, aumentando a susceptibilidade aos efeitos ocasionados pelo consumo exacerbado de gordura na vida adulta, seja em tecidos centrais ou periféricos.
Mecanismos de resistência à insulina na obesidade
A resistência à insulina é uma condição onde a captação de glicose, função primária da insulina, se torna prejudicada em tecidos responsivos à sua ação, por inibição de sua via de sinalização (Ye, 2013). Dentre as anormalidades associadas a essa doença, pode-se destacar a intolerância à glicose, dislipidemias (principalmente aumento dos níveis de triglicérides e colesterol LDL), disfunção endotelial, mudanças hemodinâmicas, aumento de marcadores inflamatórios e problemas durante o sono (Reaven, 2005). Em um estado pré-diabético, as células β pancreáticas tentam manter a glicemia aumentando a secreção de insulina, o que leva a uma condição de hiperinsulinemia combinada à resistência (Konner, Bruning, 2012). O desenvolvimento de DM2 ocorre quando o quadro de resistência é associado com defeitos na secreção de insulina pelas células β, situação onde a secreção falha em compensar a hiperglicemia existente (Soumaya, 2012).
A sinalização da insulina se inicia com a ligação dessa proteína ao seu receptor (IR), presente em todas as células responsivas à insulina, entre elas os hepatócitos, adipócitos e células musculares. Tal ligação desencadeia a autofosforilação em tirosina da subunidade β do receptor, o que é fundamental para a sequência da cascata de sinalização (Myers, White, 1996). Posteriormente, os IRS (substratos do receptor de insulina), são fosforilados e se ligam à proteína PI3K, que continua a propagação do sinal (Sun et al., 1992). A proteína AKT é um alvo direto da PI3K, sendo recrutada após a sua ativação, auxiliando na translocação de GLUT4 para a membrana celular em tecidos como músculo e adiposo, para conseqüente captação de glicose (Cong et al., 1997). No entanto, em outros tecidos, o papel dessa via não é limitado apenas à translocação de transportadores de glicose, sendo fundamental na síntese de glicogênio e no aumento da síntese protéica.
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Um dos principais mecanismos de resistência à insulina, observado durante a obesidade, decorre de sua interação com a sinalização inflamatória. A descoberta de que o tecido adiposo é capaz de produzir, dentre outras substâncias, citocinas inflamatórias como TNF-α, possibilitou o estabelecimento da relação entre inflamação e resistência à insulina (Hotamisligil, Shargill, Spiegelman, 1993). Em um primeiro estudo foi observado que, na presença de TNF-α, ocorria uma menor fosforilação em tirosina de IR e IRS-1, o que levava a menor propagação do sinal (Feinstein et al., 1993). Posteriormente, foi demonstrado que essa menor fosforilação ocorre em decorrência da ativação de proteínas-chave da via da sinalização de TNF-α que agem diretamente sobre substratos do receptor de insulina propiciando sua fosforilação em serina, e bloqueando os passos seguintes da via (Hotamisligil et al., 1996).
Figura 1: Sinalização da insulina e sua interação com a via inflamatória (Adaptado de Luca, Olefsky, 2008).
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A ligação de TNF-α a seu receptor resulta na estimulação da sinalização capaz de ativar as serinas quinases JNK (c-Jun N-terminal) e IKK (quinase do inibidor kappa B) que então poderão agir sobre IRS-1 (Luca, Olefsky, 2009). Adicionalmente, IKK participa da ativação transcripcional de NFκB (fator nuclear kappa), responsável pela indução da transcrição de genes envolvidos com inflamação, potencializando o processo inflamatório (Hayden, Ghosh, 2004). Além da produção de citocinas pelo tecido adiposo, também já foi demonstrado que os ácidos graxos possuem capacidade de se ligar a receptores TLR4, resultando também na ativação de JNK e IKK (Shi et al., 2006).
Um recente estudo de nosso grupo demonstrou que a prole recém desmamada de mães obesas apresenta a ativação de estresse de retículo endoplasmático (ERE) no hipotálamo (Melo et al., 2014). O ERE também já foi descrito como um mecanismo associado a superativação de JNK e, portanto, indutor de resistência (Ozcan et al., 2004). Além disso, fatores como NFκB e ERE parecem estar envolvidos na ativação de PTP1B (proteína tirosina fosfatase 1B), que interage com IR e IRS-1, hidrolizando a fosforilação desencadeada pela ação da insulina e prejudicando a captação da glicose (Panzhinsky, Ren, Nair, 2013). Dessa forma, na obesidade diversos mecanismos que propiciam o processo inflamatório podem estar ativos, resultando em maiores níveis das serinas quinases e fosfatases que contribuem para a instalação da resistência. É importante ressaltar que diversos outros fatores e mecanismos descritos mais recentemente podem estar envolvidos com o desenvolvimento da resistência à insulina, no entanto, os mecanismos ligados à inflamação e à ativação de componentes inflamatórios ainda são reconhecidos como os mais relevantes.
O quadro de resistência à insulina possui diferentes repercussões em diversos tecidos. No músculo, a captação de glicose via GLUT4 se torna comprometida, há prejuízo na glicogênese e na síntese protéica, e no metabolismo de ácidos graxos (Schinner et al., 2005, McArdle et al., 2013). No fígado, também ocorre diminuição da glicogênese, e um aumento na glicogenólise, lipólise e gliconeogênese, essa última
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devido à perda na ação que a insulina exerce sobre FOXO1, levando, portanto, a maior transcrição de genes das principais enzimas da via gliconeogênica, dentre elas a PEPCK (Hall et al., 2000; Gross, Wan, Birnbaum, 2009; McArdle et al., 2013). No adiposo, também pode ser observado prejuízo na captação de glicose via GLUT4, além de aumento na lipólise e diminuição na produção de adiponectina (Luca, Olefsky, 2008; Schinner et al., 2005). No hipotálamo, a resistência leva tanto ao descontrole na regulação da ingestão alimentar, por comprometer a ação da insulina sobre FOXO1, quanto a efeitos negativos sobre o controle periférico do metabolismo lipídico e glicídico (Gross, Wan, Birnbaum, 2009; Scherer et al., 2011; Konner et al., 2011; Konner, Bruning, 2012).
Alguns estudos já demonstraram que a prole de mães obesas apresenta intolerância à glicose e menor sensibilidade à insulina (Taylor et al., 2005; Dunn, Bale, 2009; Gregorio et al., 2010; Volpato et al., 2012; Ashino et al., 2012). No entanto o quanto a dieta materna pode interferir na sinalização de insulina em tecidos centrais e periféricos, de forma específica ainda não é conhecido. Considerando esses aspectos, o presente estudo investigou e comparou o efeito potencial da programação metabólica sobre a sinalização de insulina no período após desmame e na vida adulta da prole de mães submetidas à dieta hiperlipídica durante a gestação e lactação.
Os efeitos na sinalização periférica da insulina em decorrência da reintrodução de dieta hiperlipídica na vida adulta em proles de mães obesas ainda não foram evidenciados na literatura, o que ressalta a necessidade de se conhecer como está funcionando tal via nessa fase da vida. Por meio da comparação entre efeitos da programação metabólica e prejuízos diretos do consumo de dieta hiperlipídica, nossa hipótese foi de que ambos poderiam ocasionar alterações potenciais nos mecanismos estudados, no entanto, a programação metabólica seria um fator crucial e agravante para o desenvolvimento de distúrbios moleculares na vida adulta. Dessa forma, acredita-se que tais achados são fundamentais para um maior esclarecimento das vias de sinalização e suas interações, contribuindo para o melhor entendimento do fenótipo da obesidade e buscando o desenvolvimento de medidas terapêuticas que posterguem os malefícios ocasionados por tais interações a nível molecular.
13 OBJETIVOS
Objetivo geral:
Avaliar os efeitos da programação metabólica e da reintrodução de dieta hiperlipídica na fase adulta sobre a sinalização de insulina na prole após desmame e na vida adulta.
Objetivos específicos:
- Avaliar a evolução do peso corporal e a ingestão alimentar da prole de camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica;
- Verificar a massa de tecido adiposo epididimal e retroperitoneal na prole de camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica após o desmame e na vida adulta;
- Avaliar o metabolismo glicídico por meio de testes de tolerância à glicose, insulina e piruvato, e pela dosagem de glicogênio hepático da prole recém desmamada e adulta; - Avaliar a resposta ao sinal de insulina, através da investigação de proteínas envolvidas na transdução e no bloqueio do sinal desse hormônio no fígado, músculo esquelético, tecido adiposo e hipotálamo de prole de mães obesas logo após o desmame;
- Avaliar a resposta ao sinal de insulina, através da investigação de proteínas envolvidas na transdução e no bloqueio do sinal desse hormônio no fígado, músculo esquelético, tecido adiposo e hipotálamo de prole de mães obesas na fase adulta, com ou sem reexposição à dieta hiperlipídica.
- Verificar o conteúdo de citocinas inflamatórias e leptina no soro da prole adulta de mães obesas, reexpostas ou não à dieta hiperlipídica.
14 ARTIGO
Implications of maternal obesity on insulin signaling in newly weaned and adult offspring of mice exposed to a high-fat diet in later life
Thaís de Fante1; Laís Angélica de Paula Simino1; Andressa Reginato1; Tanyara da Silva Baliani1; Débora Cristina Gustavo Vitoréli1; Monique Souza1; Márcio Alberto Torsoni1; Marciane Milanski1; Adriana Souza Torsoni1
1Laboratory of Metabolic Disorders, School of Applied Sciences, University of Campinas – UNICAMP, Limeira, São Paulo, Brazil.
Key words: Insulin resistance, metabolic programming, maternal obesity, high-fat diet
Running title: Maternal obesity alters insulin signaling in mice
Correspondence address: Adriana Souza Torsoni, PhD.
School of Applied Sciences - University of Campinas (UNICAMP)
Rua Pedro Zaccaria, 1300 - Jardim Santa Luiza - Limeira, São Paulo, Brazil. CEP: 13484350 Phone: +55 19 3701 6705
E-mail: adriana.torsoni@fca.unicamp.br
Conflict of interest:
15 Abstract
Background/Objectives: Modern lifestyle has resulted in an increase in the prevalence of obesity and its comorbidities in pregnancy and young population. Many effects from direct consumption of a high-fat diet (HFD) on glucose metabolism are well established. However, it is important to assess whether maternal consumption of HFD during critical periods of development can trigger epigenetic mechanisms, perpetuating changes in offspring metabolism and creating a vicious circle that cannot be broken. This study evaluated the potential effect of metabolic programming in impairing the insulin signaling in recently weaned offspring of obese dams. Additionally, we investigated if early exposure to obesogenic environment is able to exacerbate the impairment of glucose metabolism in adult life in response to a HFD.
Methods: Female Swiss mice were fed with Standard chow (SC) or HFD before and during mating, gestation and lactation. Tissues from male offspring were obtained at d28 and d82 to analyze activation of key proteins of inflammatory and insulin signaling pathways by Western Blot.
Results: Offspring of obese dams (HC-O) showed greater weight gain, adiposity and food intake than offspring of control dams (CC-O). Furthermore, they showed impairment in insulin signaling in central and peripheral tissues, associated to increased activation of inflammatory pathways. The HFD re-exposure seems to be an aggravating factor in the development of obese phenotype leading to systemic insulin resistance and hyperleptinaemia. Moreover, adipose tissue was ultimately the most affected in adult
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offspring after HFD rechallenge (HH-O) which may have contributed to the metabolic deregulation observed.
Conclusions: Maternal consumption of HFD can cause changes in glucose metabolism of offspring in both weaned and adult animals. Additionally, maternal obesity leads to increase susceptibility to the development of obesity and impairment in insulin signaling in offspring that cannot be reversed by SC consumption, but can be aggravated when re-exposed to HFD.
Introduction
Early obesity prevalence in population suggests that intrauterine environment and lactation period, can contribute considerably to the development of the obesogenic phenotype through fetal programming of offspring metabolism and impairment of energy balance (1,2). In animals, maternal obesity and its influence on offspring metabolism has been studied mostly in models of diet-induced obesity (DIO) (3). Dietary fatty acids may influence metabolic mechanisms, leading to lipid accumulation, increased circulating fatty acids and development of metabolic syndrome (4). Maternal high-fat diet (HFD) consumption during pregnancy and lactation have been associated to changes in lipid metabolism, increased cholesterol levels, development of fatty liver, endoplasmic reticulum stress, impaired hypothalamic glucose metabolism, deregulation in energy homeostasis and food intake, and deterioration of β-cell function in offspring (5-13). Besides, maternal insulin resistance per se in absence of obesity can impair glucose metabolism in offspring (14).
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Obesity and its comorbidities are followed by an inflammatory condition (15). Inflammation is casually linked with impaired insulin signaling in peripheral tissues and central nervous system (16-18). Pro-inflammatory cytokines, mainly TNFα, can inhibit insulin signaling by targeting IRS proteins or insulin receptor. TNFα and other cytokines can stimulate proteins, such as c-Jun N-terminal kinases (JNK) and IκB kinase (IKK), which mediate serine phosphorylation of IRS proteins, leading to inactivation of insulin signaling pathway proteins (19).
Pregnancy is also characterized by an inflammatory process in the placenta. Maternal HFD consumption may exacerbate the inflammatory response during pregnancy by stimulating macrophage infiltration, inflammatory signaling pathways and production of inflammatory markers (20,21). In humans has been shown that umbilical cord from obese mothers present alterations in genes expression that may promote inflammation and development of metabolic syndrome in offspring (22). Additionally, a recent study showed that methylation pattern of genes in blastocyst is altered in infants of obese mothers (23). Similarly, expression of microRNAs that participate in control of fatty acid oxidation are impaired in offspring of obese mothers after weaning indicating the strong influence of maternal nutritional status on epigenetic inheritance and metabolic programming (24). In mice the association of exposition to HFD during early development and HFD consumption after weaningincrease the susceptibility to develop severe liver disease (25). In addition, overnutrition by decrease in litter size on postnatal day 1 can lead to increased obesity susceptibility, insulin and leptin resistance after the later consumption of HFD (26). Kruse and colleagues recently shown that offspring from obese dams fed with HFD in adulthood present increased body weight gain, high blood
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glucose and insulin levels, and liver triglycerides deposit (27). Given the effects of obesity on metabolism and signaling pathway and the early contact with an inflammatory environment in the womb during the development, we hypothesized that an early contact with an inflammatory environment during gestation and lactation would increase the inflammatory response after stimulus in the adult life.
In this study we evaluated the potential effect of metabolic programming in impairing the insulin signaling in recently weaned offspring of dams fed HFD during pregnancy and lactation. In addition, we investigated if early exposure to obesogenic environment during developmental period is able to exacerbate the impairment of glucose metabolism in adult life in response to a HFD.
Material and Methods
Animal model and diet
Swiss mice were acquired from Animal Breeding Center at University of Campinas (Campinas, SP, Brazil) and housed at 12 hours light/dark cycle in temperature-controlled environment. Five-weeks-old female mice were randomly fed ad libitum with standard chow (SC) or high-fat diet (HFD) during adaptation period, mating, pregnancy and lactation. HFD was prepared according to the AIN-93G modified for high-fat (45%) content as previously described (24). After 3 weeks of adaptation, mating was performed with same age adult males fed only with SC. Litters were adjusted to eight pups each and divided in two groups: offspring of SC dams (CC-O) and offspring of HFD dams (HC-O). Pups were weaned on d18 and only male offspring were used in experiments. All offspring received only SC after weaning until d42. At d42, part of
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offspring in CC-O and HC-O groups were fed with HFD (CH-O and HH-O) or remained on SC diet (CC-O and HC-O). Tissues were extracted on d28 (CC-O and HC-O) or d82 (CC-O, CH-O, HC-O and HH-O) for newly weaned and adult mice, respectively.
Food intake
Food intake was conducted in d28 mice after weaning and in adult mice after d42. Mice were individually housed and food intake was assessed daily for four or seven days, respectively.
Glucose Tolerance Test (GTT), Insulin Tolerance Test (ITT) and Pyruvate Tolerance Test (PTT)
Tolerance tests were performed only in adult offspring. Glycemia was determined in an Accu-Chek Performa Glucometer (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland).
For GTT, mice were starved for 12h, fed for 2h and starved for an additional 4h before i.p. injection of glucose (1g/Kg of a 25% solution of D-glucose). Blood samples were collected at 0, 15, 30, 60, 90 and 120 min after glucose administration for measurement of blood glucose. For ITT, the same fasting protocol was following. Insulin (1,5UI/Kg) was administrated by i.p. injection and blood samples were collected at 0, 3, 6, 9, 12 and 15 min after injection. For PTT, mice were starved for 12h and fed for 2h. Pyruvate (2g/Kg of a 20% solution of sodium pyruvate) was injected (i.p.) and blood samples were collected following GTT protocol.
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In both GTT and PTT, the area under curve of glycemia vs time was calculated above each individual baseline. In ITT, the constant for the glucose disappearance rate during the test was calculated using the formula 0,693/t1/2.
Hepatic glycogen
Hepatic glycogen concentration was analyzed as described by Dubois et al. (1956) (28). Frozen hepatic fragments (200mg) were digested in a 30% KOH solution. Subsequently samples were saturated with Na2SO4 and treated with 70% ethanol for glycogen precipitation. For glycogen quantification was utilized the colorimetric method using phenol and sulfuric acid and the absorbance was determined at 490nm.
Biochemical measurements
Serum TNF-α was measured using ELISA MAXTM Deluxe Sets kit (BioLegend, CA, USA). To determinate serum leptin, a Mouse Leptin ELISA kit (Sigma-Aldrich, MO, USA) was utilized.
Tissue extraction and Western Blot
Fragments of hypothalamus, liver, skeletal muscle and epididymal adipose tissue from male offspring were collected at d28 and d82. In some cases, a bolus injection of saline or regular insulin (5UI) through the abdominal cava vein was given. Subsequently hepatic, muscle, adipose and hypothalamic fragments were extracted after 45 s, 90 s, 3 min and 10 min, respectively.
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Tissue samples were homogenized in freshly prepared ice-cold buffer [1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mol/L Tris, pH7.4, 0.1 mol/L sodium pyrophosphate, 0.1 mol/L sodium fluoride, 0.01 mol/L EDTA, 0.01 mol/L sodium vanadate, 0.002 mol/L PMSF, and 0.01 mg/mL aprotinin]. Insoluble material was removed by centrifugation (10,000 x g) for 30 min at 4ºC. The protein concentration in supernatant was determined using Bradford dye-binding method. The supernatant was resuspended in Laemmli sample buffer and boiled for 5 min before separation by SDS-PAGE using miniature slab gel apparatus (BioRad, Richmond, CA, USA). Electrotransfer of proteins from the gel to nitrocellulose was performed for 120 min at 120 V (constant). Nitrocellulose blots were probed with specific antibodies. Antibodies to p-AKT 7985), total AKT 8312), p-IRS1 (sc-17200), total IRS1 (sc-559), p-JNK (sc-6254), total JNK (sc-1648), p-IKK (sc-21661), total IKK (sc-34673), PEPCK (sc-32879), p-JAK2 (sc-16566-R), total JAK2 (sc-278), total STAT3 (sc-483) were obtained from Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Antibodies against β-actin (ab8227) and PTP1b (ab52650) were obtained from Abcam (Cambridge, MA, USA). Antibody to p-STAT3 (#9145) was obtained from Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Antibody against α-tubulin (T5168) was obtained from Sigma (Sigma-Aldrich, MO, USA).
Blots were incubated with HRP-conjugates secondary antibodies (KPL, Gaithersburg, MD, USA). Proteins recognized by the secondary antibodies were detected by chemiluminescence (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Fisher Scientific, MA, USA). The results were visualized by autoradiograph with preflashed Kodak XAR film. Band intensities were quantified by optical densitometry of developed autoradiographs using Scion Image software (ScionCorp, MD, USA), and the
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intensities of the bands were normalized to those of total protein or loading control α-tubulin or β-actin.
Cannula implant
Mice were submitted to a stereotaxic surgery in which a cannula was placed on lateral ventricle (anteroposterior 0.34 mm, lateral 1.0 mm and depth 2.2 mm) according to a previously described method (29). The correct position of the cannula was confirmed after recovery, using water drinking response after administration of 2 µl of 10 -6M angiotensin II (Sigma, MO, USA). For extraction, fasted cannulated mice from different groups received 10 µl of leptin (1ng/µl) or saline ICV and hypothalamus was removed 15 min later.
Statistical analyses
Results are expressed as the mean ± SEM of the indicated number of experiments. Blot results are presented as direct band comparisons in autoradiographs and quantified by densitometry. Student’s T-test of unpaired samples and analysis of variance (ANOVA) for multiple comparisons were used. A post-hoc test (Bonferroni) was employed for determining a significance level of p<0.05.
Results
Body weight, adiposity, food intake and hepatic glycogen content
Pups were weight on d7 and weekly thereafter. The HC-O group was heavier (10%) than CC-O after d28. However, when HC-O group was reexposed to high-fat diet (HH-O) the weight gain become exacerbated and higher (28%) than control group
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exposed to the same diet in later life (CH-O), as shown in Figure 1a. In addition, HC-O group showed increased epididymal and retroperitoneal adiposity (2.0 and 1.4 fold, respectively), and food intake (1.1 fold) at d28, but not at d82, when a further contact to HFD (HH-O) improved adiposity and food intake compared to CH-O (Figures 1b-e). Hepatic glycogen content was decreased in HC-O group at both d28 (35%) and d82 (84%) (Figures 1f-g).
Serum biochemical parameters
To evaluate glucose homeostasis in adult offspring, ITT, GTT and PTT were performed. The results suggest that offspring reexposed to HFD in later life (HH-O) have an impaired insulin response that results in glucose intolerance when compared to CH-O (Figures 2a-c). Furthermore, HH-O showed higher leptin levels than CH-O (1.7 fold), despite they exhibited similar serum TNF-α levels (Figures 2d-e).
Expression and activation of inflammatory markers and proteins of insulin signaling pathway on d28
To evaluate insulin resistance and inflammatory pathway activation in central and peripheral tissues of newly weaned offspring, western blot analysis were performed. At d28, HC-O group showed an increase in JNK and IKK phosphorylation (3.1 and 2.0 fold respectively) in adipose tissue, associated with higher PTP1b content (2.2 fold) and reduced AKT phosphorylation compared to CC-O (Figures 3a-e). In the liver, although no differences have been found in inflammatory proteins and PEPCK, the AKT and IRS-1 phosphorylation was impaired in HC-O group (Figures 3f-j and Supplementary Figure
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1a). Furthermore, muscle IRS-1 and AKT phosphorylation was also reduced (78% and 34%, respectively) (Figures 3n-o). PTP1b (2.2 fold) and all inflammatory markers were increased in HC-O (p-JNK, 179% and p-IKK, 83%) compared to CC-O (Figures 3k-m). In hypothalamus, similar pattern for HC-O was observed, such as increase in inflammatory proteins [p-JNK (1.2 fold) and p-IKK (2.5 fold)], and decrease in IRS-1 (42%) and AKT (56%) phosphorylation (Figures 4a-e) when compared to CC-O. In addition, leptin signaling proteins were investigated and a decrease in STAT3 phosphorylation was observed in HC-O compared to CC-O (Figures 4f-g).
Expression and activation of inflammatory markers and proteins of insulin signaling pathway on d82
In adult offspring, re-exposure to HFD seems to be an aggravating factor for the harm observed in insulin signaling especially for adipose tissue. PTP1b and p-JNK remained increased in HC-O compared to CC-O in d82 (1.8 and 1.5 fold, respectively). However, JNK and IKK phosphorylation in adipose tissue did not change significantly in HH-O group (Figures 5a-c), despite IRS1 and AKT phosphorylation markedly decreased in HH-O compared to CH-O (77% and 57%, respectively) (Figures 5d-e). In addition, re-exposure to HFD did not alter inflammatory pathway and insulin signaling in liver (Figures 5f-h) although hepatic PEPCK content was lower (Supplementary Figure 1c). In muscle, HH-O showed increased PTP1b and PEPCK content compared to CH-O (Figure 5m and Supplementary Figure 1d). HC-O maintained higher p-JNK and p-IKK (about 1.6 and 2.1 fold, respectively) compared to CC-O, and lower p-IRS-1 and p-AKT, as observed in d28 (Figures 5k,l,n,o). In addition, PTP1b and PEPCK expression was
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higher in HC-O compared to CC-O (166% and 97%, respectively) but no difference was observed between HH-O and CH-O for inflammatory pathway, IRS1 and AKT phosphorylation (Figures 5k-o and Supplementary Figure 1d). In hypothalamus, AKT phosphorylation did not increased after insulin challenge in HH-O, despite no alterations in phosphorylation of IRS-1 in both comparisons were found (Figures 6 d-e). Only IKK phosphorylation was increased in HC-O group compared to CC-O at d82 (2.1 fold), and anyone changes in JNK and PTP1b were observed (Figures 6a-c).
Discussion
High-fat diet has been widely used in the literature to induce obesity in experimental models, since it mimics the current dietary pattern. The excess of lipids in the diet has been considered one of the main factors contributing to the expansion of obesity in the population (30). In addition to contribution of lipids to increase of body fat mass and consequently the development of obesity, they can interact with molecular pathways and exert significant effects on metabolism (31,32).
The literature has emphasized the modulatory role of lipids resulting from indirect consumption, as observed in fetuses during critical periods of development, such as pregnancy and lactation, as a result of maternal overnutrition (3). Some studies indicate that changes in metabolism manifested after birth occurs by the possibility of maternal obesity exacerbate physiological inflammatory response in the placenta, leading to an adverse intrauterine environment (20,23).
In the present study, HC-O mice recently weaned presented higher body weight, adiposity and food intake, characteristics compatible with obese phenotype and
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metabolic impairment. Studies using similar models suggest that changes at central nervous system, as the presence of inflammation, could be resulting in difficulty in action of peripheral hormones, promoting the development of the obese phenotype (9,33,34). In addition to the inflammatory response, maternal obesity can cause changes in the transport of nutrients across the placenta, benefiting the passage of glucose and amino acids that can also promote the development of metabolic syndrome in the offspring (35). Moreover, as shown in other studies, damage at peripheral tissues are also present, such as hepatic steatosis, impaired glucose tolerance and reduced sensitivity to insulin (7,24,36).
The greater weight gain observed in the HC-O group compared to the CC-O group show up in the first weeks of life and remains into adulthood. White et al (2009) point out that excessive weight gain observed in the offspring, should be dependent on dam obesity, not only from maternal consumption of lipids (37). When there is a second contact with the high-fat diet in later stages (HH-O group), the weight gain of offspring from obese dams becomes exacerbated when compared to animals exposed late to the high-fat diet, gestated by control dams (group CH-O). As showed in a recent study, animals re-exposed to high-fat diet seems to develop a more damaging mechanism of response to this type of diet, gaining more weight, with higher adipocytes and becoming more resistant to the action of insulin evaluated by ITT and GTT (27).
HH-O group also showed a higher food intake and hyperleptinaemia than CH-O group, probable due to a resistance to leptin action, although this mechanism has not been evaluated at the molecular level in our study with adult offspring. However, when assessing the leptin signaling in newly weaned offspring, we find lower phosphorylation
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of STAT3, which is indicative of resistance. Chen and Morris (2009) found that the offspring of obese dams has lower levels of leptin receptor expression and STAT3 after birth, which can alter neuronal formation and contribute to eating disorders observed in adulthood (10). This hormone has a key role in neuronal development during the first days of offspring’s life, and changes in their levels contribute to additional damage to that programmed by pregnancy, which can be triggered during the lactation period (38). Nevertheless, Volpato et al (2012) suggest that the progeny of obese dams may have features of the metabolic syndrome, such as increased adiposity and insulin resistance, independent of changes in the central leptin (39). In the same study, the authors also found that the offspring that is re-exposed to high-fat diet showed higher circulating levels of leptin, which corroborates our findings.
Besides the hyperleptinaemia, animals HH-O presented systemic insulin resistance in adult life, evidenced by glucose intolerance and reduced sensitivity to insulin observed in GTT tests, ITT and PTT when compared to CH-O. The same was observed by Kruse et al. (2013), and the authors also speculate that animals rechallenged with the high-fat diet become more resistant to insulin although this mechanism has not been investigated at the molecular level (27). All groups, with 28 and 82 days, that somehow had contact with high-fat diet (CH-O, CH-O and HH-O) showed lower hepatic glycogen content. In a recent study, López-Soldado and co-workers (2014) established an inverse relationship between hepatic glycogen content and obesity (40). In this work it was shown that the liver glycogen accumulation is associated with lower food intake and mitigate the harmful effects of high-fat diet on metabolism. Thus, our findings corroborate the impairment in glucose metabolism
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detected in tolerance tests, suggesting that both, diet and metabolic programming are elements that can predispose to metabolic dysregulation and DM2 development.
To assess hepatic gluconeogenesis, we also investigated the contents of PEPCK in recent weaned and adult mouse. The HC-O group only increased PEPCK levels compared to CC-O in adulthood, suggesting greater activation of gluconeogenesis in these animals, and further corroborating the damage observed in glucose metabolism. In muscle, there is also an increase of PEPCK in adults gestated in obese dams, and in this tissue this protein also contributes to a mechanism known as glyceroneogenesis, an abbreviated version of gluconeogenesis that favors the formation of triglycerides (41), which would be indicative of increased fat deposition in the muscle.
Insulin resistance has been identified as a major metabolic disorder triggered by excessive body fat, and the low-grade inflammation acts as a link connecting obesity and insulin resistance (19,42). It has been shown that the offspring of dams who had consumed a high fat diet, even after weaning, presents a loss in sensitivity to insulin (9,24). In part, this resistance can be attributed to signaling capacity of fatty acids to activate the inflammatory response via TLR4, and by the combined action with the existing inflammation (31,43). This activation results in interaction between proteins involved in the inflammatory pathway, like JNK, IKK and PTP1B, and the insulin pathway, such as IRS-1 and AKT leading to impairment in signaling (44).
The evaluation of HC-O newly weaned showed increased activation of JNK, IKK and PTP1B proteins in tissues such as fat and muscle, suggesting that inflammatory mechanisms are more active in these tissues, when compared to CC-O. It has been reported in the literature that adipose tissue inflammation in obesity is a key component
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that leads to insulin resistance. This tissue has a endocrine function, responsible for, among other compounds, TNF-α secretion, and can promote subclinical inflammation present in obesity (45,46). At central nervous system, the scenario is no different, since animals gestated by obese dams showed greater activation of JNK and IKK, suggesting that the installed hypothalamic inflammation could also be acting in the spread of inflammation to peripheral tissues. Several studies addressing that hypothalamic inflammation would be the initiating factor in the development of obesity and all metabolic deregulation, since such mechanisms are well described in the literature in obese animals and/or diabetic patients who have resistance to insulin signal (47,48,49).
Here we also observed decrease in IRS-1 and AKT phosphorylation in the liver of newly weaned offspring from obese dams (HC-O), indicative of insulin resistance development, even without increasing evidence of inflammation in the molecular markers (such as p -JNK and p- IKK).
In a study performed by Kim et al (2008), it was observed that inflammation in peripheral tissues may display a late response to stimulation with high-fat diet (50). In this study, the authors found inflammation and insulin resistance in muscle and liver about 8 weeks after diet consumption and in adipose tissue with only 14 weeks. Williams et al (2014) showed that after 3 days of high-fat diet consumption was possible to observe an acute phase inflammatory response that may coincide with glucose intolerance (51). However, such response would be directly related to dietary components, and cease thereafter, returning only after a period of chronic exposure. Thus, we believe that these different diet-induced "inflammatory phases" account for difficulties in increasing detection in inflammatory proteins in our study, in both young
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and adult offspring exposed to the diet over a period would not be sufficient for such markers were elevated.
Since we found impaired insulin signaling in the hypothalamus of the HC-O and, considering the cross talk with leptin at central nervous system and its important action on energy metabolism, STAT3 activation was evaluated in animals recently weaned after intracerebroventicular injection of leptin. The HC-O animals showed lower activation of STAT3 when compared to CC-O, consistent with the increase in food intake and body weight gain observed in these mice after weaning. Thus, the results in newly weaned offspring suggest that maternal obesity is capable of disrupting the glucose metabolism of offspring, favoring subclinical inflammation and impairing insulin action in both central and peripherals tissues.
Considering these results, insulin signaling was investigated in adult life, to understand whether such changes would be permanent and could be exacerbated by directly consumption of high-fat diet. When analyzed in adult life, offspring of obese dams (HC-O) remained the same behavior observed after weaning, compared to offspring of lean dams (CC-O). Disruption of the insulin signaling, either by a decrease in phosphorylation of IRS-1 or AKT was observed in peripheral tissues, as well as inflammatory markers remained elevated in muscle, adipose tissue and hypothalamus, without change in liver tissue. This suggests that the damage depicted in newly weaned and adult offspring arise from a schedule that occurs during critical periods of development and that, as observed by Marco et al. (2014), are not reversed by consumption of a proper diet (52).
