TÍTULO: HIDRÓLISE DO LEITE DE SOJA IN NATURA UTILIZANDO PROTEASES VEGETAIS: DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOX
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Nutrição SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): ROUCHELLE DE SANTANA FERREIRA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): JULIANA CRISTINA BASSAN ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA - UNESP COLABORADOR(ES):
1 1. RESUMO
A incorporação de leite de soja e seus subprodutos na dieta humana estão despertando um crescente interesse devido à sua importância nutricional associada à presença de cálcio, grande quantidade proteínas de alta qualidade biológica, ácidos graxos poli-insaturados e as isoflavonas que são capazes de inibir a degeneração óssea e possuem propriedades anticancerígenas. Além das propriedades nutricionais, o leite de soja também é uma alternativa alimentar bastante viável para pessoas que são intolerantes à lactose. Diversos peptídeos bioativos foram isolados, purificados e caracterizado a partir da hidrólise leite de soja. Dentre eles peptídeos inibidores da enzima conversora de angiotensina, peptídeos com atividade hipocolesterolêmica, imunomoduladoras e anticancerígenas. O uso das proteases vegetais papaína e bromelina para hidrólise do leite de soja é uma forma de agregar valor ao produto, além de serem proteases consideradas GRAS (Generally Recognized as Safe) para uso em produtos alimentícios.
2. INTRODUÇÃO 2.1. Leite de soja.
O leite de soja é uma dispersão coloidal composta por cerca de 2% de lipídios, 4-6% de proteínas, 2% de carboidratos, 0,6% de cinzas e 8-10% de sólidos totais (NIK et al., 2008). Trata-se do extrato aquoso obtido do grão de soja após a remoção das fibras insolúveis denominadas okara (LAKSHMANANA et al., 2006). A incorporação de leite de soja e seus subprodutos na dieta humana estão despertando um crescente interesse devido à sua importância nutricional associada à presença de cálcio, grande quantidade proteínas de alta qualidade biológica, ácidos graxos poli-insaturados e as isoflavonas que são capazes de inibir a degeneração óssea e possuem propriedades anticancerígenas (RINALDONI et al., 2012). Além das propriedades nutricionais, o leite de soja também é uma alternativa alimentar bastante viável para pessoas que são intolerantes à lactose (MATTOS et al, 2009).
As proteínas da soja são reconhecidas por fornecerem todos os aminoácidos essenciais e não essenciais e existem evidências que são capazes de baixar os níveis de LDL colesterol, reduzir o risco de hiperlipidemia e doenças cardiovasculares (JEKINS et al., 2010; NISHINARI et al, 2014). Quando hidrolisadas são capazes de gerar peptídeos bioativos que possuem impacto positivo sobre diversas funções corporais influenciando diretamente sobre a boa saúde (SINGH et al., 2014).
2.2. Hidrólise das proteínas do extrato de leite de soja para obtenção de peptídeos
Os peptídeos bioativos são fragmentos específicos obtidos através da hidrólise de proteínas que proporcionam um impacto positivo sobre diversas funções corporais ajudando na manutenção da boa saúde. De acordo com a especificidade da protease utilizada podem ser geradas diferentes sequências de aminoácidos que podem influenciar os principais sistemas corporais como o sistema cardiovascular, digestivo, nervoso e imune (MEISEL e FITZGERALD, 2003; SINGH, VIJ e HATI, 2014).
A soja (Glycine max) é economicamente o feijão mais importante do mundo, proporcionando proteína vegetal para milhões de pessoas, é ingrediente base para centenas de produtos e uma potencial fonte de peptídeos bioativos. As proteínas de soja são abundantes e uma fonte relativamente barata de proteínas com alto valor nutricional e excelentes propriedades funcionais. As proteínas da soja não é apenas uma excelente fonte de proteína dietética, mas também possui propriedades anti-hipertensiva, anticolesterolêmica, antioxidante e anticancerígena. Dentre as proteínas a glicinina e a β – conglicinina representam 65-80% das proteínas totais de soja e são as principais precursoras da maioria dos peptídeos bioativos isolados (SINGH, VIJ e HATI, 2014). Na Figura 1 são discriminadas as propriedades bioativas dos peptídeos obtidos a partir das proteínas da soja.
Figura 1. Peptídeos bifuncionais obtidos das proteínas da soja.
Fonte: Singh, Vij e Hati, 2014.
3. OBJETIVOS
Diante do exposto o objetivo do projeto foi hidrolisar as proteínas do extrato de leite de soja com as proteases vegetais papaína e bromelina visando e analisar os
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hidrolisados (pool de peptídeos) quanto ao potencial de apresentarem atividade antioxidante e quelante de ferro.
4. METODOLOGIA
O leite de soja in natura foi gentilmente doado pelo UNISOJA (Unidade de Desenvolvimento e Produção de Derivados de Soja) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-FCFar.Todos os reagentes e equipamentos utilizados durante as análises foramgentilmente cedidos pelo Laboratório de Enzimologia da Faculdade de CiênciasFarmacêuticas de Araraquara-FCFar.
As metodologias utilizadas nesse trabalho foram:
• Determinação de proteínas totais pelo método de Hartree (1972);
• Análise do perfil proteico do extrato de soja in natura e dos hidrolisados por SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970)
• Determinação do pH e temperatura de máxima atividade das proteases vegetais papaína e bromelina (TARDIOLI et al., 2003).
• Obtenção dos hidrolisados das proteínas do extrato de leite de soja;
• Determinação da atividade antioxidante (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006; RUFINO et al., 2007);
• Determinação da atividade quelante de ferro (KIM et al., 2007) 5. DESENVOLVIMENTO
5.1. Determinação de proteínas totais.
Para determinação da concentração de proteínas totais, será utilizado o método Lowry et al. (1951), modificado por Hartree (1972). Para fins de cálculo foi será construída uma curva analítica utilizando soro albumina bovina como padrão. O coeficiente de absortividade (ε) da SBA foi 4,2216 (mg.0,5mL)-1.cm-1.
5.2. Análise do perfil proteico das proteínas do extrato de soja in natura e dos hidrolisados por SDS-PAGE
O perfil de proteínas do leite de soja in natura e dos hidrolisados foram determinados por SDS-PAGE (10%) com base no método Laemmli (1970), utilizando como padrão de massa molar o kit GE Lifesciences® composto por fosforilase B (97 kDa), BSA (66 kDa), ovoalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (31 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa) e α-lactoalbumina (14,4 kDa). O leite de soja in natura e os
hidrolisados foram diluídos em tampão de ruptura (1:1) e a coloração do gel foi realizada com Azul de Coomassie 250R.
5.3. Temperatura e pH de máxima atividade das enzimas papaína e bromelina. Para determinação da temperatura e pH de máxima atividade das enzimas papaína e bromelina foi utilizado o substrato sintético éster-paranitrofenílico de N-butiloxicarbonil-L-alanina (Boc-Ala-ONp) seguindo metodologia descrita por Tardioli et al. (2003).
Para determinação do pH de máxima atividade foram realizados ensaios enzimáticos no intervalo de pH de 3,0 – 10,0 utilizando os tampões de McIlvaine 100 mM (pH 3,0 – 7,0), tampão fosfato de sódio 100 mM (pH 7,5) e tampão bicarbonato 100 mM (pH 8,0 – 10,0). Para determinação da temperatura de máxima atividade o ensaio foi conduzido no intervalo de temperatura de 30ºC – 90ºC.
Para efeito de cálculo foi construída a curva analítica para determinação do coeficiente de extinção molar do p-nitrofenol, produto de reação da hidrólise do substrato Boc-Ala-ONp quando hidrolisado pelas proteases vegetais papaína e bromelina. O coeficiente de absortividade molar (ε) do p-nitrofenol foi 11.026 M-1.cm-1
sendo que uma unidade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1 μmol de Boc-Ala-ONp por minuto nas condições de ensaio.
5.4. Obtenção dos hidrolisados das proteínas do extrato de leite de soja
Os hidrolisados das proteínas do extrato de leite de soja foram obtidos através da incubação do extrato com as proteases papaína e bromelina nas condições de pH e temperaturas ótimos para atividade máxima de cada enzima. Os ensaios enzimáticos para cada enzima foram realizados separadamente, onde o produto de um ensaio foi substrato para outro ensaio de acordo com o descrito abaixo:
• Ensaio enzimático 1: hidrólise das proteínas do extrato de leite de soja com a enzima papaína em condições de pH e temperatura ótimos para máxima atividade da enzima.
• Ensaio enzimático 2: hidrólise das proteínas do extrato de leite de soja com a enzima bromelina em condições de pH e temperatura ótimos para máxima atividade da enzima.
• Ensaio enzimático 3: hidrólise do produto obtido no ensaio 1 com a enzima bromelina em condições de pH e temperatura ótimos para máxima atividade da enzima.
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O tempo de hidrólise para todos os ensaios enzimáticos foi de no mínimo 2 horas e no máximo de 24 horas.
5.5. Determinação da atividade antioxidante nos diferentes hidrolisados obtidos. A determinação da atividade antioxidante foi realizada utilizando o método ABTS cujo princípio está baseada na captura do cátion radical ABTS+ (ácido [2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico)]) por antioxidantes , produzindo descoloração da cor verde-escura para verde-clara proporcional à concentração de espécies antioxidantes, acompanhada do decréscimo da absorbância (PÉREZ-JIMÉNEZ e SAURA-CALIXTO, 2006; RUFINO et al., 2007). Para tanto foi construída uma curva de calibração utilizando o Trolox como antioxidante padrão. O coeficiente de absortividade molar (ε) do trolox foi 0,3392 mM-1.cm-1
5.6. Determinação da atividade quelante de metais
A metodologia utilizada para a atividade quelante de ferro será de acordo com Kim et al. (2007) com adaptações. A atividade quelante do íon ferro foi calculada segundo a fórmula:
QF (%) = [(A0 – A1)/A0] x 100
Onde: A0 é a absorbância do controle e A1 absorbância da amostra. O controle foi
feito com água MILI-Q e o branco com solução de EDTA 2%.
6. RESULTADOS
6.1. Determinação da temperatura e pH de máxima atividade da enzima papaína.
A protease papaína apresentou temperatura e pH de máxima atividade de 80ºC e pH 9,0 (Figura 2 A e B), respectivamente. Com relação a temperatura apresentou atividade relativamente alta nas temperaturas entre 70ºC – 85ºC, fator interessante, pois durante o processo de hidrólise a temperatura pode auxiliar no controle da contaminação microbiológica. Com relação a literatura pertinente os valores obtidos estão dentro do encontrado por outros autores (https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.22.2)
Figura 2: Temperatura e pH de máxima atividade da enzima papaína.
6.2. Determinação da temperatura e pH de máxima atividade da enzima bromelina.
A protease bromelina apresentou temperatura e pH de máxima atividade de 45ºC e pH 6,5 (Figura 3 A e B), respectivamente. Com relação a temperatura apresentou atividade relativamente alta nas temperaturas entre 40ºC – 45ºC. Com relação a literatura pertinente os valores obtidos estão dentro do encontrado por outros autores (https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.22.33)
Figura 3. Temperatura e pH de máxima atividade da enzima bromelina.
6.3. Determinação do perfil proteico do extrato de leite de soja in natura e dos diferentes hidrolisados obtidos pela ação das enzimas papaína e bromelina.
Conforme podemos observar no zimograma (Figura 4) o extrato de leite de soja (raia B) apresenta uma grande variedade de proteínas principalmente com massas moleculares entre 97kDa e 14,4kDa comprovando o fato que essa leguminosa é realmente uma importante fonte de proteínas. Afim de melhorar as propriedades nutricionais das proteínas do extrato de leite de soja através da obtenção de hidrolisados foram utilizadas as proteases vegetais papaína e bromelina de maneira isolada e de forma combinada. Os resultados obtidos mostram que a enzima papaína foi menos eficaz na hidrólise das proteínas, havendo uma hidrólise mais efetiva com 24 horas. Podemos
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observar nas raias C (2h), D (4h) e E (6h) há presença de uma variedade de bandas proteicas o que configura uma hidrólise menos efetiva. Já os hidrolisados obtidos com a enzima bromelina (raias G,H,I e J) e com a ação combinada das enzimas papaína e bromelina (raias K,L,M e N) mostram grande efetividade dessas enzimas, uma vez que apresentam apenas uma proteína que se mostrou resistente a hidrólise.
Figura 4: SDS-PAGE 10%: Perfil proteico do extrato de leite de soja (Glycine max) não
hidrolisado e hidrolisado. A) Padrão de massa molecular (3µL); B) proteínas não hidrolisadas do extrato de leite de soja ( 5µL); C) hidrolisado com papaína – 2h (10µL); D) hidrolisado com papaína – 4h (10µL); E) hidrolisado com papaína – 6h (10µL); F) hidrolisado com papaína – 24h (10µL); G) hidrolisado com bromelina – 2h (10µL); H) hidrolisado com bromelina – 4h (10µL); I) hidrolisado com bromelina – 6h (10µL); J) hidrolisado com bromelina – 24h (10µL); K) hidrolisado com papaína e bromelina – 2h (10µL); L) hidrolisado com papaína e bromelina – 4h (10µL); M) hidrolisado com papaína e bromelina – 6h (10µL);
N) hidrolisado com papaína e bromelina – 24h (10µL)
6.4. Determinação da atividade antioxidante dos diferentes hidrolisados obtidos pela ação das enzimas papaína e bromelina
A obtenção de hidrolisados proteicos com diferentes fontes proteicas e diferentes proteases são um campo de estudo bastante explorado. Sabe-se que a partir da hidrólise de proteínas pode-se obter peptídeos com propriedades bioativas bastante diversificada. Peptídeos bioativos são fragmentos de proteínas específicas que possuem impacto positivo sobre a saúde. Apresentam estrutura com sequência de 2-20 resíduos de aminoácidos e massas moleculares inferiores a 6000 Da (KORHONEN e PIHLANTO, 2006; SARMADI; ISMAIL, 2010) sendo a hidrólise de proteínas nativas utilizando enzimas proteolíticas a maneira mais comum de sua obtenção (MÖLLER et al., 2008; NAJAFIAN;
BABJI, 2014; RIPOLLES et al., 2015). Através dos resultados apresentados na Figura
naturalmente uma significativa atividade antioxidante, entretanto a os hidrolisados obtidos com a enzima bromelina e os hidrolisados obtidos com a ação combinada da papaína e bromelina mostraram uma maior atividade antioxidante principalmente com 2 e 4 horas de hidrólise. Observa-se ainda que a atividade antioxidante foi reduzida para os hidrolisados obtidos com maiores tempos de hidrólise.
Figura 5: Atividade antioxidante dos hidrolisados do extrato do leite de soja em equivalentes
de Trolox e porcentagem de redução do radical ABTS+. (ELSP): extrato de leite de soja hidrolisado com papaína; (ELSB): extrato de leite de soja hidrolisado com bromelina; (ELSPB): extrato de leite de soja hidrolisado com papaína e bromelina.
6.5. Determinação da atividade quelante de ferro dos diferentes hidrolisados pela ação das enzimas papaína e bromelina.
Para a atividade quelante de ferro os melhores resultados encontrados (Figura 6) foram para os hidrolisados obtidos com as enzimas papaína e bromelina combinadas (2h e 4h) e para a enzima papaína (4h e 6h). Podemos observar ainda que uma maior hidrólise (Figura 4) resultou em hidrolisados que apresentaram um efeito pró-oxidante com exceção para o hidrolisado obtido com e enzima papaína, mesmo com 24 horas de hidrólise. Esses resultados de atividade antioxidante e quelante de ferro mostram claramente que a especificidade enzimática afetou diretamente nas propriedades bioativas, uma vez que para a atividade antioxidante os melhores resultados foram conseguidos com a bromelina e para atividade quelante de ferro, a papaína mostrou os melhores resultados.
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Figura 6: Atividade quelante de ferro dos diferentes hidrolisados do extrato de leite de soja. (ELSP): extrato de leite de soja hidrolisado com papaína; (ELSB): extrato de leite de soja
hidrolisado com bromelina; (ELSPB): extrato de leite de soja hidrolisado com papaína e bromelina.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com os resultados obtidos podemos concluir que os hidrolisados do extrato de leite de soja obtidos com as proteases vegetais papaína e bromelina podem ser uma importante fonte de peptídeos com atividade antioxidante e quelante de ferro e que o tempo de hidrólise e especificidade das enzimas foram determinantes em relação à atividade biológica. Com relação a atividade antioxidante, os hidrolisados obtidos principalmente nas primeiras horas de hidrólise foram os que apresentaram a maior
capacidade de reduzir o radical ABTS+ demonstrando que o a ingestão dietética dos
hidrolisados associada a uma alimentação equilibrada tem potencial para auxiliar na prevenção do estresse oxidativo. Por outro lado, usar os hidrolisados para a obtenção de quelatos ferro-peptídeos pré-sintetizados têm sido indicado como uma promissora fonte dietética de ferro mais biodisponível (SILVA, 2013), ou seja, a ingestão dietética dos quelatos ferro-peptídeos poderia auxiliar em um maior aproveitamento desse mineral.
8. FONTES CONSULTADAS
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