Como estudar uma proteína?

(1)

1

Métodos de estudo das proteínas

1

2

Como estudar uma proteína?

1. Separá-la e purificá-la.

2. Determinar a sua massa molecular.

3. Determinar a sua composição e

sequência de aminoácidos.

4. Elucidar a sua estrutura tridimensional.

(2)

3

1. SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS

4

-

antes de mais, é necessário

destruir a

estrutura do tecido

que contém a proteína ou

proteínas a estudar

Métodos de disrupção

homogenizador

(3)

5

RUPTURA DO TECIDO/CÉLULAS

CRIA ALGUNS PROBLEMAS:

libertação de ácidos e outras substâncias acumuladas nalguns organelos Solução tampão mantém pH oxidações (>O2, oxidases) Incluir substâncias antioxidantes (ex.c/SH:DTT ou cisteína) libertação de proteases (ex.dos lisossomas) desnaturação proteica realizar todo o processo a baixa temperatura(≈4ºC) 6

(4)

7

PARA SEPARAR AS PROTEÍNAS

- Exploram-se

diferenças em propriedades

fisico-químicas

das

proteínas,

resultantes

das

diferentes sequências primárias de aminoácidos:

4. Afinidade de ligação

1. Tamanho

2. Solubilidade

3. Carga

8

1. Diálise, ultrafiltração, centrifugação,

precipitação

2. Cromatografia de exclusão molecular

3. Cromatografia de troca iónica e de fase

reversa

4. Cromatografia de afinidade

5. Electroforese

TTTTéééécnicas de separa

cnicas de separa

cnicas de separaçççção e purifica

ão e purifica

ão e purificaçççção de

ão de

prote

(5)

9

Diálise

–

Princ

í

pio:

≠≠≠≠

dimensão/forma molecular

10

Ultrafiltração

(6)

11

Ultracentrifugação

12 inicial _final

força centrífuga

partículas mais densas partículas de densidade intermédia partículas menos densas aumento da densidade do meio

- gradientes de densidade

(7)

13

–

Princ

í

pio

: :

≠≠≠≠

solubilidade

(precipita

ç

ão)

A solubilidade das proteínasvaria com:

--pHpH

--temperaturatemperatura

--forforçça ia ióónicanica

--constante dielconstante dielééctrica do solventectrica do solvente

Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade: 1.Precipitação isoeléctrica (variação de pH)

2.‘Salting in’ / ‘salting out’ (variação da força iónica)

3.Precipitação por solventes orgânicos

14 So lu bi lid ad e pH pI

•••• em geral, a solubilidade é menor no pImenor no pImenor no pImenor no pI porque há menos interacmenos interacmenos interacmenos interacçççções electrostões electrostões electrostões electrostááááticasticasticasticas com o solvente 1. Precipita 1. Precipita1. Precipita 1. Precipita 1. Precipita 1. Precipita 1. Precipita

(8)

15 2. Precipita 2. Precipita 2. Precipita 2. Precipita 2. Precipita 2. Precipita 2. Precipita

2. Precipitaçççççççção por soluão por soluão por soluão por soluão por soluão por soluão por soluão por soluçççççççções salinas:ões salinas:ões salinas:ões salinas:ões salinas:ões salinas:ões salinas:ões salinas:

Salting Salting Salting Salting inininin Salting Salting Salting

Salting outoutoutout→ depende de:

- hidrofobicidade da proteína - força iónica do sal

- temperatura

- pH (se pH=pI ↓↓↓↓solubilidade)

So lu bi lid ad e [sal]

••••

Salifica

Salificaçççção (salting in)

Salifica

ão (salting in)

: a solubilidade aumenta até certo ponto, com o aumento da [sal]

•

Dessalifica

Dessalificaçççção (salting out)

ão (salting out)

:::: os sais, a concentração muito elevada, retiram a H₂O de hidratação da proteína ⇒ as moléculas de proteína precipitam

16

-Exemplo: utilização do (NH

₄

)

₂

SO

₄

- Utiliza-se frequentemente o sulfato de amónio, (NH₄)₂SO₄devido à sua grande solubilidadegrande solubilidadegrande solubilidadegrande solubilidade em água

- diferentes proteínas têm diferente solubilidade ⇒⇒⇒⇒ precipitam a diferentes concentrações de (NH₄)₂SO₄

- a precipitação com (NH4)2SO4 não desnatura as proteínas

ex: proteínas da clara de ovo

100% saturada ovalbumina 50% da saturação ovoglobulina 50% da saturação ovomucina Precipita Precipita Precipita Precipita àààà [[[[(NH(NH(NH(NH4444))))2222SOSOSOSO4 4 4 4 ] de] de:] de] de Prote Prote Prote Proteíííínananana

(9)

17 3. Precipita 3. Precipita 3. Precipita 3. Precipita 3. Precipita 3. Precipita3. Precipita

3. Precipitaçççççççção por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:ão por solventes orgânicos:

Ex. Etanol, acetonaEtanol, acetonaEtanol, acetonaEtanol, acetona Precipita

PrecipitaPrecipita

Precipitaçççção ão ão proteicaão proteicaproteica por proteicapor por por ↓↓↓↓solubilidadesolubilidadesolubilidadesolubilidade

Solvente orgânico: ↓↓↓↓solvatasolvataççççãosolvatasolvata ãoão e ãoe e e ↓↓↓↓constante dielconstante dielconstante dielconstante dielééééctrica (D)ctrica (D)ctrica (D)ctrica (D)

Sendo,

Lei de Coulomb Então,

Se ↓D e ↑F :

Agregação proteica Precipitação ↓Solubilidade

q1 q2 F = F = F = F = _{D r}₂ F atracção entre 2 cargas no vazio

F atracção entre as cargas no meio D =

D =D = D =

18 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DE SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS

Diferentes tipos:

- exclusão molecular - troca iónica

- afinidade - fase reversa

(10)

19

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR ––volume/formavolume/forma

(11)

21

CROMATOGRAFIA DE TROCA I

CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓÓNICA NICA ––cargacarga

Trocadores aniónicos (+) e catiónicos (-)

(12)

23

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE ––selectividade de ligaselectividade de ligaççãoão

24

- um esquema de

purificação

possível:

Material de partida (células) Disrupção celular

Centrifugação Precipitação fraccionada (Sais, polihydroxiálcoois) Diálise (para eliminar os sais) Cromatografia de troca iónica Cromatografia de exclusão molecular

Proteína purificada

(13)

25

26

2. DETERMINAÇÃO DA MASSA

MOLECULAR

(14)

27

Electroforese: Electroforese: Electroforese: Electroforese:

-

métodos diversos, tais como:

28

Espectrometria de massa MALDI Espectrometria de massa MALDI Espectrometria de massa MALDI Espectrometria de massa MALDI----TOF:TOF:TOF:TOF:

(15)

29

Ultracentrifuga Ultracentrifuga Ultracentrifuga

Ultracentrifugaçççção em gradientes de densidade:ão em gradientes de densidade:ão em gradientes de densidade:ão em gradientes de densidade:

30

3. DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO

E SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS

(16)

31

DETERMINA

DETERMINAÇÇÃO DA COMPOSIÃO DA COMPOSIÇÇÃO DE AMINOÃO DE AMINOÁÁCIDOS CIDOS DE UMA PROTE

DE UMA PROTEÍÍNANA

1ºHidrólise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24 horas)

2ºReacção de ‘revelação’ dos aminoácidos (ex., ninidrina, cloreto de dansilo)

3º Separação e quantificação dos aminoácidos (ex. cromatográfica)

Ex: determinação da composição de aminoácidos do fragmento

ala-gly-asp-phe-arg-gly

32

Reagentes utilizados para “revelação” e quantificação dos aminoácidos:

(17)

33 Separação e quantificação dos aminoácidos por cromatografia (HPLCHPLCHPLCHPLC- ‘High pressure liquid chromatography)

- Matriz de separação (tirando partido das diferentes propriedades físicas de cada um dos aminoácidos)

- Eluente(variação controlada das condições do meio)

- Partição de cada aminoácido entre o meio e a matriz (de acordo com as suas propriedades fisico-químicas,

ex carga, forma, hidrofobicidade)

- Detecção após a sua derivatização)

Fase reversa, eluição com eluente de baixa força iónica em gradiente

34 Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa de cada aminoácido (mas não a sequência!!!)

(18)

35

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINO

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁÁCIDOS EM CIDOS EM DIAGN

DIAGNÓÓSTICO CLSTICO CLÍÍNICONICO

- Recém-nascido – parto e peso (3 Kg) normais, alimentação com leite materno - Ao 5º dia de vida – inicia recusa alimentar, vómitos, hipotonia, prostração - Agravamento progressivo e internalização ao 7º dia – quadro clínico anterior +

hipoglicémia, gasometria normal e cetonúria (corpos cetónicos)

- Suspeita de sepsis (infecção generalizada). Tratamento com antibióticos, soro glicosilado c/ iões e pausa alimentar

- Evolução, 9º dia – melhoria. Leite administrado por sonda nasogástrica - 10-11º dia – agravamento (prostação, coma com apneia)

- Suspeita de doença metabólica, baseada em: - período de intoxicação

- cetonúria (cetoácidos derivados de aminoácidos ?)

- ‘maple syrup urine disease’ (MSUD, urina com cheiro a caramelo)

Cromatografia de aminoácidos

36

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINO

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁÁCIDOS NO CIDOS NO DIAGN

DIAGNÓÓSTICO CLSTICO CLÍÍNICONICO NORMAL

(19)

37

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINO

USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁÁCIDOS NO CIDOS NO

DIAGN

DIAGNÓÓSTICO CLSTICO CLÍÍNICONICO

Cromatografia de aminoácidos aumento de leucina, isoleucina e valina Cromatografia de ácidos orgânicos cetoácidos ramificados derivados de

leucina, isoleucina e valina

LEUCINOSE

(defeito da desidrogenase dos αααα-cetoácidos ramificados ou α

αα

α-cetovalerato desidrogenase)

Tratamento:

Soro com glucose, dieta com restrição proteica (< 1 g/Kg/dia) com mistura de aminoácidos não-ramificados e diálise peritoneal ou hemodiálise

(com o objectivo de aumentar o anabolismo, reduzir o catabolismo e remover tóxicos)

38

DETERMINA

DETERMINAÇÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁÁCIDOS CIDOS DE UMA PROTE

DE UMA PROTEÍÍNANA

1- marca-se o resíduo N-terminal do péptido com fenil-tioisocianato(

⊗

):

⊗

⊗-Ala-Thr-Gly-Ile-Asp-COO

-2- hidrolisa-se o aminoácido N-terminal marcado, em condições suaves

⇒fica

⊗

⊗-Ala

e +₃

HN-Thr-Gly-Ile-Asp-COO

-+

3

HN-Ala-Thr-Gly-Ile-Asp-COO

-3- identifica-se cromatograficamente o resíduo N-terminal e hidrolisado,

⊗

⊗-Ala

4- Repete-se o ciclo 1-3 até à total determinação da sequência.

(20)

39

40

DEGRADA

DEGRADAÇÇÃO DE EDMAN ÃO DE EDMAN ––DerivatizaDerivatizaççãoãocom com fenilisotiocianatofenilisotiocianato SEQUENCIA

SEQUENCIAÇÇÃO DE PÃO DE PÉÉPTIDOS PTIDOS ‘‘PEQUENOSPEQUENOS’’

. Marca . Marca . Marca

. Marcaçççção do AA Não do AA Não do AA N----ão do AA N terminal terminal terminal terminal . Hidr . Hidr . Hidr

. Hidróóóólise do AA lise do AA lise do AA lise do AA ‘‘‘‘marcadomarcadomarcado’’’’marcado . Identifica . Identifica . Identifica

. Identificaçççção do AA ão do AA ão do AA ão do AA ‘‘‘‘marcadomarcadomarcado’’’’marcado . In . In . In

. Iníííício de um novo ciclo cio de um novo ciclo cio de um novo ciclo cio de um novo ciclo de marca

de marca de marca

de marcaçççção, hidrão, hidrão, hidrão, hidróóóólise lise lise lise e identifica

e identifica e identifica

e identificaçççção do AA ão do AA ão do AA ão do AA N

NN

(21)

41

DEGRADA

DEGRADAÇÇÃO DE EDMANÃO DE EDMAN

42 Tripsina Tripsina Tripsina Tripsina Quimotripsina Quimotripsina Quimotripsina Quimotripsina SEQUENCIA

(22)

43 ESTRATÉGIA TRADICIONAL DE SEQUENCIAÇÃO DE PÉPTIDOS ‘LONGOS’ 44

(23)

45

4. ELUCIDAÇÃO DA ESTRUTURA 3D

46

DETERMINA

DETERMINAÇÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÍÍNASNAS Necessidade de cristalização de alguns grupos ‘invisiveis’ DIFRAC

(24)

47

DETERMINA

DETERMINAÇÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÍÍNASNAS RESONÂNCIA MAGN

RESONÂNCIA MAGNÉÉTICA NUCLEARTICA NUCLEAR

Espectros essencialmente

para pequenas prote