CK- MB da Creatina Quinase Código DF 31 = 480 testes

DADE BEHRING

DIAGNOSTICA SAO PAULO

Finalidade

-

in vitro para a determinação quantitativa da atividade da isoenzima MB da creatina quinase em soro e plasma heparinizado.

Resumo - O método para determinação da isoenzima MB da creatina quinase é uma modificação do método de imunoinibição descrito por Neumeier et al com detecção da subunidade CKB não inibida baseada na modificação de Rosalki2 da determinação enzimática de Oliver3.

Princípios do Procedimento - A atividade da isoenzima CKMM é inibida por um anticorpo específico para a subunidade CK-M. A atividade da subunidade CK-B da CKMB é determinada. CK catalisa a transfosforilação reversível de fosfato a partir de creatina fosfato para adenosina-difosfato (ADP), produzindo adenosina-trifosfato (ATP). O ATP fosforila a glicose para produzir glicose-6-fosfato em uma reação catalisada pela hexoquinase (HK). A glicose-6-fosfato desidrogenase é entãoutilizada para catalisar a reação de glicose-6-fosfato e adenina-dinucleotídeo (NAD+), produzindo nicotinamida-adenina dinucleotídeo reduzida (NADH). A adenosina monofosfato (AMP) e 1,5 di [adenosina-5-pentafosfato (AP5A)] são incubadas para inibir a adenilato quinase. A taxa de alteração da absorbância a 340 nm devido à formação de NADH é diretamente proporcional à atividade da sub-unidade CK-B e é determinada utilizando uma técnica de taxa bicromática (340, 405 nm).

Creatina fosfato + ADP CKB Creatina + ATP

ATP + Glicose HK Mg++ ADP + Glicose-6-fosfato

Glicose-6-fosfato + NAD G-6-PDH 6-fosfogliconato + NADH + (H+) Reagentes

Cavidades Forma Ingrediente Concentração Fonte 1, 2, 3, 4, 5 Comprimido Creatina fosfato

Glicose NAD+ ADP AMP AP5A N-acetil cisteína 13 mM 12mM 1,6 mM 1,5 mM 7,1 mM 6,1 µM 23 mM 6 Líquida Anti CK-MB Hexoquinase G-6-PDH Tampão 0,25 mg/ml 4,5 U/ml 2,7 U/ml Cabra Levedura Bactéria a. As cavidades são numeradas consecutivamente a partir da extremidade larga do cartucho. b. Valor nominal por teste na fabricação.

c. Os comprimidos contêm excipientes.

Precauções:- As cubetas usadas contêm fluidos de origem humana; manipular com o cuidado apropriado a fim de evitar contato com a pele ou ingestão.

Para uso diagnóstico in vitro.

Preparação de Reagentes: - A homogeneização e diluição são automaticamente realizadas pelo equipamento.

Validade: - Consultar a embalagem para obter o prazo de validade dos cartuchos individuais não abertos. As cavidades seladas ou não hidratadas dos cartuchos no equipamento são estáveis por 30 dias. Quando as cavidades 1 - 5 tiverem sido introduzidas pelo equipamento, estas são estáveis por 48 horas. Quando a cavidade 6 tiver sido introduzida pelo equipamento, esta é estável por 30 dias.

Coleta de Amostras - Podem ser utilizados procedimentos normais para coleta e armazenamento de amostras de soro ou plasma a serem analisadas por este método. Evitar o contato prolongado do soro e plasma com as células vermelhas separadas.

Substâncias Interferentes Conhecidas - As seguintes substâncias, nas concentrações indicadas, não possuem efeito mensurável no método CKMB:

Acetaminofeno 20 µg/ml [1,3 mmol/l]d Ampicilina 20 µg/ml [57 µmol/l] Diazepam 20 µg/ml [70 µmol/l] Digoxina 20 ng/ml [25,6 nmol/l] Etanol 800 mg/dl [174 mmol/l] Gentamicina 16 µg/ml [29,4 µmol/l]

Lipemia 600 mg/dl [6,86 mol/l] triglicérides

Nortriptilina 1000 ng/ml [3797 nmol/l]

Fenobarbital 80 µg/ml [344 µmol/l]

Fenitoína 30 µg/ml [119 µmol/l]

Salicilato 100 mg/dl [7,24 mmol/l]

Teofilina 100 µg/ml [555 µmol/l]

d. Unidades no Sistema Internacional de Unidades estão indicadas entre colchetes. Bilirrubina na concentração de 20 mg/dl [342 µmol/l] aumenta o resultado de CKMB em 20 U/l a uma atividade de CKMB de 28 U/l. Hemoglobina na concentração de 500 mg/dl [0,31 mmol/l (monômero)] irá aumentar o resultado de CKMB em 7 U/l a uma atividade de CKMB de 21 U/l. Amostras contendo atividade total de creatina quinase acima de 2000 U/l devem ser diluídas com o Diluente Enzimático (Cat. Nº 790035901) antes de serem analisadas. Tubos para coleta de sangue contendo EDTA, fluoreto de sódio ou oxalato de potássio não devem ser utilizados. Tubos para coleta Corvac e SST não afetam o método CKMB. Cada laboratório deve determinar a aceitabilidade de seus próprios tubos para coleta de sangue e produtos para separação de soro. Variações nestes produtos podem existir entre fabricantes e, às vezes, entre lotes.

Corvac é uma marca registrada da Monoject, Divisão da Sherwood Medical, St. Louis, MO. SST é uma marca registrada da Becton-Dickinson, Rutherford, NJ.

Procedimento - O cartucho reagente Flex CKMB, Cat. Nº DF31 é requerida para a realização do teste CKMB. Este teste é realizado no sistema de química clínica Dimension após o método ser verificado (ver

Material de Referência na seção Verificação)

Etapas de Análise- A amostrageme, distribuição de reagentes, homogeneização, processamento e impressão de resultados são etapas realizadas automaticamente pelo sistema Dimension. Para obter mais detalhes sobre este processamento, consultar o manual do sistema Dimension.

e. O recipiente para amostras (se não for um tubo primário) deve conter volume suficiente para acomodar o volume de amostra mais o volume morto. Um enchimento preciso do recipiente não é necessário. Condições de Análise

Tamanho da Amostra 20 µl Volume de Reagente 1 40 µl Volume de Reagente 2 270 µl

Volume de Diluente 20 µl Temperatura de Análise 37 ºC Comprimento de Onda 340 e 405 nm Tipo de Leitura taxa bicromática

Verificação - O procedimento geral de verificação é descrito no manual do sistema Dimension. O CKMB pode requerer um ajuste de C0. Se os 3 resultados de teste forem reprodutíveis e a média do nível 1 estiver

fora de 0 ± 3 U/l, ajustar o termo de intersecção (C0) utilizando a função F-7 “Cálculo” na tela de Revisão de

Calibração. As informações a seguir devem ser consideradas durante a verificação do método para determinação de isoenzima da creatina quinase:

Faixa de Análise (@ 37 ºC) 0 – 125 U/l

Material de Referência Verificadores secundários tais como o Verificador Isoenzima da Creatina Quinase (Cat. Nº DC27)

Níveis de Verificação Sugeridos 0, 55, 110 U/l

Esquema de Verificação Três níveis em triplicata

Freqüência de Verificação A cada novo lote de cartucho reagente A cada 3 meses para qualquer lote

Coeficientes designados C0 -1,000

C1 10,000

Controle de Qualidade- Pelo menos uma vez a cada dia, analisar soluções de um material de controle de qualidade com concentrações de conhecidas. Para obter mais detalhes, consultar o manual do sistema Dimension. Os resultados obtidos devem estar dentro dos limites definidos pela variabilidade dia a dia do sistema determinado pelo laboratório. Se os resultados estiverem fora dos limites aceitáveis pelo laboratório, seguir o procedimento descrito na seçãoResolução de Problemas no manual do sistema Dimension.

Observação: Em alguns materiais de controle comerciais, o CKMB tem mostrado ser sensível à fotodegradação e à temperatura de reconstituição. Estes efeitos podem causar variação que podem contribuir significativamente para a precisão dia a dia. Pode existir um mau funcionamento do sistema se a seguinte precisão de 5 testes for observada:

Atividade D.P.

10 U/l] > 1,5 U/l

50 U/l > 2,0 U/l

Resultados - O equipamento automaticamente calcula e imprime a concentração da isoenzima MB da creatina quinase em U/l utilizando o esquema de cálculo ilustrado no manual do sistema Dimension. Uma alteração de absorbância de 0,1 mA/min corresponde a uma atividade de CKMB de 1 U/l a 37 ºC.

Limitações do Procedimento- Resultados acima de 125 U/l devem ser novamente analisados após diluição da amostra com Diluente Enzimático (Cat. Nº 790035901) a fim de se obter uma concentração de amostra dentro da faixa de análise. A leitura obtida será então multiplicada pelo fator de diluição para fornecer a atividade da amostra não diluída. O sistema de relatórios do equipamento contém mensagens de erro a fim de avisar o operador sobre maus funcionamentos específicos. Qualquer relatório que contenha tais mensagens de erro deve ser mantido ou acompanhado. Consultar o manual do sistema Dimension.

Intervalo de Referência (@ 37 ºC): 0 – 6 U/l

Cada laboratório deve estabelecer o seu próprio intervalo de referência para CKMB realizado no sistema de química clínica Dimension_. Critério de Diagnóstico - Devido à presença de pequenas quantidades de CKMB no tecido não cardíaco, a utilização somente da atividade de CKMB (U/l) como critério de diagnóstico irá resultar em desempenho diagnóstico sub-ótimo. O método CKMB determina não

somente a CKMB, mas também qualquer CKBB, CK mitocondrial, ou IgG-CKBB presente no soro do paciente. Estas últimas fontes de atividade CK-B podem ser distinguidas pela persistente elevação de CKMB durante um período de 3 dias. A probabilidade de IM associado com um conjunto de critérios irá depender da prevalência de IM na população sendo analisada. A eficácia diagnóstica máxima do teste CKMB será obtida quando um protocolo de coleta de amostras seqüencial for utilizado e consideração for dada ao padrão de tempo da atividade durante um período de 6 – 48 horas. Quando somente a atividade de CKMB é utilizada, a eficácia do diagnóstico será mais baixa e irá variar com o tempo de amostragem.Os seguintes fenômenos são indicativos da presença de isoenzimas CK atípicas: Valores totais de CK geralmente são normais a ligeiramente elevados e o valor de CKMB aparente é de, aproximadamente, 20% do CK total. Os resultados de CKMB obtidos utilizando-se um protocolo de coleta de amostras seqüencial não apresentam a elevação e queda típicas durante um período de tempo de 6 – 48 horas, permanecendo a atividade relativamente constante.

Características de Desempenho Específicas Reprodutibilidade

Média Desvio Padrão (%CV)

Material U/l Inter-corrida Entre Dias

Controle Isoenzima CKMB Cala

31 0,6 (2,0) 1,6 (5,1)

Cardiotrol Roche 105 2,6 (2,4) 4,5 (4,2)

Controle Isoenzima CKMB Cala da Cala Diagnostics, Los Osos, CA 93402. Cardiotrol é uma marca registrada da Roche Diagnostic Systems, Nutley, NJ Correlação

Estatística de Regressãoh

Método Comparativo Inclinação Intersecção Coeficiente de Correlação ni Método CKMB no analisador

clínico aça discrete

1,02 0,8 0,969 162

f. Todos os testes de características de desempenho específicas foram realizados após verificações normais de controle de qualidade recomendadas para o equipamento (consultar o manual do sistema Dimension). g. As amostras de cada nível foram analisadas em triplicata, durante 20 dias. Os desvios padrão

inter-corridas e entre dias foram calculados por análise do método de variância.

h. A equação modelo para estatística de regressão é: [Resultado do analisador Dimension] = Inclinação x (resultado do método comparativo) + intersecção.

i. Faixa de amostras: 5 – 88 U/l

Especificidade Analítica - Consultar a seção Substâncias Interferentes Conhecidas para obter detalhes. Referências Bibliográficas

1. Neumeier, D et al, Determination of creatine kinase isoenzyme MB activity in serum using immunological inhibition of creatine kinase M subunit activity, Clinica Chimica Acta, 1976, 71445-451. 2. Rosalki, SB, An improved procedure for serum creatine phosphokinase determination, J Lab Clin Med,

1967; 69:696-105.

3. Oliver, IT, A spectrophotometric method for the determination of creatine phosphokinase and myokinase, Biochem J, 1955; 61:116.

4. Tietz, NW, Textbook of Clinical Chemistry, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA 1986, pp, 52-53 (techniques and procedures to minimize laboratory infections) and pp, 478-497 (specimen collection and storage recommendations).

5. Wu, AHB, Bowers, GN, Evaluation and comparison of immunoprecipitation methods for differentiating MB from BB and macro forms of creatine kinase isoenzymes in patients and healthy individuals, Clin Chem 1982; 28:2017.

6. Henry, RJ, Cannon, DC, Winkelman, JW, Clinical Chemistry, Principles and Techniques, Harper & Row, New York, NY, 1974, pp 362-634.

7. Naccarato, WF, Interpretation of results from the Du Pont CKMB Method, DuPont Company, Wilmington, DF, 1983.

8. Clement, GF, Havassy, J, Gull, J, Diagnostic performance of combined isoenzyme analysis using the Du Pont CKMB and LDH isoenzymes, Clin Chem, 1983; 29:1678.

9. Maturen, A, Pielras, RF, Kondos, GT, Shulruff, SF, Giangrasso, M, A protocol for use of the aca CKMB method in acute myocardial infarction, Clin Chem, 1983, 29:1183

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