Efeito anti-hiperalgésico e anti-inflamatório dos complexos de inclusão de citral em β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

CAIO DE ALCÂNTARA CAMPOS

EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO E ANTI-INFLAMATÓRIO

DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE CITRAL EM

β-CICLODEXTRINA E HIDROXIPROPIL-β-β-CICLODEXTRINA

SÃO CRISTÓVÃO - SE 2019

EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO E ANTI-INFLAMATÓRIO

DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE CITRAL EM

β-CICLODEXTRINA E HIDROXIPROPIL-β-β-CICLODEXTRINA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo

SÃO CRISTÓVÃO - SE 2019

C198e

Campos, Caio de Alcântara

Efeito anti-hiperalgésico e anti-inflamatório dos complexos de inclusão de citral em β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina / Caio de Alcântara Campos ; orientador Adriano Antunes de Souza Araújo. – São Cristóvão, 2019.

61 f. : il.

Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de Sergipe, 2019.

1. Ciclodextrinas. 2. Agentes antiinflamatórios. 3. Monoterpenos. 4. Hiperalgesia. I. Araújo, Adriano Antunes de Souza, orient. II. Título.

EFEITO ANTI-HIPERALGÉSICO E ANTI-INFLAMATÓRIO

DOS COMPLEXOS DE INCLUSÃO DE CITRAL EM

β-CICLODEXTRINA E HIDROXIPROPIL-β-β-CICLODEXTRINA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

São Cristóvão, 19 de fevereiro de 2019.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________ Prof. Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo

____________________________________________________ Prof. Dra. Rogéria de Souza Nunes

____________________________________________________ Prof. Dra. Paula Santos Nunes

Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida e por ter me feito suportar tanta coisa durante esse período do mestrado. Por ter me dado forças pra seguir. Agradeço a minha mãe, Beatriz, por estar sempre comigo, nessa parceria que vem desde o ventre e que é um vínculo realmente inexplicável. Te amo. Agradeço a toda a minha família, incluindo tios, primos e avós. Sei e sinto que sempre estão a torcer por mim. Agradeço a minha tia e madrinha Teresa, por ter me dado força e suporte em momentos que de fato precisei.

Não posso deixar de falar de toda a equipe do LeFT. Esse, no caso, é um agradecimento essencial. Não sei o que teria sido de mim sem esse pessoal. Foi com essa equipe que de fato aprendi o que é realmente trabalhar em equipe, em parceria, em união. Sim, vocês foram essenciais nessa jornada. Agradeço a Paulinha, Yasmim, Guilherme, Taty, Monna, Lee, Valléria, Graça, Eloísa, Saran, Isabella, Igor, Lívia, Ana Maria, Clara, Milena, Victória, Lislene e Bruna. Agradeço em especial a Marília, que me acompanha desde a iniciação científica, e sempre me deu um apoio muito grande em tudo. A Lana, minha brother e parceira desde o começo desse mestrado, e se mostrou uma amiga verdadeira e fiel. Não sei o que teria sido de mim sem os seus conselhos e os momentos em que sempre esteve disposta a me ouvir. Agradeço também em especial a Bruno, amigo e parceiro desde a graduação, mas que no mestrado apresentou essas atribuições de forma muito mais intensa, e que me ajudou e me deu suporte quando mais precisei. Nunca vou me esquecer da sua ajuda. Se não fosse por você talvez nem tivesse concluindo esse mestrado agora. A gratidão é eterna. E por fim, a Gaby, minha parceira de loucuras, amiga pra todas as horas também. Sempre disposta a ajudar e a me ouvir. Você é demais!

Agradeço ao meu orientador, Adriano, que me acompanha a 4 anos, levando em conta os 2 anos de iniciação científica. Praticamente um doutorado, ein? Kkk. Agradeço toda a paciência e orientação no decorrer desses anos. Agradeço a Profª. Mairim, por também ter me acompanhado no LeFT por todos esses anos, dando todo o suporte necessário. Minha gratidão a todos os laboratórios parceiros. Sem eles esse trabalho de dissertação de mestrado não teria sido realizado. Em especial ao LANEF, laboratório dirigido por Prof. Lucindo e Profª. Jullyana. Muito obrigado por todo o suporte e paciência. E por fim agradeço a CAPES e CNPq, por todo o financiamento da pesquisa. Obrigado!

ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina, Caio de Alcântara Campos, São Cristóvão, 2019.

O citral (CIT) é um monoterpeno formado pelos estereoisômeros geranial e neral. CIT é o composto majoritário do óleo essencial da Cymbopogon citratus, conhecido popularmente como capim-limão, tem demonstrado potenciais efeitos anti-hiperalgésico, anti-nociceptivo e anti-inflamatório. No entanto, o CIT apresenta alta volatilidade, baixa solubilidade em água e consequentemente baixa biodisponibilidade, o que limita sua utilização. Diante disso, este estudo teve o objetivo de preparar, caracterizar, avaliar a viabilidade celular (citotoxicidade) e os efeitos anti-hiperalgésico e anti-inflamatório do CIT livre e complexado em β-ciclodextrina (β-CD) e hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD). Inicialmente, a mistura física (MF) e os complexos de inclusão por liofilização (LI) do CIT/β-CD e CIT/HP-β-CD foram obtidos na razão molar de 1:1. As amostras foram caracterizadas por DSC, TG/DTG, FTIR, DRX, MEV e a eficiência de complexação foi realizada por CLAE. O ensaio de viabilidade celular foi realizado em macrófagos J774 pela técnica de redução da rezasurina. A atividade motora por meio do aparato rota rod, hiperalgesia mecânica e pleurisia induzida por carragenina foram avaliadas em camundongos. A complexação do CIT foi evidenciada com a β-CD e com a HP-β-CD pelas técnicas de caracterização analisadas. A eficiência de complexação do CIT/HP-β-CD e CIT/HP-β-CD foram de 78,6% e 71,7%, respectivamente. CIT, CIT/β-CD e CIT/HP-β-CD apresentaram viabilidade celular em macrófagos e não interferiram na atividade motora dos camundongos. Além disso, as amostras apresentaram atividade hiperalgésica e anti-inflamatória devido à redução do número de leucócitos totais e dos níveis de TNF-α. Porém, o CD teve melhor efeito farmacológico entre as amostras analisadas. Portanto, o CIT/β-CD apresenta potencial para o desenvolvimento de produtos para o tratamento de reações inflamatórias e dolorosas.

Palavras-chave: citral; ciclodextrinas; complexos de inclusão; hiperalgésico; anti-inflamatório.

cyclodextrin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Caio de Alcântara Campos, São Cristóvão, 2019.

Citral (CIT) is a monoterpene formed by the geranial and neral stereoisomers. CIT is the major compound of Cymbopogon citratus essential oil, known as “capim-limão”, and has demonstrated potential antihyperalgesic, anti-nociceptive and anti-inflammatory effects. However, CIT shows high volatility, low solubility in water and consequent low bioavailability, which limits its use. Therefore, the aim of this study was to prepare, characterize, evaluate cell viability, anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects of inclusion complexes of CIT on β-cyclodextrin (β-CD) and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD). Initially, physical mixture (PM) and freeze-dried inclusion (FD) complexes of CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD were obtained in the molar ratio (1:1). The samples were characterized by DSC, TG/DTG, FTIR, XRD, SEM and the complexation efficiency were performed by HPLC. Cell viability assay was performed by rezasurin reduction technique in J774 macrophages cell line. The motor activity through rota rod apparatus, mechanical hyperalgesia and pleurisy induced by carrageenan were evaluated in mice. The complexation of CIT was evidenced with β-CD and HP-β-CD by the characterization techniques analyzed. The complexation efficiency of CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD were 78.6% and 71.7%, respectively. The CIT, CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD showed cell viability in macrophages and did not interfere in the motor activity of mice. Besides that, the samples demonstrated antihyperalgesic and anti-inflammatory activity due to reduction in total leukocytes and TNF-α levels. However, CIT/β-CD has better pharmacological effects among the three samples evaluated. Therefore, CIT/β-CD has potential for the development of products to treatment of inflammatory and painful reactions.

Página Figura 1 Estruturas moleculares dos estereoisômeros do citral (geranial e

neral).

15

Figura 2 Estruturas químicas e dimensões da α-CD, β-CD e γ-CD. 17 Figura 3 Representação esquemática da formação de complexo de inclusão

entre uma molécula hidrofóbica e a β-CD.

18

Figura 4 Estrutura molecular da β-CD (Grupo R = H) e HP-β-CD (Grupo R = C3H7OH).

AINE – Anti-inflamatório não esteróide CD(s) – Ciclodextrina(s)

CIT – Citral

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência COX-1 – Ciclooxigenase 1

COX-2 – Ciclooxigenase 2 D.C – Depois de Cristo

DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil DRX – Difração de raios-X

DSC – Calorimetria exploratória diferencial

FT-IR – Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier

GPx1 – Glutationa peroxidase 1

HPLC – High performance liquid chromatography HP-β-CD – Hidroxipropril-beta-ciclodextrina HSM – Microscopia de estágio quente

IL-1β – Interleucina 1 beta IL-6 – Interleucina 6

iNOS – Óxido nítrico sintase indutível kg - kilograma

L – Litro

LPS – Lipopolissacarídeo

MEV – Microscopia eletrônica de varredura mg – miligrama

NF-ĸβ – Fator nuclear kappa b

PPAR-γ – Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma SOD1 – Superóxido dismutase 1

TG – Termogravimetria

TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa

TRPV1 – Receptores transitórios potenciais vanilóides do tipo 1 v.o – via oral

CAPÍTULO 1

2.4. Complexos de inclusão e dor inflamatória ...20

2.5. Métodos de obtenção e caracterização de complexos de inclusão ...21

3. OBJETIVOS ... 25

3.1. Geral ...25

3.2. Específicos ...25

4. REFERÊNCIAS ... 26

CAPÍTULO 2

5. CONCLUSÃO GERAL ... 56

6. PERSPECTIVAS ... 57

ANEXO I ... 58

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA E

OBJETIVOS

1. INTRODUÇÃO

A dor é um dos quatro sinais cardeais da inflamação definidos por Celsus durante o 1° século D.C. A mediação da dor ocorre através dos nociceptores, que são subconjuntos especializados de neurônios sensoriais que inervam densamente tecidos periféricos como a pele, articulações, vias respiratórias e trato gastrintestinal. Os nociceptores podem responder a estímulos mecânicos, químicos ou térmicos (PINHO-RIBEIRO, 2016; BASBAUM et al, 2009). A dor inflamatória aguda, um dos tipos de condições dolorosas, caracteriza-se por hipernocicepção causada por sensibilização de nociceptores primários, também chamada de hiperalgesia ou alodinia (CUNHA, 2005; MILLAN, 1999).

Uma parte significativa da população mundial é afetada por algum tipo de dor, causando perda da qualidade de vida (DE SOUSA, 2011; DE SANTANA et al., 2015). Os tratamentos para condições dolorosas, como a dor inflamatória, são muitas vezes insatisfatórios, pois sua etiologia é heterogênea e os mecanismos fisiopatológicos são complexos (QUINTANS-JÚNIOR et al, 2011; BATISTA et al., 2010). Para este tipo de condição geralmente são prescritos medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), no entanto, estes costumam apresentar efeitos colaterais relevantes e baixa eficácia em grande parte dos casos (MITCHELL; WARNER, 1999; DAY; GRAHAM, 2013). Portanto, novas alternativas terapêuticas para o tratamento da dor inflamatória vêm sendo investigadas. Neste contexto, as moléculas derivadas de produtos naturais apresentam destaque, pois demonstram efeitos farmacológicos promissores, menos efeitos adversos e dessa forma, possibilitam o desenvolvimento de novos fármacos com maior eficácia para o tratamento da dor inflamatória (RABELO et al., 2016; MCCURDY, SCULLY, 2005).

O citral (CIT) é um monoterpeno formado pelos estereoisômeros neral (cis-citral) e geranial (trans-citral), considerado o composto majoritário do óleo essencial da planta

Cymbopogon citratus, conhecida popularmente como capim-limão (KATSUKAWA, et al.,

2010). O CIT demonstrou efeito anti-inflamatório por meio da inibição da óxido nítrico sintase indutível (iNOS) e fator nuclear kappa b (NF-ĸB) (LIN et al., 2008) e inibição da liberação das interleucinas pró-inflamatórias IL-1β e IL-6 (BACHIEGA; SFORCIN, 2011). O CIT apresentou efeito anti-inflamatório sinérgico com naproxeno (ORTIZ et al., 2010), efeito antinociceptivo e anti-inflamatório quando administrado via intraperitoneal em roedores (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2011), redução de estímulo nociceptivo agudo sem causar disfunção motora, redução de hiperalgesia mecânica, e significativa ação gastroprotetora contra úlceras induzidas por anti-inflamatórios não-esteroidais (NISHIJIMA et al., 2014).

Além disso, o CIT foi relatado como agonista parcial de receptores transitórios potenciais vanilóides do tipo 1 (TRPV1), o que reforça seu potencial analgésico e anti-inflamatório (STOTZ et al., 2008). No entanto, seu uso na prática é limitado devido a sua baixa solubilidade em água, por ser um composto hidrofóbico, e devido a sua baixa estabilidade perante agentes ambientais como oxigênio e temperaturas elevadas, sendo altamente volátil (LU et al., 2017).

As Ciclodextrinas (CDs) são amplamente utilizadas em pesquisas e na indústria farmacêutica com o objetivo de aumentar a solubilidade e estabilidade de fármacos, possibilitando o aumento da biodisponibilidade e dos efeitos farmacológicos (RODRIGUES, 2016). As CDs são oligossacarídeos cíclicos em forma de cones truncados, compostos por monômeros de α-D-glicopiranose ligados por ligações α-1,4, sendo as CDs naturais classificadas em α-CD, β-CD ou γ-CD, tendo seis, sete ou oito monômeros, respectivamente. Elas possuem uma cavidade central hidrofóbica e uma superfície hidrofílica e podem incorporar uma variedade de moléculas para formar complexos hóspede-hospedeiro (CRINI, 2014; PINHO et al., 2014). Dentre as CDs naturais, a β-ciclodextrina (β-CD) é a mais utilizada para complexação de fármacos, no entanto, sua utilização é restringida pela sua baixa solubilidade aquosa (DUCHÊNE; WOUESSIDJEWE, 1990).

Algumas modificações químicas tem sido feitas em CDs naturais para superar a extensão limite de solubilidade, otimizar sua capacidade em aplicações específicas, ou para fornecê-las com novas funcionalidades. A substituição dos átomos de hidrogênio das hidroxilas da β-CD por grupos 2-hidroxipropil, resultando em hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD), representa talvez a modificação química mais amplamente empregada. Em comparação com as naturais, a principal característica desta CD modificada é a sua maior solubilidade aquosa. Quanto às aplicações farmacêuticas, suas vantagens são o aumento da solubilidade, da velocidade de dissolução, e da biodisponibilidade do fármaco (SANTOS et al., 2013).

Na perspectiva de melhorar a solubilidade, estabilidade e os efeitos farmacológicos do CIT, a inclusão deste em CDs, torna-se promissora. Diante disso, este trabalho teve como objetivo preparar, caracterizar e avaliar a citotoxicidade in vitro, bem como, as atividades anti-hiperalgésica e anti-inflamatória in vivo dos complexos de inclusão de CIT com β-CD e HP-β-CD. Trata-se de um trabalho inovador que apresenta perspectivas para o desenvolvimento de um produto farmacêutico que possa ser utilizado para o tratamento de condições dolorosas e inflamatórias.

2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Dor e inflamação

A dor é definida como uma experiência sensorial ou emocional desagradável, associada a um dano tecidual real ou potencial, e pode envolver uma interação complexa de mecanismos neurofisiológicos, fatores psicossociais, e processos inflamatórios (MERSKEY; BOGDUK, 1994; GOULOOZE et al., 2017). Cada vez mais é evidenciada a correlação existente entre os nociceptores (neurônios sensoriais que medeiam a dor) e o sistema imunológico, que controlam a dor, a defesa do hospedeiro e as doenças inflamatórias. Células imunológicas em terminais nervosos periféricos e na medula espinhal liberam mediadores que modulam a sensibilidade mecânica e térmica. Por sua vez, os neurônios nociceptores liberam neuropeptídeos e neurotransmissores que regulam respostas vasculares, inatas e adaptativas de células imunes. Deste modo, a relação entre os nociceptores e o sistema imunológico é um aspecto fundamental da inflamação, tanto aguda quanto crônica (PINHO-RIBEIRO; VERRI JR; CHIU, 2016).

Citocinas são produzidas por vários tipos de células em resposta a uma variedade de estímulos e constituem um elo entre o dano celular e o desenvolvimento de sinais e sintomas sistêmicos de inflamação (CUNHA et al., 2005). A dor inflamatória aguda é caracterizada por hipernocicepção, também conhecida como hiperalgesia, devido à sensibilização de neurônios nociceptivos sensoriais primários (MILLAN, 1999). Foi demonstrado que estímulos inflamatórios não estimulam diretamente a liberação de mediadores hipernociceptivos primários, mas que sua liberação é precedida por uma cascata de citocinas (CUNHA, et al., 2005).

A inflamação é a resposta do corpo ao dano tecidual desencadeado por estímulos endógenos e/ou exógenos. É caracterizada por alterações bioquímicas, vasculares e celulares que levam a ativação de componentes celulares e plasmáticos do sistema imune, para eliminar o agente ofensivo e restaurar a integridade do tecido (LAWRENCE; GILROY, 2007). No local da inflamação, células liberam mediadores inflamatórios que promovem alterações locais e sistêmicas, incluindo extravasamentos de plasma e recrutamento e ativação de leucócitos. Os leucócitos desempenham um papel fundamental na eliminação de patógenos, incluindo mecanismos de liberação de enzimas lisossomais e produção de espécies reativas de oxigênio. No entanto, esses produtos leucocitários afetam o hospedeiro, causando lesão tecidual e levando ao desenvolvimento de sinais e sintomas específicos (BASBAUM et al., 2009; RODRIGUES et al., 2017).

Uma parcela significativa da população mundial é afetada por algum tipo de dor, seja inflamatória ou neurogênica, o que causa considerável perda da qualidade de vida (DE SOUSA, 2011, DE SANTANA, 2015). Na tentativa de tratar o processo inflamatório, medicamentos anti-inflamatórios têm sido utilizados; estes medicamentos são tipicamente classificados como anti-inflamatórios não esteróides (AINEs), que atuam na modulação das atividades enzimáticas das ciclooxigenases (COX-1 e/ou COX-2), e os corticosteroides que agem inibindo a transcrição gênica inflamatória. (VANE, 2000; DINARELLO, 2010; RODRIGUES et al, 2017). No entanto, especialmente a longo prazo, eles causam efeitos colaterais significativos. AINEs não seletivos causam lesões gástricas devido à sua interferência na produção de prostaglandinas gastroprotetoras, além de interferir na coagulação sanguínea. Por outro lado, os corticosteróides induzem alterações endócrinas e causam imunossupressão, aumentando a suscetibilidade a infecções (RAINSFORD, 1999; BUCHMAN, 2001; RODRIGUES et al, 2017).

Diante disso, novas alternativas terapêuticas para o tratamento da dor inflamatória estão sendo investigadas. Neste contexto, moléculas derivadas de produtos naturais têm apresentando efeitos promissores e oferecem possibilidade de desenvolvimento de novos fármacos com maior eficácia e melhor desempenho para o tratamento da dor inflamatória (RABELO, 2016; MCCURDY, SCULLY, 2005).

2.2. Citral

Diante deste contexto insere-se o citral (CIT), um monoterpeno de cadeia aberta formado pelos isômeros neral e geranial (Figura 1), e está presente como composto majoritário no óleo essencial da planta Cymbopogon citratus, conhecida popularmente como capim-limão, a qual tem um teor de 77,1% de CIT, sendo 46,8% de geranial e 30,3% de neral (TAK; JOVEL; ISMAN, 2015).O extrato aquoso das folhas secas do capim-limão obtido por infusão é frequentemente utilizado na medicina tradicional para o tratamento da dor, febre, inflamação, desordens digestivas e distúrbios nervosos (LORENZETTI et al., 1991).

O CIT tem apresentado diferentes atividades biológicas e fisiológicas que podem ter grande relevância na farmacologia e na clínica. Dentre as atividades farmacológicas descritas na literatura destacam-se seu potencial antimicrobiano (SADDIQ; KHAYYAT, 2010), antiprotozoário (MACHADO et al., 2012), antioxidante, antitumoral (SHI et al., 2016), antinociceptivo, anti-hiperalgésico (NISHIJIMA et al., 2014), anti-inflamatório (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2011), e cardiovascular (MOREIRA et al., 2013).

Figura 1: Estruturas moleculares dos estereoisômeros do citral (geranial e neral).

Quanto à atividade antimicrobiana, o CIT apresenta efeito contra as bactérias

Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e contra os fungos Penicillium italicum, Rhizopus stolonifer, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes e Microsporum gypseum,

causadores de importantes infecções em humanos (PARK et al., 2009; SADDIQ; KHAYYAT, 2010; MIRON et al., 2014; SHI et al., 2016). Estudos confirmaram a atividade antiprotozoária do CIT em fases amastigotas e promastigotas de três espécies do gênero

Leishmania: L. infantum, L. tropica e L. major, causadoras de Leishmaniose cutânea e

visceral, e não foi detectado efeito tóxico do CIT em células mamíferas por teste in vitro em cultura de células endoteliais de aorta bovina e macrófagos (MACHADO et al., 2012).

Estudos revelaram a atividade antioxidante e antitumoral do CIT, por meio do teste in

vitro de determinação da capacidade de eliminação do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

(DPPH), e também por ser detectada a indução, pelo CIT, da regulação da expressão de superóxido dismutase 1 (SOD1) e glutationa peroxidase 1 (GPx1), enzimas responsáveis pela inativação de superóxido e peróxido de hidrogénio, em células hepáticas de linhagem L-02 (SHI et al., 2016). O CIT também demonstrou significativo efeito antitumoral pela inibição da enzima ALDH1A3 presente como marcador tumoral e promotor de crescimento em células de câncer de mama, pulmão, melanomas e glioblastomas (THOMAS et al., 2016). Além disso, foi demonstrado que o CIT induz hipotensão, bradicardia e vasorrelaxamento em ratos. A bradicardia aparentou ser causada pela ativação de receptores muscarínicos cardíacos e o vasorrelaxamento ocorreu por meio do bloqueio dos canais de cálcio (MOREIRA et al., 2013).

Pesquisas demonstraram que o CIT possui um grande potencial anti-inflamatório por ser um ativador do fator de transcrição PPAR-γ, o que inibe a resposta inflamatória induzida por LPS, inibindo assim a produção das citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6, e do fator de transcrição NF-κB (BACHIEGA; SFORCIN, 2011; SHEN; SUN; GUO, 2015). Foram evidenciados os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório do CIT quando administrado via intraperitoneal em roedores (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2011) e o efeito anti-inflamatório sinérgico com naproxeno, um tipo de AINE (ORTIZ et al., 2010). Nishijima e colaboradores demonstraram o efeito do CIT na redução da nocicepção aguda, sem causar disfunção motora, redução da hiperalgesia mecânica, e também detectaram significativa ação gastroprotetora do CIT contra úlceras induzidas por anti-inflamatórios não-esteroidais (NISHIJIMA et al., 2014). Além disso, o CIT foi relatado como agonista parcial de receptores transitórios potenciais vanilóides do tipo 1 (TRPV1), o que reforça seu potencial analgésico e anti-inflamatório (STOTZ et al., 2008). No entanto, o CIT apresenta desvantagens como alta volatilidade, baixa estabilidade perante agentes ambientais e baixa solubilidade em água, o que consequentemente reduz sua biodisponibilidade. Todos esses fatores limitam seu manuseio e aplicação farmacológica (LU et al., 2017).

2.3. Ciclodextrinas

Para melhorar a estabilidade e solubilidade de bioprodutos, várias técnicas, tais como dispersão sólida e complexação, têm sido estudadas. A obtenção de complexos de inclusão com CDs é um dos métodos mais explorados para melhorar a atividade de fármacos insolúveis a partir do aumento da sua solubilidade e biodisponibilidade (SU et al., 2012).

A primeira publicação descrevendo CDs foi feita por Antoine Villiers. Ele descobriu dextrinas cristalinas (celulosinas) que foram obtidas por digestão enzimática de fécula de batata por Bacillus amylobacter (VILLIERS, 1891). No final da década de 1940, a palavra “ciclodextrina” foi usada para definir as características da dextrina observadas por Friedrich Cramer, que também investigou o procedimento de purificação e separação das CDs naturais (ou seja, α-CD, β-CD e γ-CD) e realizou diversos estudos em complexos de inclusão no estado sólido e em solução (CRAMER, 1949; CRAMER, 1954; JANSOOK; OGAWA; LOFTSSON, 2018). CDs têm sido utilizadas na indústria farmacêutica desde a década de 1970 com o primeiro produto prostaglandina E2/βCD (comprimido sublingual da Prostarmon E™) comercializado no Japão em 1976 (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007; JANSOOK; OGAWA; LOFTSSON, 2018).

Figura 2: Estruturas químicas e dimensões da α-CD, β-CD e γ-CD.

Fonte: https://todosigueigual.wordpress.com/tag/ciclodextrinas/

CDs são oligossacarídeos cíclicos solúveis em água, compostos por 6 a 8 unidades de α-D-glicopiranose unidas por ligações α-1,4 (SERAFINI et al.,2012; GOSH; NAU, 2012). Dependendo do número de unidades de glicopiranose, as CDs naturais podem ser classificadas em α-CD (seis unidades), β-CD (sete unidades) ou γ-CD (oito unidades), como pode ser visto na Figura 2 (ZHANG; MA, 2013). A estrutura cíclica das CDs possui uma cavidade onde moléculas hidrofóbicas podem se hospedar para formar complexos de inclusão (Figura 3). As principais interações que ocorrem entre moléculas hóspedes e CDs envolvem forças de Van der Waals, interações dipolo-dipolo, interações hidrofóbicas, pontes de hidrogênio e efeitos estéricos (SUTHARI et al., 2014). Neste caso, em solução aquosa, as CDs, que possuem forma de cone truncado, podem incluir uma ou duas moléculas, a depender do tamanho e do tipo da CD. Isto se deve à acomodação dos grupos CH2 dentro da cavidade,

fornecendo características hidrofóbicas, e os grupamentos hidroxilas na superfície conferem características hidrofílicas (DEL VALLE, 2004; KHAN; DURAKSHAN, 2013). Em estado sólido, as moléculas hóspedes podem ser parcial ou completamente inseridas dentro da cavidade da CD, ou podem formar complexos de não inclusão. Esses fenômenos tem relação com a taxa de dissolução e estabilidade do fármaco (JANSOOK; OGAWA; LOFTSSON, 2018).

Figura 3: Representação esquemática da formação de complexo de inclusão entre uma molécula hidrofóbica e a β-CD.

Fonte: https://www.jotdown.es/2016/02/cual-es-la-rama-de-la-ciencia-mas-importante Assim, as moléculas hospedadas pelas CDs podem ter suas características físico-químicas modificadas, aumentando sua estabilidade perante agentes ambientais, controlando a volatilidade, mascarando sabores e odores adversos e aumentando a solubilidade em água e fluidos corporais. Os complexos de inclusão com CDs podem agir nos fármacos controlando a velocidade de liberação destes, melhorando a biodisponibilidade e assim reduzindo a dose necessária para produzir um efeito farmacológico, e também prolongando a validade da formulação. Além disso, as CDs podem reduzir os efeitos toxicológicos/irritantes dos compostos (LOFTSSON et al., 2005; ZHANG; MA, 2013; TIWARI; TIWARI; RAI, 2010; KHAN; DURAKSHAN, 2013; STELLA; HE, 2008; PINHO et al., 2014).

Na administração oral dos complexos de inclusão, a diluição provocada pelos fluidos gastrointestinais, promove a dissociação do complexo, com o estabelecimento de um equilíbrio dinâmico extremamente rápido. As CDs funcionam como transportadores, carregando as moléculas de fármaco hidrofóbicas em solução até as membranas celulares lipofílicas para sua absorção, e permanecendo nos fluidos aquosos. O elevado tamanho das CDs e sua superfície fortemente hidrofílica tornam a absorção desta molécula praticamente insignificante (RAJEWSKI; STELLA, 1996; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007). A toxicidade das CDs é dependente da via de administração. Na adminstração oral de CDs, estudos comprovam sua inocuidade a elevadas doses (American Pharmaceutical Association, 2006). Para a β-CD, a administração de preparados por via endovenosa provoca precipitação microcristalina desta CD nos rins devido a sua solubilidade limitada, além da formação de complexos com o colesterol, provocando sérios danos renais (DAVIS; BREWSTER, 2004; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007).

Apesar de a β-CD ser bastante utilizada pela indústria farmacêutica para o complexação de fármacos, uma vez que é obtida com elevado rendimento e baixo custo

(KRANAWETVOGL, 2013), ela apresenta alguns inconvenientes devido a sua solubilidade aquosa limitada. Assim, derivados de CDs naturais como a HP-β-CD foram desenvolvidos por meio da substituição dos átomos de hidrogênio das hidroxilas da superfície da β-CD por grupos 2-hidroxipropil (HP), reduzindo assim sua cristalinidade e resultando em uma melhor solubilidade aquosa e em perfis toxicológicos mais baixos (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). Essas características tornam a HP-β-CD uma das CDs modificadas mais utilizadas, especialmente no desenvolvimento de formulações para aplicação oral ou parenteral (ARIMA; MOTOYAMA; IRIE, 2011).

Figura 4: Estrutura molecular da β-CD (Grupo R = H) e HP-β-CD (Grupo R = C3H7OH).

2.4. Complexos de inclusão e dor inflamatória

Complexos de inclusão com diferentes tipos de fármacos têm sido estudados com finalidade de tratamento pra dor e inflamação. O efeito anti-inflamatório do valdecoxib livre e complexado em β-CD foi avaliado em ratos pelo método do edema de pata induzido por carragenina, e o complexo mostrou ter melhor atividade. Uma vez que existe uma relação direta entre taxa de absorção e efeito farmacológico, os dados in vivo pressuporam que complexos com CDs podem ser considerados para desenvolver formulações de dissolução rápida de valdecoxib para o alívio da dor (RAJENDRAKUMAR; MADHUSUDAN; PRALHAD, 2005). Foi demonstrado que a complexação do óleo essencial de Lippia grata com β-CD melhora as propriedades antinociceptivas e anti-inflamatórias do óleo essencial

quando administrado por via oral nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg em camundongos (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2013).

Um estudo pré-clínico foi realizado com ratos tratados com 10 mg/kg/v.o de um analgésico derivado da tioureia, livre e complexado com HP-β-CD, para avaliação dos parâmetros farmacocinéticos. As amostras sanguíneas foram coletadas e analisadas em HPLC para quantificação da concentração do fármaco no plasma, e como esperado, a complexação com HP-β-CD aumentou em cerca três vezes a biodisponibilidade do fármaco, possibilitando um aumento do efeito analgésico em comparação com a tioureia livre (KIM et al., 2003). O tomoxiprole, um derivado imidazólico de AINEs, clinicamente utilizado para o tratamento da dor, inflamação e artrite, foi complexado com HP-β-CD e administrado por via oral (5 mg/kg) em ratos. Foi demonstrado que a concentração de tomoxiprole atingiu seu máximo em 90 min, enquanto que o tomoxiprole complexado com HP-β-CD levou apenas 40 minutos para atingir a concentração máxima, que em mg/L foi de 0,22 e 0,36 respectivamente, mostrando assim que o complexo melhorou consideravelmente a biodisponibilidade do fármaco (MILANESE et al., 2013).

Estudos demonstram que algumas atividades farmacológicas de produtos naturais são mais expressivas quando o composto em estudo está complexado com CDs. Foi demonstrado que diferentes terpenos quando complexados com β-CD ou HP-β-CD, apresentam um aumento da solubilidade em água e da biodisponibilidade, resultando em melhor efeito farmacológico (LIMA et al., 2016). O monoterpeno β-cariofileno livre apresentou um menor efeito anti-hiperalgésico comparado com o complexo β-cariofileno/β-CD, na mesma dose. Mas é importante ressaltar que a dose do princípio ativo no complexo é cerca de 10 vezes menor que a do ativo livre (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2016; SIQUEIRA-LIMA et al., 2014). O monoterpeno carvacrol complexado em β-CD demonstrou excelentes propriedades anti-inflamatórias e antinociceptivas em diferentes modelos experimentais de inflamação, investigados pela primeira vez em lesão de músculo esquelético (SOUZA et al., 2018). Yang e colaboradores (2009) descobriram que a biodisponibilidade aparente do sesquiterpeno arteméter após complexação com HP-β-CD foi encontrada em 181% quando comparada com uma suspensão de arteméter, indicando que o complexo apresentou uma extensão muito maior de biodisponibilidade.

2.5. Métodos de obtenção e caracterização de complexos de inclusão

Devido às características particulares inerentes a cada sistema binário fármaco/CD, não existe uma técnica geral de preparação. As condições devem ser definidas para cada

molécula hóspede. A maioria dos métodos de preparação de complexos sólidos inclui diferentes graus de solubilização como etapa intermediaria do processo de obtenção. A presença da água solubiliza os componentes e favorece a interação hidrofóbica entre a molécula hóspede e a CD. Dentre os métodos mais comumente utilizados na obtenção de complexos sólidos, avaliando os diferentes aspectos envolvidos, podemos citar a mistura física, malaxagem, atomização, liofilização, fluidização supercrítica, precipitação e co-evaporação (CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007; MENEZES et al., 2014).

O método da mistura física baseia-se na simples mistura dos componentes sem adição de água. É um método de complexação pouco eficiente (HEDGES, 1998). A malaxagem consiste na formação de uma pasta a partir da adição da mínima quantidade de líquido (água ou misturas etanoaquosas) suficiente para umedecer a mistura em pó de fármaco e CD. Em escala laboratorial, é realizada em um almofariz com auxílio de um pistilo (FERNANDES; VEIGA, 2002; CIRRI et al., 2005; CUNHA-FILHO et al., 2007). Devido à praticidade, ao elevado rendimento e à facilidade de transposição de escala, este método é um dos mais utilizados na indústria farmacêutica, ainda que sua eficiência de complexação seja inferior a de outras técnicas (CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007).

A atomização representa um dos métodos mais empregados para produzir complexos de inclusão a partir de uma solução. A mistura parcial do sistema e a rápida eliminação de água propiciam uma eficiência de complexação elevada. Além disso, esta técnica permite controlar o tamanho de partículas obtido em intervalos bastante estreitos, fundamental, por exemplo, para obtenção de pós de administração pulmonar. O baixo rendimento e o estresse térmico são algumas das limitações desta técnica (VOZONE; MARQUES, 2003; FERNANDES; VEIGA, 2002; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007). O método da liofilização consiste na eliminação de solvente dos sistemas em solução, através de um prévio congelamento e posterior secagem a pressões reduzidas. Esta técnica permite a obtenção de complexos de inclusão com elevado rendimento e um baixo estresse térmico. Geralmente se obtêm pós secos, amorfos e com elevado grau de interação fármaco/CD (CAO et al., 2005; VENTURA et al., 2005; RODRIGUEZ-PEREZ et al., 2006; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007).

A fluidização supercrítica constitui um dos métodos mais inovadores de obtenção de complexos em estado sólido. A utilização do CO2 em estado supercrítico confere aos

materiais obtidos características únicas quanto à interação (PALAKODATY; YORK, 1999). Apesar de todas as qualidades do método, ainda é uma técnica que apresenta um custo inicial

bastante elevado (CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007). A técnica da co-precipitação parte de uma solução de fármaco e CD em condições muito próximas a saturação e através de mudanças bruscas de temperatura ou adição de solventes orgânicos, se obtém a precipitação do material em forma de complexo de inclusão. Os cristais obtidos são coletados por centrifugação ou filtração (MIRO et al., 2000; CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007). No método da co-evaporação é preparada uma suspensão do fármaco com a CD em determinada quantidade de água, e após agitação por tempo determinado, a amostra é transferida para um dessecador onde é feita a secagem do solvente (MENEZES et al., 2014).

Algumas das principais técnicas analíticas utilizadas para a caracterização de sistemas sólidos Fármaco/CD incluem: Calorimetria exploratória diferencial (DSC), Termogravimetria (TG) e Microscopia de estágio quente (HSM), como análises térmicas; Difração de raios-X (DRX); Espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) e Espectroscopia Raman, como técnicas espectroscópicas; e Microscopia eletrônica de varredura (MEV) (MURA, 2015).

As análises térmicas são amplamente utilizadas na caracterização das CDs e dos seus complexos, principalmente pela rapidez das análises. Dentre os mais utilizados, tem-se o DSC. A formação de complexos de inclusão pode ser identificada nos perfis das curvas DSC, pela redução, desaparecimento ou deslocamento de picos endotérmicos ou exotérmicos e pelas variações relevantes na entalpia do fármaco puro ou complexado (LYRA, 2010). A análise de TG para complexos de inclusão com CDs são frequentemente utilizadas em combinação com análises de DSC, para dar suporte e ajudar na interpretação dos resultados. O TG permite determinar mudanças no peso da amostra em relação à mudança de temperatura. A comparação das curvas TG de componentes puros, mistura física e complexo de inclusão devem evidenciar alterações no perfil de perda de massa do suposto complexo, sendo indicativo de interações entre os componentes e/ou formação de um verdadeiro complexo de inclusão. A HSM é frequentemente utilizada como técnica térmica complementar à análise de DSC, para corroborar os resultados e/ou ajudar a explicar a natureza dos efeitos térmicos observados nas curvas DSC (MURA, 2015).

A difração de raios-X (DRX) pode ser realizada em amostras finamente moídas e homogeneizadas, sendo então amplamente utilizada para identificar rapidamente substâncias cristalinas desconhecidas, bem como para determinar o grau de cristalinidade ou amorfização das amostras examinadas. A técnica DRX tem a vantagem de não exigir qualquer pré-tratamento da amostra e que, ao contrário dos métodos térmicos de análise, a amostra não

sofre qualquer alteração físico-química durante a gravação do espectro e pode ser reutilizada para outras análises. A análise DRX tem sido amplamente utilizada na caracterização de CDs e seus complexos de inclusão em pó ou estados microcristalinos, principalmente no decorrer das últimas três décadas (MURA, 2015). Diferenças nas amostras, como surgimento ou desaparecimento de picos ou mudanças nas intensidades relativas, constituem indícios de formação de complexos (CUNHA-FILHO; SÁ-BARRETO, 2007).

O FT-IR é amplamente utilizado no estudo de complexos sólidos. Esta técnica de espectroscopia é útil para identificar os modos vibratórios do fármaco e da CD que são alterados durante o processo de inclusão, sugerindo interação entre estas moléculas (MURA, 2015). Os fenômenos envolvidos na complexação produzem desvios e mudanças de intensidade das bandas correspondentes aos grupos químicos do fármaco ou da CD (LYRA, 2010). Em comparação com a espectroscopia FT-IR, a espectroscopia Raman apresenta algumas vantagens importantes, decorrentes do fato de que o efeito Raman se manifesta na luz dispersa de uma amostra em oposição à luz absorvida por uma amostra. Consequentemente, a espectroscopia Raman necessita de pouca ou nenhuma preparação de amostra e é insensível às bandas de absorção de água (MURA, 2015).

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) permite uma investigação aprofundada dos aspectos morfológicos das matérias-primas e de suas correspondentes misturas físicas e complexos de inclusão obtidos por diferentes métodos de preparação. Embora esta técnica seja inadequada para avaliar a verdadeira formação do complexo de inclusão, ela ajuda a evidenciar alterações morfológicas que podem estar relacionadas com as interações entre os componentes, indicando assim uma possível complexação (MURA, 2015).

3. OBJETIVOS 3.1. Geral

Preparar e caracterizar complexos de inclusão de citral (CIT) em β-ciclodextrina (β-CD) e hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-(β-CD), bem como avaliar o efeito citotóxico, anti-hiperalgésico e anti-inflamatório dos complexos obtidos e do CIT livre em modelos in vitro e

in vivo.

3.2. Específicos

- Preparar complexos de inclusão do CIT em β-CD e HP-β-CD pelos métodos da mistura física e liofilização;

- Caracterizar o CIT, β-CD, HP-β-CD e os complexos de inclusão por parâmetros físicos e químicos;

- Caracterizar morfologicamente a β-CD, HP-β-CD e os complexos de inclusão;

- Realizar análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificar o CIT nas amostras;

- Avaliar a eficiência de complexação do CIT em β-CD e HP-β-CD por CLAE; - Avaliar a citotoxicidade in vitro do CIT e seus complexos de inclusão;

- Avaliar a atividade motora in vivo do CIT e seus complexos de inclusão;

- Avaliar o efeito anti-hiperalgésico in vivo do CIT e seus complexos de inclusão; - Avaliar o efeito anti-inflamatório in vivo do CIT e seus complexos de inclusão.

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CAPÍTULO II

Anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects of citral with

β-cyclodextrin and hydroxypropyl-β-β-cyclodextrin inclusion

complexes in animal models

Artigo submetido ao periódico Biomedicine and Pharmacotherapy (Fator de Impacto: 3.457; Qualis A2)

Anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects of citral with

β-cyclodextrin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion

complexes in animal models

Caio A. Camposa, Bruno S. Limaa, Gabriela G.G. Trindadea, Eloísa P.B.S.S. Souzaa, Débora S.A. Motab, Luana Heimfarthb, Jullyana S.S. Quintansb, Lucindo J. Quintans-Júniorb, Eliana M. Sussuchic, Victor H.V. Sarmentod, Flávio M.S. Carvalhoe, Ricardo N. Marretof, Roseane M.R. Costag_{, Rogéria S. Nunes}a_{, Adriano A.S. Araújo}a,*

a_{Department of Pharmacy, Federal University of Sergipe, São Cristovao, SE, Brazil,} b_{Department of}

Physiology, Federal University of Sergipe, São Cristovao, SE, Brazil, c_{Department of Chemistry,}

Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE, Brazil, d_{Departament of Chemistry, Federal}

University of Sergipe, Itabaiana, SE, Brazil, e_{Department of Mineralogy and Geotectonics, University}

of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil, f_{Faculty of Pharmacy, Federal University of Goiás, Goiânia, GO,}

Brazil g_{Faculty of Pharmacy, Federal University of Pará, Belém, PA, Brazil}

*Corresponding author: Adriano A.S. Araújo (left.ufs@hotmail.com)

ABSTRACT

Citral (CIT) is a monoterpene formed by the geranial and neral stereoisomers. CIT is considered the major compound of Cymbopogon citratus essential oil, known as “capim-limão”, and has demonstrated potential antihyperalgesic, nociceptive and anti-inflammatory effects. However, CIT shows high volatility, low solubility in water and consequent low bioavailability, which limits its use. Therefore, the aim of this study was to prepare, characterize, evaluate cell viability, anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects of inclusion complexes of CIT on β-cyclodextrin (β-CD) and hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD). Initially, physical mixture (PM) and freeze-dried inclusion (FD) complexes of CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD were obtained in the molar ratio (1:1). The samples were characterized by DSC, TG/DTG, FTIR, XRD, SEM and the complexation efficiency were performed by HPLC. Cell viability assay was performed by rezasurin reduction technique in J774 macrophages cell line. The motor activity through rota rod apparatus, mechanical hyperalgesia and pleurisy induced by carrageenan were evaluated in mice. The complexation of CIT was evidenced with β-CD and HP-β-CD by the characterization techniques analyzed. The complexation efficiency of CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD were 78.6% and 71.7%, respectively. The CIT, CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD showed cell viability in macrophages and did not interfere in the motor activity of mice. Besides that, the samples demonstrated antihyperalgesic and anti-inflammatory activity due to reduction in total leukocytes and TNF-α levels. However, CIT/β-CD has better pharmacological effects among the three samples evaluated. Therefore, CIT/β-CD has potential for the development of products to treatment of inflammatory and painful reactions.

1. Introduction

Pain is one of the four cardinal signs of inflammation defined by Celsus during the 1st century AD. Pain mediation occurs through nociceptors, which are specialized subsets of sensory neurons that densely innervate peripheral tissues such as the skin, joints, respiratory tracts, and gastrointestinal tract. Nociceptors can respond to mechanical, chemical or thermal stimuli [1,2]. Acute inflammatory pain, one of the types of painful conditions, is characterized by hypernociception caused by sensitization of primary nociceptors, also called hyperalgesia or allodynia [3,4].

A significant part of the world's population is affected by some type of pain, causing loss of quality of life [5,6]. The treatments for painful conditions, such as inflammatory pain, are often unsatisfactory, since their etiology is heterogeneous and the pathophysiological mechanisms are complex [7,8]. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are usually prescribed for this type of condition, however, these usually have relevant side effects and low efficacy in most cases [9,10]. Therefore, new therapeutic alternatives for the treatment of inflammatory pain have been investigated. In this context, molecules derived from natural products have promising effects and offer the possibility of developing new drugs with greater efficacy and performance in inflammatory pain [11,12].

Citral (CIT) is a monoterpene formed by the neral (cis-citral) and geranial (trans-citral) stereoisomers, considered the major compound of the essential oil of the plant Cymbopogon citratus, popularly known as lemongrass [13]. CIT demonstrated anti-inflammatory effect through the inhibition of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nuclear factor kappa b (NF-ĸB) [14] and inhibition of the release of proinflammatory interleukins IL-1β and IL- 6 [15]. The CIT presented synergistic anti-inflammatory effect with naproxen [16], antinociceptive and anti-inflammatory effect when administered intraperitoneally in rodents [7], reduction of acute nociceptive stimulus without causing motor dysfunction, reduction of mechanical hyperalgesia, and a significant gastroprotective action against ulcers induced by non-steroidal anti-inflammatory drugs [17]. In addition, CIT has been reported as a partial agonist of potential transient receptors type 1 (TRPV1), which reinforces its analgesic and anti-inflammatory potential [18]. However, its practical use is limited due to its low solubility in water, because it is a hydrophobic compound, and due to its low stability to environmental agents such as oxygen and elevated temperatures, being highly volatile [19].

Cyclodextrins (CDs) have been widely used to make natural products, such as terpenes and essential oils, more bioavailable for pharmacological application, thus enhancing analgesic and anti-inflammatory profiles [20]. CD are cyclic oligosaccharides in the form of truncated cones, composed of α-D-glucopyranose monomers linked by α-1,4 bonds, the natural CDs being classified as α-CD, β-CD or γ-CD, having six, seven or eight monomers, respectively. They have a hydrophobic central cavity and a hydrophilic surface and can incorporate a variety of molecules to form host-host complexes [21,22], resulting in increased water solubility, stability and bioavailability of the molecule guest [23, 24]. Among natural CDs, β-cyclodextrin (β-CD) is the most used for drug complexation, however, its use is restricted by its low aqueous solubility [25].

Some chemical modifications have been made on natural CDs to overcome the limiting extent of solubility, optimize their capacity in specific applications, or to provide them with

new features. The replacement of the hydrogen atoms of the β-CD hydroxyl groups by 2-hydroxypropyl groups, resulting in 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD), represents perhaps the most widely used chemical modification. Compared with natural ones, the main characteristic of this modified CD is its greater aqueous solubility. As for pharmaceutical applications, its advantages are increased solubility, dissolution rate, and bioavailability of the drug [26].

In the perspective of retaining the therapeutic potential and improving the solubility and stability properties of CIT, the inclusion of it in CDs is promising. Therefore, the aim of this study was to prepare, characterize and evaluate cell viability in vitro and the anti-hyperalgesic and anti-inflammatory activities in vivo of CIT inclusion complexes with β-CD and HP-β-CD. 2. Material and methods

2.1. Material

CIT (purity ≥ 95%), carrageenan, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and tween 80 was purchased from Sigma Aldrich (USA). β-CD and HP-β-CD (purity ≥ 95%) were purchased from Wacker Chemie AG. Triton X-100, Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), Resazurin sodium salt were purchased from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO (USA) and fetal bovine serum (FBS) was obtained from Gibco BRL (USA).

2.2. Preparation of samples

The samples were prepared based on CIT’s molecular weight (152.23 g.mol-1) and β-CD’s (1134.98 gmol-1_{) and HP-β-CD (1375.37 gmol-1) molecular weight, with a molar ratio}

of 1:1 (CIT/β-CD or HP-β-CD) by methods of physical mixture (PM) and freeze drying (FD). The PM sample was prepared by addition CIT to an agate mortar containing β-CD or HP-β-CD powder under manual stirring, which were then stored in sealed glass containers [27]. The FD sample was prepared by addition of CIT and β-CD or HP-β-CD to 20 mL of distilled water, this solution was submitted to agitation by a magnetic stirring device operating at 400 rpm (Quimis Q 261A21, Brazil) at room temperature for 36 h, then was frozen at -20 °C for 24 h and freeze-dried. After, was stored in airtight glass containers. This method of preparation was adapted from Carvalho et al., 2017 [28].

2.3. Characterization of the complex 2.3.1. Thermal analysis

The DSC and TG/DTG curves were obtained in the temperature range of 25 to 500°C and 25 to 600°C, respectively, using Shimadzu DSC-60 and TGA-60 instruments, under dynamic nitrogen atmosphere (l00ml.min-1) and a heating rate of 10°C.min-1 utilizing aluminum (DSC) and platinum (TG/DTG) crucibles with approximately 2 mg of the sample. The instruments were previously calibrated and/or verified using the standard calcium oxalate for TG (purity 99.99%) and indium metal for DSC.

2.3.2. Karl Fischer titration

The moisture contents of CIT, β-CD, HP-β-CD and their PM and FD samples were determined through the Karl Fischer Titrino Plus KF 870 method (Metrohm).

2.3.3. Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR)

The infrared spectra of CIT, β-CD, HP-β-CD and their PM and FD samples were obtained in the range from 4000 to 400 cm-1 in KBr pellets using a Varian 640-IR Fourier Transform spectrophotometer at room temperature.

2.3.4. X-ray diffractometry (XRD)

The X-ray diffraction of β-CD, HP-β-CD and their PM and FD samples were obtained in Siemens model D5000 equipment, with CuKα tubes, in the range of 5 to 50 ° (2) and 1s at each step.

2.3.5. Scanning electron microscopy (SEM)

The morphology of samples of CIT, β-CD, HP-β-CD and their respectives PM and FD were analysed in a scanning electron microscope (JEOL JSM-6060, Tokyo, Japan) operating at 7kV. For this analysis, the samples were gold-sputtered.

2.4. Complexation efficiency (CE%)

The inclusion efficiency of CIT in the inclusion complexes were determined by the ultrasonic-centrifugal method [29]. The amount of CIT into inclusion complexes were analyzed by HPLC (Supplementary Information). The calibration curve of CIT concentration was y = 146175x + 1346.2 (R2 = 0.9992). All preparations and measurements were done in triplicate. The CE was calculated according to the equation:

where “mass of recovered” is the quantified amount of CIT in the solid inclusion complexes and “mass added” is the amount of CIT initially used to prepare the inclusion complexes.

2.5. Cell viability

To evaluate cell viability, the resazurin reduction technique (Alamar Blue Assay) was used. Cells of the J774 lineage were cultured in an oven at 37°C and 5% CO 2 in bottles containing Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with fetal bovine serum 10%. Cells were trypsinized and plated in 96-well plates transparent. After the adhesion period of 24 hrs, the following treatments were added: CIT and FD of CIT/β-CD and CIT/HP-β-CD at concentrations 10, 50, 100 μg/mL. Two hours before the end of the 72 hr incubation period, resazurin diluted in 0.15 mg/mL PBS was added to a final concentration 75 μg/mL in each well. Triton-X 100 (0.5%) was used as the negative control, and cells with DMEM 10% FBS were used as the positive control (PC). The resazurin reaction time was 2 h, and the estimated number of cells in each well on the day of reading was 2 x 105 cells.