Propriedade de membrana de neurônios do giro denteado em camundongos sem a enzima de reparo de DNA NEIL3

Texto

(1)Annara Yve Moura Soares. PROPRIEDADES DE MEMBRANA DE NEURÔNIOS DO GIRO DENTEADO EM CAMUNDONGOS SEM A ENZIMA DE REPARO DE DNA NEIL3. Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.. NATAL 2016.

(2) ANNARA YVE MOURA SOARES. PROPRIEDADES DE MEMBRANA DE NEURÔNIOS DO GIRO DENTEADO EM CAMUNDONGOS SEM A ENZIMA DE REPARO DE DNA NEIL3. Dissertação de Mestrado do Curso de. Pós-Graduação. Psicobiologia. da. em. Universidade. Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do Título de Mestre em Psicobiologia.. Orientador: Leão. Natal 2016. Richardson. Naves.

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(4) Título: Propriedades de membrana de neurônios do giro denteado em camundongos sem a enzima de reparo de DNA Neil3. Autor: Annara Yve Moura Soares. Data da defesa: 05/04/2016. Banca examinadora:. __________________________________________________ Prof. Richardson Naves Leão (Orientador) (Universidade Federal do Rio Grande do Norte). __________________________________________________ Prof. Olavo Amaral (Universidade Federal do Rio de Janeiro). __________________________________________________ Prof. Emilie Katarina Svahn Leão (Universidade Federal do Rio Grande do Norte).

(5) Resumo Esse estudo objetiva avaliar se a expressão da enzima de reparo de DNA Neil3 é importante para o desenvolvimento funcional dos neurônios. Estudos prévios têm demonstrado que Neil3 interfere tanto na neurogênese adulta como na fase embrionaria. Eu utilizei whole cell patch clamp para estudar propriedades sinápticas e de membrana das células granulares do giro denteado. O giro denteado é uma das regiões com maior expressão de Neil3 no cérebro e estudos prévios têm demonstrado que a neurogênese reativa em camundongos adultos é afetada pela ausência da enzima de reparo Neil3. Eu encontrei que a maioria das propriedades de membrana nas células granulares de camundongos knockout para Neil3 são normais, com exceção da resposta de membrana às correntes de hiperpolarização e pós-hiperpolarização. Diferentemente de neurônios imaturos, as células granulares do giro denteado de camundongos com ausência de Neil3, na qual as correntes de hiperpolarização ativadas são geralmente as ultimas a aparecerem durante o desenvolvimento. Além disso, correntes sinápticas excitatórias foram similar em amplitude, mas apresentaram um decaimento ligeiramente mais rápido em células de camundongos knockout de Neil3. Esses resultados podem indicar um balanço diferente entre os receptores AMPA e NMDA em camundongos knockout. Análises morfológicas de neurônios preenchidos com biotina e reconstrução post hoc não apresentaram grandes diferenças na morfologia dendrítica entre animais controle e knockout. Esse estudo mostra que, em relação a diferenças entre animais controle, neurônios do giro denteado de animais knockout de Neil3 não podem ser classificados como imaturos. Eu encontrei diferenças pontuais na corrente de hiperpolarização e pequenas diferenças em propriedades sinápticas. Ainda devem ser avaliadas se essas diferenças podem ser responsáveis por alterações 5.

(6) comportamentais encontradas em camundongos Neil3-knockout. Além disso, estudos. futuros. necessários. para. utilizando analisar. marcadores o. efeito. da. de. neurônios. eliminação. recém-nascidos da. enzima. Neil3. são no. desenvolvimento de neurônios. Palavras-chave: camundongo Neil3 knockout, reparo de DNA, patch clamp, propriedades neuronais, giro denteado.. 6.

(7) Abstract This study aims to assess whether the expression of the DNA repair enzyme Neil3 is important for the functional development of neurons. Previous studies have demonstrated that Neil3 interferes with both adult and embryonic neurogenesis. I have used whole cell patch clamp to study membrane and synaptic properties of granule cells of the dentate gyrus. The dentate gyrus is one of the regions with the highest expression of Neil3 in the brain, and previous studies have shown that reactive neurogenesis in adult mice is affected by Neil3 deletion. I found that most membrane properties of granule cells in Neil3-knockout mice are normal except from the membrane response to hyperpolarization currents and afterhyperpolarization currents. Different from immature neurons, granule cells of the dentate gyrus from Neil3-knockout mice, in which hyperpolarizing activated currents, are generally the last to appear during development. In addition, excitatory synaptic currents were similar in amplitude but showed a slightly faster decay in cells from Neil3-knockout mice. These results could indicate a different balance between AMPA and NMDA receptors in Neil3-knockout mice cells. Morphological analysis of neurons filled with biocytin and reconstructed post hoc showed no gross difference in dendritic morphology between dentate gyrus neurons of control and Neil3-knockout mice. This study shows that, while different from those of control littermates, dentate gyrus neurons of Neil3-knockout mice cannot be classified as ‘immature’. I found specific differences in hyperpolarizing activated currents and small differences in synaptic properties. Whether these differences may account for behavioral changes found in Neil3-knockout mice is yet to be assessed. In addition, future studies using markers of newly born neurons are necessary for analyzing the effect of Neil3 deletion in developing neurons. 7.

(8) Key words: Neil3-KO mice, DNA repair, patch clamp, neurons properties, dentate gyrus.. 8.

(9) Sumario. Lista de Figuras ....................................................................................................... 9 Introdução ............................................................................................................... 10 Objetivos ................................................................................................................. 16 Metodos ................................................................................................................... 17 Resultados ................................................................................................................ 20 Propriedades de membranda de neurônios do GD em camundongos Neil3-KO ................................................................................................................................... 20 Propriedades pré-sinápticas de neurônios do GD em camundongos Neil3-KO ................................................................................................................................... 21 Analises morfologias de neuronios do GD de camundongos Neil3-KO ................................................................................................................................... 22 Discussão ................................................................................................................. 29 Referencias .............................................................................................................. 32 Anexo ........................................................................................................... 39. 9.

(10) Lista de Figuras. Figura 1: A via BER .................................................................................................. 11 Figura 2: Organização de paralogos de NEIL em Homo sapiens (Hs).................... 12 Figura 3: Propriedades membrana a partir de aumento de corrente em neurônios de camundongos Neil3-KO............................................................................................ 24 Figura 4: propriedades da membrana de neurônios do DG de correntes em rampas em camundongos Neil3-KO...................................................................................... 26 Figura 5: Propriedades sinápticas de neurônios do DG de camundongos Neil3-KO no modo de Voltage-clamp........................................................................................ 27 Figura 6: A análise morfológica de neurônios DG de camundongos Neil3-KO........ 28. 10.

(11) Introdução. Nesta dissertação, pretendo investigar o efeito da remoção da DNA glycosilase Neil3 nos neurônios do giro denteado. Estudos anteriores têm ligado Neil3 à proliferação e diferenciação de células estaminais neurais (Regnell et ai, 2012, p 3;.. Reis e Hermanson, 2012a;. Sejersted et ai, 2011a, p. 3). A lógica deste estudo foi investigar se o giro denteado, um dos poucos nichos de neurogênese adulta no cérebro, é afectado pela supressão da enzima de reparo DNA glycosilase Neil3. O reparo de DNA é um sistema complexo que fornece defesa celular geral contra danos no DNA, defeitos genéticos, e envelhecimento. Danos ao DNA são uma consequência de agentes produzidos tanto por fontes exógenas como fontes intracelulares decorrentes do metabolismo normal da célula (Rolseth et al., 2008a). Os mecanismos de reparação de DNA diferem na forma como eles interagem com a sequencia danificada (Aravind et al., 1999). As DNA glicosilase são enzimas que iniciam o reparo de DNA por base-excisão, um mecanismo eficaz que contribui para a manutenção da estabilidade do genoma, pelo reconhecimento e, em seguida, remoção da base danificada (Prakash et ai., 2012). Por ser uma enzima do grupo das DNA glicosilase, foi mostrado que a enzima Neil3 atua principalmente por β-eliminação de lesões hidantoinas em DNA de cadeia dupla, com elevada afinidade por purinas e pirimidinas. e. também. produtos. de. oxidação. de. 8-oxoG. como. spiroiminodihydantoin (SP) e guanodinohydantoin (GH ) (Krokeide et al, 2013;.. Liu. et. al,. 2013).. 11.

(12) Reparação por excisão de base (BER) é a principal via para a reparação de dano por estresse oxidativo ao DNA. A via BER inclui o reconhecimento e eliminação de uma base danificada da cadeia do DNA, incisão de uma nova base, o preenchimento de lacunas, e vedação (Figura 1) (Robertson et al., 2009).. Figura 1. A via BER. A DNA glicosilase de inicia a via de reparo BER pelo reconhecimento de lesões de base. A excisão da base a partir da espinha dorsal do DNA e subsequente incisão de base é realizada por DNA glicosilase bifuncionais.. BER é iniciada por DNA glicosilase que reconhece um grande número de lesões de base. Até agora, 11 glicosilase de DNA de mamífero foram identificados. Várias DNA glicosilase apresentam larga sobreposição e espectros de substrato. Isto é particularmente verdade para as DNA glicosilase específicas para as bases de DNA oxidadas que inclui cinco enzimas em mamíferos; OGG1, NTH1, Neil1, Neil2 e Neil3 (Dizdaroglu, 2005). Neil1, Neil2 e Neil3 possuem homologia significativa de sequência (Figura 2) e redundância na remoção de uma ampla variedade de lesões oxidativas de bases de DNA (Hazra et al., 2002). Recentemente, o grupo Bjørås mostrou que Neil3 é induzida no inicio da fase S do ciclo celular sob o controle das Ras ERK MAP 12.

(13) quinase-dependente. Em contraste, a expressão total de Neil1 foi diminuida após a saida da fase de quiescência, ao passo que a expressão de Neil2 era independente do ciclo celular (Neurauter et al., 2012). Notavelmente, Neil3 mostrou um padrão de regulação semelhante à proteína de replicação FEN1, dando suporte a um papel funcional de Neil3 na replicação associado ao reparo. Assim, parece que as funções especializadas do Neils são asseguradas pelos seus padrões de expressão (Neurauter et al., 2012).. Figura 2. Organização de NEIL paralogos em Homo sapiens (Hs). Os ortologos Neil3 de Mus musculus (Mm), E. coli (Ec) Nei, Thermus thermophilus (Tt) MutM e a enzima humana APEX2 BER são mostrados em comparação. A. A., aminoácidos; H2TH, dupla hélice; NLS, sinal de localização nuclear; PCNA, antígeno nuclear de proliferação celular; TOP IIIα, topoisomerase IIIα. Os detalhes são discutidos no corpo do texto. A ilustração é adaptado de Torisu et al.. (Torisu. et. al.,. 2005).. Foi previamente mostrado que a zona subgranular (SGZ) e zona subventricular. 13.

(14) (SVZ) de roedores exibem um padrão de expressão distinto de Neil3, e que a expressão está confinada aos estágios embrionários e perinatal (Hildrestrand et ai, 2009a;. Rolseth et ai ., 2008b). Dados recentes gerados no laboratório Bjørås mostrou um declínio na neurogénese pós-isquemia hipóxica de camundongos Neil3-KO quando comparados com camundongos de tipo selvagem (Sejersted et al., 2011b). É importante notar que a proliferação celular (a primeira parte da neurogénese) é grandemente diminuída no giro dentado na esquizofrenia (Reif et al., 2006). Os números de células progenitoras neuronais e microglia no corpo estriado foram reduzidas e a reconstituição de tecido neuronal foi diminuída. Mais recentemente, o grupo Bjørås também relatou que os ratos Neil3-KO exibiram défices de aprendizagem e memória e redução do comportamento tipo ansiedade (Regnell et al., 2012). As células-tronco/progenitoras neurais de ratos Neil3-KO idosos mostrou capacidade proliferativa prejudicada e atividade reduzida de reparação do DNA. Além disso, os neurónios do hipocampo em ratos Neil3-KO exibiram irregularidades sinápticas. Afigura-se que a atividade de reparo Neil3dependentes de danos por estresse oxidativos no DNA em células progenitoras, é necessária para a manutenção da neurogénese adulta para contrariar a. deterioração. associada. idade. do. desempenho cognitivo.. Camundngos Neil1-KO não mostraram diferenças na função cognitiva, em comparação com camundongos de tipo selvagem. Inesperadamente, Neil2 mostra deficit aprendizagem e redução da ansiedade (dados não publicados), porém nenhuma mudança na acumulação de lesões oxidativas no cérebro, sugerindo um papel além do reparo pela via BER. Está se tornando, assim, cada vez mais evidente que a deficiencia no reparo de lesões oxidativas podem. 14.

(15) alterar a função normal de vários circuitos neuronais críticos para os procedimentos. cognitivos. e. mnemônicos.. Tem sido relatado que os danos oxidativos ao DNA podem contribuir para a modulação de estados epigenéticos (Grayson e Guidotti, 2013). Por um lado, a oxidação de guanina induzida por ROS em sequências de dinucleótido CpG interfere na capacidade do DNA funcionar como um substrato para a DNA metiltransferases (DNMTs), inibindo assim a metilação do DNA (Franco et ai, 2008;. Weitzman et ai, 1994. ). Além disso, a geração de lesões oxidativas do DNA em regiões reguladoras de genes próximas à regioes onde ocorrem reações de desmetilação de histona que recruta o reparo de danos por oxidação, resulta na ativação da transcrição de genes responsivos a estrogénio, provavelmente acompanhado por desmetilação de DNA da respectiva sequência promotora (Perillo et al., 2008) . Por outro lado, o dano oxidativo tem sido relatado como suporte para a metilação do DNA de promotores não metilados ricos em CpG num processo que envolve o acoplamento de cromatina silenciando atividades de metilação de DNA (O'Hagan et ai., 2011). O envolvimento de BER e epigenética também pode ser crucial na geração de psicose (Grayson e Guidotti, 2013). Um amplo estudo de metilação do epigenoma humano encontrou diferenças drasticas de metilação em vários genes em pacientes bipolares e com esquizofrenia, quando comparados. com. indivíduos. controle. (Moinho. et. al.,. 2008).. A hibridação in situ revelou expressão de Neil3 em populações específicas de células progenitoras em cérebro humano e de rato, tais como SVZ, o RMS, giro denteado e células de Purkinje do cerebelo, sugerindo um papel importante no cérebro em desenvolvimento (Rolseth et al., 2008a). Neil3 também tem sido. 15.

(16) relatado por possuir uma função importante na regulação e manutenção da diferenciação de células estaminais no qual a sua deficiência está implicada em uma diminuição significativa na expressão de genes de duplacortina (DCX), um marcador precoce de diferenciação neuronal (Reis e Hermanson, 2012b). No geral, sob condição de estresse induzido por hipóxia-isquemia, animais com deficiência de Neil3 desempenharam um papel importante na regeneração de celulas tronco neurais/células progenitoras (NSPCs) que apresentavam resposta a danos anormais, suportando a função da enzima Neil3 no reparo de lesões oxidativas de bases de DNA (Y. Sejersted et al., 2011). Neurogênese adulta no cérebro de mamíferos ocorre em basicamente duas localizações em condições normais, na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e zona subgranular (SGZ) de giro denteado do hipocampo, no qual neurônios recém-nascidos migram para o bulbo olfativo e camada de celulas granulares do denteado gyrus (DG), respectivamente, e, em seguida, integram-se no circuito de pré-existente (Zhao et al., 2008). Estudos têm demonstrado que existe um período crítico que os neurónios recém-nascidos são mais excitáveis do que aqueles que nasceram durante a embriogénese, sugerindo propriedades electrofisiológicas únicas durante as fases iniciais que são. funcionalmente. (Jessberger. importantes et. no. contexto. da ai.,. neurogénese. adulta 2009).. O DG é o primeiro elemento do circuito trisynaptic no hipocampo, que actua como um regulador de entrada de informações corticais que surge a partir do córtex entorrinal (EC) (Yu et al., 2013). A entrada EC/DG dá origem às fibras da via perforante (PP), que são constituídas principalmente por neurônios da segunda camada do EC. Essa via fornece informações sensoriais polimodais. 16.

(17) que ativa as células granulares do DG. As células granulares dão origem às fibras musgosas, que por sua vez é a inervação excitatória mais proeminente de CA3. Essa característica sugere que a entrada do EC é um fator chave para a formação natural da potenciação de longa duração (LTP) em CA1 (Stepan et al., 2012). A fim de neurônios recém-nascidos do DG integrarem em circuitos hipocampais, eles devem possuir características neuronais para interagir com neurônios maduros já estabelecidas. Nesta tese, eu investigo propriedades sinapticas e de disparo das células granulares do giro dentado de camundongos do tipo selvagem (Controle), Knockout homozigotos (Neil3-KO) e heterozigóticos (HET). Eu também analiso as características morfológicas de células granulares (análise Sholl) de camundongos Neil3-KO e Neil3-HET.. Objetivos. •. Avaliar se a taxa de disparo nas células granulares do DG é afetada pela. eliminação da enzima Neil3; •. Avaliar as propriedades sinápticas das células granulares do DG em. camundongos Neil3-KO; •. Avaliar as diferenças morfológicas entre as células granulares do DG de. camundongos controle e Neil3-KO;. 17.

(18) Métodos. Sujeitos. Foram utilizados camundongos adultos (2-6 meses de idade), de ambos os sexos, Neil3-knockout (com 57 / BL6 fundo). Os animais foram mantidos sob ciclo de claro/escuro de 12h (06:00-18:00), e mantidos a uma temperatura de 21 ° C + 2 ° C. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA-UFRN). Camundongos Neil3-KO foram obtidos a partir de nosso colaborador Prof. Magnar Bjoras, Hospital Universitário de Oslo. Camundongos Neil3-KO foram gerados no Hospital da Universidade de Oslo substituindo os domínios de ligação de DNA H2TH exons de 3-5, que alberga a sequência de codificação por uma resistência cassete-neomicina (Sejersted et al., 2011a). Os segmentos de DNA foram amplificadas por PCR, linearizado pela enzima NotI e electroporado em células 129/SvJ ES. Um clone positivo foi identificado por PCR e a célula ES contendo as sequencias foram injetados em blastocistos C57BL/6 (Yngve Sejersted et al., 2011a). Genotipagem de camundongos Neil3-KO foi realizado com. os. seguintes. iniciadores:. CTTGTTTTCCCACCACAATCTG, GCCTCTGTTCCACATACACTTCAT. Tipo. selvagem. Neil3-KO e. para WT/KO. para. frente: frente: reverso:. GTGGGCTGAAATTACACAAACAAT. A PCR convencional foi realizada numa máquina Termocicladora Vapo-protect da Eppendorf utilizando 2uL de DNA em 18ul de solução (2,5uL de 10x tampão (s / MgCl 2), 2,5uL de MgCl2 (50 mM), 0,5uL dNTPs (10 mM), 0,5uL Primer WT-FW, 0,5uL Primer KO, 1,0uL Primer WT-RV, 10,32uL H2O DNAse e RNAse livre, 0,18uL de Taq polimerase da 18.

(19) Sigma, em um programa de 35 ciclos de (94ºC - 2 min; 35x 94ºC - 10 seg, 62ºC - 20 seg, 72ºC - 30 seg; 72ºC - 5 min). Para avaliar os produtos de PCR (produto do tipo selvagem: 280 pb e Neil-3 produto KO: 160 bp) Os produtos foram sujeitos a eletroforese em gel de agarose 1% e 0,01% de gel de Ácido Nucleico vermelho Stain 10.000x em água (1 / 10.000 ) de Biotium.. Preparação de cortes. Fatias. horizontais. do. hipocampo. de. camundongos. Neil3-KO. homozigotos e heterozigotos (controle) foram obtidas após a decapitação rápida sob anestesia de cetamina (80 mg / kg). Em resumo, os cérebros de camundongos de 2-6 semanas de idade foram removidos depois de decapitação e colocados em fluido artificial cerebrospinal (ACSF) / solução de sacarose (em mM: KCl, 2,49; NaH2PO4, 1,43; NaHCO3, 26; glicose, 10 ; sacarose, 252; CaCl2, 1;. MgCl 2, 4) arrefecido com gelo (Leão et al, 2012). Fatias horizontais (300 um) foram recolhidos num vibratomo (VT1200, Leicaa) e transferidos para gravação a uma câmara cheia com ACSF (em mM: NaCl, 124; KCl, 3,5; NaH2PO4, 1,25; MgCl2, 1,5; CaCl2, 1,5; NaHCO3 , 30; glicose, 10), borbulhado constantemente com 95% de O2 e 5% de CO2 (BrancoMartins).. Eletrofisiologia, morfologia e analise de dados. Para as gravações de células com a técnica de patch clamp, as fatias foram transferidas para a base de um microscópio vertical (Zeiss). Pipetas de 19.

(20) vidro para o registo foram preenchidos com uma solução à base de Kgluconato (em mm: 17,5 KCl, 122,5 K-gluconato, 9 NaCl, MgCl2 1, 3 Mg-ATP, 0,3 GTP-Tris, 1 de Hepes, 0,2 EGTA; o pH foi ajustado para 7,2 utilizando KOH) suplementado com 1-2% biocitina (Sigma-Aldrich). Células granulares foram gravadas sob orientação visual usando um microscópio vertical equipado com diferencial de interferência óptica de contraste (Leão et al., 2009). Depois de obter a configuração de whole cell, a qual se caracteriza pelo acesso à célula por aderência da membrana plasmática às paredes da pipeta de vidro, foram realizadas gravações no modo voltage-clamp para obter correntes sinápticas excitatórias espontâneas (sEPSC) usando um amplificador Axopatch 200B. Sequencialmente, foram realizadas gravações em modo current-clamp para analisar propriedades de disparo de células granulares do DG. Para análise da morfologia dendrítica, as fatias foram transferidas a partir da câmara de registo para um contentor com 4% de paraformaldeído em PBS. As fatias foram fixadas por um período overnight ou mais. Após lavagem em PBS, durante 10 minutos, as fatias foram incubadas overnight em 0,1% de estreptavidina conjugada com o fluorocromo Alexa 488 (Life Sciences). As fatias foram então lavadas e montadas com Mowiol. Fotomicrografias de células granulares foram obtidas num microscópio confocal de varrimento a laser ou um microscópio convencional equipado com epifluorescência (Zeiss). Dendritos foram rastreados usando o ImageJ plug-in NeuronJ (Leão et al., 2012). Os arquivos NeuronJ foram deles importados para Matlab para análise Sholl automatizada usando o programa 'Bonfire' (Kützing et al., 2010).. 20.

(21) Resultados. Um total de 24 células do grupo controle 7 (Neil3-HET) e 5 camundongos Neil3-KO foram analisadas neste estudo. A média de idade dos camundongos foi 2,5 meses para ambos macho e fêmea e não houve diferença de idade entre os camundongos Neil3-KO e controle. As células com resistência de entrada abaixo de 50 MOhm ou resistência série superior a 20 MOhm não foram considerados na análise.. Membrane properties of Neil3-KO mice DG neurons. Primeiramente foram avaliados a resistência de entrada e potencial de repouso da membrana de neurônios do DG utilizando 400ms de duração com correntes que variaram de -100pA para 350pA em incrementos 50pA (Figura 3A). Os valores de resistência de entrada não diferiram significativamente entre o grupo controle e os camundongos Neil3-KO (409 ± 36,6 MOhm vs. 370 ± 31,8 MOhm, respectivamente, n = 24 células, Figura 3B). Potencial de repouso da membrana também não foi diferente entre controle e Neil3-KO (-73,3 ± 2,6 mV vs 73,6 ± 3,0 mV, respectivamente, n = 24, Figura 3C). O potencial de ação (AP) amplitude e meia largura (do primeiro AP provocada por etapas atuais) não diferiu entre as células do DG em Neil3-KO e controle (AP amplitude: 80,7 ± 4,8 mV vs. 79,8 ± 4,2 mV, e AP meia largura : 1,7 ± 0,19 ms vs. 1,3 ± 0,05 ms, para controle e Neil3-KO, respectivamente, n = 24, Figura 3D). No entanto, não. houve. diferenças significativas na amplitude. do potencial. após. 21.

(22) hiperpolarização (seguindo o primeiro AP): -17,1 ± 3,4 mV vs controle em -8,5 ± 1,3 mV em células Neil3-KO, p = 0,04, n = 24, Figura 3F ). Além disso, o SAG produzido por -100pA de adição de corrente hiperpolarizante era ligeiramente maior em células de camundongos Neill3-KO (-0,38 ± 0,61 mV no controlo vs 3,51 ± 0,54 mV em células Nei3-KO, p = 0,001, n = 24, Figura 3G). Tomados em conjunto, estes dados indicam que as células granulares do Neil3-KO podem ter expressão diferente das correntes de potássio ativas após a repolarização e na corrente de hiperpolarização activada.. Após isso foram. aplicadas correntes em rampa para avaliar a frequência AP e adaptação de amplitude em células granulares do DG em camundongos Neil3-KO (Figura 4). Para este estudo, foram calculados os coeficientes de correlação para a corrente injetada vs. frequência de pico instantânea e corrente injetada vs. amplitude do AP. A Figura 4 mostra exemplos de traços em Neil3-KO e controle. Eu não encontrei nenhuma diferença significativa em ambos os coeficientes entre camundongos Neil3-KO e controle. No entanto, células de camundongos Neil3-KO dispararam mais APs durante a injeção de corrente em rampa que células da mesma ninhada do grupo controle (6,8 ± 0,79 EPA para controlo vs. 11,1 ± 1,31 para os APs células Neil3-KO, p = 0,001, n = 24). Estes resultados indicam que as células de camundongos Neil3-KO pode disparar em frequências mais altas em resposta à adição de correntes.. Propriedades pré-sinápticas de neurônios DG em camundongos Neil3-KO. Posteriormente foram registrados eventos sinápticos espontâneos em modo de Voltage-clamp. É importante salientar aqui que APs espontâneos não. 22.

(23) foram eliminados nessas gravações (portanto, estes resultados referem-se correntes espontâneas excitatória pós-sinápticas sEPSCs - não deve ser confundida com a miniatura EPSC que exigem a eliminação de APs). sEPSCs foram detectados usando um método adaptado (Clements e Bekkers, 1997). No entanto, o método de modelo de deslizamento original foi simplificado pelo uso de coeficientes de Pearson partir de um modelo de deslizamento (Richardson Leão, não publicado). sEPSCs foram detectados a partir de 2 segmentos de dados de comprimento mínimo. Eu não encontrei diferenças na amplitude de sEPSC, a ativação constante de tempo ou de meia largura entre as células granulosas de controle e Neil3-KO (Figura 5B, C e E). No entanto, a constante de tempo de desativação foi mais rápida em camundongos Neil3-KO, quando comparado ao grupo controle (11,8 ± 0,84 ms no controle vs. 8,8 ± 0,29 ms em células Neil3-KO, n = 24, p = 0,003, Figura 5D). Estes dados indicam que os receptores pós-sinápticos (AMPA e / ou NMDA) podem diferir entre as células granulares Neil3-KO e do grupo controle, ou correntes pós-sinápticas podem 'acelerar' desativação.. Análise morfológica de neurônios DG de camundongos Neil3-KO. A fim de testar a hipótese de que a supressão da enzima Neil3 poderia interferir com o desenvolvimento da árvore dendrítica das células granulares, enchi células granulares de camundongos Neil3-KO com biocitina para reconstrução post hoc. Um total de 5 células do grupo controle e 3 células de camundongos Neil3 foram preenchidos com sucesso com biocitina para rastreio da arvore dendrítica (Figura 6A). A inspeção visual não mostrou. 23.

(24) nenhuma diferença notável entre a morfologia dendrítica de controle e células Neil3-KO. Além disso, uma análise simplificada de Sholl (número de pontos de ramificação e terminais, Figura 6B) corroborou a minha inspeção visual apoio uma falta de evidência de alterações macroscópicas em árvores dendríticas de células granulares em camundongos Neil3-KO. Estes resultados sugerem que as alterações em células granulares do DG em Neil3-KO são restritas, possivelmente, a expressão de alguns canais iónicos, mas não em termos de complexidade dendrítica.. 24.

(25) Figura 3: Propriedades membrana a partir de aumento de corrente em neurônios de camundongos Neil3-KO. A: Neurônios do DG em camundongos Neil-KO e controle usando 400ms de duração com acréscimos de que variam de -100pA para 350pA em aumentos de 50pA (apenas -100 e 100 pulsos PA são mostrados). B: 409 ± 36,6 MOhm vs. 370 ± 31.8 MOhm, 25.

(26) respectivamente, n = 24 células: resistência de entrada no controle (barra azul) e Neil3-KO (verde) Média. C: média de repouso potencial de membrana em animais do grupo controle e Neil3-KO: -73,3 ± 2,6 mV vs 73,6 ± 3,0 mV, respectivamente, n = 24. D: A média de potencial de ação (AP) amplitude em células Neil3-KO DG e controle: 80,7 ± 4,8 mV vs. 79,8 ± 4,2 mV. E: AP meia largura: 1,7 ± 0,19 ms vs. 1,3 ± 0,05 ms, para controle e Neil3-KO, respectivamente, n = 24. F: amplitude do potencial após hiperpolarização: -17,1 ± 3,4 mV vs controle em -8,5 ± 1,3 mV em células Neil3-KO, p = 0,04, n = 24.. 26.

(27) Figura 4: propriedades da membrana de neurônios do DG de correntes em rampas em camundongos Neil3-KO. Controle: esquerda: protocolo de injeção de corrente. Direita, potencial de membrana em resposta à corrente injetada. Parte inferior esquerda, a frequência instantânea de picos vs. corrente injetada. Canto inferior direito, gráfico de dispersão que mostra a correlação amplitude vs. pico de corrente injetada. Painéis de baixo, o mesmo que acima para camungondos Neil3-KO. 27.

(28) Figura 5: Propriedades sinápticas de neurônios do DG de camundongos Neil3-KO no modo de Voltage-clamp. A: Dois minutos de eventos sinápticos espontâneos de voltage-clamp referidos a correntes excitatórias espontâneas pós-sinápticas (sEPSCs). B: Amplitude de sEPSC em controle (azul) e Neil-KO (verde) sem diferença significativa. C: Tempo de ativação de sEPSC em controle (azul) e camundongos Neil-KO (verde) sem diferença significativa. D: Tempo de desativação de sEPSC no controle (azul) 11,8 ± 0,84 ms e Neil-KO 28.

(29) (verde) 8,8 ± 0,29 ms, n = 24, p = 0,003. E: Meia Largura de sEPSC no controle (azul) e Neil-KO (verde) sem diferença significativa.. Figura 6: A análise morfológica de neurônios DG de camundongos Neil3-KO. A: células granulares do grupo controle a esquerda e a direita células granulares em Neil3-KO, ambos cheios de biocitina. B: Esquerda: Relação entre o número de pontos de ramificação em camundongos Neil3-KO e controle com nenhuma diferença significativa; Direita: Número de pontos terminais do grupo controle e Neil3-KO, também não houve diferença significativa.. 29.

(30) Discussão. Neste estudo eu usei a técnica de patch clamp na configuração de célula inteira para avaliar se a enzima Neil3 é importante para determinar as propriedades neuronais. A enzima Neil3 é fortemente expressa em neurónios em desenvolvimento, principalmente em áreas progenitoras, tanto em neurogênese adulta como embrionária, sugerindo um papel importante no desenvolvimento de neurónios (Hildrestrand et al., 2009a). Em camundongos adultos, o giro dentado é uma das regiões com a mais alta expressão do Neil3 no cérebro e estudos anteriores demonstraram que a neurogênese reativa em camundongos adultos é afetada pela eliminação de Neil3 com atividade de reparo e capacidade proliferativa reduzida (Hildrestrand et al., 2009b;. Regnell et al, 2012). Descobri que a maioria das propriedades da membrana de células granulares em camundongos Neil3-knockout são normais, exceto a partir da resposta da membrana a correntes de hiperpolarização e correntes póshiperpolarização. Diferentemente de neurónios imaturos, as células granulares do giro dentado de camundongos Neil3-KO em que as correntes de hiperpolarização ativadas são geralmente o último a aparecer durante o desenvolvimento. Além disso, as correntes sinápticas excitatórias foram semelhantes em amplitude, mas mostraram deterioração ligeiramente mais rápida em células de camundongos Neil3-KO. Estes resultados poderiam indicar um equilíbrio diferente entre AMPA e receptores NMDA em células de camundongos com a supressão de Neil3. A análise morfológica de neurônios cheios de biocitina e reconstruídos em post hoc mostraram não haver diferença bruta na morfologia dendrítica entre os neurônios do giro denteado do grupo. 30.

(31) controle e Neil3-KO. Estudos anteriores demonstraram que os camundongos Neil3-KO apresentam deficiências na aprendizagem e na memória, na tarefa do labirinto aquático de Morris, semelhantes a ratos em que a neurogênese adulta foi interrompido, e também mostrou um comportamento de menor ansiedade no labirinto em zero elevado e teste de campo aberto quando em comparação com camundongos com a expressão normal de Neil3 (Imayoshi et ai, 2008;. Regnell et ai, 2012.). A avaliação de parâmetros fisiológicos dos potenciais de membrana fornecem indicadores de níveis de maturidade celular como resistência de entrada, que é uma medida de canais abertos de ions e é inversamente correlacionada com comprimento dendritico, e também com potencial de repouso da membrana indicando maturação celular (OverstreetWadiche e Westbrook, 2006). Eu descobri mudanças específicas em propriedades neuronais como potencial de pós hiperpolarização, mais potenciais de ação em aplicação de corrente em rampa e corrente de desativação em sEPSCs. A análise morfológica de células granulares de camundongos Neil3-KO mostram que as árvores dendriticas são complexas, semelhantes às células em camundongos controle. Estes resultados não levam à conclusão de presença de atraso no desenvolvimento em células granulares DG de camundongos com falta de enzima Neil3 (Ambrogini et al, 2004;. Pedroni et al, 2014).. Células imaturas do DG mostram os potenciais de ação de sódio rudimentares com pouca corrente pós hiperpolarização (Pedroni et al., 2014). Células granulares imaturas também mostram pequenos corpos celulares com árvores dendríticas simples (Pedroni et al., 2014). Neil3. tem. sido relacionada como a principal DNA glicosilase que age no reparo de hidantoinas em fita simples de DNA em células progenitoras, sugerindo um. 31.

(32) papel importante na neurogênese e, consequentemente, na função do hipocampo, onde os défices na aprendizagem e memória e comportamento do tipo ansiedade reduzida foram relacionados em camundongos na falta de Neil3 (Y. Sejersted et al, 2011;.. Regnell et al, 2012; Rolseth et al, 2013.). Eu não encontrei alterações significativas em neurônios do DG de camundongos Neil3KO que poderiam indicar uma mudança importante na unção do giro denteado. A expressão de proteína de ligação aos microtúbulos duplacortina (DCX) tem sido proposta como um indicador da neurogênese adulto encontrada principalmente no giro dentado, ventrículo lateral e bulbo olfativo (Brown et al., 2003).. Recentemente,. um. camundongo. transportando. a. enzima. Cre. recombinase sob o promotor induzível do gene da DCX foi criado para estudar neurónios recém-nascidos (Cheng et al., 2011). Assim, estudos futuros que cruzam camundongos Neil3-KO com camundongos DCX-Cre podem servir para analisar se as integrações dos neurônios decorrentes da neurogênese adulta integram-se normalmente em circuitos adultos.. 32.

(33) Referências. Ambrogini, P., Lattanzi, D., Ciuffoli, S., Agostini, D., Bertini, L., Stocchi, V., Santi, S., Cuppini, R., 2004. Morpho-functional characterization of neuronal cells at different stages of maturation in granule cell layer of adult. rat. dentate. gyrus.. Brain. Res.. 1017,. 21–31.. doi:10.1016/j.brainres.2004.05.039 Aravind, L., Walker, D.R., Koonin, E.V., 1999. Conserved domains in DNA repair proteins and evolution of repair systems. Nucleic Acids Res. 27, 1223–1242. Brown, J.P., Couillard-Després, S., Cooper-Kuhn, C.M., Winkler, J., Aigner, L., Kuhn, H.G., 2003. Transient expression of doublecortin during adult neurogenesis. J. Comp. Neurol. 467, 1–10. doi:10.1002/cne.10874 Cheng, X., Li, Y., Huang, Y., Feng, X., Feng, G., Xiong, Z.-Q., 2011. Pulse labeling and long-term tracing of newborn neurons in the adult subgranular zone. Cell Res. 21, 338–349. doi:10.1038/cr.2010.141 Clements, J.D., Bekkers, J.M., 1997. Detection of spontaneous synaptic events with. an. optimally. scaled. template.. Biophys.. J.. 73,. 220–229.. doi:10.1016/S0006-3495(97)78062-7 Dizdaroglu, M., 2005. Base-excision repair of oxidative DNA damage by DNA glycosylases.. Mutat.. Res.. 591,. 45–59.. doi:10.1016/j.mrfmmm.2005.01.033 Franco, R., Schoneveld, O., Georgakilas, A.G., Panayiotidis, M.I., 2008. Oxidative stress, DNA methylation and carcinogenesis. Cancer Lett. 266, 6–11. doi:10.1016/j.canlet.2008.02.026. 33.

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(39) Anexos 39.

(40)