ERIKA THIENNE LOPES DA SILVA
DESENVOLVIMENTO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA EM
RATOS SUBMETIDOS À DIETA HIPERCALÓRICA E
HIPERLIPÍDICA NO PERÍODO PERINATAL: UM ESTUDO À
LUZ DA PLASTICIDADE FENOTÍPICA
RECIFE
ERIKA THIENNE LOPES DA SILVA
DESENVOLVIMENTO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA EM
RATOS SUBMETIDOS À DIETA HIPERCALÓRICA E
HIPERLIPÍDICA NO PERÍODO PERINATAL: UM ESTUDO A
LUZ DA PLASTICIDADE FENOTÍPICA
Recife
2014
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Nutrição do
Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco,
para obtenção do título de Mestre em
Nutrição
Orientação: Profº Drº Raul Manhães
de Castro
Co-orientação: Profª Drª Jairza Maria
Barreto Medeiros
ERIKA THIENNE LOPES DA SILVA
DESENVOLVIMENTO DA ATIVIDADE LOCOMOTORA EM RATOS
SUBMETIDOS À DIETA HIPERCALÓRICA E HIPERLIPÍDICA NO
PERÍODO PERINATAL: UM ESTUDO À LUZ DA PLASTICIDADE
FENOTÍPICA
Tese aprovada em: 24 de fevereiro de 2014.
BANCA EXAMINADORA
Raquel da Silva Aragão (Doutora em Nutrição)
Núcleo de Educação Física e Ciências do Esporte, CAV-UFPE
Ana Elisa Toscano Meneses da Silva Castro (Doutora em Nutrição)
Núcleo de Anatomia, CAV - UFPE
Lígia Cristina Monteiro Galindo Novaes (Doutora em Nutrição)
Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Anatomia UFPE
Recife
2014
Dedico esta dissertação a meus pais,
irmãos e noivo. Vocês são inspirações
para a minha realização de grandes e
AGRADECIMENTOS
A Deus que me deu força, coragem e proteção.
Aos meus pais Sebastiana e José Ednilson pelo exemplo de conduta e imenso esforço que fizeram para colocar-nos no caminho do conhecimento. É a quem, neste momento, em particular, não meço esforços para agradecer todo o apoio, incentivo e paciência.
Aos meus irmãos Erick e Eberth exemplo de força e perseverança, sei que Deus está na frente de todas as dificuldades. Obrigada pela compreensão, amizade e apoio durante o tempo que me dediquei a essa dissertação.
Ao meu noivo Davi pelo amor, suporte, apoio em meus momentos de ausência e estímulo em todo o processo da Pós-graduação.
A Thaysa pela colaboração e incansável disponibilidade em ajudar sempre. A Débora e Amanda pela colaboração nos experimentos.
Aos colegas da pós-graduação pelo companheirismo, apoio nessa etapa final e incentivo. Foram bons momentos, em especial com Bruna Merten, Marília Tokiko, Nathália, Danielle Wanderley, Renata Beserra e Vilma que com certeza ficarão marcados.
A França pela colaboração, ensinamentos com os experimentos e vida, além da amizade verdadeira. Obrigada por todo tempo dispensado, incentivo e por não permitir que nada me vencesse.
A Ana Elisa Toscano, cujas observações na qualificação acrescentaram melhorias a este estudo.
Ao Profº Sebastião Rogério pela sua sempre disponibilidade em ajudar e pelo despertar no interesse da pesquisa.
A Drº Fabio Moura que com seu eterno bom humor fez valiosas observações da minha vida acadêmica para minha vida profissional e pelas despretensiosas e produtivas discussões informais.
A Drª Luciene e Drº Gutemberg pela amizade, apoio demonstrado e estímulo nessa nova convivência.
A Kátia pelas risadas e amizade nos momentos difíceis. A Luciana pelo apoio, amizade e confiança demonstrada.
A todos os amigos e familiares pela compreensão das ausências em eventos e verdadeiro sentimento de amizade.
A Profº Jairza por oportunizar parte do trabalho e pelas orientações. Ao CNPq pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio.
Por fim, ao estimado e incentivador Profº Raul Manhães de Castro pela competência e excelência no ensino. Com certeza sua liderança me servirá de guia. Muito obrigada por ter me aceito e por ser mais uma honrada em poder oportunizar esse aprendizado.
RESUMO
Modelos experimentais buscam compreender as consequências da falta de uma alimentação saudável no desenvolvimento do organismo. Assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da exposição materna de uma dieta hipercalórica-hiperlipídica (DH) sobre o desenvolvimento da atividade locomotora na prole de ratas Wistar. As ratas foram acasaladas e distribuídas em dois grupos: dieta controle normocalórica-normolipídica (DC) (n=4) e DH (n=6). Após o desmame, os conceptos receberam DC. Semanalmente, foram verificados o peso corporal, consumo da ração, macronutrientes e caloria total ingerida pelas gestantes. Os parâmetros antropométricos (Índice de massa corpórea (IMC), circunferência abdominal (CA), circunferência torácica (CT), relação CA/CT (RAT)) dos descendentes da DH e DC foram medidos no 8º, 14º, 17º, 21º, 30º e 60º dias pós-natal (PN). O peso corporal foi avaliado ao nascer e nos dias da avaliação da atividade locomotora. Foi utilizado o teste de campo aberto através de imagens digitais capturadas por câmera com luz infravermelha para verificar os efeitos da dieta materna sobre a atividade locomotora. Os animais ficaram no ciclo claro-escuro invertidos e foram avaliados no 8º, 14º, 17º, 21º, 30º, 60º, 90º e 150º dias de vida no início do ciclo escuro. Para o desenvolvimento da atividade locomotora foram avaliados a distância real, além de velocidade média, potência, tempo imóvel, número de paradas, tempo imóvel por número de paradas e período de permanência nas áreas (central, intermediária e periférica). O gasto energético (GE) também foi mensurado. O estudo não identificou atraso da atividade locomotora (p>0,05) em animais com DH, porém sugere uma possível programação desses animais ao sedentarismo. Além disso, nossos resultados sugerem menor risco de doenças metabólicas mesmo com animais de DH com menor GE. Conclui-se, então, que são necessários mais estudos que utilizem ácidos graxos polinsaturados como prevenção às doenças metabólicas e como fator protetor ao desenvolvimento da atividade locomotora.
Palavras-chave: Desenvolvimento fetal. Dieta hiperlipídica. Atividade motora. Estilo de vida sedentário. Ratos.
ABSTRACT
Experimental models seek to understand the consequences of the lack of a healthy diet in the development of the organism. Thus, this study aims to evaluate the effects of maternal exposure to a high calorie, high fat diet (HFD) on the development of locomotor activity in the offspring of female Wistar rats. The rats were mated and divided into two groups: control diet normocaloric-normolipidic (CD) (n = 24) and HFD (n = 37). After weaning, the fetuses received CD. Weekly, were analyzed the body weight, feed intake, macronutrients and total calories ingested by rats pregnant. Anthropometric parameters (BMI, waist circumference (WC), thoracic circumference (TC), CA / CT (RAT) ratio) of the descendants of HFD and CD were assessed at postnatal (PN) 8th, 14th, 17th, 21th, 30th and 60th days. Body weight was measured at birth and in the days of the assessment of locomotor activity. To check the effects of diet on locomotor activity were used the test of open countryside through digital images captured by infrared light. The animals were kept in light-dark cycle reversed and were evaluated at 8th, 14th, 17th, 21th, 30th, 60th, 90th and 150th days at the beginning of the dark cycle. For the assessment of locomotor activity was assessed real, rotational and total distance, and average speed, power, motionless time, number of stops, motionless time by number of stops and the time of fixed period in the areas (central, intermediate and peripheral). Energy expenditure (EE) was also measured. The study did not identify delay of locomotor activity (p> 0.05) in animals with DH, but suggests a possible programming of these animals to sedentarism. Furthermore, our results suggest a lower risk of metabolic diseases even with animals with lower GE. Then it is concluded that more studies using polyunsaturated fatty acids for prevention of metabolic diseases and as protective factor for the development of locomotor activity are needed.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURAS
Figura 1 Representação esquemática dos grupos experimentais --- 24
Figura 2 Manipulação nutricional de dietas experimentais --- 24
Figura 3 Dieta hiperlipídica e hipercalórica --- 26
Figura 4 Dieta Nuvilab --- 26
Figura 5 Aparelho de campo aberto --- 28
Figura 6 Representação esquemática do hardware de monitoramento da atividade locomotora --- 30
Figura 7 Modelo esquemático de avaliação do desenvolvimento da atividade locomotora e de parâmetros antropométricos da prole do GC e GH --- 30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Análise centesimal da dieta hipercalórica-hiperlipídica e Nuvilab --- 25
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGPi Ácidos graxos polinsaturado
AGS Ácidos graxos saturados
CA Circunferência abdominal
CEEA Comitê de Ética em experimentação Animal
cm Centímetro
CPG Gerador padrão central
CT Circunferência torácica
DCNT Doenças crônicas não transmissíveis
DC Dieta controle normocalórica-normolipídica
DH Dieta hipercalórica-hiperlipídica
EVA Acetato de vinil etila
GE Gasto energético
IMC Índice de Massa Corpórea
LEAAL Laboratório de Experimentação e Análise de Alimentos Nonete
Barbosa
m massa
mW Miliwatt
PN Pós-natal
RAT Relação circunferência abdominal sobre circunferência torácica
s Segundo
TACO Tabela de Composição dos Alimentos
UFBA Universidade Federal da Bahia
UFPB Universidade Federal da Paraíba
SUMÁRIO
1 APRESENTAÇÃO--- 13
2 REVISÃO DA LITERATURA --- 16
3 MÉTODOS--- 23
4 RESULTADOS (ARTIGO ORIGINAL)--- 33
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS--- 65
13
14
APRESENTAÇÃO_____________________________________________________
As habilidades funcionais, como o controle motor são o elemento básico de interação entre o homem e o ambiente relacionado à sobrevivência, capaz de tornar o indivíduo independente ou autônomo. O aprendizado motor é um processo contínuo, mas com alterações acentuadas nos primeiros anos de vida no humano. No entanto, ao enfatizar o controle do movimento, de fato é necessário considerar a evolução do sistema nervoso nas espécies. Isto acontece porque todo aprendizado motor envolve processos neurais básicos e específicos que ocorrem desde a detecção do estímulo até a efetivação de uma resposta.
Estabelece-se dessa forma, a necessidade de um sistema nervoso desenvolvido, cujo período crítico é representado por uma única janela de desenvolvimento, situação que não pode ser revertida e nem repetida posteriormente. No rato, esse período corresponde ao pré-natal, se referindo à formação de novos neurônios (neurogênese) e pós-natal no qual ocorrem fenômenos como a formação das células da glia (gliogênese), além da migração e diferenciação com mielinização e sinaptogênese. O desenvolvimento do sistema nervoso permite, portanto, estabelecer padrões corretos de conexões. Assim, vale ressaltar o papel fundamental da nutrição no desenvolvimento do organismo, principalmente no desenvolvimento das estruturas e funções cerebrais.
De modo geral, o adequado desempenho das funções motoras se estende ao decorrer do desenvolvimento normal de vários sistemas orgânicos, dentre eles, o sistema nervoso e músculo esquelético. Destaca-se nesse particular, a nutrição como fator relevante para um bom crescimento e desenvolvimento de mamíferos. Diante disso, com o advento da globalização há notória transformação do hábito alimentar, observada em todas as classes sociais. Há atualmente, considerando a praticidade e a conveniência, um aumento no consumo de DH, designada de dieta ocidentalizada. Com isso, as alterações nutricionais continuam sendo campo de estudo no desenvolvimento dos sistemas.
Sendo assim, a pergunta condutora que norteou essa pesquisa é se uma dieta ocidentalizada, hipercalórica e hiperlipídica, poderia programar a prole a um atraso no desenvolvimento da atividade locomotora. Assim, o objetivo do presente estudo, em modelo experimental, foi avaliar o desenvolvimento da atividade locomotora até a idade adulta na prole de ratas submetidas à DH durante a gestação e lactação.
A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Fisiologia da nutrição Drº Naíde Teodósio do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), tendo como orientador o Profº Drº Raul Manhães de Castro e co-orientadora a Profª DrªJairza
15 Maria Barreto Medeiros da Universidade Federal da Bahia (UFBA). Parte desse trabalho foi realizado em colaboração com o Centro de Informática da UFPE.
O estudo até o momento gerou um artigo, intitulado ‘Maternal exposure to high
calorie and high fat diet in Wistar rats can lead their offspring to sedentary lifestyle and delay the pup's locomotor development’. Ele foi enviado como artigo original para a
Revista Nutrition Research. Essa revista é classificada como qualis B1. Também será submetido outro artigo com análise dos efeitos da DH considerando a relativização dos parâmetros aqui apresentados e exames laboratoriais não descritos neste trabalho.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
17
REVISÃO DA LITERATURA____________________________________________
Nutrição e a plasticidade fenotípica
Uma alimentação balanceada é indispensável para o adequado crescimento e desenvolvimento do organismo (MORGANE et al., 1993; MORGANE; MOKLER; GALLER, 2002). Por este motivo, estudos têm demonstrado que alterações nutricionais, podem acarretar insultos permanentes, como o risco de doenças metabólicas (MOURA; LISBOA; PASSOS, 2008; ALFARADHI; OZANNE, 2011). De fato, o ambiente intrauterino (gestação) e extrauterino (lactação) tem sido considerado como preditor de alterações fenotípicas com posteriores consequências na vida adulta (BARKER, 1991). Estas alterações durante o período de desenvolvimento é conhecida como plasticidade fenotípica, definida como a capacidade de um genótipo responder as condições ambientais em sua morfologia, estado fisiológico e/ou comportamento (WEST-EBERHARD, 1989; HANSON; GLUCKMAN, 2011). Mediante a estas alterações, temos a hipótese do fenótipo poupador (thrifty phenotype hypothesis), a qual se postula que o feto para garantir sua sobrevivência adapta-se ao ambiente intrauterino desfavorável (HALES; BARKER, 2001). Entretanto, esse processo adaptativo prioriza a formação de órgãos nobres em detrimento de outros. Embora essa adaptação seja inicialmente benéfica, em longo prazo podem ser prejudiciais (DESAI; HALES, 1997; CERF; CHAPMAN; LOUW, 2012). Isto sugere que um ambiente nutricional desfavorável durante estágios críticos de desenvolvimento pode predispor um indivíduo as doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), como doença cardiovascular, diabetes, osteoporose e declínio cognitivo (HANSON; GLUCKMAN, 2011). Assim, o período perinatal parece ser o de maior susceptibilidade a alterações orgânicas devido ao crescimento rápido e desenvolvimento de importantes sistemas fisiológicos (PELEG-RAIBSTEIN; LUCA; WOLFRUM, 2012).
Em humanos, todo esse período de crescimento e desenvolvimento é crítico e corresponde a uma fase pré-natal e pós-natal. Da mesma forma, em roedores perdura até a lactação (DOBBING, 1970; MORGANE, 1993). Em geral, variação na qualidade ou quantidade de nutrientes consumidos durante este período crítico, desencadeia respostas adaptativas capazes de alterar o perfil de genes em qualquer fase de desenvolvimento (LANGLEY-EVANS, 2006). Dentre as dietas, a hiperlipídica tem sido estudada extensivamente na compreensão dessas alterações como fator importante no desenvolvimento
18 da prole (VICKERS et al., 2003; BAYOL; SIMBI; STICKLAND, 2005; PURCELL et al., 2011). Nesse contexto, é imprescindível entender que o crescimento e desenvolvimento do feto são controlados por fatores genéticos, determinantes do genoma fetal e também fatores ambientais como a nutrição materna (DESAI; HALES, 1997). A prova de que uma dieta materna pode afetar as condições iniciais de desenvolvimento é demonstrado a partir de estudos em humanos e animais (DESAI; HALES, 1997; BARKER, 1991; ESTADELLA et al., 2011; HANSON e GLUCKMAN, 2011).
Diante destes fatos, estudos em animais tem sido boas ferramentas para a plasticidade fenotípica (OZZANE et al., 2004; BARROS et al., 2008; PURCELL et al., 2011). Com isso, modelos experimentais utilizando dieta hipercalórica e hiperlipídica durante o período perinatal tem demonstrado atrofia muscular, hipoplasia das fibras, além de alterações metabólicas em ratos adultos (BAYOL; SIMBI; STICKLAND, 2005; ESTADELLA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011). Estas alterações têm sugerido que o consumo desse tipo de dieta durante a gestação e lactação aumenta o risco de transtornos na vida adulta, além de uma expressão anormal dos neurotransmissores envolvidos na regulação da homeostase energética (VICKERS et al., 2003; MORAES et al., 2009).
Dieta ocidentalizada (hipercalórica e hiperlipídica) x sedentarismo
Estilo de vida materna tem sido relacionado ao aumento da obesidade (BREIER et al., 2001). No entanto, isso é resultado da abundância e facilidade de acesso aos “junk food”, definidos como alimentos altamente processados, palatáveis, hipercalóricos e muitas vezes, privados de vitaminas e nutrientes essenciais (BAYOL; FARRINGTON; STICKLAND, 2007). Uma das explicações para a obesidade é a mudança na composição da dieta, além da disponibilidade e acesso aos grãos refinados, açúcares e óleos vegetais associados à falta de escolhas mais saudáveis e a conveniência da alimentação em “fast-food” (MENDONÇA; ANJOS, 2004; CORDAIN et al., 2005; WANDERLEY; FERREIR, 2010). Assim, uma dieta hipercalórica a partir do excesso de lipídios é comumente usada em modelos experimentais para mimetizar hábitos alimentares do mundo ocidental (STEYN et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2011). Com base nisso, estudos têm consistentemente relacionado a gordura dietética com o aumento da obesidade e de consequências adversas à saúde (TAMASHIRO; MORAN; 2009; ESTADELLA et al., 2011; FRANCIS; STEVENSON, 2013). Por isso, na última década, especial atenção tem se dado as pesquisas sobre alterações no sistema nervoso e
19 consumo de dieta de alimentos com ácidos graxos saturados (MILANSKI et al., 2009; FRANCIS; STEVENSON, 2013)
Recentemente, foi observada inflamação hipotalâmica associada ao consumo de dieta hiperlipídica, mas especificamente a alimentos fonte de AGS (MARIC; WOODSIDE; LUHESHI, 2014). Em geral, animais expostos a esse tipo de gordura, mostraram prejudicada memória, além de aumento do peso corporal, consumo de caloria, níveis de triglicerídeos e da pressão arterial (ESTADELLA et al., 2011; KOSARI et al., 2012). Por outro lado, AGPi de cadeia longa são considerados essenciais não só para o desenvolvimento neurológico, mas também para a função visual (DA SILVA; MIRANDA JUNIOR; SOARES, 2007). De fato, já é reconhecida a importância dos AGPi no desenvolvimento do sistema nervoso, uma vez que o cérebro é um tecido com cerca de 60% de seu peso de lipídios, sendo 40% de AGPi (VALENZUELA; NIETO, 2003; DA SILVA; MIRANDA JUNIOR; SOARES, 2007).
Com base nesses dados, modelos experimentais têm sido concebidos para estudar o efeito da dieta hiperlipídica (PURCELL et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011; PELEG-RAIBSTEIN; LUCA; WOLFRUM, 2012). Estudos demonstraram que esse tipo de dieta aumenta o risco de obesidade, além de hiperfagia, preferência por alimentos gordurosos e comportamento sedentário (SULIVAN; SMITH; GROVE, 2010). Diante disso, estudos estão buscando os mecanismos pelos quais a DH induz as disfunções fisiológicas (TAMASHIRO; MORAN; 2009; ESTADELLA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011).
Dada a importância do consumo de DH nos estudos atuais, AGS tem sido relacionado diretamente com o ganho de peso (FUNG et al., 2001; LÓPEZ et al., 2010). Nesse sentido, é válido ressaltar a atual alteração do estilo de vida da população, no qual temos como consequência uma diminuição de subnutrição e aumento da obesidade (BATISTA FILHO; RISSIN, 2003). Então, se durante momentos de escassez de alimentos a eficiência em acumular energia foi favorável à sobrevivência, atualmente ocorre o inverso, uma vez que recentes estudos tem demonstrado o excesso de peso como um problema de saúde pública (SANDE-LEE; VELLOSO, 2012). Por isso, ressalta-se a existência de uma preocupação sobre o aumento de hábitos alimentares pouco saudáveis associados ao comportamento sedentário no desenvolvimento de DCNT (CROEZEN et al., 2009; AL-HAZZAA et al., 2011). De fato, se sabe do reconhecimento da dieta e da atividade física como papel importante na manutenção da saúde e prevenção de doenças (WHO, 2004; BIBILONI et al., 2012). No entanto, as mudanças no estilo de vida têm sido relacionadas com fatores ambientais. Frente a isso, estudos demonstram que a obesidade, síndrome metabólica e o
20 comportamento sedentário podem ter uma causa biológica comum (GREENWOOD; WINOCUR, 2005). Para tanto, escolhas de estilo de vida, como o sedentarismo pode ter origem pré-natal provocada por alteração no padrão alimentar (VICKERS et al., 2003).
Diante disso, VICKERS et al. (2003) sugere que o comportamento sedentário é determinado durante o desenvolvimento pré-natal. Nessa fase, ocorre à maturação biológica, ficando o organismo sensível à influência de fatores ambientais e comportamentais (GUEDES, 2007). Assim, o sedentarismo é um ponto preocupante, uma vez que embora as doenças associadas ao sedentarismo somente se inicie na vida adulta, tem sido evidente o seu desenvolvimento na infância (PARSONS et al., 1999). Dessa forma, acredita-se que o estilo de vida sedentário e o processo de desenvolvimento motor podem ser prejudicados por um ambiente intrauterino desfavorável (VICKERS et al., 2003).
Desenvolvimento da atividade locomotora
O desenvolvimento motor é um processo contínuo e ordenado que possibilita a realização de habilidades motoras essenciais à vida (CONOLLY, 2000). Estas habilidades constituem uma ferramenta na relação de um ser vivo com o seu ambiente, realizada através de movimentos alternados e coordenados (MELO, 2006; BARROS et al., 2008). No rato, assim como no humano é perceptível a influência do reflexo primitivo com a atividade motora mais elaborada, caracterizado por um conjunto de fatores que desencadeiam a maturação da locomoção (FOX, 1965). Porém, para aquisição e refinamento na sequência de movimentos é necessário interconexão de uma série de estruturas envolvidas no controle motor (GEISLE; WESTERGA; GRAMSBERGEN, 1993; HANDLEY, et al., 2009).
A locomoção é considerada um movimento automático iniciado voluntariamente, porém não deve ser analisado como um resultado isolado, e sim como uma consequência da interação entre o sistema musculoesquelético, o ambiente e sistema nervoso (DICKSON et al., 2000). Para um padrão locomotor, os sistemas nervosos central e periférico são importante por apresentarem unidades motoras consideradas vias comum finais na função motora (LIEBERMANN; BUCHMAN; FRANKS, 2006). Na medula espinal, encontra-se o gerador de padrão central (CPG) que recebe informações de sensores periféricos (visão, sistema vestibular e proprioreceptores) e da memória somática para iniciar, parar e modular a locomoção (ROSSIGNOL, 2006). Essa rede neural em todos os mamíferos é principalmente controlada em nível cortical, que transmite o movimento pretendido ao núcleo estriado, globo
21 pálido e tálamo (HANDLEY, et al., 2009). Estas estruturas reenviam novamente as informações do movimento para as estruturas corticais, funcionando como um sistema de retroalimentação (HANDLEY et al., 2009). Em termos anatômicos e funcionais, as estruturas aqui supracitadas também estão relacionadas ao controle da postura, pois os efeitos posturais coincidem com a maturação do desenvolvimento da atividade locomotora (FOX, 1965; PAASEN; GRAMSBERGEN, 2005).
A postura é definida como a posição do corpo em relação ao vetor gravitacional e de segmento do corpo (GRAMSBERGEN, 1998). Ela requer diferentes propriedades dos músculos para atender a velocidade de contração e a produção da força, assim como a percepção do estímulo até a efetivação da resposta selecionada (PAASEN; GRAMSBERGEN, 2005). E por essa razão, tem sido considerada como um fator limitante no desenvolvimento da atividade locomotora (AICARDI; BAX, 1992). Em concordância com isso, o controle postural depende do desenvolvimento muscular, bem como do controle neural (GEISLE; WESTERGA; GRAMSBERGEN, 1993).
Mudanças no comportamento motor seguem uma sequência hierárquica de maturação do sistema nervoso central (ALTMAN; SUDARSHAN, 1975; BARROS et al., 2008). Isso ocorre devido ao momento de intensa maturação estrutural e funcional que corresponde aos eventos celulares (DOBBING, 1970). Dessa forma, o controle motor fino só será alcançado após o término da formação de mielina (KOLB; WHISHAW, 2002). Assim, por exemplo, a mielinização e formação de sinapses das células nervosas evoluem passando por atividades reflexas primitivas até assumir o comando voluntário das atividades (PAINE et al., 1964). Para isso, o sistema nervoso necessita de condições ambientais favoráveis para o seu pleno desenvolvimento e funcionamento (LUSSAC, 2008). No entanto, para a realização do movimento, o sistema musculoesquelético é imprescindível na atividade locomotora (GEISLE; WESTERGA; GRAMSBERGEN, 1993).
Segundo Smith (1997), o controle motor refere-se à regulação da postura e do movimento, sendo qualquer movimento produzido pela contração dos músculos esqueléticos. Com isso, os músculos desempenham tanto um trabalho dinâmico, o qual permite a locomoção e o posicionamento dos segmentos corporais no espaço, quanto um trabalho estático, responsável pela manutenção da postura corporal (ALTMAN; SUDARSHAN, 1975; MCCOMAS, 1996). Em termos da evolução motora, roedores são imaturos logo após o nascimento em comparação com outros mamíferos (CLARAC et al., 1998). No entanto, a
22 ausência ou falta de informação do sistema vestibular é o suficiente para atrasar ou desorganizar o controle do movimento.
Assim, o sistema vestibular, cuja função é orientar as informações geradas pelos movimentos da cabeça durante as posturas estáticas e dinâmicas, tem sua contribuição no controle motor (CLARAC et al., 1998; KLEINER et al., 2011). No rato, a maturação do sistema vestibular ocorre de forma importante entre o 8º dia de vida embrionária e o 15º dia pós-natal (CLARAC et al., 1998). Este período é considerado essencial sobre o desenvolvimento e organização da atividade locomotora (CLARAC et al., 1998). A sua imaturidade é demonstrada através da oscilação da cabeça durante a locomoção, o que define a falta de uma atividade motora mais complexa, como a marcha ou o correr (CLARAC et al., 1998; BROCARD; VINAY; CLARAC., 1999). Assim, uma vez ocorrido a maturação do sistema vestibular, regulação dos reflexos e o controle da postura, a atividade locomotora mais complexa será desenvolvida, ocorrendo no rato no 21º dia pós-natal (BROCARD; VINAY; CLARAC, 1999; CLARAC et al., 2004).
Estudos comportamentais em animais têm sido avaliados no instrumento de campo aberto. Ele foi descrito inicialmente em um estudo de investigação da defecação e micção como reações emocionais dos ratos (HALL, 1934). Atualmente, esse instrumento foi expandido e utilizado em várias situações, dentre as quais se podem citar a análise comportamental do desenvolvimento da atividade locomotora (SACHETTI et al., 2009; ARAGÃO et al., 2011). Dentre as análises realizadas no campo aberto, já foi observado tempo despendido na parte central e tempo de parada como indicativo de ansiedade e estresse, respectivamente (HALL, 1934; SACHETTI et al., 2009). Para a observação destas avaliações comportamentais, utiliza-se de três a cinco minutos para obter os registros, considerado suficiente (HALL, 1934). Por isso, com a modernidade e o avanço da tecnologia, a vantagem de utilizar o campo aberto com captura de imagem tem sido favorável, pois é eliminada qualquer influência do pesquisador na análise dos resultados (ARAGÃO et al., 2011).
Diante disso, o instrumento de campo aberto pode ser utilizado como um método de avaliação para verificar a influência do meio ambiente, em especial da nutrição, como indutora de alterações no comportamento locomotor em ratos no período pós-natal (BARROS et al., 2006; ARAGÃO et al., 2011). Dessa forma, existem evidências que o rato neonato tem sido considerado um excelente modelo experimental para estudar o desenvolvimento da atividade locomotora (ALTMAN; SUDARSHAN, 1975; CLARAC, et al., 1998; ARAGÃO et al., 2011).
23
24 MÉTODOS_____________________________________________________________ 1 Animais
Para o presente estudo foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar selecionados aleatoriamente, provindos de ratas primíparas com peso corporal entre 220g-260g. Os animais foram obtidos na colônia do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e Universidade Federal da Bahia (UFBA). Todos os animais ficaram mantidos em gaiolas de polipropileno (46cmx34cmx20cm), ambiente com ciclo invertido de escuridão (06:00 às 18:00 h) e luz (18:00 às 06:00h), temperatura 22 ± 2 C e com livre acesso a água e ração.
Para obtenção de neonatos, foram acasalados animais machos e fêmeas (proporção 1:2) com idade entre 90 e 120 dias. O diagnóstico da prenhez foi realizado através do teste de esfregaço vaginal com constatação do espermatozoide na secreção vaginal. Imediatamente após a identificação da gravidez, ratas foram divididas em dois grupos experimentais: Grupo controle (GC=4) e Grupo hipercalórico -hiperlipídico (GH=6).
Um dia após ser constatado o nascimento de filhotes, as ninhadas foram ajustadas para 8 filhotes (de preferência machos ou no mínimo com 4 machos), pesando entre 6-8g cada. Este dia foi considerado como o 10 dia de vida do concepto (BENTO-SANTOS et al., 2012).
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE nº 502/12.
2 Grupos Experimentais
Os Grupos experimentais foram formados a partir do primeiro dia após o diagnóstico de prenhez. A manipulação nutricional ocorreu em dois grupos (figura 2):
- Grupo Controle (GC) (n=24 animais): nesse grupo, todos os filhotes eram descendentes de ratas alimentadas com DC durante a gestação e lactação.
- Grupo Hipercalórica-Hiperlipídica (GH) (n = 37 animais): nesse grupo, todos os filhotes eram descendentes de ratas alimentadas com DH nos períodos da gestação e lactação, semelhante a que foi proposta por Estadella (2011). Essa dieta é constituída de uma mistura de alimentos hipercalóricos contendo ração comercial (Nuvilab ®, CR1, Brasil), amendoim torrado, chocolate e biscoito, ofertados em forma de péletes.
25 A DH foi confeccionada no Departamento de Nutrição da UFPE. A análise centesimal da dieta do GC e GH foi realizada no Laboratório de Experimentação e Análise de Alimentos Nonete Barbosa (LEAAL). Todas as dietas foram oferecidas durante o período de gestação e lactação. Além disso, os ácidos graxos foram analisados e calculados conforme descrito na Tabela de composição dos alimentos (TACO).
Figura 1: Representação esquemática dos grupos experimentais
Figura 2: Manipulação nutricional de dietas experimentais
No 22º dia após o nascimento, os conceptos foram desmamados e receberam dieta Nuvilab®, adotada como padrão do biotério até o final do experimento.
26 Tabela 01: Análise centesimal da dieta hipercalórica-hiperlipídica e Nuvilab
Nutrientes Dieta hipercalórica-hiperlipídica (g/100g) Dieta normocalórica-normolipídica (Nuvilab ®, CR1, Brasil – g/100g) Carboidratos 46,33 57 Proteína 19,02 22 Lipídios 23,84 4 Cinzas 8 9 Umidade 2,81 8 Energia (Kcal/g) 4,75 3,5
Tabela 2: Análise de ácidos graxos da dieta hipercalórica-hiperlipídica e Nuvilab
Ácidos graxos Dieta hipercalórica-hiperlipídica (g/100g) Dieta normocalórica-normolipídica (Nuvilab ®, CR1, Brasil – g/100g) Saturada 6,58 0,77 Polinsaturada 7,93 2,14 Monoinsaturada 6,29 1,05 (TACO, 2012).
27 Figura 3: Dieta hipercalórica e hiperlipídica
Figura 4: Dieta Nuvilab ®
4 Avaliação do peso e consumo alimentar
O peso e o consumo alimentar das gestantes foram avaliados semanalmente e registrados através de balança eletrônica digital. Este consumo da ração foi avaliado pela subtração do peso da dieta ofertado e o peso da dieta restante após 24h, de acordo com a fórmula:
Consumo alimentar = peso ração (g) – peso ração do dia anterior (g)
O peso da prole foi registrado ao nascer, no 8º, 14º, 17º, 21º, 30º, 60º, 90º e 150º dias de vida, a fim de acompanhar a evolução ponderal desses animais.
28 Durante o período de gestação foi realizado a análise de macronutrientes (proteína, carboidrato e lipídios) calculados segundo o consumo em gramas da dieta. Também foi analisado o consumo da dieta em calorias.
Esse consumo foi realizado semanalmente. O cálculo de ingestão dos macronutrientes seguiu as referências da análise da DH e DC (Nuvilab®) realizada no LEAAL, na UFPE.
6 Determinação do IMC e RAT
O IMC foi avaliado aos 8, 14, 17, 21, 30 e 60 dias de idade, através da fórmula:
IMC = peso corporal (g)/ extensão naso-anal2 (cm2) (NOVELLI et al., 2007)
O RAT foi avaliado aos 8, 14, 17, 21, 30 e 60 dias de idade. Para esta avaliação, foi aferida a circunferência torácica (cm), linha perpendicular ao eixo longitudinal na altura da décima segunda vértebra torácica, última costela e região esternal e a circunferência abdominal (cm), maior circunferência entre a borda da crista ilíaca e a última costela foram utilizadas para a obtenção da relação abdômen/ tórax. A fórmula para determinar o RAT:
RAT = CA (cm)/ CT(cm) (NOVELLI et al., 2007)
7 Avaliação da atividade locomotora
Para avaliar os efeitos da DH sobre a atividade locomotora, os animais foram avaliados no 8º, 14º, 17º, 21º, 30º, 60º, 90º e 150º dias PN durante a fase escura do ciclo circadiano (6:00 – 18:00h) nas duas primeiras horas iniciais (7:00-8:00h).
A monitoração ocorreu no aparelho de campo aberto, circular, delimitado por uma parede com 30 cm de altura, superfície interna pintada de preto com acetato de vinil etila (EVA) através de imagens digitais capturadas sob luz infravermelha. Neste estudo, foi seguido o protocolo descrito por Aragão et al. (2011), o qual foi validado e testado.
29
Figura 5: Aparelho de campo aberto
A fim de não interferir na manipulação nutricional dos animais e de não obter adaptações dos animais no instrumento de campo aberto, após o desmame foram avaliados no máximo dois animais em cada idade (30º, 60º, 90º e 150º PN) e depois sacrificados por decapitação. Cada animal foi colocado individualmente no centro do campo aberto com gravação de 5 minutos enquanto se movia livremente. Para cada avaliação da atividade locomotora, o campo aberto foi limpo com hipoclorito de sódio e água.
Dentro do campo aberto, a análise da atividade locomotora foi avaliada através das seguintes variáveis:
Parâmetros calculados: distância real, velocidade média, potência média, tempo de
imobilidade, número de paradas, nº de paradas/tempo imóvel, gasto energético total e tempo de permanência nas áreas pré-estabelecidas (periférica, intermediária e central).
- Distância real (cm): foi considerado o movimento da medida da separação entre dois pontos denominado de raio R. Nessa distância foi desconsiderada partes do corpo do animal que descrevem trajetórias circulares, cujo centro do animal não altera.
- Velocidade média (cm/s): representou a relação do deslocamento real e do tempo que o animal permaneceu em movimento. Fórmula: ∆S/∆T, onde ∆S é o deslocamento real em centímetros e o ∆T é o tempo total menos o tempo de imobilização em segundos;
- Potência média (mW): representa a soma da energia cinética dissipada por um corpo em movimento ao longo do tempo. Fórmula: mv2/∆T, onde m é a massa do animal em gramas, V é a velocidade média em miliwatt /segundos e ∆T a análise total do tempo menos o tempo ocioso em segundos;
- Tempo imóvel: total de tempo em segundo que o animal ficou imóvel no campo aberto; - Número de paradas: total de número de paradas ocorridas no campo aberto;
30 - Gasto de energia total (GET): representou o consumo de energia durante os 5 minutos de avaliação da atividade locomotora no campo aberto. Esse cálculo correspondeu a energia cinética que foi transformada de joule (J) para caloria (cal);
- Tempo imóvel/ número de paradas: relação entre o tempo imóvel e o total de número de paradas;
- Período de permanência nas áreas: o instrumento de campo aberto foi considerado uma coroa, a qual corresponde a uma região limitada por dois círculos concêntricos. Assim, foi viável dividir virtualmente o campo aberto em três áreas (central (A1), intermediária (A2) e periférica (A3)). Esta divisão em três áreas foi a maior possível para impedir que animais mais velhos e longos sejam posicionados por engano em duas áreas do sistema de análise. Nestas áreas foi analisada a permanência em segundos de cada animal.
A câmera de análise das variáveis citadas foi montada no teto de uma sala alinhado com a linha vertical que passa pelo centro do campo aberto. A câmera filmou o animal enquanto se movimentava livremente. A distância do local de fixação ao solo do campo foi de 2,40m.
A máquina foi conectada ao computador através de uma placa de aquisição de vídeo com taxa de captura de imagem em 30 frames por segundo e cada imagem com 240 pixel de altura e 320 pixel de largura. As imagens foram capturadas em uma sala escura com uma câmera infravermelha, permitindo a imagem dos roedores no escuro, guardada para posterior processamento no tipo de arquivo avi, usando um programa desenvolvido na linguagem de programação Delphi. A capacidade de armazenamento do vídeo dependeu do disco rígido do computador.
A análise das imagens obtidas a partir de cada vídeo foi feita através de uma plataforma de software em MATLAB. Através de uma interface, o avaliador introduziu os dados de registro do animal e da informação utilizada para análise dos frames (número de frames e o tempo entre os frames).
Devido a uma diferença na coloração entre o campo aberto e o animal, o programa usou a intensidade de pixel reconhecido para estabelecer todos os pontos que formam a imagem do animal. Um valor fixo em pixels do limiar é reconhecido pelo programa para cada idade porque os animais apresentaram diferenças no seu tom de pelagem, devido ao crescimento. O valor de cada limite foi inserido pelo examinador usando a escala com valores específicos para cada idade, evitando erros de reconhecimento do animal. Os animais avaliados em 150 dias PN foram sacrificados e decapitados com 180 dias de idade.
31
Figura 6: Representação esquemática do hardware de monitoramento da atividade locomotora
Figura 7: Modelo esquemático da avaliação do desenvolvimento da atividade locomotora e de parâmetros antropométricos da prole de ratas do GC e GH.
8 Análise estatística
Os dados foram analisados estatisticamente através do software SigmaStat3. Primeiramente, foi verificado se os dados foram distribuídos normalmente. Para avaliação do consumo de macronutrientes, ração das gestantes, antropométrica (peso, CA, CT, Comprimento e IMC), gasto energético total da prole e do desenvolvimento da atividade locomotora (distância real, velocidade média e potência média) foi realizado ANOVA
two-way para o fator grupo (GC E GH) comparado com as idades pós-natal e seguida por teste
post hoc HOLM SIDAK. Na análise do tempo imóvel, número de parada e a relação tempo imóvel/número de paradas, os dados foram transformados em postos e posteriormente foi realizada ANOVA two-way, seguida por teste post hoc HOLM SIDAK para o fator grupo
32 (GC E GH) comparado com as idades pós-natal. Os resultados foram expressos em média e erro padrão da média (EPM). A hipótese nula foi rejeitada quando p≤ 0,05.
33
34 RESULTADOS – ARTIGO ORGINAL______________________________________
Maternal exposure to high calorie and high fat diet in Wistar rats can lead their offspring to sedentary lifestyle and delay the pup's locomotor development.
Erika Thienne Lopes da Silva1; Thaysa de Oliveira Lima Souza 1; Franklin Leandro Acioly Lucena 2; Jairza Maria Barreto Medeiros3; Raul Manhães de Castro 1
1
Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil ² Informatics Center (CIn), Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil
3
School of Nutrition, Federal University of Bahia, Salvador, Bahia
Correspondence:
Raul Manhães de Castro
Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco Street Professor Moraes Rego,1235, Cidade Universitária CEP: 50670-901, Recife, Brazil
Phone: (81) 8825-7635
35
Abbreviations
BMI Body Mass index
CAL Calorie
CD Control diet
CKK Cholecystokinin
cm Centimeter
EAEC Animal Experimentation Ethics Committee
EPM Error of the average
EVA Ethyl Vinyl Acetate
g Grass
HFD High fat diet
J Joule
LEAAL Laboratory Testing and Food Analysis Nonete Barbosa mw miliwatt
NCD Non-communicable chronic disease
PN Postnatal
RWT Relationship of waist circumference by thoracic circumference
s Second
TC Circumference thoracic
UFBA Federal University of Bahia
UFPB Federal University of Paraíba
UFPE Federal University of Pernambuco
v speed
∆t Total time
36
Abstract
Evidence suggests that high calorie diet with excess lipids during pregnancy and lactation may harm the developing organism. The objective of the study was to evaluate the effects of maternal exposure to a high calorie, high fat diet (HFD) on the development of locomotor activity in the offspring of female Wistar rats. The rats were mated and divided into two groups: control diet (CG) (n = 24) and HFDG (n = 37). Weekly, were analyzed the body weight, feed intake, macronutrients and total calories ingested by rats pregnant.
Anthropometric parameters (Body Mass Index (BMI), waist circumference (WC), thoracic circumference (TC), WC/CT (RWT) ratio) of the descendants of HFD and CD were assessed at postnatal (PN) 8th, 14th, 17th, 21th, 30th and 60th days. The birth weight was evaluated until 150 days. The instrument in open field with digital images by infrared light was used to assess locomotor activity. For this, was assessed real, and average speed, power, motionless time, number of stops, motionless time by number of stops and the time of fixed period in the areas (central, intermediate and peripheral). Energy expenditure was also measured during locomotor activity. The study did not identify delay of locomotor activity (p> 0.05) in animals with HFD, but suggests a possible programming of these animals to sedentarism.
Furthermore, our results suggest a lower risk of metabolic diseases even with animals with lower GE. Then it is concluded that more studies using polyunsaturated fatty acids for prevention of metabolic diseases and as protective factor for the development of locomotor activity are needed.
37
1 Introduction
The lack of more healthy choice and convenience in fast food during pregnancy and lactation has been attributed to the development of obesity and non-communicable chronic diseases (NCD). In fact, it has been shown that the perinatal period seems to be the most susceptible to organic changes, since the rapid growth and development of major
physiological systems [1]. These changes during this period are called as phenotypic plasticity [2]. In this way, the individual phenotype could be induced by environmental conditions such as deficit or excess nutrients, able to optimize the use of nutrients to ensure their survival [3,4,5]. Although this adaptation is initially beneficial, long-term situations of normal feeding or hyperalimentation may be harmful [7,8]. Thus, high calorie and HFD has been used in experimental models to mimic eating habits of the western world [6,9].
Studies have consistently related to dietary fat as a predictor of hypothalamic
inflammation and neurons apoptosis, and muscle atrophy and fiber hypoplasia [10,11,12]. Therefore, it is believed in the possibility of motor control is impaired, since the movements are controlled by neural networks [13].
Given the importance of eating DH in current studies , it is worth noting the current change in lifestyle of the population , in which we have as a consequence a reduction of malnutrition and increasing obesity [14]. So if during times of food shortage in accumulating energy efficiency was favorable to survival , the reverse happens today , since recent studies have shown overweight as a public health problem [15] . Therefore, it is important that there is a concern about the increase in unhealthy eating habits associated with sedentary behavior in the development of NCDs [16, 17].
Stands out in this case, the nutrition as a relevant factor for proper growth and
38 exposure to a high calorie and HFD would program the delay of locomotor development in the offspring.
2 Methods and materials
2.1 Animals
For this study, male Wistar rats were randomly selected. All animals are descendants of primiparous female rats that had body weight between 220g-260g. The animals were obtained from the Nutrition Department colony of, Federal University of Pernambuco
(UFPE), Federal University of Paraíba (UFPB) and Federal University of Bahia (UFBA). All animals were kept in polypropylene cages (46cmx34cmx20cm) environment with inverted dark cycle (06:00 to 18:00) and light (18:00 to 06:00), temperature 22 ± 2°C and free access to food and water.
To obtain neonates, were mated males and females (ratio 1:2) aged between 90 and 120 days. The diagnosis of pregnancy was performed through the vaginal rub test and identification of sperm in the vaginal secretion. Immediately after the identification of pregnancy, rats were divided into two experimental groups: control group (CG) and hypercaloric-hyperlipidic Group (HFDG).
A day after being birth of pups, the litters were adjusted to 8 pups (male or preferably at least 4 males), weighing between 6-8g each. This day was considered as the 1st day of rat's life. All diets were offered during pregnancy and lactation. On 22th day after the birth, the pups were weaned and received Nuvilab ® diet, adopted as standard diet at the vivarium until the end of the experiment.
39 Moreover, the fatty acids were analyzed according to food composition table [18]. The Diet centesimal analysis of CG and HFDG was performed at the Laboratory of Food Analysis and Experimentation Nonete Barbosa (LEAAL).
All procedures were performed in accordance with the approval of Animal Experimentation Ethics Committee (EAEC) of UFPE number 502/12.
2.2 Assessment of weight and food consumption
The weight and food intake of pregnant were evaluated weekly and recorded through a digital electronic scale. The food intake was measured by subtracting the weight of the offered diet and diet remaining weight after 24 hours.
The weight of the offspring was recorded at birth and on the 8th, 14th, 17th, 21st, 30th, 60th, 90th and 150th days of life in order to monitor the weight gain of these animals.
2.3 Macronutrient intake in pregnancy
Weekly, during the gestation period was performed the analysis of macronutrients (protein, carbohydrates and lipids), calculated according to the food intake in grams. It was also analyzed the consumption diet in calories.
The calculation of macronutrient intake followed the guidelines of the analysis of HD and CD (Nuvilab ®) held in LEAAL, at UFPE.
2.4 Determination of body mass index (BMI) and abdominal and thoracic relation
40 The RWT was assessed at 8th, 14th, 17th, 21th, 30th and 60th days of age.
2.5 Assessment of locomotor activity
To evaluate the effects of HFD on locomotor activity, the animals were evaluated in 8th, 14th, 17th, 21th, 30th, 60th, 90th and 150 PN during the dark phase of the circadian cycle (6:00 - 18:00). The monitoring occurred in the open field apparatus, circular, bounded by a wall of 30 cm, inner surface painted black with ethyl vinyl acetate (EVA) through digital images captured under infrared light. This study followed the protocol described by Aragão [18].
In order to not interfere in a nutritional manipulation of animals and not get
adaptations of animals in the instrument open campus, after weaning were evaluated up to two animals at each age (30th, 60th, 90th and 150th PN) and then sacrificed by decapitation. Each animal was individually placed in the center of the field with recording 5 minutes while moving freely. For each evaluation of locomotor activity, open field was cleaned with sodium hypochlorite and water.
Inside the open field, the analysis of locomotor activity was assessed using the following variables:
Calculated parameters: real distance, average speed, average power, immobility time,
number of stops, number of stops divided by motionless time, total energy expenditure and fixed period of time in the fields.
- Real Distance (cm): was the measure of separation between two points called a radius R. At this distance was disregarded animal body parts that describe circular paths whose center does not changes position the animal.
41 - Average speed (cm /s): representing the ratio of total actual displacement and the time that the animal remained in motion. Formula: ∆S/∆T, where ∆S is the total actual displacement in centimeters and ∆T is the total time less the downtime in seconds;
- Average power (mW): power which the animal produced during the displacement. The sum of the kinetic energy dissipated by a body in motion a long time was calculated. Formula: mv²/ΔT, where m is the mass of the animal in grams, V is the average velocity in milliwatt / seconds, and ΔT total analysis time less idle time in seconds;
- Motionless Time: total time in seconds that the animal stood in the open field; - Number of stops: total number of stops occurred in the open field;
- Spent total power: representing the energy consumed during the 5 minute assessment of locomotor activity in the open field. This calculation corresponds to kinetic energy that was transformed from joule (J) to calorie (cal);
- Time motionless divide by number of stops: ration between motionless time and the total number of stops;
- Time they are in areas: The open field apparatus was considered a crown, which corresponds to a region bounded by two concentric circles. With this, it became possible to virtually divide the open field into three areas (central (A1), intermediate (A2) and peripheral (A3)). This division into three areas was established to prevent older and long animals had been
positioned incorrectly in two areas of the analytical system. In these areas was analyzed the time spent, in seconds, for each animal in order to assess the behavior of animals in the ages at which the experimental groups were evaluated.
After the completion of the experiment, all animals were sacrificed at age 180 days by decapitation.
42 The Data were statistically analyzed using SigmaStat3 software. First, we verified whether the data were normally distributed. To assess macronutrient intake, diet of pregnant women, anthropometric (weight, WC, TC, length and BMI), total energy expenditure and development of locomotor activity (actual distance, rotational distance, total distance, average speed and power ) was performed the two-way ANOVA for the factor group (CG and HFDG) compared with the postnatal ages and followed by post hoc HOLM SIDAK test. In the
analysis of motionless time, number of stops and the ration motionless time / number of stops, the data were transformed into posts and later was conducted the two-way ANOVA, followed by the post hoc HOLM Sidak test for the factor group (CG and HFDG) compared with
postnatal ages. The Results were expressed as average and standard error of the average (EPM). The null hypothesis was rejected when p ≤ 0.05.
3 Results
3.1 Body weight and pregnant rats’ food intake
To understand the effects of HFD on the development of locomotor activity, were compared the data of each age between DC and HFD. Thus, our study investigates characteristics not only related to offspring, but also related to pregnant rats to show the existence of fetal programming.
In our results we observed that although pregnant rats fed a HFD had gained more weight compared to a CD throughout the pregnancy, we could not find any significant statistically difference (Figure 1 - A). However, evaluating the feed intake, it was shown that rats HFD consumed less food in all weeks of gestation (184.508 ± 7 g in 1 week; 210.235 ± 7 g in 2nd week; 158.648 ± 7 g, p <0.05) (Figure 1 - B).
43 The intake of energy and macronutrients of pregnant rats are shown in Figure 2. The consumption of energy and lipid on HFD had reduced the 1st and 2nd week of gestation (p <0.05). However, carbohydrate intake (51.254 ± 3.831, 53.305 ± 3.831, 62.349 ± 3.831, p <0.05, in the 1st, 2nd and 3rd week, respectively) and protein (21.042 g ± 1.186, 23.919 ± 1.186, 25.596 g ± 1.186, p <0.05, in the 1st, 2nd and 3rd week, respectively) was lower for GH (Figure 2).
3.2 Assessment of anthropometric parameters of the offspring of HFD and DC
The offspring Body weights were measured at birth and in the days of the assessment of locomotor activity as shown in Figure 3. There was no significant difference in body weights of animals during the lactation period (form 1st day until 21st day). After the 30th day the HFD offspring had reduced weight compared to the DC (p <0.05).
BMI was lower (p <0.05) in HFD rats that have 17 th day (0.00648 ± 0.255) and 60 th day (0.00745 ± 0.133) compared to CD rats. From the 17th postnatal day, the HFD’s rats BMI decreased. Also interesting result was observed in the offspring of HFDG. They showed reduced PN growth (p <0.05), 8th day (6.657 ± 0.130 cm, p = 0.012), 14th day (8,170 ± 0.130 cm, p = 0.005), 17th day (9.078 ± 0.130 cm, p = 0.030), 21st day (10,005 ± 0,130 cm, p = 0.000) and 30th day (12,286 ± 0,130 cm, p = 0.000).
In DC rats, WC (p <0.05) and TC (p <0.05) had increased at all ages evaluated (8th, 14th, 17th, 21st, 30th and 60th days) compared to HFD rats (Figure 4). No significant difference was observed in RWT.
44 Assessing the real distance no significant difference was observed between DC and HFD (Figure 5A, B e C).
Related to the average speed parameter in the locomotor activity, the present study demonstrated that the HFD animals showed higher speed only at 150th days (21,764 ± 6,879 cm / s, p = 0.003) (Figure 6).
The graph in Figure 7 shows the results of the average power. In the comparison between the HFD and DC the only age that differed was 150th postnatal day (3828.467 ± 202.410 milliwatt, p = 0.003).
Assessing the period of time that the animal stood stopped at the locomotors activity evaluation time, only on 14th day (184.784 ± 10.664, p = 000), the HFD and DC differed significantly. In addition, we evaluated the number of times that the animals interrupted motion as shown in Figure 9. There were also changes in the number of stops on the 14th ((101.108 ± 3.623, p = 000) PN day.
Also in this study we evaluated the ratio between motionless time and stops times. The Results showed a significant difference only on 8th day as shown in Figure 10.
Considering the divided areas in the open field locomotor activity, we evaluated the time spent in areas 1, 2 and 3 for each group. In this evaluation it was found that there is a point of intersection of the DC rats (Figure 11 (A)) on 14th day between Area 2 and 3. For the HFD rats the intersection point occurs after the 14th day (Figure 11 (B). When comparing animals descending HFD and DC is also observed that on the 14th day HFD animas remains longer in Area 1, also reaching the DC with the highest peak in the area 3 only 17 days.
The energy expenditure (EE) was also evaluated (Figure 12). HFD was no change in the course of different ages evaluated. In HFD rats showed lower EE compared to DC. This difference was observed from 30th day.
45
4 Discussion
In pregnant rats, HFD resulted in less food intake because lipids in the small intestine release peptides such as cholecystokinin (CKK), which is a hormone responsible for satiety [19]. For this reason, it was also expected that the pregnant rats on HFD showed less energy expenditure, as we demonstrated in our study. Therefore, the third week of pregnancy with higher caloric consumption for HFD is justified, since the lipid is a macronutrient with the highest caloric density 9 cal/g [20].
Another result of this study is that the exposure of the mother to HFD during the critical period of development led to less weight gain of the offspring. Different from other studies where descendants of mothers in HFD showed greater weight gain than descendants from mothers under CD [21, 8]. Another study shows that the quality of lipid is better than the quantity [22]. This makes several studies questionable, since they make conclusions without careful analysis about the diet adopted. This way, the results obtained in this study suggests that because HFD has the largest source of unsaturated fatty acids, it has lower weight. Other studies have also found the same results [20, 23]. However, although the diets vary in the quality of lipids, the diet high in unsaturated fat diet results in higher concentrations of CKK than diets high in saturated fat [20, 24].
Descendants of HFD had a deficit in growth at all ages tested, characterized by lower energy and protein maternal diet intake. This difference observed with DC changes the catch-up growth in animals with HFD, compromised by inadequate protein and caloric intake [25], similar to what has been observed in others studies [22]. However, our study did not evaluate growth based only on length, because the result is also expressed by changes in
anthropometric measurements such as weight, length and BMI [27]. Thus, these parameters could subsidize explanations for the inadequate growth in HFD animals.
46 Interestingly enough, the offspring of HFD showed no predisposition to the risks of non-transmissible chronic diseases. Indeed, it is established that WT is a anthropometric parameter used to determine obesity and risk of metabolic diseases [28, 29]. Furthermore, it is a consensus that the WT has correlation with the increase of triglycerides, fasting glucose and high-density lipoprotein [30]. However, an explanation for our results not expressing the WT as a risk factor for metabolic diseases can be the source of polyunsaturated lipid.
Motor activity is a complex skill that changes with aging. However, this study
suggests that HFD animals with 150 days old produced less strength as showed in the average power (p <0.05). This phenomenon, despite being only significant for power, is interpreted as a compensatory strategy to assure motor stability [31]. These changes are associated with reduced muscular strength, considered specific of aging itself or a change of the motor pattern [32]. Moreover, power has been identified as a predictor of functional limitation [33]. This may suggest that animals subjected to HFD during pregnancy and lactation may have display functional limitation sooner during aging when compared to CD.
Nonetheless, when evaluating the average speed developed by HFD animals, surprisingly, within 150 days HFD animals showed improvements when compared to CD. This fact can be justified by HFD animals having lower decline in walking speed. It was also verified the influence of body mass on the average speed, in a way such that groups with lower weight have higher marching speed than the group with higher weight [33].
The vestibular system is responsible for generating muscular activity to obtain balance. However, it was identified in our studies that on the 14th day after birth, during the evaluation of the motionless time, there was less motionless time in the open field and higher number of stops. Indeed, this may have occurred due to lack of adequate development of the vestibular system, process occurred between the 8th day and the 15th postnatal day, system
47 dependent on the maturation to guide the body in space, along with somatosensory
information [34, 35].
However, this study only examined the development up to 150 days of age of the animals. Therefore, it would be necessary to continue the experiments to analyze the trend of changes in comparison to the actual distance, power, motionless time, motionless time per number of stops ratio, and average speed. For these results, the open field proved to be a good tool to assess the locomotive activity, able to analyze the behaviour of animals. However, other studies are needed to elucidate whether HFD as source of saturated fatty acids could be harmful for the development of movement of animal while they age.
Thus, this study discusses an intriguing possibility that, although polyunsaturated fatty acids do not totally undermine locomotive activity, HFD may have altered the behaviour of the animal. This can be shown through the point of intersection between the areas that represent the animal behaviour. HFD animals seem to be less anxious and have less movement capabilities than CD animals because they spent more days to reach the
intermediate and peripheral area. These area changes indicate that animals which spend more time walking in the central area are less anxious [35]. In addition, the study suggests that HFD may lower the locomotive capabilities. Furthermore, the study showed that maternal nutrition high in calories and fat may have programmed the offspring to become sedentary,
demonstrated by the energy expenditure (EE) of the animals. VICKERS [36] also states that a sedentary lifestyle may have its origin in the womb.
Finally, more studies are necessary in order to conclude whether HFD animals are sedentary. However, such an physical inactivity may occur because the sedentary lifestyle can be identified as non-participation or insufficient participation in physical activities,
considering physical activity as any bodily movement produced by skeletal muscles that results in energy expenditure [37].
48 Overall, in our study, there was no delay in locomotive activity, perhaps because the source of polyunsaturated fatty acids may have acted as a protector in the development of the nervous system. However, a HFD may have programmed their descendants with a growth deficiency and a sedentary lifestyle. Moreover, other studies with anxiolytic drugs are necessary to discuss the anxiety in animals fed with a HFD.
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References
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