Uma nova lectina da esponja marinha aplysina sp. (APLYL-1) com atividade citotóxica pra célula tumoral (HeLa) e aglutinante de leishmania amazonensis

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. ANTÔNIO MOREIRA MARQUES NETO. Uma nova lectina da esponja marinha Aplysina sp. (AplyL-1) com atividade citotóxica para célula tumoral (HeLa) e aglutinante de Leishmania amazonensis.. Natal/RN 2015.

(2) ANTÔNIO MOREIRA MARQUES NETO. Uma nova lectina da esponja marinha Aplysina sp. (AplyL-1) com atividade citotóxica para célula tumoral (HeLa) e aglutinante de Leishmania amazonensis.. Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.. Orientador: Elizeu Antunes dos Santos.. Natal 2015.

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(4) Seção de Informação e Referência Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede Marques Neto, Antonio Moreira. Uma nova lectina da esponja marinha aplysina sp. (APLYL-1) com atividade citotóxica pra célula tumoral (HeLa) e aglutinante de leishmania amazonensis. / Antonio Moreira Marques Neto. – Natal, RN, 2015. 69f.. Orientador: Elizeu Antunes dos Santos.. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. 1. Análise cromatográfica – Dissertação. 2. Lectina - Dissertação. 3. Citotóxica - Dissertação. 4. Purificação - Dissertação. 5. Aglutinação – Dissertação. I. Santos, Elizeu Antunes dos. II. Título. RN/UF/BCZM. CDU 543.54.

(5) AGRADECIMENTOS:. Neste trabalho realizado durante os últimos dois anos, várias pessoas merecem a menção e meu obrigado. Primeiramente agradeço a toda minha família (que não é muito grande), em especial a “dona Eliane” minha mãe e quem me aguenta a mais tempo nesse planeta, obrigado pelo suporte (todos eles) e pela compreensão nos meus momentos de profunda agonia e desespero (rsrsrsrs). Aos meus irmãos meu muito obrigado pelo apoio e ‘‘quebra de galhos’’ diversos. Agradeço também ao meu orientador Prof. Dr. Eliseu Antunes dos Santos que demonstrou durante todos esses anos que é um profissional ético, competente, “gente boa”, ou seja, um exemplo a ser seguido. Um obrigado especial pelo fato de ter aguentado meus “dead lines” sem arrancar minha cabeça, e também ao fato de me ajudar a crescer naquilo que me apaixonei durante a graduação, que é estar como professor em uma sala de aula, carreira que pretendo seguir daqui em diante. Ao meu filho Gabriel, que também foi mais um que teve de aguentar um pai ocupado em plenas férias de verão, indo para o laboratório e vidrado no computador. Um dia você vai ler isso filho e ficara sabendo que você é muito importante para vida do seu pai. Não posso deixar de lembrar de uma pessoa muito especial que é a minha namorada e companheira, Marina Sampaio, esta mulher é incrível, inteligente, critica, sensível, linda e foi de fato minha maior conquista neste mestrado. Obrigado pela contribuição neste trabalho, tanto na parte experimental/teórica como na emocional. Para quem viveu 4 anos diários de LQFPB, sabe muito bem que este não é um laboratório comum, aprendi muito, fiz muitos amigos que me ajudaram a realizar esta conquista e a todos que eu esquecer de listar (abaixo) meu muito obrigado e passe lá no “lab” para tomar um café. Então vamos aos nomes, em primeiro lugar vem minha segunda mãe, ou minha mãe cientifica, que seja... a Paula Ivani assim como o professor Eliseu se.

(6) dedicou nos momentos em que precisei e sempre me passou os conceitos científicos e até comportamentais para me fazer crescer na carreira e sem dúvida foi uma peça fundamental ao meu crescimento, desde a iniciação cientifica até agora. A amiga Luciana Rabelo também merece meu muito obrigado, sempre disponível para quem gosta de trabalhar, me ensinou muito e teve paciência na maioria dos momentos que se fez necessário. O famigerado Delano Aníbal e nossa eterna discussão sobre a correta pronuncia da “goma guar”(ou goma guuaar), sem ele meu protocolo de purificação não sairia e também minha experiência no equipamento que se tornaria minha segunda paixão na carreira não aconteceria, obrigado Delanooo (“Nossinhora!”). Ao colega Jonalson, que fez das disciplinas obrigatórias mais obrigatórias ainda pela sua presença de espirito contagiante (VAGI......), Não esquecendo do Raphael Serquiz que me recebeu muito bem no laboratório e em toda conversa sempre acrescentou coisas interessantes (as vezes nem tanto...kkk) e inteligentes. Obrigado ao Anderson, Igor, Ticiana pela companhia, ajuda e momentos divertidos, a IC mais legal do mundo Virginia Batista por me esperar quando marcava logo cedo as 09:00hs e chegava as 10:00, aos novatos John e Leandro que também deram sua ajuda para esta dissertação, e a todos os que compõe o melhor “lab” do DBQ/UFRN se sintam agradecidos. Por fim agradeço a minha turma de mestrado com quem compartilhei momentos inesquecíveis, sejam pelo desespero com os artigos para o outro dia, seja nos carnavais fora de época que fazíamos (O nome da festa foi censurado). Diego, Sinara, Kahena, Demetrios, Paula, Evelim, João Paulo(J), Diego Rosa, Ricardo, Romulos(os dois kkK), Marilia... Muito obrigado!!!.

(7) “Não importa quanto a vida possa ser ruim, sempre existe algo que você pode fazer, e triunfar. Enquanto há vida, há esperança.” Stephen Hawking.

(8) RESUMO. Uma lectina com elevada atividade aglutinante sobre hemácias humanas dos vários tipos do sistema ABO foi purificada da esponja marinha Aplysina sp. por extração hidroalcoólica e uma sequência de etapas de purificação envolvendo cromatografias de gel filtração em Superdex 75 10/300 GL e de troca-iônica Resource Q (FPLC-AKTA Purifier). Após purificada, a lectina denominada AplyL-1, apresentou uma única cadeia peptídica com uma massa molecular de 40 kDa e com especificidade de ligação para D-galactose, D-galactosamina e lactose. A atividade hemaglutinante de AplyL-1 foi independente da presença de íons bivalentes e não foi alterada em condições básicas (acima de pH 7,0), mas bastante reduzida quando submetida a condições ácidas (abaixo de pH 6,0). Testes de termoestabilidade mostraram que AplyL-1 perde gradativamente sua atividade hemaglutinante a partir de 40ºC e não mais exibe atividade em 100ºC. Aply-L1 (10 µg/mL) foi testada frente a diversas linhagens tumorais, onde apresentou atividade citotóxica significativa para a linhagem de adenocarcinoma cervical humano (HeLa). Para a linhagem de célula normal 3T3 não foi vista atividade citotóxica. Em testes realizados com Leishmania braziliensis e Leishmania amazonensis, Aply-L1 exibiu a capacidade de aglutinar a espécie L. amazonensis (concentração de 77,5 µg/mL). Os resultados mostram que esta nova lectina ligante de derivados de galactose pode ser importante no desenvolvimento de produtos com importância biotecnológica e filogenética.. Palavras Chave: Lectina, Lactose, Purificação, Caracterização, Citotóxica, Aglutinação..

(9) ABSTRACT. A lectin with high binding activity under human erythrocytes of different types of ABO system was isolated from the marine sponge Aplysina sp. by hydroalcoholic extraction and a sequence of purification steps involving gel filtration chromatography on Superdex 75 10/300 GL and ion exchange chromatography on Resource Q (FPLC-AKTA Purifier). Once purified, the lectin, named AplyL-1, showed a single peptide chain with a molecular of weight 40 kDa and binding specificity for D-galactose, D-galactosamine and lactose. The AplyL1 hemagglutinating activity was independent of bivalent ions and was not changed in basic conditions (pH > 7.0), but significantly reduced when submitted into acid conditions (pH <7.0). Thermal stability tests showed that AplyL-1 gradually loses its hemagglutinating activity at 40 °C and no longer displays any activity at 100 °C. AplyL-1 has been tested against several tumour cell lines, and howed significantly cytotoxic activity (up to 10 µg/mL) only for human cervical adenocarcinoma cell line (HeLa). For the 3T3 normal cell line no cytotoxic activity was seen. In tests performed with Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis, AplyL-1 exhibited the ability to agglutinate only the species L. amazonensis (at a concentration 77.5 µg/mL). The results show that this new binding galactose derivatives lectin, could be important to development of new products with biotechnological and phylogenetic significance.. Key words:. Lectin,. Cytotoxic, agglutination.. Lactose,. Purification, characterization,.

(10) LISTA DE FIGURAS. Figura 1 - Classificação das lectinas quanto à quantidade e a composição dos domínios reconhecedores de carboidratos ...................................................... 14 Figura 2 - Estrutura das galectinas .................................................................. 18 Figura 3 - Estrutura geral das esponjas. .......................................................... 23 Figura 4 - Modelos de aplicação do uso de lectinas como alvos ou carreadores de drogas para células tumorais ...................................................................... 26 Figura 5 - Distribuição das espécies causadoras da LTA no Brasil. ................ 29 Figura 6 - . Esponja marinha Aplysina sp., ...................................................... 32 Figura 7 - Perfil cromatográfico da F1(1mg) na coluna superdex75; ............... 42 Figura 8 - Perfil cromatográfico obtido após aplicação de 1mg de P2s75 na coluna Resource Q ........................................................................................... 43 Figura 9 - Perfil Eletroforetico dos passos de purificação de AplyL-1 .............. 44 Figura 10 - Inibição da Hemaglutinação de APLYl-1. ...................................... 45 Figura 11 - Curva de termoestabilidade de AplyL-1. ....................................... 46 Figura 12 - Efeito de diferentes pH na atividade hemaglutinante d eAplyL-1. . 46 Figura13 - Analise do efeito de AplyL-1 frente as diferentes linhagens celulares normais e tumorais ............................................................................ 47 Figura 14 - Efeito de AplyL-1 sobre a linhagem tumoral HeLa.. ...................... 48 Figura 15 -Fotogmicrografias de Leishmanias tratadas com por AplyL-1 ....... 49.

(11) LISTA DE TABELAS. Tabela 1- Classificação de lectinas animais quanto à sua estrutura e especificidade de ligação a carboidratos ............................................................ 16 Tabela 2 - Variedade de funções de lectinas em diferentes organismos. ........... 20 Tabela 3 - Lectinas de invertebrados Marinhos.....................................................22 Tabela 4 - Atividade Hemaglutinante do extrato Bruto da Esponja Aplysina sp....40 Tabela 5 - Atividade hemaglutinante das Frações proteicas obtidas com adição de acetona ao extrato bruto................................................................................... 41 Tabela 6 - Resultados de todas as etapas de purificação da Lectina da esponja marinha Aplysina sp. AplyL-1. .............................................................................. 43.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS. DRC. Domínio de Reconhecimento a Carboidrato EDTA. Ácido etilenodiamino-tetra-acético. kDa. Quilodaltons Ca2+. Cálcio. Mg2+. Manganês. Mn2+. Magnésio. HeLa. Células de câncer cervical. SDS. Dodecilsulfato de Sódio. ELISA. Ensaio de Ligação Imunoenzimática.

(13) Sumário 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 13 1.1. LECTINAS .......................................................................................... 13 1.2. CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS ................................................... 13 1.2.1. LECTINAS DE ORIGEM ANIMAL ................................................ 15 1.2.2. GALECTINAS ............................................................................... 17 1.3. Distribuição nos organismos e funções biológicas: ..................... 18 1.4. Lectinas em invertebrados: .............................................................. 20 1.5. Esponjas Marinhas e Suas Lectinas................................................ 22 1.6. Aplicações das Lectinas: ................................................................. 24 1.7. CÂNCER: ............................................................................................ 26 1.8. LEISHMANIOSE: ................................................................................ 28 2. OBJETIVOS: ............................................................................................. 31 2.1. Objetivo Geral .................................................................................... 31 2.2. Objetivos específicos ....................................................................... 31 3. Materiais e métodos: ............................................................................... 32 3.1. Esponja .............................................................................................. 32 3.1.1. Classificação Taxonômica ............................................................ 32 3.2. Coleta da Esponja: ............................................................................ 33 3.3. Eritrócitos Humanos ......................................................................... 33 3.4. Linhagens celulares .......................................................................... 33 3.5. Obtenção do extrato proteico .......................................................... 33 3.6. Fracionamento com Acetona ........................................................... 34 3.7. Técnicas cromatográficas de purificação ....................................... 34 3.4.1. Cromatografia de Exclusão Molecular .......................................... 34 3.4.2. Cromatografia de Troca Iônica ..................................................... 34 3.8. Determinação proteica ...................................................................... 35 3.9. Eletroforeses em gel de poliacrilamida ........................................... 35 3.10. Ensaios de Hemaglutinação ......................................................... 36 3.3.1. Lavagem do sangue ..................................................................... 36 3.10.2. Tratamento enzimático dos eritrócitos .......................................... 36 3.4.3. Teste de atividade hemaglutinante ............................................... 36 3.10.4. Teste de Inibição da Hemaglutinação por carboidratos: ............... 36 3.10.5. Efeito de íons bivalentes na atividade hemaglutinante: ................ 37 3.11. Efeito do pH sobre a Atividade da Lectina: ................................. 37 3.12. Efeito da Temperatura sobre a Atividade da Lectina .................. 37 3.13. Atividade Citotóxica....................................................................... 38 3.14. Teste de aglutinação com Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania amazonensis. .......................................................................... 38 4. Resultados: .............................................................................................. 40 4.1. Detecção de lectinas no extrato bruto da esponja marinha.

(14) Aplysina sp.: ................................................................................................ 40 4.2. Atividade Hemaglutinante das frações obtidas por precipitação com acetona ................................................................................................ 40 4.3. Estabelecimento de um protocolo para purificação da proteína a partir do fracionamento com Acetona: ..................................................... 41 4.4. Cromatografia de Exclusão Molecular em Sistema de FPLC-AKTA Purifier: ........................................................................................................ 41 4.5. Cromatografia de Troca Iônica – Resource Q: ............................... 42 4.6. Eletroforese em gel de poliacrilamida- SDS/PAGE: ....................... 43 4.7. Teste de Inibição da Hemaglutinação por carboidratos: ............... 44 4.1. Efeito da Temperatura sobre a Atividade da Lectina AplyL-1: ...... 45 4.2. Efeito de íons bivalentes na atividade hemaglutinante: ................ 45 4.1. Efeito do pH sobre a Atividade da Lectina: .................................... 45 4.2. Testes de Viabilidade Celular em linhagem celular HeLa: ............ 47 4.3. Teste de aglutinação com Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania amazonensis............................................................................. 13 5. Discussão ..................................................................................................... 48 6. Referências................................................................................................... 53.

(15) 13. 1. INTRODUÇÃO. 1.1.. LECTINAS. Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos de forma reversível e especifica, e não possuem origem imunológica (LORIS et al., 2002). Este grupo de moléculas pode ser encontrado em diversos organismos de vários taxa, o que as torna ubíquas (KENNEDY et al.,1995). A primeira lectina descoberta foi da planta Ricinus communis, sendo denominada ricina, quando se estudava os efeitos tóxicos do extrato desta planta, conhecida popularmente como mamona (BARONDES et al., 1988). A característica encontrada nas lectinas de aglutinar células, em especial eritrócitos, lhe concedeu a designação de aglutininas. A nomenclatura dada às lectinas pode ser originada por diversos motivos como, denominação científica das espécies em que são extraídas, de acordo com o protocolo de purificação, especificidade de ligação com o açúcar, ou ainda pela designação do tecido do qual foi obtida a lectina. A lectina conhecida como favina, por exemplo, é purificada da espécie Vicia faba, a concanavalina A é uma lectina purificada da espécie Canavalia ensiformis, e a lectina específica para Dgalactose/N-acetil-D-galactosamina extraída de Erythrina cristagalli é nomeada ECA (KENNEDY et al.,1995). A ligação com os carboidratos acontece graças a uma região chamada DRC (Domínio Reconhecedor de Carboidratos), que se localiza na porção N-terminal e se apresenta bastante conservada para cada tipo de lectina (NI. et al.,1996).. 1.2.. CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS. Devido à grande quantidade de estruturas e especificidades de ligação, as lectinas formam um grande grupo heterogêneo. Essa grande variabilidade de características encontradas nas lectinas dificulta o trabalho de classificação, podendo então afinidade com carboidratos, similaridades na sequência de aminoácidos e a origem biológica serem considerados para discriminar grandes grupos dessas moléculas (KIRAN KUMAR, 2012). Em vertebrados podemos.

(16) 14 distinguir as lectinas devido à sua solubilidade; um tipo é formado por proteínas que se encontram solúveis e conseguem ser extraídas com soluções salinas e aquosas, outro tipo são proteínas de membrana que requerem detergentes para que sejam solubilizadas e extraídas (LIENER et al 1981).. MEROLECTINAS. HOLOLECTINAS. QUIMEROLECTINAS. SUPERLECTINA DRC. Figura 1 - Classificação das lectinas quanto à quantidade e a composição dos domínios reconhecedores de carboidratos. Adaptada de Van Damme et al; 1998. A origem biológica dessas diversas lectinas é usada para separá-las em grandes grupos, sendo as lectinas de origem vegetal o grupo mais bem estudado, tendo sua pesquisa iniciada em 1988 (BARONDES et al., 1998). Enquanto a primeira publicação de uma lectina de origem animal foi feita no ano de 1974 (STOCKERT et al., 1974), apesar de vários indícios sugerirem a presença de lectinas em venenos de serpentes antes disso (KILPATRICK et al., 2002). Devido a estes dois grandes grupos de lectinas possuírem uma composição heterogênea de proteínas, foi necessário aprofundar mais os critérios de classificação dentro deles. Outra característica generalista das lectinas que é usada para sua classificação é a quantidade e a variedade de domínios reconhecedores de carboidratos em uma mesma proteína (VAN DAME et al; 1998)..

(17) 15 Neste contexto PEUMANS e VAN DAMMME , (1995) agruparam essas proteínas em três grupos (Figura 01). O primeiro deles são proteínas com apenas um domínio reconhecedor de carboidratos (DCR) chamadas Merolectinas, estas também possuem pequeno tamanho e não possuem a capacidade de aglutinar células; o segundo grupo é composto por lectinas com no mínimo dois DCR´s idênticos. ou. com. estrutura. bem. similar,. as. chamadas. Hololectinas. diferentemente das merolectinas são capazes de aglutinar células e precipitar glicoconjugados. Por fim temos as quimerolectinas, estas lectinas possuem um ou mais DCR´s interligados a outro domínio distinto, que por sua vez pode possuir atividade enzimática dentre outras atividades biológicas. Posteriormente PEUMANS e VAN DAMMME (1998) identificaram um quarto grupo de lectinas chamado, superlectinas (Figura 01), que possuíam no mínimo dois DCR´s de diferentes estrutura e especificidade.. 1.2.1. LECTINAS DE ORIGEM ANIMAL As lectinas de origem animal têm sido estudadas mais profundamente a pouco mais de 40 anos, aumentando significantemente a quantidade de lectinas conhecidas a cada ano. Inicialmente, as lectinas animais foram divididas em 2 grupos, as do tipo C, que eram dependentes de cálcio para sua atividade, e as do tipo S que dependiam de um grupo tiol para seu perfeito funcionamento (DRICKAMER et al., 1993). Com a criação de novas cromatografias foi possível a purificação, caracterização e sequenciamento de diversas lectinas. Isto aumentou consideravelmente o conhecimento novas características presentes nessas moléculas e novas formas de classificação (DIAS et al., 2015). Uma delas foi usar os componentes estruturais, já que foi evidenciada uma grande variabilidade de estrutura nessas proteínas, entretanto a especificidade por carboidratos não se mostrou totalmente relacionada com as características estruturais dessas proteínas, podendo estruturas diferentes se associarem ao mesmo carboidrato(Tabela 1). As funções biológicas apresentadas por diferentes lectinas também ajudaram em sua classificação, como as Calreticulinas e Calnexinas, que possuem atividades de chaperona, auxiliando no enovelamento correto de.

(18) 16 proteínas. Essas duas lectinas se localizam no reticulo endoplasmático, sendo as calreticulinas presentes no lúmem, e as calnexinas proteínas transmembrana (MULLER et al., 2001). Outra forma de se classificar as lectinas animais é relacionar sua estrutura e sua especificidade de interação com determinados carboidratos, esse tipo de abordagem foi o que possibilitou a classificação das galectinas, um dos maiores grupos de lectinas animais conhecidos atualmente. Tabela 1- Classificação de lectinas animais quanto à sua estrutura e especificidade de ligação a carboidratos (Adaptado de Murphy P.V et al 2013).. TIPO DE ESTRUTURA. β-sandwich (Jelly-roll). EXEMPLO DE LECTINA. EXEMPLO DE LIGANTE. Glc1; Man9; GlcNAc2 βgalactosideos calnexin, calreticulin galectinas glicosaminoglicanos, pentraxinas Man-6-fosfato collectinas selectinas Fucose, Galactose , Manose,. Tipo-C. heparina Tetrassacarideos. Tipo-I. Tipo-P. N-CAM Receptores de Manose6fosfato. Man6GlcNAc2, HNK-1 epitope, α2,3. Manose-6-fosfato,. Fator de crescimento de β-trefoil. GalNAc fibroblasto taquilectina-4, eel (Anguilla β-. barril com topologia jelly- anguilla). β-propeller. Fucose roll aglutinina, Xepilectina tachylectin-3 tachylectin-2 tachylectin-1. Lipossacarídeo tipo-S GlcNAc/GalNAc KDO.

(19) 17. 1.2.2. GALECTINAS. As galectinas são um dos grupos mais bem estudados e bem caracterizados de lectinas e têm como características principais a interação com βgalactosídeos e a presença de elementos conservados na sua estrutura, especificamente o domínio reconhecedor de carboidratos (COOPER et al., 2002). A primeira galectina relatada foi a eletrolectina, purificada de uma espécie de enguia elétrica, que demonstrou atividade hemaglutinante, sendo inibida na presença de β– galactosídeos. Inicialmente, elas foram agrupadas nas lectinas do tipo S, mas com o crescimento de suas caracterizações ganharam sua própria designação, . (CUMMINGS et al., 2009). As galectinas podem ser divididas em três tipos distintos dependendo da forma como seus domínios reconhecedores de carboidratos (DRC) se organizam. Quando possuem um tipo de DCR são chamadas de prototípicas, estas ainda possuem a capacidade de interagir para formar dímeros. Se a proteína possuir um DCR e a região n-terminal for rica em prolina, glicina, e resíduos de tirosina estas são chamadas de quimeras. Por fim, quando possui mais de um DCR ligados por um peptídeo de ligação são nomeadas de tandem repeat (Figura 2) (VASTA et al, 2012). As funções das galectinas estão relacionadas com diversos processos biológicos como apoptose (HSU, YANG, LIU, 2006), resposta imunológica (STOWELL et al., 2008), auxilio na invasão de parasitas (VASTA, TASUMI , 2007) e adesão celular (MARTINEZ et al 2004), o que indica que galectinas purificadas podem ser usadas como possíveis ferramentas para aplicações biotecnológicas..

(20) 18. A. B Figura 2 - Estrutura das galectinas: A. Galectinas (a) prototípicas, (b) quimeras e (c) “tandem repeat”. B. Estrutura da galectina-1, complexo tiodigalactosideo (TDG), onde cada subunidade do dímero se liga a um único oligossacarídeo. (adaptada de Vasta G.R 2012).. 1.3. Distribuição as lectinas nos organismos e suas funções biológicas As lectinas podem ser encontradas em quase todos os organismos vivos independente da ordem taxonômica, como, por exemplo em microrganismos, plantas, fungos,. animais invertebrados e animais vertebrados, sendo. encontradas em maior quantidade em sementes de leguminosas e gramíneas (MANCINI et al., 1979). A presença de lectinas em diversos organismos e, em especial, sua distribuição abundante nas plantas, sugerem que estas possuem funções fisiológicas importantes bem definidas (Tabela 2) (LIENER, 1976; ETZLER, 1985). As funções das lectinas em plantas e tem relação com diversos processos fisiológicos normais, como os estágios de maturação e germinação das sementes diretamente relacionados com os mecanismos de defesa da planta contra o ataque de fungos e bacterias (KOVALCHUK NV. 2006). Além disso novas funções vem sendo estudadas como a interação com o indol-3-acético (IAA), interferindo na atividade hormonal deste composto ( DELATORRE P. et al., 2013).

(21) 19 As lectinas presentes em membranas de células humanas, como nas células dendríticas, que podem agir na infecção do vírus da AIDS através da interação vírus-lectina, possibilitando a entrada destes nas células (CHAGAS K. N 2005). Em microrganismos (bactérias, protozoários e vírus) também são encontradas diversas lectinas que tem a função de permitir a adesão às estruturas celulares em que são encontrados (SZE K.L., TZE B. N., 2011). Por exemplo, a bactéria Peseudomonas aeruginosa possui duas lectinas (PAL-I ePAL-2) que auxiliam na ligação das bactérias à célula pulmonar do hospedeiro, gerando lesões que foram diminuídas após a inibição das lectinas por seus carboidratos específicos (CHEMANI C. et al., 2009). A primeira identificação de lectinas em animais foi feita a partir de venenos de cobras por Flexner e Noguchi no ano de 1902 quando observaram que o veneno possuía a capacidade de aglutinar eritrócitos humanos. Posteriormente, foram descobertas outras lectinas de origem animal, como a aglutinina de caranguejo ferradura, a conglutinina que foi a primeira lectina animal associada com o sistema imune; aglutininas de enguia, que tiveram sua aplicação na determinação de tipo sanguíneos; lectina hepática de coelho (primeira lectina de mamífero); eletrolectina (de peixe elétrico); selectinas e outras(OGAWA. et al., 2011). Dentre as diversas funções das lectinas, a que apresenta maior destaque é a de reconhecimento do próprio e não-próprio, aparecendo em muitas das lectinas conhecidas, esta função é de suma importância nos processos de defesa contra patógenos, outras funções já encontradas são: participação no tráfego celular, regulação imunológica e na prevenção de doenças autoimunes (KILPATRICK et al., 2002). Lectinas com especificidade para galactose e com atividade hemolítica foram encontradas no caranguejo ferradura (se liga ao ácido siálico), e no equinoderma Cucumaria echinata) (ARMSTRONG et al., 1996 e HATAKEYAMA et al.,1995). Esse processo de lise celular ocorre após ligação da lectina com a cadeia de carboidrato presente na superfície dos eritrócitos HATAKEYAMA . et al., 1995 ).. (.

(22) 20 Tabela 2 - Variedade de funções de lectinas em diferentes organismos.. MICRORGANISMOS PLANTAS • Aglutinam eritrócitos (E. • Maturação/germinação sementes (HOWARD coli) ( BASU et al et al., 1972). 2004). •. Início infecção Influenza por • Mecanismo hemaglutinina ( defesa CHAGAS, KN 2005). contra ataque fungos et al., 2015).. •. Reconhecimento célula -célula (SHARON et al., 1989).. •. Ligação de organismos em células hospedeiras (DIGGLE et al., 2006). •. Lectinofagocitose (OFEK I e SHARON N 1988). 1.4.. •. •. ANIMAIS Defesa contra patógenos ( NEYROLLES et al., 2015). Tráfego celular (HAURLI et al., 2000).. (DIAS •. •. •. Regulação imunológica (LIU et al., 2005). Prevenção de doenças autoimunes (FREED et al.,1999). Aglutinação de células cancerosas (NITTA et al.,1987). Lectinas em invertebrados: Os invertebrados são seres que não possuem um sistema imunológico bem. organizado. A deficiência de células específicas para esta função poderia ser crucial para estes organismos, entretanto estes conseguem prosperar em diversos ambientes mesmo com esse déficit imunológico, isto ocorre devido a presença de moléculas bioativas que assumem a função de defesa. Neste espectro as lectinas possuem função primordial, pois sua habilidade de reconhecer padrões de glicosilação torna possível reconhecer padrões não próprios dos indivíduos, (RENWRANTZ, 1986; ARAZON, 1996; MATSUSHITA, 1996; WILSON et al., 1999; VASTA et al., 1999). As lectinas também podem ter papel de opsonização, aglutinando microrganismos e facilitando a fagocitose, ou mesmo impedindo sua.

(23) 21 disseminação. O reconhecimento de moléculas não próprias pode ocorrer quando as lectinas presentes na membrana das células do invertebrado reconhecem padrões glicídicos dos patógenos, outra maneira pode ser a interação da lectina do patógeno com o carboidrato da membrana das células do tecido, e por fim as lectinas humorais que se ligam aos glicoconjugados do invasor, marcando este para que as células possam reconhecer estes indivíduos invasores (RENWRANTZ, 1983). Ainda há outras funções atribuídas às lectinas de invertebrados, como participação na mineralização de cracas da espécie Megabalanus rosa (KAMIYA, 2002), morfogênese do tunicado Polyandrocarpa misakiensise, lise de membrana vitelínica da ostra Mytilus edulis (TAKAGI, 1994; MUTA et al., 1991) e, nesta última espécie, uma lectina parece também estar envolvida na captura de alimento (ESPINOSA, PERRIGAULT, ALLAM, 2010). Já foram purificadas diversas lectinas de invertebrados e investigadas suas potenciais aplicações biotecnológicas como a lectina do molusco Aplysia kurodai, que possui atividade citotóxica em células leucêmicas da linhagem K562. A maioria da lectinas purificadas de invertebrados marinhos são lectinas do tipo-C (OGAWA et al, 2011)(Tabela 3).. 1.5.. Esponjas Marinhas e Suas Lectinas As esponjas são organismos predominantemente marinhos, pertencentes. ao filo Porífera, possuem origem no período cambriano, que compreende uma faixa de 542 a 488 milhões de anos atrás, aproximadamente. Esses organismos são primitivos em sua essência, não possuem órgãos, nem tecidos bem definidos e sua disposição celular lembra uma colônia de protozoários (BELL; BARNES, 2001). O crescimento assimétrico e a grande diversidade de cores e tamanhos são características deste táxon, que utilizam de seu corpo formado por canais de água para capturar alimento e realizar digestão intracelular. Além disso, a respiração e a excreção ocorrem por difusão direta entre a água que circula pelos canais e as células do animal (LUCANO, 2003)..

(24) 22. Tabela 3 - Lectinas de invertebrados Marinhos. Adaptada de OGAWA et al, 2011. ORGANISMO LECTINA CARBOIDRATO FAMÍLIA REFERÊNCIA ESPECIFICO Tridacna máxima (Molusco) Haliotis laevigata (Molusco) Megabalanus rosa (Artrópode) Balanus rostratus (Artrópode) Cucumaria echinata (Echinoderma) Cucumaria echinata (Echinoderma) Stichopus japonicu (Echinoderma) Tachypleus tridentatus (Artrópode) Tachypleus tridentatus (Artrópode). Tridacin. N-acetyl galactosamine. Tipo-C. BALDO et al., 1978. PLC. D-Galactose DManose. Tipo-C. WEISS et al., 1990. BRA-1. D-Galactose. Tipo-C. WEISS M. et al 2000. BRL. D-Galactose. Tipo-C. MURAMOTO K. et al 1996. CEL-IV. GlcNAcGalactose. Tipo-C. HATAKEYAMA T. et al 2011. CEL-III. GlcNAc. Tipo-C. HATAKEYAMA T. et al 1995. SJL-1. D-Galactose. Tipo-C. MATSUI T. et al 1994. TL-3. LPS (Oantigen). Tipo- F. SAITO T. et al., 1997. TL-4. LPS (Oantigen). Tipo- F. INAMORI K. I. et al., 1999. As células que compõem as esponjas são pouco variadas, mas com funções especificas. Na parede do corpo encontramos, externamente, a epiderme com função protetora; o mesênquima, localizado internamente, possui células chamadas amebócitos que distribuem o alimento que é capturado pelos coanócitos para o restante das células do animal. Os coanócitos são células flageladas, localizadas na parte interna do corpo das esponjas e possuem função de capturar alimento (figura 3). Ainda no mesênquima, podemos encontrar as espículas calcárias ou silicosas, que têm função de sustentação para o corpo do animal e servem também para identificar espécies. (BELL; BARNES, 2001).Existem também esponjas sem espículas (córneas) que possuem esqueleto de fibras de espongina (LUCANO, 2003)..

(25) 23 As esponjas são um reservatório de moléculas bioativas devido a sua biologia, por ser séssil e viver em um ambiente altamente disputado, dividindo espaço com diversas espécies de organismos. Estes organismos desenvolveram um arsenal de moléculas para conquistar espaço neste ambiente repelindo predadores (PAWLIK; MCFALL; ZEA, 2002), competindo por espaço com outros organismos sésseis e se protegendo de infecções (BECERRO; TURON; URIZ, 1997).. Figura 3 - Estrutura geral das esponjas. Adaptada do site http://fossil.uc.pt/pages/fbm_porifera.dwt (acessado em: 27/03/2014).. A pesquisa com moléculas de esponjas se tornou intensificada quando se isolou um componente anti-HIV da esponja Niphates erecta (O'KEEFE BR. et al., 1997). O registro das primeiras lectinas isoladas de esponjas foi realizado por DODD e colaboradores em 1968 (DODD; MACLENNA; HAWKINS, 1968). MIARON e FRESNO(2000) realizaram um levantamento com 22 espécies de esponjas do mar do Caribe e foi verificada a presença de lectinas em diversos gêneros, em especial o Aplysina (MIARONS; FRESNO, 2000). Recentemente foram purificadas e caracterizadas diversas lectinas de diferentes espécies de esponjas e estudadas suas atividades heterológas, como a lectina CaL, da.

(26) 24 esponja Cinachyrella apion, que induz a morte celular em células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa) (RABELO, 2012), e a lectina de 18 kDa purificada da esponja Halichondria okadai, que apresentou atividade citotóxica para células T leucêmicas (MATSUMOTO R. et al. 2012). Uma lectina foi purificada da esponja Tedania ignis eapresentou capacidade de aglutinar formas promastigotas de Leishmania chagasi (DIAS, 2006). Além dessas atividades foram identificadas lectinas com relacionadas aos processos de quimiotaxia, ativadora da produção de citocinas, modulatória de canais iônicos, mitogênica e pró-inflamatória (GOMES FILHO et al, 2014).. 1.6.. Aplicações Biotecnológica das Lectinas. As aplicações das lectinas são diversas e estão relacionadas principalmente com as áreas biomédicas e agroindústria. Isso é devido às suas funções fisiológicas normais, como de defesa em plantas contra diversos patógenos (PEUMANS and VAN DAMME, 1995) (TRIGUEROS et al., 2003) e atividades anti-inflamatórias, antitumorais, antivirais (ASSREUY et al., 1999; ASSREUY et al., 1997; RABELO et al., 2012; YANG et al., 2011), mitogênicas (BARKER e FARNES, 1967; NOVOGRODSKY e KATCHALSKI, 1971; SUZUKI et al., 1979; IGLESIAS et al., 1982; KOLBERG e SLETTEN, 1982; WANTYGHEM et al., 1986; FREIR e RUDGER, 1990; LICASTRO et al., 1991; RYDER et al., 1992), caracterização de estágios de desenvolvimento de tripanossomatídeos (MACGRECOR et al., 1985) e para diferenciar in vitro a forma amastigota da promastigota de Leishmania donovani (Wilson e Pearson, 1984).. A capacidade dessas moléculas interagirem com diversos tipos de células, desde microrganismos a organismos complexos, abre grandes possibilidades para diversas aplicações biotecnológicas. Os estudos nesse sentido estão sendo bastantes explorados e uma das áreas mais estudadas é o uso das lectinas para testes diagnósticos, pois os mesmos glicanos que as lectinas se ligam podem estar relacionados com diversos tipos de doenças, como infecções e câncer (FUSTER; ESKO, 2005)..

(27) 25 No câncer a modificação dos padrões de glicosilação são relacionados a processos de metástases e não reconhecimento do sistema imunológico (COULDREY; GREEN, 2000), tornando as lectinas alvo para reconhecer essas diferenças nesses padrões e diferenciando células normais de tumorais, podendo também indicar o quanto maligno é aquele tumor. Em outro modelo de diagnóstico os alvos são glicoproteínas plasmáticas que também possuem seus padrões de glicosilação ou níveis de expressão alterados quando suas células secretoras são tumorais, o que acontece no caso do câncer de pâncreas, que exibe padrões de expressão diferentes para a glicoproteína Alpha-1-β. Esses padrões podem ser quantificados por um ensaio ELISA com a associação anticorpo/glicoproteína/lectina, levando a uma diferença na detecção da Alpha-1-β em pacientes com e sem câncer pancreático (CHEM LI et al., 2009). As lectinas ainda podem desenvolver papéis cruciais no tratamento do câncer, como no endereçamento de drogas usando lectinas tanto como alvo como carreadores (GHAZARIAN; IDONI; OPPENHEIR, 2009) (Figura 4) .. Droga. Droga Espaçador Lectina exógena. Carboidrato exógeno Lectina endógena. Espaço extracelular. Carboidrato endógeno. Membrana Celular. Citoplasma. Figura 4 - Modelos de aplicação do uso de lectinas como alvos ou carreadores de drogas para células tumorais (Adaptada de GHAZARIAN et al., 2009).. 1.7.. CÂNCER: O crescimento desordenado de células gerado por diversos tipos de falhas. no controle de crescimento celular é responsável por caracterizar um conjunto.

(28) 26 de mais de 150 doenças chamadas de câncer. Essa desordem de crescimento gera tumores que conseguem burlar os sistemas de defesa do organismo e se desenvolverem (WEINBERG et al., 2008). O câncer se origina geralmente de mutações ocasionadas por exposições a agentes carcinogênicos, como reagentes químicos e radiações ultravioletas. Mesmo dentro de tumores histopatologicamente idênticos podem se diferir os processos que levaram à sua formação, processos tais como mutações pontuais, amplificações, translocações e deleções (STRATTON; CAMPBELL; FUTREAL, 2009). Uma alteração celular recentemente associada ao câncer é a modificação nos padrões glicídicos das células tumorais (DUBE et al., 2005), sendo resultado de alterações na regulação das enzimas envolvidas nas construções das regiões glicídicas de muitas proteínas, como no caso da enzima Nacetilglicosaminiltransferase V, que em testes in vitro e in vivo mostrou aumentar as chances de proliferação, migração e invasão de células tumorais HepG2, tornando-se diretamente relacionada com a malignidade deste tipo de célula (WEI et al, 2012). Um dos tipos de cânceres que mais causam mortes em mulheres é o câncer de colo de útero que representa 8% (275.100) de todas as mortes causadas por câncer no mundo e 9% (529,800) de novos casos de cânceres relatados em 2008 (JEMAL et al, 2011). O tratamento deste tipo especifico de câncer é feito por radioterapia e quimioterapia (ENDO D. et al 2015). O conhecimento sobre como essas células se diferenciam das demais poderá tornar o combate a elas mais seletivo e uma destas formas de diferenciação pode ser feita pelos padrões de glicosilação, entretanto, pouco se sabe sobre os padrões de glicosilização das células de câncer de colo do útero. Uma recente análise bioinformática revelou que um grande número de glicoproteínas da linhagem de câncer cervical HeLa foram identificadas como possíveis biomarcadores de malignidade (MARELOD. et al., 2013). O tratamento do câncer pode se dar de diversas maneiras e dentre elas está a quimioterapia, a qual não atua com especificidade nas células malignas, ocasionando diversos efeitos colaterais. Este fato reforça a necessidade da procura de novas moléculas que interajam especificamente com as células.

(29) 27 tumorais diminuindo os riscos e desconfortos dos tratamentos atuais. As lectinas são moléculas que podem ajudar no tratamento do câncer tanto no diagnóstico (MODY JOSHI; CHANEY, 1995), quanto no endereçamento de drogas a células especificas (GHAZARIAN; IDONI; OPPENHEIR, 2009).Por exemplo, várias lectinas são utilizadas para selecionar biomarcadores de células tumorais, como o quando foram analizadas aa distribuições de N-acetilgalactosomina e Nacetilglicosamina em glioblastomas, tornando estes carboidratos indicadores deste tipo celular ( BURDEN C.T. et al., 2012). Em outro caso se observa a produção de um biopolímero revestido de lectinas auxiliando na entrega de drogas a alvos específicos, como em células do trato gastrointestinal (TAO S.L. et al., 2003).. 1.8.. LEISHMANIOSE: Segundo o Ministério da Saúde a leishmaniose é considerada tanto uma. zoonose quanto uma antropozoonose, pois o homem entra em contato com o ciclo de transmissão do parasita, sendo atualmente classificada como uma entre as seis endemias prioritárias no mundo. O primeiro caso no Brasil ocorreu em 1913 no município de Boa Esperança-Mato Grosso (ALENCAR; DIETZE, 1991), a partir daí a doença foi descrita em vários locais do Brasil predominando ambientes rurais e periurbanos. O agente etiológico dessa patologia são protozoários tripanossomatídeos do gênero Leishmania, que podem ser encontrados em duas formas, amastigota e promastigota, durante o seu ciclo de vida. A forma amastigota está diretamente relacionada com o hospedeiro humano, pois se desenvolve em células do sistema imunológico como monócitos e macrófagos. A forma promastigota é uma forma flagelada extracelular que geralmente se desenvolve no intestino do vetor (BARBOSA, 2012). Dentro da forma promastigota ainda podemos observar as formas procíclicas e metacíclicas, não infectantes e infectantes, respectivamente (AWASTHI; MATHUR; SAHA A 2004). As espécies Leishmania. braziliensis e Leishmania amazonensis são. agentes causadores da leishmaniose tegumentar americana (LTA), infectando.

(30) 28 diversos animais como homens, cães, roedores domésticos e marsupiais. A LTA causa lesões na pele e mucosas, além de dor no hospedeiro. Ela está distribuída em todo território nacional e foi considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma das seis doenças infecciosas mais importantes em âmbito mundial (BASANO; CAMARGO, 2004). As poucas formas de tratamento conhecidas tornam o controle desta zoonose mais difícil, reforçando a necessidade da formulação de novas drogas mais acessíveis para a população de baixa renda. A distribuição destas espécies ocorre em todo Brasil, (MINISTERIO DA SAÙDE, 2003) (Figura 5). Na região nordeste do país temos diversos casos evidenciados com registros de epidemias em vários locais da região, como as cidades de Natal/RN, São Luiz e Aracaju onde as espécies de Leishmania chagasi são as mais encontradas, estas espécies são as causadoras da Leishmaniose visceral (GONTIJO C.M.F e MELO M. N 2004).. Figura 5 - Distribuição das espécies causadoras da LTA no Brasil: as espécies Leishmania braziliensis e Leishmania amazonensis ocorrem em todo país..

(31) 29. O diagnóstico laboratorial pode ser feito por ensaio imunoenzimático (ELISA), mas a identificação da espécie e forma de desenvolvimento do parasita pode ser invasiva, como a punção aspirativa da medula óssea (MINISTERIO DA SAÙDE, 2003). Neste contexto, as lectinas podem atuar tanto no diagnóstico, como para estudos das formas de desenvolvimento do parasita, até mesmo a purificação de populações metacíclicas mais homogêneas, para utilização em estudos que utilizam de infecções experimentais como modelo de análise (BARBOSA, 2012). Algumas lectinas já mostraram interagir com formas promastigotas de Leishmania chagasi como a lectina da esponja marinha Cinachyrella apion, que mostrou ser capaz de se aglutinar esses parasitas (MEDEIROS, D. S et al.; 2010). Dados como estes reforçam o estudo de lectinas para entender a composição glicídica do parasita considerando alguma mudança nesta composição quando se muda a forma de desenvolvimento.. Diante de todos os fatos científicos apresentados se faz necessário tanto um maior estudo das características químicas, físicas e biotecnológicas dessas moléculas, como um considerável aumento na biblioteca de lectinas purificadas, principalmente de lectinas de invertebrados, já que estas ainda são pouco exploradas na bibliografia cientifica. A elucidação de como essas proteínas se comportam em contato com parasitas e células tumorais pode gerar novos conhecimentos em busca de métodos de tratamento mais eficazes..

(32) 30. 2. OBJETIVOS: 2.1.. Objetivo Geral. Purificar e caracterizar uma lectina da esponja marinha Aplysina sp. e testar sua atividade frente à proliferação de células tumorais e capacidade de aglutinação de cepas de Leishmania.. 2.2.. Objetivos específicos. Caracterizar a lectina purificada quanto à(ao): •. Massa molecular;. •. Especificidade de ligação a diferentes tipos sanguíneos e carboidratos;. •. Efeito de pH sobre sua atividade hemaglutinante; • Efeito da temperatura sobre sua atividade hemaglutinante;. •. Dependência por íons bivalentes.. Testar a lectina isolada quanto às atividades: •. Citotóxica “in vitro”;. •. Capacidade de aglutinar diferentes espécies de Leishmanias;.

(33) 31. 3. Materiais e métodos: 3.1.. Esponja. 3.1.1. Classificação Taxonômica Esponja marinha Aplysina sp. (Figura 6) Filo: Porifera (GRANT, 1836) Classe: Demospongiae (SOLLAS, 1885) Subclasse Ceractinomorpha (LÉVI, 1953) Ordem: Verongida (BERGGUIST, 1978) Família: Aplysinidae (CARTER, 1875) Gênero: Aplysina (NARDO, 1834). Figura 6 - . Esponja marinha Aplysina sp., A- espécimes fixados; B- reticulação de fibras de espongina; C- detalhe das fibras de espongina. Disponível em http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/4especies/ceractinomorpha/verongida/aplysinasp/aplysinasp .htm. Acesso em 28 de Janeiro de 2013..

(34) 32 3.2.. Coleta da Esponja:. A esponja marinha da espécie Aplysina sp. (Figura 6) foi coletada na praia de búzios (Latitude: -6.09359, Longitude: -35.2104 6° 5′ 37″ Sul, 35° 12′ 37″ Oeste), localizada no litoral sul do Estado do Rio Grande do Norte. Em seguida os espécimes foram refrigerados, a uma temperatura de -10 ºC, até serem dissecados para o estudo.. 3.3.. Eritrócitos Humanos. Os eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O foram obtidos através de doações de bolsas de sangue, fora do prazo de validade para transfusões, pelo HEMOCENTRO – RN.. 3.4.. Linhagens celulares. As linhagens celulares de adenocarcinoma cervical humano (HeLa), fibroblasto murinho imortalizado (3T3), melanoma de pele de Mus musculus (B16-F10), adenocarcinoma alveolar humano (A549) e adenocarcinoma colorretal humano (HT-29) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). As linhagens HeLa, B16f10, Ht29 e 3t3 foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) e a linhagem A549 teve seu crescimento em meio Ham F12. Ambos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino e adicionados de estreptomicina (5000 mg/mL)/ penicilina (5000 UI). Todas as linhagem foram cultivadas em incubadoras com temperatura de 37 °C em atmosfera úmida de 5% de CO2. 3.5.. Obtenção do extrato proteico As esponjas foram homogeneizados (homogeneização de 500 g da. esponja triturada com 1000 mL de solução hidroalcoólica) com solução hidroalcoólica e centrifugados a 12000 x g durante 30 minutos a 4 ºC, para.

(35) 33 separar o precipitado da fração solúvel. A fração solúvel foi denominada de extrato bruto. Em seguida o mesmo foi submetido ao fracionamento com Acetona.. 3.6.. Fracionamento com Acetona. O fracionamento sequencial foi realizado com três volumes crescentes de acetona (0,5; 1,0 e 2,0). Após cada adição dos volumes determinados foi realizada centrifugação a 12000 x g durante 30 minutos a 4 ºC, Os precipitados obtidos pós-centrifugação foram solubilizados em tampão Tetraborato de Sódio 0,02 M, pH 7,5.. 3.7.. Técnicas cromatográficas de purificação. 3.7.1. Cromatografia de Exclusão Molecular. A fração que apresentou melhor atividade lectínica foi submetida a cromatografia de exclusão molecular em uma coluna superdex 75, no sistema de FPLC AKTA Purifier, previamente estabilizada em tampão Borax 0,02M, pH 7,5. Frações de 0,5 mL foram coletadas sob um fluxo de 0,5 mL/min e absorbância medida a 280 nm.. 3.7.2. Cromatografia de Troca Iônica O pico com melhor atividade hemaglutinante proveniente da cromatografia de exclusão molecular foi concentrado e dissolvido no tampão Tris-Hcl 0,02 M, pH 8 e posteriormente e submetido à cromatografia de troca iônica na coluna Resource Q (1 mL) devidamente estabilizada com o tampão Tris-Hcl 0,02 M, pH 8, e a eluição do material retido foi feita com um gradiente linear de NaCl (final.

(36) 34 1M) em Tris-Hcl 0,02 M, pH 8. O gradiente utilizado teve seu tempo de eluição da cromatografia reduzido entre as faixas 0,32-0,38 M, para aumentar a resolução desta região no perfil cromatográfico.. 3.8.. Determinação proteica. A determinação da concentração de proteínas foi realizada através do método descrito por Bradford (1976), utilizando-se albumina bovina como padrão.. 3.9.. Eletroforeses em gel de poliacrilamida Com o intuito de avaliar o grau de pureza das amostras proteicas, as. mesmas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em presença de SDS (SDS/PAGE), de acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970). Uma vez diluída em tampão de amostra (azul de bromofenol 0,01%, SDS 2%, 10% v/v glicerol, 0,0625M Tris- HCl), a alíquota foi aplicada no gel (10 x 14 cm, com espaçadores de 0,75 mm), o qual foi submetido a uma corrente constante de 20mA por, aproximadamente, 2 horas. O gel foi corado em solução de Coomasie Blue R 250 a 1%, etanol 40% e ácido acético 10% em água. A banda de proteína foi revelada após a imersão de gel em uma solução descorante (etanol 40% e ácido acético 10%). Para acompanhar a migração eletroforética da proteína isolada, foram utilizados padrões de proteínas conhecidas. Para a eletroforese em condição não desnaturante (PAGE) as amostras foram adicionadas ao gel de poliacrilamida 12%, sem adição de SDS a fim de manter a forma nativa da proteína.. 3.10.. Ensaios de Hemaglutinação. 3.10.1. Lavagem do sangue Foram coletados de cada bolsa sanguínea (A, B, e O) 2 mL e adicionados solução salina (NaCl 0,15M) completando-se o volume para 10 mL. Em seguida.

(37) 35 o material foi centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos. Este processo foi repetido até que a solução pareça cristalina e incolor. 3.10.2. Tratamento enzimático dos eritrócitos Os eritrócitos foram tratados tanto com papaína como tripsina com o intuito de expor os carboidratos presentes em sua superfície. Em ambos os casos, a partir do sangue devidamente lavado, foram retirados 0,5 mL de cada tipo sanguíneo. As enzimas, papaína e tripsina, foram adicionadas a 0,5 ml de hemácias na proporção de 1:1. Posteriormente a concentração de hemácias foi ajustada para 4%. 3.10.3. Teste de atividade hemaglutinante Os ensaios de atividade hemaglutinante foram feitos por meio de diluições seriadas. Em cada poço da placade 96 poços. com fundo em “V”, foram. adicionados 25 µL de NaCl 0,15 M (solução salina), 25 µL da amostra (diferentes concentrações) e realizada a diluição seriada, após isso, foi adicionada uma suspensão de eritrócitos humanos a 4% devidamente tratados. A mistura foi incubada por 30 minutos e o título foi expresso em unidades de hemaglutinação (UH), que é definido como o inverso da maior diluição que tenha apresentado nítida aglutinação (MOREIRA E PERRONE, 1977).. 3.10.4. Teste de Inibição da Hemaglutinação por carboidratos: A especificidade de interação da lectina isolada com carboidratos foi determinada através de ensaios de inibição da atividade hemaglutinante, utilizando a mais ampla variedade disponível de carboidratos, esses são: ácido glicurônico, D-xilose, D- Galactose, D-Glucosamina, D-Ribose, D- Arabinose, Dfucose, Manose, Frutose, Dextran, inulina, D-galactose, D-galactosamina e lactose. Os ensaios de inibição foram realizados da mesma maneira que os ensaios de hemaglutinação (ver 3.10.3), no entanto, após as diluições seriadas das amostras foram adicionados 25 µL do carboidrato teste na concentração de 200 mM e deixados em contato por 1 hora, antes de adicionar a suspensão de eritrócitos (25 µL)..

(38) 36. 3.10.5. Efeito de íons bivalentes na atividade hemaglutinante: Para determinar a curva de dependência de íons bivalentes, a lectina foi dialisada em solução de Tris-HCl 50 mM, 20 mM EDTA, pH 7,5. Após esse período uma nova diálise em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 foi realizada. Alíquotas de lectinas foram diluídas em soluções com os íons Ca2+, Mg2+ e Mn2+ na concentração de 100 mM. A atividade da lectina com este tratamento foi visualizada e quantificada pelo ensaio de hemaglutinação(ver 3.10.3).. 3.11.. Efeito do pH sobre a Atividade da Aply-L1:. Com o objetivo de analisar a influência do pH sobre a atividade hemaglutinante, alíquotas da lectina foram liofilizadas e posteriormente solubilizadas com diferentes tampões: Glicina 50 mM pH 2,5, 3,5, 9,5 e 11,5; Acetato de sódio 50 mM pH 4,0 e 5,5; Bórax 50 mM pH 6,0 e 7,5; Tris-HCl 50 mM pH 8,0 e 9,0. Ensaios de hemaglutinação foram realizados em seguida para visualização da interferência de diferentes pH na atividade hemaglutinante.. 3.12.. Efeito da Temperatura sobre a Atividade da Aply-L1:. O efeito da temperatura sobre a atividade da lectina foi investigado, usando alíquotas da solução de lectina em Tris-HCl 50 mM pH 7,5, que foram submetidas a diferentes temperaturas: 25, 40, 60, 80 e 100 ºC por uma 1 hora. Após este período sua atividade foi analisada pelo ensaio de hemaglutinação, à temperatura ambiente.. 3.13.. Atividade Citotóxica. As linhagens celulares foram expostas a diferentes concentrações da fração lectínica da esponja Aplysina sp. (1, 2, 5, 10 µg/mL) e avaliadas pelo método colorimétrico do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazólio),.

(39) 37 que é baseado na quantificação da conversão do MTT a cristais de formazan pelas desidrogenases mitocondriais,. As células (5 x 10 3) foram colocadas em placas estéreis de 96 poços para um volume final de 100 μL de meio DMEM ou Ham F12 somado a 10% de soro fetal bovino. Após 72 horas, MTT (1 mg/mL) foi adicionado às células, e incubadas por mais 4 horas. Após este período, o meio foi aspirado, e logo após foram adicionados 100 μL de álcool isopropílico para dissolver os cristais de formazan formados e precipitados. A quantificação da absorbância foi feita em espectrofotômetro em comprimento de onda de 570 nm. O cálculo de inibição da proliferação celular foi realizado em comparação ao controle contendo células não expostas à lectina.. 3.14.. Teste de aglutinação com Leishmania (Viannia) braziliensis e. Leishmania amazonensis.. Formas. promastigotas. de. Leishmania. (Viannia). braziliensis. (MHOM/BR/2011/AF) e Leishmania amazonensis (IFLA/BR/67/pH8) foram cultivas “in vitro” em meio de cultura ágar-sangue "Novy-MacNeal & Nicolle" (NNN) e meio Schneider (Sigma-Aldrich™, St. Louis, USA), suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB), streptomicina (100 µg/mL) e penicilina (100 U.I/mL) (Cultilab, São Paulo, Brasil), a uma temperatura de 25 ±1 ºC (Amorim et al., 2013). Para o ensaio de aglutinação, formas promastigotas em fase logarítmica de crescimento foram lavadas três vezes em tampão fosfatosalina gelado [PBS (NaCl 145 mM, Na2HPO4 mM NaH2PO41mM, pH 7,4)], e quantificadas em câmara de Neubauer. Em microplacas de 96 poços foram adicionados 25 µL da lectina AplyL-1 (0,3 mg/mL) diluída em PBS, e realizado o procedimento de diluição seriada, também em PBS. Em seguida, foram adicionados 25 µL das formas promastigotas dos parasitos (3 x 107 células/poço), incubadas por 10 minutos a 25 °C e observadas e fotografadas em microscópio óptico comum. As amostras foram analisadas comparando-as a dois controles: (1) formas promastigotas em PBS (ausência da lectina) e (2) formas promastigotas na presença da lectina e de lactose (200 mM).

(40) 38. 4. Resultados: 4.1. Detecção de lectinas no extrato bruto da esponja marinha Aplysina sp.: O extrato bruto da esponja marinha Aplysina sp., obtido através da homogeneização da esponja com a solução hidroalcoólica foi testado com eritrócitos humanos tratados ou não com enzimas (papaína e tripsina). Os resultados demonstraram a presença de lectinas no extrato, com uma maior atividade específica em sangues do tipo A tratados com a enzima papaína (Tabela 4), sendo este tipo de sangue o utilizado nas etapas seguintes de purificação e caracterização. Tabela 4 - Atividade Hemaglutinante do extrato Bruto da Esponja Aplysina sp. *Unidade de hemaglutinação definida como o inverso da maior diluição da amostra que apresentou atividade hemaglutinante **Valor que relaciona a atividade aglutinante visualizada no teste com a quantidade de proteína aplicada, UH/mg de proteína.. Tipo sanguíneo. Atividade hemaglutinante (U.H.)*. Atividade hemaglutinante específica (U.H/mg/ml)**. A. 128. 4,0. B. 512. 16,10. O. 256. 8,05. A papaína. 2048. 257,6. B papaína. 1024. 128,8. O papaína. 1024. 128,8. A Tripsina. 1024. 128,8. B Tripsina. 1024. 128,8. O Tripsina. 1024. 128,8.

(41) 39 4.2.. Atividade Hemaglutinante das frações obtidas por precipitação com. acetona O extrato bruto da esponja Aplysina sp. foi submetido a fracionamento com três volumes crescentes de acetona (0,5, 1,0 e 2,0) a fim de verificar qual deles possuía o maior valor de atividade nos testes de hemaglutinação. Nos resultados obtidos (Tabela 5) vimos que a fração 1,0 foi a que apresentou o melhor resultado. Esta fração então foi escolhida para os posteriores passos de purificação.. Tabela 5 - Atividade hemaglutinante das Frações proteicas obtidas com adição de acetona ao extrato bruto.. Frações Proteicas 0,5. 4.3.. Atividade hemaglutinante (U.H.)*. Atividade hemaglutinante especifica (U.H/mg/ml)**. 1.024. 5,12. 1,0. 65.536. 277,52. 2,0. 256. 23,12. Purificação da proteína a partir do fracionamento com Acetona:. . 4.3.1. Cromatografia de Exclusão Molecular em Sistema de FPLC-AKTA Purifier:. A fração obtida com 1 volume de acetona foi utilizada para a realização de uma cromatografia de exclusão molecular superdex 75, para esta cromatografia foi aplicado 1mg da F1 solubilizadas em Borax 0,02 M + 0,2 M de NaCl pH 7,5 e o cromatograma (Figura 7) apresentou uma fração inicial com tempo de retenção de 14.98 minutos sem atividade, outro mais predominante com 25.81 minutos de tempo de retenção, no qualvisualizamos a atividade hemaglutinante, além desses foram visualizados mais 4 picos sem atividade hemaglutinante com os tempos de retenção de 36.61, 42.93, 45.51 e 48.53 minutos. A fração P2s75.

(42) 40 apresentou maior atividade hemaglutinante especifica de 125,036 e foi escolhido para dar prosseguimento aos passos de purificação.. Figura 7 - Perfil cromatográfico da F1(1mg); O segundo pico com tempo de retenção de 25.81 minutos apresentou maior atividade hemaglutinante especifica de 125,03.. 4.3.2. Cromatografia de Troca Iônica – Resource Q:. Para a cromatografia de troca iônica Resource Q, foi utilizado 1 mg do P2s75 solubilizado em 100 µl do tampão Tris-Hcl 0,02M,. O perfil cromatográfico (Figura 8) mostrou uma separação de três picos, sendo eles, A fração que não interagiu com a resina não apresentou atividade hemaglutinante, a primeira fração retida a qual foi eluida com 0,320 M de NaCl (AplyL-1) e outro retido eluido com 0,370 M de NaCl (AplyL-1). Destes dois picos somente o primeiro apresentou atividade hemaglutinante (1024 UH). A amostra foi intitulada AplyL-1 e utilizada para os testes de caracterização e atividades biológicas. A lectina purificada nesta sequência de passos cromatográfico apresentou uma atividade especifica de 1024 UH/mg e foi purificada cerca de 9 vezes (Tabela 6)..

(43) 41. Figura 8 - Perfil cromatográfico obtido após aplicação de 1mg de P2s75, o primeiro pico eluido foi o único a apresentar atividade hemaglutinante e foi intitulado AplyL-1.. Tabela 6 - Resultados de todas as etapas de purificação da Lectina da esponja marinha Aplysina sp. AplyL-1. Total de proteína (mg) Fração. Atividade total. Atividade especifica (UH/ mg). (UH) Extrato Bruto. Purificação. Rendimento. (vezes). (%). 388,80. 44.206,56. 113,70. 1. F 1,0. 94. 26.213,78. 278,87. 2,45. 24,17. P2s75. 0,36. 163,83. 445,20. 3,91. 0,09. AplyL-1. 0,08. 81,92. 1024. 9. 0,02. 4.4. 100. Eletroforese em gel de poliacrilamida- SDS/PAGE:. Todas as amostradas processadas da esponja Aplysina sp. foram submetidas a eletroforese em gel de polacrilamida sob condições desnaturantes por SDSPAGE (12%), o gel foi corado em solução de Coomasie Blue R 250 a 1% (Figura 9) . O perfil eletroforético demonstrou a presença de uma única banda proteica no último passo de purificação (Fração Aply-L1), com massa molecular aproximada de 40 kDa, baseado no marcador utilizado. Foi também realizada a eletroforese em condição não desnaturante (PAGE 12%) da amostra AplyL-1 (Fig. 3b), demonstrando a presença de uma única banda com 40 kDa. O.

(44) 42 tratamento com ß-mercaptoetanol. também não alterou o comportamento. eletroforético de AplyL-1 (dados não mostrados).. 4.5. Teste de Inibição da Hemaglutinação por carboidratos:. os carboidratos, ácido glicurônico, D-xilose, D- Galactose, D-Glucosamina, DRibose, D- Arabinose, D-fucose, Manose, Frutose, Dextran apresentaram nenhum efeito inibitório na lectina AplyL-1 que. e inulina não teve a. sua. atividade hemaglutinante reduzida em X% apenas após a incubação com Dgalactose, D-galactosamina e lactose (Figura 10).. kDa. Figura 9 - Perfil Eletroforetico dos passos de purificação de AplyL-1: a. Eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), b. eletroforese não desnaturante (PAGE). Linha 1- marcador( ; Linha 2 – Extrato bruto de Aplysina sp.;Linha 3 – F1; Linha 4- P2S75; Linha 5- Aply AplyL-1; b. Gel de eletroforese não-desnaturante (PAGE) de AplyL-1. .. 4.1.. Efeito da Temperatura sobre a Atividade da Lectina AplyL-1:.

(45) 43 A atividade hemaglutinante de AplyL-1 foi testada após esta ser submetida a tratamento térmico durante 1 hora nas temperaturas de 25, 40, 60, 80 e 100̊C, mostrando uma forte estabilidade na temperatura de 25 ̊ C, e posteriormente uma queda gradativa até a perda total de sua atividade em 100̊C (Figura 11).. 4.6. Efeito de íons bivalentes na atividade hemaglutinante:. Após o tratamento com EDTA a lectina AplyL-1 continuou apresentando atividade hemaglutinante normal (Dados não mostrados).. Figura 10 -Inibição da Hemaglutinação de APLYl-1.. 4.1.. Efeito do pH sobre a Atividade da Lectina:. Após ser submetida a diferentes valores de pH, foi visualizado que AplyL-1 é bastante sensível às condições ácidas, sofrendo grande perda da sua atividade hemaglutinante quando submetidas a incubações em pH 5,5. Por outro lado, manteve-se estável entre pH 7,5-11,5 (Figura 12)..

(46) 44. Figura 11 - Curva de termoestabilidade de AplyL-1.. Figura 12 - Efeito de diferentes pH na atividade hemaglutinante d eAplyL-1.. 4.7 Testes de Viabilidade Celular em linhagem celular HeLa: A avaliação da interferência na viabilidade celular de AplyL-1 sobre diversas linhagens de células em cultura. mostrou que as concentrações testadas.

(47) 45 interferiram significantemente apenas na linhagem de adenocarcinoma cervical humano, HeLa (Figura 13), chegando a inibir cerca de 64% da proliferação dessa linhagem com a concentração de 10 µg/mL da lectina (Fig. 14). Dentre as outras linhagens só as células B16f10 mostraram uma diferença estatisticamente significativa, mas necessitaria da avaliação de um amento nas concentrações testadas para uma melhor av aliação.. Linhagens expostas a 10. g/ml de AplyL -1. Figura 13 - Analise do efeito de AplyL-1 frente as linhagens, 3T3; A549; B16f10; HT29 e HeLa. Os testes estatísticos realizados foram o t de student e o teste Mann Whitney, e em ambos foi verificado diferença significativa apenas para as linhagens B16f10 e HeLa; * = p<0,01..

(48) 46 4.8. Teste de aglutinação com Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania amazonensis.. Testes de aglutinação de leishmanias por AplyL-1 mostrou que a lectina foi competente, na concentração mínima de 77,5 µg/mL,. em aglutinar. promastigotas da espécie Leishmania amazonensis(Figura 15.a), mas não da espécie Leishmania braziliensis (Figura 15.d) (Figura 15.c).. Figura 14 - Efeito de AplyL-1 sobre a linhagem celular HeLa. O ensaio avaliou a atuação de diferentes concentrações de AplyL-1(1; 2,5; 5 e 10 µg/ml) sobre a linhagem tumoral HeLa, revelando um efeito de diminuição na viabilidade destas células..