MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS CONTENDO
ANFOTERICINA B: DESENVOLVIMENTO, AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES
FARMACÊUTICAS E ESTABILIDADE SOB ACONDICIONAMENTO
i
ROSILENE RODRIGUES SANTIAGO
CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS CONTENDO
ANFOTERICINA B: DESENVOLVIMENTO, AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES
FARMACÊUTICAS E ESTABILIDADE SOB ACONDICIONAMENTO
Tese apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como requisito para a obtenção do
título de Doutor em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito
Coorientadora: Profª. Drª. Kattya Gyselle de Holanda e Silva
NATAL
2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Santiago, Rosilene Rodrigues.
Carreadores lipídicos nanoestruturados contendo anfotericina B: desenvolvimento, avaliação das propriedades farmacêuticas e estabilidade sob acondicionamento / Rosilene Rodrigues Santiago. - 2018.
82f.: il.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2018.
Orientador: Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. Coorientadora: Kattya Gyselle de Holanda e Silva.
1. Anfotericina B - Tese. 2. Carreadores lipídicos nanoestruturados - Tese. 3. Óleo de gergelim - Tese. I. Egito, Eryvaldo Sócrates Tabosa do. II. Silva, Kattya Gyselle de Holanda e. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 615.282
ii
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
Profa. Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves de Oliveira
Ao meu maior tesouro, minha filha
Juliana, seja dedicado este trabalho.
À Deus, sem o qual nada seria possível.
“Deus não nos exige que tenhamos sucesso, ele só exige que você tente.”
(Madre Teresa de Calcutá)
Aos meus pais, Nelson e Arlete, e irmãos, que mesmo sem entenderem todo este
trabalho, nunca deixaram de me apoiar e ao meu esposo Jorge por estar comigo em
todos os momentos.
“Pais e filhos não foram feitos para serem amigos. Foram feitos para serem pais e filhos.”
(Millôr Fernandes)
Aos professores, Sócrates Egito e Gyselle Holanda por terem tornado este trabalho
possível.
“Minhas conquistas devo aos meus professores mais incrédulos.”
(Kaab Al Qadir)
Aos amigos que me apoiaram e, que contribuíram com a realização desse trabalho,
principalmente a Débora.
“Obrigado, amigo, pelos erros que me emprestastes, pois com eles pude corrigir os meus.”
(Silvestre C. Cabral)
Meus sinceros agradecimentos a todos, que de uma forma ou de outra, estiveram
comigo e que não foram citados.
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar.
As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.”
(Chico Xavier)
RESUMO
As nanopartículas lipídicas sólidas foram desenvolvidas na década de 1990 e uma
nova geração desse grupo de sistemas tem sido estudada nos últimos anos: os
carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN). Estas nanoestruturas podem
melhorar a vetorização fármacos, como a anfotericina B (AmB). Sendo assim, esse
trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um CLN contendo AmB e
avaliação das suas propriedades físico-químicas e farmacêuticas. Inicialmente,
ensaios de pré-formulação foram realizados para avaliar a solubilidade da AmB em
diferentes lipídeos líquidos e determinar as condições para o processamento das
amostras. CLNs formulados com óleo de gergelim exibiram melhores resultados e
um desenho experimental foi utilizado para determinar a concentração dos
componentes da formulação. Uma combinação de lipídeo sólido e líquido na
proporção de 7:3(p/p) e tensoativo na concentração de 3%(p/v) foi utilizada. A
estabilidade físico-química das amostras foi determinada através do tamanho de
partícula, índice de polidispersão, potencial zeta e taxa de recuperação de AmB.
Após a produção, os CLN e os CLN-AmB apresentam-se como nanodispersões,
branca e amarela, respectivamente. Essas amostras foram analisadas por até 60
dias, quando iniciaram processos de instabilidade e a liofilização foi utilizada a fim de
manter a estabilidade. A influência de crioprotetores foi avaliada para determinação
dos parâmetros do processo de secagem por liofilização. Entre os crioprotetores
avaliados, a maltose exibiu melhores resultados na concentração de 10% e após
48h de liofilização. Em seguida, as partículas foram analisadas ao longo de 360 dias
de acordo com os testes aplicados anteriormente. Para partículas liofilizadas foi
observado aumento no tamanho de partícula, pequena redução no índice de
polidispersão e o potencial zeta se manteve constante. Os liofilizados
apresentaram-se sob a forma de um pó branco (CLN-liof) e amarelo (CLN-AmB-liof), facilmente
redispersíveis. CLN-AmB-liof apresentou taxa de encapsulação superior a 90% ao
longo do tempo de análise. A calorimetria exploratória diferencial e a difração de
raios-X exibiram o estado de cristalinidade das partículas. O perfil de liberação in
vitro foi avaliado 24 horas após a preparação das partículas e o melhor modelo
matemático para o ajuste dos dados foi o proposto por Baker-Lonsdale. Desta forma,
os CLNs desenvolvidos e analisados nesse trabalho podem ser uma alternativa para
o tratamento de doenças que envolvam o uso da AmB.
Palavras-chave: Carreadores lipídicos nanoestruturados, anfotericina B, óleo de
gergelim.
ABSTRACT
The solid lipid nanoparticles were developed in the 1990s and a new generation of
this system group has been studied in recent years: the nanostructured lipid carriers
(NLC). This nanostructure can improve the vectorization of drugs such as
amphotericin B (AmB). Therefore, this study aimed to develop a NLC containing AmB
and to evaluate their physicochemical and pharmaceutical properties. Initially,
pre-formulation studies were carried out in order to estimate the AmB solubility in
different liquids lipids and the conditions for processing the samples. NLCs
formulated with sesame oil exhibited better results. Moreover, an experimental
design was used to determine the components concentration within the formulation.
The combination of solid/liquid lipid at the 7:3(w/w) ratio and surfactant at 3%(w/v)
concentration was further used. The physicochemical stability of the formulations was
determined based on the particle size, the polydispersity index (PdI), the zeta
potential and the AmB recovery rate. After production, NLC and AmB-NLC was
presented as translucent nanodispersions, white and yellow, respectively. These
samples were analyzed for up to 60 days, when instability was observed. Thus, the
lyophilization process was used to increase their stability. Among the studied
cryoprotectants, maltose showed better results at the concentration of 10% and after
48 hours of lyophilization. Then, the particles were analyzed over 360 days in
accordance with the tests previously described. The lyophilized particles presented
higher particle size, smaller PdI and constant zeta potential.
The lyophilizates were
obtained as white (Liof-NLC) and yellow (Liof-AmB-NLC), easily redispersible
powders.
The Liof-AmB-NLC presented drug loading rates above 90% during the
analysis time. The d
ifferential scanning calorimetry
and the
X-ray diffraction
results
exhibited the state of crystallinity of the particles. The in vitro release profile was
assessed 24 hours after the preparation of the NLC and the best model for fitting the
data was Baker-Lonsdale. Thus, the NLC developed and analyzed in this work can
be an alternative for the treatment of diseases that have AmB as its therapeutic
choice
.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Matriz experimental do Desenho Composto Central com as variáveis
naturais e codificadas...
...23AmB
Anfotericina B
AmB-CLN
Carreador lipídico nanoestruturado com anfotericina B
CLNCarreador lipídico nanoestruturado
DCC
Desenho composto central
EE
Eficácia de encapsulação
IPd
Índice de polidispersão
xiv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16 2 JUSTIFICATIVA... 19 3 OBJETIVOS... 21 3.1 OBJETIVO GERAL ... 21 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 21 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 23 4.1 MATERIAIS ... 23 4.2 MÉTODOS ... 234.2.1 Espectroscopia na região do ultravioleta/visível ... 23
4.2.2 Linearidade da curva analítica ... 23
4.2.3 Seletividade do método analítico... 23
4.2.4 Precisão do método analítico ... 24
4.2.5 Exatidão do método analítico ... 24
4.2.6 Limite de detecção e limite de quantificação ... 25
4.2.7 Desenho experimental ... 26
4.2.8 Desenvolvimento dos CLNs ... 26
4.2.9 Otimização das variáveis do processo ... 27
4.2.9.1 Seleção do lipídeo líquido ... 27
4.2.9.2 Determinação da proporção lipídeo sólido/líquido e concentração de tensoativo ... 27
4.2.10 Avaliação dos CLNs ... 27
4.2.10.1 Tamanho médio de partícula, IPd e potencial zeta. ... 27
4.2.10.2 Determinação da eficiência de encapsulação da AmB e taxa de recuperação do fármaco nos CLNs ... 27
4.2.10.3 Liofilização/redispersão das partículas ... 28
4.2.10.4 Estudo de liberação in vitro ... 28
4.2.10.5 Estudo de estabilidade ... 28
4.2.10.6 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ... 29
4.2.10.7 Difração de raios-X (DRX)... 29
4.2.11 Análise estatística ... 29
5 ARTIGO PRODUZIDO ... 31
6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES ... 75
16
Introdução
---
---Rosilene Rodrigues Santiago
1 INTRODUÇÃO
Reconhecida como o fármaco padrão ouro no tratamento de infecções
fúngicas sistêmicas (1, 2), a anfotericina B (AmB) é um exemplo clássico de uma
molécula cujas propriedades físico-químicas levam a dificuldades na formulação e
uso terapêutico (3, 4). Apesar de sua importância clínica, a dificuldade em
desenvolver novas formulações com AmB está relacionada ao seu limitado perfil de
solubilidade aquosa (5-8). Como consequência, a AmB apresenta baixa
biodisponibilidade para administração oral e, portanto, seu uso é restrito a infusão
intravenosa e aplicação local (9, 10).
Atualmente, vários produtos à base de lipídios comercialmente disponíveis
contendo AmB, cuja produção é baseada em abordagens nanotecnológicas, foram
desenvolvidos com o objetivo de melhorar a sua biodisponibilidade (4, 11, 12). Além
disso, a capacidade da AmB de formar complexos com moléculas lipídicas surgiu
como uma possível estratégia para estabilizar esse fármaco em um estado auto
associado, impedindo sua interação com o colesterol nas membranas celulares
humanas. Com base nessa abordagem, complexos lipídicos como Abelcet
®,
Amphocil
®e Amphotec
®foram desenvolvidos (13-15).
Mais tarde, o desenvolvimento de lipossomas carregados com AmB trouxe ao
mercado o produto AmBisome (11, 16). No entanto, eventos tóxicos ainda são
relatados durante a administração de todas essas novas formulações,
especialmente a nefrotoxicidade (17-19). A este respeito, várias abordagens como
microemulsões, cristais líquidos, nanoesferas lipídicas e formulações nanosomais
foram consideradas para reduzir a toxicidade da AmB por meio de novas
formulações. Atualmente, a manutenção do efeito terapêutico da AmB e a redução
da nefrotoxicidade são os objetivos mais importantes das formulações lipídicas de
AmB (8, 20-27).
As vantagens das formulações lipídicas como sistemas de liberação de
medicamentos têm sido cientificamente reconhecidas há várias décadas (28). Além
disso, dentre os excipientes farmacêuticos disponíveis, os lipídios são os mais
versáteis, pois podem fornecer uma ampla gama de formulações com potencial para
aumentar a biodisponibilidade e a biocompatibilidade de drogas pouco solúveis
(29-Introdução
---
31). Emulsões, microemulsões, lipossomas, complexos lipídicos e nanoemulsões
(32, 33) são bons exemplos das formulações lipídicas.
Além disso, como alternativa para os sistemas lipídicos tradicionais, as
nanopartículas lipídicas sólidas consistem de uma matriz constituída por um ou mais
lipídeos sólidos (34, 35).. Estes sistemas foram descritos para a entrega de
moléculas insolúveis (36) e solúveis em água (37). Em particular, uma nova geração
deste tipo de sistema, nomeadamente carreadores lipídicos nanoestruturados
(CLNs), tem sido estudada nos últimos anos. Os CLNs consistem em uma matriz
composta de uma mistura de lipídios sólidos e líquidos (38-41).. É importante
ressaltar que os CLNs mostram o potencial de aumentar a taxa de incorporação de
drogas e a estabilidade do armazenamento (42). Portanto, o objetivo deste estudo
foi desenvolver um CLN contendo AmB e avaliar as propriedades físico-químicas e
farmacêuticas dessa formulação.
Justificativa
---
2 JUSTIFICATIVA
A anfotericina B permanece como substância fungicida de escolha no
tratamento da maioria das micoses sistêmicas que acometem pacientes
imunocomprometidos. Mesmo com a sua toxicidade, a potência, o espectro de ação
e os quase 50 anos de experiência clínica asseguram sua efetividade tanto para o
tratamento das infecções fúngicas quanto para a profilaxia fúngica sistêmica em
pacientes neutropênicos. Sua eficácia tem sido julgada a cada medicamento
antifúngico novo apresentado aos profissionais de saúde e, por esta razão,
numerosas tentativas para reduzir sua nefrotoxicidade específica surgiram nos
últimos anos.
Adicionalmente, a necessidade de se instituírem tratamentos agressivos para
as micoses sistêmicas invasivas com dosagens necessariamente mais altas motivou
o desenvolvimento de diferentes veículos para a administração de anfotericina B.
Dessa forma, o desenvolvimento de um nanocarreador lipídico pode ser uma nova
ferramenta nesse tipo de tratamento, uma vez que estes sistemas podem reduzir a
toxicidade da AmB e aumentar a biodisponibilidade, conferindo um melhor
tratamento.
Objetivos
---
3 OBJETIVOS
3.1
OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver e caracterizar carreadores
lipídicos nanoestruturados contendo AmB.
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver CLN contendo AmB;
Otimizar a composição das formulações e os parâmetros do método de
produção dos CLNs;
Caracterizar os CLNs;
Determinar as propriedades físico-químicas dos CLNs;
Estudar a estabilidade físico-química dos CLNs, através dos testes realizados
em curto e em longo prazo;
Doseamento do princípio ativo encapsulado no CLN;
Estudar a cinética de liberação in vitro das formulações obtidas, contendo a
AmB, pelo método de diálise inversa;
Materiais e Métodos
---
4
MATERIAIS E MÉTODOS
4.1
MATERIAIS
Monoestearato de glicerila foi adquirido a partir de Croda (Brasil). O óleo de
girassol e o Miglyol
®812N foram adquiridos da Vital Atman (Brasil) e Sasol
(Alemanha), respectivamente. O óleo de gergelim, Pluronic
®F68, anfotericina B
(AmB), glicose, lactose, maltose e manitol foram adquiridos da Sigma-Aldrich
®(EUA). Foi utilizada água bidestilada.
4.2
MÉTODOS
4.2.1 Espectroscopia na região do ultravioleta/visível
Para a quantificação da AmB foi desenvolvido um método por espectroscopia
na região do ultravioleta/visível. A análise foi realizada utilizando-se um
espectrofotômetro (Libra S32, Biochorom
®US, Cambridge, UK). A detecção UV/VIS
foi realizada no comprimento de onda máximo da AmB (416 nm), utilizando
dimetilsufóxido como solvente.
4.2.2 Linearidade da curva analítica
Em uma balança analítica, pesou-se 10 mg de AmB em um béquer. O pó do
fármaco foi dissolvido em 10 mL de DMSO e a solução foi transferida
quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL com auxílio de DMSO. A
partir desta foram preparadas soluções-padrão com concentrações de 0,5 a 5,0
µg/mL.
A curva analítica foi realizada em triplicata a partir das médias das
absorbâncias correspondentes a cada concentração do padrão e construída a
equação da reta média para a representação gráfica da curva analítica.
4.2.3 Seletividade do método analítico
Para a avaliação da seletividade foram comparados os espectros de absorção
dos CLNs contendo ou não AmB para verificar se a formulação contém excipientes
e/ou impurezas que interferem no pico de absorção referente ao fármaco, ou seja,
verificou-se a presença de picos de absorção interferentes no comprimento de onda
de 416 nm.
24
Materiais e Métodos
---
---
Rosilene Rodrigues Santiago
Para o preparo das amostras, 1,25 mL do CLN carregado com AmB foi medido em
pipeta volumétrica e transferido para um balão volumétrico de 25 mL e o volume foi
completado com DMSO (concentração final teórica de 2 µg/mL de AmB). O mesmo
procedimento de diluição foi feito para o CLN branco. As soluções finais foram
submetidas à varredura no comprimento de onda entre 300 e 450 nm.
4.2.4 Precisão do método analítico
A precisão do método foi avaliada quanto à repetibilidade e à precisão
intermediária.
Para a avaliação da repetibilidade do método, foram preparadas soluções com as
concentrações de 0,5 µg/mL (baixa), 2,0 µg/mL (média) e 5,0 µg/mL (alta) e as
absorbâncias foram analisados.
Para a avaliação da precisão intermediária, este mesmo procedimento foi
realizado em dois dias diferentes.
A precisão, expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou CV, foi calculada
de acordo com a seguinte fórmula:
Onde DP é o desvio padrão.
4.2.5 Exatidão do método analítico
Foram preparadas soluções padrões de AmB para obtenção das
absorbâncias que correspondem à concentração teórica de cem por cento. Para o
preparo das soluções, pesou-se 10 mg de AmB em um béquer. O pó do fármaco foi
dissolvido em DMSO e solução foi transferida quantitativamente para um balão
volumétrico de 100 mL com auxílio de DMSO. A partir dessa solução resultante, 50,
200 e 500 µL foram transferidos para balões volumétricos de 10 mL e o volume
completado com DMSO, obtendo-se, respectivamente, as soluções de concentração
0,5, 2,0 e 5,0 µg/mL. Esse procedimento foi feito em triplicata, obtendo-se três
soluções de cada uma das três concentrações.
Soluções de mesmas concentrações (baixa, média e alta) de AmB foram
preparadas a partir do CLN. Para isso, 2,5 mL do CLN carregado com AmB foi
Materiais e Métodos
---
transferido para um balão volumétrico de 10 mL, e solubilizado com DMSO. Foram
transferidos 50, 200 e 500 µL dessa solução para balões volumétricos de 10 mL e o
volume foi completado com metanol, obtendo-se, respectivamente, soluções de
concentração 0,5, 2,0 e 5,0 µg/mL. Esse procedimento foi feito em triplicata,
obtendo-se três soluções de cada uma das três concentrações.
A exatidão do método analítico foi determinada avaliando-se a capacidade de
recuperação da AmB a partir dos CLNs através da equação especificada pela RE
899:(43)
A concentração média experimental foi obtida pela absorbância de AmB no
CLN. A concentração média teórica foi obtida pela absorbância de AmB das
soluções-padrão.
4.2.6 Limite de detecção e limite de quantificação
Limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma
amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as
condições experimentais estabelecidas. Limite de quantificação (LQ) é a menor
quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e
exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.(43)
As estimativas do LD e do LQ foram feitas com base nas equações:
Em que: DP
aé o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo,
3 curvas de calibração e IC é a inclinação da curva de calibração (BRASIL, 2003).
A confirmação do LD foi feita através da leitura das soluções de AmB, em triplicata,
na concentração obtida pelo cálculo através da fórmula acima.
26
Materiais e Métodos
---
---
Rosilene Rodrigues Santiago
4.2.7 Desenho experimental
Um desenho fatorial do tipo 2
2sem replicações e adicionado de cinco pontos
centrais e quatro pontos axiais foi utilizado para estudar o efeito da concentração do
lipídeo líquido (óleo de gergelim) em relação ao lipídeo
sólido (monoestearato de
glicerila) e da concentração do tensoativo (Pluronic
®F68) sobre o tamanho de
partícula, índice de polidispersão (IPd) e potencial zeta. A Tabela 1 apresenta as
variáveis independentes, juntamente com seus níveis. A concentração do lipídeo
total (2%) foi mantida constante.
TABELA 1. Matriz experimental do Desenho Composto Central com as variáveis
naturais e codificadas.
Experimento
Variáveis
codificadas
Variáveis
naturais
Lipídeo
líquido/sólido
Tensoativo
Lipídeo líquido/sólido
(%)
Tensoativo
(%)
1
-1
-1
10
3
2
+1
-1
30
3
3
-1
+1
10
7
4
+1
+1
30
7
5
-1,414
0
5,86
5
6
+1,414
0
34,14
5
7
0
-1,414
20
2,17
8
0
+1,414
20
7,83
9
0
0
20
5
10
0
0
20
5
11
0
0
20
5
12
0
0
20
5
13
0
0
20
5
4.2.8 Desenvolvimento dos CLNs
Os CLNs foram preparados por cavitação ultrasônica. Os lipídeos, sólido e
liquido, com ou sem adição de fármaco, foram fundidos a 75 ± 5 °C com
subsequente adição de solução de tensoativo na mesma temperatura. A mistura foi,
então, submetida à agitação em Vibra Cell Sonicador 75041 (Bioblock Scientific,
ILLKIRCH, França) por 10 min com amplitude de 40%. A dispersão obtida foi
submetida à agitação magnética até atingir temperatura ambiente.
Materiais e Métodos
---
4.2.9 Otimização das variáveis do processo
4.2.9.1
Seleção do lipídeo líquido
Os CLNs foram formulados usando os lipídeos líquidos óleo de gergelim, óleo
de girassol e miglyol em diferentes concentrações, conforme metodologia descrita. O
lipídeo líquido mais adequado foi identificado com base no menor tamanho de
partícula e menor índice de polidispersão (IPd). Além disso, foi avaliada também a
solubilidade da AmB em cada um dos lipídeos analisados.
4.2.9.2
Determinação da proporção lipídeo sólido/líquido e concentração de
tensoativo
Os melhores resultados obtidos com o ensaio anterior foram apresentados
pelo óleo de gergelim, a partir do qual foram desenvolvidos novos ensaios para
determinação da proporção de lipídeo sólido/líquido e concentração de tensoativo
para a preparação dos CLNs usando um DCC. Os parâmetros foram determinados
com base no tamanho de partícula, IPd e potencial zeta (-potencial).
4.2.10 Avaliação dos CLNs
4.2.10.1
Tamanho médio de partícula, IPd e potencial zeta.
Para avaliar o tamanho médio e IPd dos CLNs foi utilizado o método de
dispersão de luz dinâmica. As amostras foram diluídas (1:20
v/v) com água destilada e
analisados utilizando o Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, UK). O potencial
zeta foi determinado à partir da mobilidade eletroforética utilizando o Zetasizer Nano
ZS (Malvern Instruments, UK).
4.2.10.2
Determinação da eficiência de encapsulação da AmB e taxa de
recuperação do fármaco nos CLNs
O teor de AmB no AmB-CLN foi determinado após centrifugação a 14.000
rpm durante 30 min para precipitar qualquer excesso de AmB em Centrífuga 5410
(Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). O sobrenadante foi microfiltrado utilizando uma
membrana de 0,22 µm (GSWP, Millipore) e uma alíquota de 500 µL do sobrenadante
foi cuidadosamente diluída em 12 mL de dimetilsulfóxido. Logo após, agitou-se
durante 40 minutos para extrair a AmB para a solução orgânica. Em seguida, o
28
Materiais e Métodos
---
---
Rosilene Rodrigues Santiago
nm (Biochorom EUA, Massachusetts, EUA). A eficácia de encapsulação (EE) foi
determinada utilizando a seguinte equação:
4.2.10.3
Liofilização/redispersão das partículas
Para determinar os parâmetros ideais para o processo de liofilização foram
usados diferentes crioprotetores (glicose, lactose, maltose e manitol) em diferentes
concentrações (5, 10 e 15%) e tempo (24 e 48h), a fim de analisar o efeito da
concentração do crioprotetor e do tempo de liofilização. Após a preparação das
formulações (CLN e AmB-CLN) o crioprotetor foi adicionado e as amostras foram
congeladas a -80 °C. As suspensões foram reconstituídas em água sob leve
agitação e foram avaliados o tamanho médio de partícula e IPd.
4.2.10.4
Estudo de liberação in vitro
O estudo de liberação in vitro da AmB à partir de AmB-CLN foi realizado em
tampão fosfato salino pH 7,4 pelo método de diálise. O estudo foi realizado
utilizando AmB e AmB-CLN após a liofilização. A dispersão de CLN (10 mL) foi
suspensa e adicionada em saco de diálise. O saco foi suspenso individualmente em
60 mL de tampão fosfato salino, pH 7,4, contendo 1% (p/v) de lauril sulfato de sódio
e mantido a 37 °C e sob agitação de 100 rpm. Alíquotas da amostra foram retiradas
em tempos predeterminados (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 24, 48 e 72 horas)
e analisadas por espectrofotometria. O volume retirado da amostra foi substituído
com novo meio para manter o volume constante. Os dados cinéticos de liberação
dos sistemas foram modelados utilizando o software suplementar Excel - DDSolver e
analisados frente aos principais modelos matemáticos de dissolução.
4.2.10.5
Estudo de estabilidade
A estabilidade físico-química dos CLN e AmB-CLN foi analisada durante 60
dias. As amostras foram preparadas, colocadas em frascos âmbar de 30 mL,
lacrados e armazenados. Os parâmetros: tamanho médio de partícula, IPd e
potencial zeta das amostras foram mensurados após 1, 30 e 60 dias. A taxa de
encapsulação da AmB (%) foi medida após 1, 30 e 60 dias. As partículas liofilizadas
Materiais e Métodos
---
foram reconstituídas em água sob leve agitação e foram avaliadas após 1, 30 e 60
dias.
4.2.10.6
Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
A análise térmica dos lipídios foi realizada utilizando um calorímetro DSC
Q-1000 (TA Instruments, New Castle, EUA). Amostras (aproximadamente 5 mg) foram
pesadas em recipientes de alumínio de 40 µL e, então, hermeticamente seladas. O
aparelho foi aquecido de 20 a 100 °C a uma taxa de aquecimento de 10 °C
min-1.Subsequentemente, as amostras foram arrefecidas a 20 °C e aqueceu-se a
100 °C. Todas as experiências foram realizadas em duplicata com três ciclos, um
primeiro aquecimento, um ciclo de arrefecimento, e um segundo aquecimento.
4.2.10.7
Difração de raios-X (DRX)
Os difratogramas foram registados com um difratômetro de raios X teta-teta
(D8 Advance, Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Alemanha). As medições foram
realizadas em modo de reflexão simétrica com radiação CuKα (λ = 1,54 A) com
óptica multicamadas dobrada em espelho Gobel na faixa angular de 5 - 40° (2θ). O
tamanho do passo foi de 0,05° (2θ) e o tempo de medição foi de 1 s por passo. Cada
experimento foi conduzido em triplicata, comprimindo as amostras no
porta-amostras, proporcionando uma superfície lisa.
4.2.11 Análise estatística
As análises estatisticas, modelagens e processo de otimização foram
realizados utilizando o software Minitab 16 Statistical Software (Minitab Inc., State
College, PA, USA).
Artigo Produzido
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5 ARTIGO PRODUZIDO
O artigo Nanostructured lipid carriers containing Amphotericin B:
development, in vitro release assay, and storage stability foi aceito para
publicação no periódico
Journal of Drug Delivery Science and Technology
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Rosilene Rodrigues Santiago
Nanostructured lipid carriers containing Amphotericin B: development, in vitro releaseassay, and storage stability.
1. Introduction
Recognized as the gold standard drug for treating systemic fungal infections [1, 2] and leishmaniasis [3-5], amphotericin B (AmB) is a classic example of a molecule whose physicochemical properties lead to difficulties in its formulation and therapeutic use [6, 7]. Despite its clinical importance, the major drawback to developing new AmB formulations is related to the AmB’s limited aqueous solubility profile [8-11]. As a consequence, AmB presents low bioavailability for oral administration and, therefore, its use is restricted to intravenous infusion and local application [12, 13].
Nowadays, several commercially available lipid-based products containing AmB, whose production is based on nanotechnological approaches, have been developed in order to improve the AmB therapeutic index by reducing its toxicity [7, 14, 15]. In addition, the ability of AmB to form complexes with lipid molecules came up as a possible strategy to stabilize this drug in a self-associated state, preventing its interaction with cholesterol in human cell membranes. Based on this approach, lipid complexes such as Abelcet®, Amphocil®, and
Amphotec® were developed [16-18].
Also, the development of liposomes loaded with AmB brought to the market the product AmBisome [14, 19]. However, toxic events are still reported during the administration of all these new formulations, especially nephrotoxicity [20-22]. In this regard, several approaches such as microemulsions, liquid crystals, lipid nanospheres and nanosomal formulations have been considered to reduce the AmB toxicity by means of new formulations. Currently, the maintenance of the AmB therapeutic effect and the reduction of nephrotoxicity are the most important goals of AmB lipidic formulations [11, 23-30] .
The advantages of lipid formulations as drug delivery systems have been scientifically recognized for several decades. In addition, among the available pharmaceutical excipients, lipids are the most versatile ones because they can provide a wide range of formulations with the potential to increase the bioavailability, the therapeutic index, and the biocompatibility of
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poorly soluble drugs [31-33]. Emulsions, microemulsions, liposomes, lipid complexes, and nanoemulsions [34-36] are good examples of lipid formulations.Furthermore, as an alternative for the traditional lipid systems, solid lipid nanoparticles consist of a matrix constituted by one or more solid lipids [37, 38] These systems were described for the delivery of both insoluble [39] and water-soluble molecules [40]. In particular, a new generation of this kind of system, namely nanostructured lipid carriers (NLC), has been studied in the recent years. NLC consist of a matrix composed of a mixture of solid and liquid lipids [41-44]. Importantly, NLC show the potential to enhance the drug encapsulation rate and the storage stability [45]. Therefore, the aim of this study was to develop an NLC containing AmB and to evaluate the physicochemical and pharmaceutical properties of this formulation.
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2. Materials and Methods2.1. Materials
Glyceryl monostearate was purchased from Croda (Snaith, UK). Sunflower oil came from Vital Atman (Uchoa, Brazil). Miglyol® 812N was bought at Sasol (Hamburg, Germany).
Sesame oil (SES), Pluronic® F68, amphotericin B (AmB), glucose, lactose, maltose, mannitol,
and dimethyl sulfoxide (DMSO) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Double distilled water was used in the procedures.
2.2. Methods
2.2.1. Development of nanostructured lipid carriers
Liquid lipid selection
The selection of liquid lipids was based on their capacity of AmB solubilization. Three liquid lipids were evaluated: sunflower oil, sesame oil, and Miglyol® 812. Solubility tests were
performed according to Baka et al. [46]. Briefly, an excess of AmB was weighed and placed under stirring for 24 h in 10 g of liquid lipid, followed by centrifugation and filtration. Then, an aliquot of the supernatant (100 l) was dissolved in 900 l of DMSO in order to extract the AmB. Moreover, a spectrophotometric analysis was performed by scanning samples from 300 to 450 nm to visualize AmB characteristic peaks [47]. The drug solubility was assessed by calculating AmB concentration into the oil, using a validated analytical method, which will be further discussed.
Lipid excipient evaluation
The evaluation of the lipid components of the mixture was assessed by the ability to form NLC. For this purpose, different mass ratios (9:1 (w/w), 8:2 (w/w), 7:3(w/w)) of solid/liquid lipids
were heated at 75°C until reaching liquid state and, then, subjected to ultrasonic cavitation (Vibra cell sonicator 75041 - Bioblock Scientific, Illkirch, France) at 40% amplitude in the presence of the surfactant (Pluronic® F68) aqueous solution (3%). The particle formation,
average size, and polydispersity index (PDI) were used as parameters of choice for the best lipid mixture.
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Determination of solid/liquid lipid ratio and surfactant concentration.A 22factorial design without replicates (Table 1), with a central point (n=5) and four axial
scores, was used to assess the effect of the concentration of the liquid and solid lipid, and the surfactant concentration on the average particle diameter and PDI. The variables analyzed were solid/liquid lipid proportions (9:1, 8:2, and 7:3) and surfactant concentration (3, 5, and 7%). The concentration of the lipid mixture formulation (2%) was determined in a previous study (not shown) and maintained as constant. The contour plots and response surface curves were plotted using the Statistic 7 software (StatSoft®, São Caetano do Sul-SP, Brazil) to represent
the values of the responses and the relationship between the dependent and the independent variables.
NLC production
NLC with and without AmB, namely AmB-NLC and NLC, respectively, were prepared according to the ultrasonic cavitation homogenization method. Liquid and solid lipids were melted at 75 ± 5°C with subsequent addition of the surfactant aqueous solution at the same temperature. Then, the mixtures were sonicated in a Vibra Cell Sonicator 75041 (Bioblock Scientific, Illkirch, France) for 10 min, at 40% amplitude. To generate NLC, the resulting dispersions were subjected to magnetic stirring until they reached room temperature. To produce AmB-NLC and evaluate their loading capacity (LC), 10 mg of the drug was added in the first step of the production process. After the evaluation of the LC, 2 mg of AmB was chosen as the drug loading for the further formulations.
Validation of the analytical curve for the AmB quantification
The AmB quantification was assessed by a UV-Vis spectroscopy method previously validated. The analysis was performed using a Libra S32 spectrophotometer (Biochrom, Cambridge, UK). The absorbance detection was settled at 416 nm, which was the maximum wavelength of AmB in DMSO. To guarantee the quality of the results, the method was validated according to the ICH Q2 (R1) [48]. The parameters of linearity, selectivity, precision, accuracy, limit of quantification, and detection were evaluated. To this end, samples with AmB concentrations from 0.5 to 5.0 µg/mL (5 x 10-7 M to 5 x 10-6M) in DMSO were used.
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2.2.2. NLC characterization
Particle size and zeta potential
Average particle size and PDI were assessed by dynamic light scattering (DLS), while zeta potential was measured by electrophoretic mobility. Both analyses were carried out in a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Samples were diluted in distilled water (1:20) just before analysis.
AmB encapsulation efficiency (EE)
To determine the AmB content in the AmB-NLC, the particles were firstly washed and centrifuged at 12,000g for 30 min, using an Eppendorf 5410 centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Germany), in order to precipitate any unloaded molecule. Then, the washed particles were disrupted using DMSO and 30 min of magnetic stirring. Moreover, the sample was centrifuged at 12,000 g for 30 min, using an Eppendorf 5410 centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Germany) to settle down the debris of lipids and dissolve the entire AmB content in the media. Then, the supernatant was filtered through a 0.22 µm pore membrane (Millipore, Billerica, USA). An aliquot of 500 µL of the supernatant was carefully diluted with 12 mL DMSO and stirred for 40 minutes in order to extract the drug with the organic solvent. Finally, the AmB content was obtained using the equation (y = 0.0021 + 0.092x R2 = 0.9999), according to the absorbance,
measured in a Libra S32 spectrophotometer (Biochrom, Cambridge, UK) at 416 nm wavelength, and to the analytical curve.
The EE was calculated from the nominal AmB content (2 mg) and the real concentration, as follows:
%EE = (AmB real concentration / AmB nominal content) X 100
Differential scanning calorimetry (DSC)
Thermal analysis of the lipids was performed using a DSC Q-1000 calorimeter (TA Instruments, New Castle, USA). Samples (approximately 5 mg) were weighed into 40 µL aluminum pans and, then, hermetically sealed. The apparatus was heated from 20oC to 100°C
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100oC. All experiments were conducted in duplicate with three cycles, one first heating, onecooling cycle, and one second heating. X-Ray diffraction (XRD)
Diffractograms were recorded with a theta-theta X-ray diffractometer (D8 Advance, Bruker AXS GmbH, Karlsruhe, Germany). Measurements were performed in symmetrical reflection mode with CuKα radiation (λ = 1.54 A) with Gobel mirror bent multilayer optics in the angular range of 5 – 40° (2θ). The step size was 0.05° (2θ), and the measuring time was 1 s per step. Each experiment was conducted in triplicate, compressing the samples into the sample holder, hence providing a smooth surface.
2.2.3. NLC lyophilization
To determine the optimal parameters for lyophilization samples, different cryoprotectants (glucose, lactose, maltose, and mannitol) at different concentrations (5, 10, and 15% (w/w)), and two drying cycles (24 and 48 h) were tested (Table 2). After NLC and AmB-NLC
preparation, the cryoprotectants were added and samples frozen at -80°C. An Alpha 1-2 LD lyophilizer (Christ, Osterode am Harz, Germany) was used for freeze-drying. Moreover, the lyophilized (LYO) powders were reconstituted in water under gentle agitation and characterized for average particle size and PDI.
2.2.4. NLC in vitro release study
The in vitro release study was conducted using a dialysis membrane (cutoff 12,000 – 14,000 Da, Sigma-Aldrich, EUA). The membrane was previously hydrated (30 min, in PBS pH 7.4) and then filled with 1 mL AmB-NLC suspension containing 40 µg of AmB. The membrane was placed into 60 mL of PBS (pH 7.4) containing 1% (w/v) sodium lauryl sulphate and maintained at 37°C under magnetic stirring (100 rpm). Aliquots of 500 µL of the released medium were withdrawn at different time intervals (0, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 12.0, 24.0, 48.0, and 72.0 h) and the volume of each sample was replaced with fresh medium to keep volume constant. Samples were then analyzed by UV-Vis at a maximum wavelength of 412 nm, and AmB concentrations were calculated using the equation (y = 0.038
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+ 0.0425x R2 = 0.9999) obtained through the analytical curve in the same medium (PBS pH 7.4containing 1% (w/v) sodium lauryl sulphate). To this end, samples with AmB concentrations from 0.5 to 5.0 µg/mL (5 x 10-7 M to 5 x 10-6M) in PBS - sodium lauryl sulphate medium were
used.
2.2.5. NLC stability study
AmB-NLC had their stability analyzed over 60 days and LYO-AmB-NLC, over 360 days. Samples were prepared as previously described, placed in amber vials, sealed and stored. The content of AmB was measured after 1, 30, and 60 days for AmB-NLC. For LYO-AmB-NLC, samples were reconstituted in water under mild agitation and stability assessed after 1, 30, 60, 90, 180, and 360 days.
2.2.6. Statistical analysis
Statistical analysis, selection of models, and numerical optimization were performed using Statistical Software Minitab 16 (Minitab Inc., State College, PA, USA).
3. Results
The AmB solubility in the three liquid lipids chosen for this study was determined, and the values found for sesame oil, sunflower oil, and Miglyol® were 27.4 ± 0.3,
5.9 ± 0.2, 32.5 ± 0.4 µg/g, respectively. Simultaneously, the study of the ability to form NLC from the components of the lipid matrix was performed. The size of the particles, the PDI, and the 30-day stability period of NLC prepared with the three different liquid lipids are shown in Table 3. As can be seen, sesame oil is capable of producing smaller particles than Miglyol® when used
in a binary mixture with glyceryl monostearate. The results showed a statistical difference for the mean diameter of the particles for all evaluated samples (p < 0.05). Indeed, the NLC prepared with Miglyol® showed greater particle size (146.9 ± 2.1 to 240.6 ± 3.7 nm) and larger
PDI (0.29 ± 0.00 to 0.48 ± 0.01), indicating a heterogeneous distribution. NLC prepared with sunflower oil exhibited a particle size of 101.6 ± 0.4 nm on the first day after preparation, increasing over a 30-day period and reaching a final size of 136.2 ± 4.4 nm. In contrast, NLC
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formulated with sesame oil showed smaller particle size, ranging from 98.7 ± 3.6 to 129.0 ± 0.5 nm during the analysis frame time. In addition, NLC produced with sunflower oil and sesame oil demonstrated acceptable PDI values, indicating the homogeneous distribution of the average particle diameter. Based on these results, sesame oil was the liquid lipid that showed better results regarding the average diameter and PDI.Once the best liquid lipid for the NLC formulation was identified, an experimental design was used to determine the optimal concentration of each component in the formulation. At this stage, the proportion solid/liquid lipid and the concentration of non-ionic surfactant were evaluated. The results observed through the response surface graph (Figure 1) showed that different proportions of solid/liquid lipid and surfactant concentrations in both NLC and AmB-NLC influenced the particle size (p < 0.05). Importantly, it was observed that smaller particle sizes were obtained when a high proportion of liquid lipid and a low concentration of surfactant were used. These results indicated that the solid/liquid lipid combination in the ratio of 7:3 (w/w) and surfactant at the concentration of 3% (w/v) were the best conditions to produce NLC with smaller particle size and greater stability for more than 24 h. Therefore, such formulation parameters were adopted for further studies.
In Table 4, a comparison between the physicochemical properties of the NLC formulations before and after lyophilization is described. The parameters to assess the physical and the chemical stability of the AmB-NLC for 60 days were average particle size, PDI, zeta potential, EE, LC, and physical appearance.
The samples lyophilized without cryoprotectants did not maintain the properties from their original formulations (average particle size of 388.7 ± 10.7 and 379.9 ± 11.6 nm for NLC and AmB-NLC, respectively). Then, a study using different cryoprotectants at concentrations of 5, 10, and 15% (w/v) was performed. Again, the particle size, PDI evaluation, and EE were the parameters used to classify the best NLC. Lyophilized particles were re-dispersed and analyzed for 15 days. Among the studied cryoprotectants, the NLC using maltose at 10% (w/v) and a lyophilization cycle of 48 hours presented the smaller particle size (182.3 ± 2.7 and 179.7 ± 2.1 for NLC and AmB-NLC, respectively). Then, these parameters were further adopted for the lyophilization process of the samples.
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After determination of the lyophilization parameters, the stability of the NLC and the AmB-NLC were followed over 360 days. For lyophilized NLC and AmB-NLC, no change in the particle size was observed. Indeed, lyophilized NLC and AmB-NLC presented a particle size average of 182.3 ± 2.7 to 180.9 ± 3.1 nm and from 179.7 ± 2.1 to 178.2 ± 0.9 nm, respectively. The lyophilized powders of NLC and AmB-NLC were presented as white and yellow, respectively, both easily redispersible.DSC curves for the samples studied are presented in Figure 2. The event’s temperature and energy are shown in Table 5. Concerning the thermal behavior of the components used to produce NLC, the DSC curves of sesame oil and AmB had no peaks in the cooling and heating events, suggesting that they did not change their endothermic and exothermic reactions under the examined temperature range (Figure 2e and 2c). On the other hand, for glyceryl monostearate, on both the first and second heating cycles, melting endotherm peaks at around 53°C (Figure 2d) were seen. Also, during the cooling step a crystallization peak was identified at 52.68oC. Surprisingly, the addition of AmB on the NLC did not induce changes in the system
(Figure 2a). Therefore, as can be observed in Table 5, the melt point and the crystallization values were similar to the peaks for the non-loaded NLC. However, the NLC presented two endotherm peaks in both LYO-NLC and LYO-AmB-NLC curves because of the addition of the cryoprotectant, maltose at 10%, which was added to the lyophilization process. For LYO-NLC and LYO-AmB-NLC, the DSC curves of the cooling had similar behavior, presenting two exothermic peaks, which corresponded to the crystallization process.
Figure 3 illustrates the x-ray diffractogram of the components used in the preparation of NLC. The crystal-like structure of the sesame oil (first diffractogram) with a characteristic peak centered at 19.325° (2θ) was observed. Broader peaks were also seen for the glyceryl monostearate (second diffractogram) with peaks centered at 19.700° and 23.925° (2θ). On the other hand, the crystalline structure of the AmB (third diffractogram) was confirmed and its diffractogram presented peaks at 14.000°, 17.200°, 20.750°, and 21.575° (2θ). The nanostructure systems (NLC) presented spectra quite similar. Indeed, the NLC (fourth diffractogram) presented peaks at 14.375°, 18.300°, 19.175°, 20.050°, 21.075°, and 21.825° (2θ) and the one for AmB-NLC (black) at 14.375°, 18.300°, 19.150°, 20.050°, 21.050°, and
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21.800° (2θ). These peaks characterize the crystal structure of the raw materials and analyzed particles. It is important to note that the loading of AmB to the NLC did not change the diffractogram, which is evidence that the drug was fully entrapped in the NLC and its crystal structure was no longer observed.The content of AmB in the encapsulation efficiency (EE) study of the AmB-NLC was determined by a validated spectrophotometric method. After formulation production, EE was equal to 98 ± 1%, and by day 60 of storage it was 87 ± 5%, which demonstrates a reduction of 13% over that period. In addition, after 60 days the nanodispersion initiated a process of instability with the formation of precipitates, so the lyophilization process was used in order to maintain the stability of the formulations. Furthermore, lyophilized AmB-NLC presented an EE above 90% during the analysis time (360 days).
The in vitro AmB release profile from the NLC was assessed 24 hours after the production of the particles. The release assay, made in a dissolution medium consisting of PBS (pH 7.4) and 1% sodium lauryl sulfate, was performed in order to ensure sink conditions. Then, mathematical models were applied to the experimental data obtained along with 72 hours of the assay to describe and explain the system release profile (Table 6). The adjusted coefficient of determination (adjusted R²) was used to choose the model that best fitted the data, which in this case was the one proposed by Baker-Lonsdale (Figure 4).
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4. DiscussionThe idea of developing an NLC containing AmB is based on the fact that this nanostructure is composed of a binary mixture of solid and liquid lipids, able to promote a high rate of drug entrapment and control its release [44, 49, 50]. Indeed, the imperfections caused by the presence of the liquid lipid in a solid lipid matrix are able to induce a higher encapsulation of drugs, either in the molecular form or amorphous crystals [49, 51-53]. Therefore, the selection of the components of the NLC matrix is a critical step to achieve a successful formulation. Although there are no specific guidelines in the literature for choosing these components [54], the consensus is that the solubility of the drug in the lipid that forms the internal phase of the matrix is crucial and should be carefully considered, as it will influence the entrapment rate and, consequently, the drug release [55].
In this work, the solubility of the AmB in three liquid lipids was assessed (Table 3). Sesame oil and Miglyol® 812 had solvent properties. In addition to the solubility property of a
lipid liquid, another factor that may influence its selection is its tendency to form crystalline structures, or at least, the speed at which the polymorphic transitions occur [56]. Despite the differences observed in the AmB solubility in the studied oils (p > 0.05), sesame oil was determined to be the first-choice liquid lipid component of the formulation. In fact, sesame oil has unsaturated and long-chain fatty acids, which will lead to slower crystallization processes than Miglyol® 812, which only has saturated chains. Additionally, this phenomenon may have
important implications in the NLC formulation, since the physical characteristics, the stability, the EE, and possibly drug release from the nanoparticles are closely related to the crystal formation speed and the polymorphic transitions of the lipids that constitute this structure [38, 53, 57]. Moreover, the study of the feasibility of NLC based on the components of the lipid matrix showed that sesame oil was capable of producing smaller particles than Miglyol® 812
when used in a binary mixture with glyceryl monostearate.
Normally, for the development of new drug delivery systems, a large number of formulation variables have to be considered. In this work, the ratio between solid and liquid lipids and the concentration of the surfactant to stabilize the formulation revealed to be crucial. As a strategy to reduce the number of experiments, time, and cost of development of the
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formulations, without compromising the quality of the result, an experimental design based on statistical planning was carried out (Table 1) [58]. Essentially, a relatively small number of empirical evaluations were used to determine the mathematical trends that enable the prediction of parameters needed for a specific and optimized result [59]. The experimental design utilized in this work provided information regarding how the response of interest (NLC formation) was influenced by the lipid proportion and the surfactant concentration.A variety of different surfactants have been used to stabilize SLNs and NLC, including polymeric stabilizers and amphoteric, ionic, and non-ionic surfactants. The latter are particularly advantageous because they are more biocompatible and safe [60-62]. In this work, in order to stabilize the NLC, the non-ionic surfactant Pluronic® F68 was chosen. Furthermore, it is well
known that non-ionic surfactants effectively inhibit the in vivo degradation of the lipid matrix [63]. In particular, surfactants derived from poly(ethylene oxide) (PEO), as Pluronic® F68, do so by
preventing the adhesion of lipases on the surface of the dispersed phase [64, 65]. The adjustment of the density of PEO chains on the surface of lipid nanoparticles can modify its degradation rate in vivo and, consequently, the release rate of the incorporated drug. Thus, it is clear that the choice of the surfactant used to prepare such systems is not a trivial issue, since it will alter the carrier´s stability and consequently the release of the incorporated drug, as noted by Venkateswarlu (2004) [66], who evaluated the percentage of Poloxamer® 188 and the NLC
surface charge for Clozapine release.
The proper characterization of the NLC formulations is important to guide the development of dispersions having the desired properties for the intended application. Additionally, the confirmation of the results obtained from different techniques may provide a better understanding of the structural and behavioral properties of these systems [67]. However, the characterization just after production is not sufficient to ensure that the product will maintain its properties for the desired time. Therefore, it is extremely important to analyze the maintenance of these characteristics as a function of time.
The stability of pharmaceutical dispersions is usually modulated by the electrostatic and/or the steric stabilization. The mechanism of destabilization, otherwise undesirable while the product is on the shelf, may be important for drug release. Moreover, instability problems
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can arise during storage, and events such as sedimentation, agglomeration, jellification, and particle growth are common in lipid nanodispersions. On the other hand, in the dried version of the nanodispersions these phenomena are nonexistent [68].Lipid nanodispersion stability analysis for NLC has been described. In most reported cases, these systems remain stable for an initial period of time, but the instability phenomena are observed when the formulations are stored in the dispersion form at room temperature for a period of 90 to 120 days after production [45, 69]. In this regard, Teeranachaideekul (2007)[45] evaluated NLC and solid lipid nanoparticle (SLN) suspensions for 90 days and observed that the average diameter remained smaller than 350 nm. In addition, Li (2008)[69] showed that particle size alterations may occur depending on the time and storage temperature. When stored at 25°C, the dimensions of NLC particles increased significantly (p <0.001) during the storage period. On the other hand, the particle growth was slower (p> 0.05) when NLC were stored at 4°C. Furthermore, NLC visible aggregation was observed at 15 and 30 days.
Furthermore, in our work, the stability of dispersed and lyophilized NLC was evaluated. Parameters such as mean diameter, PDI, zeta potential, encapsulation capacity, EE, and macroscopic aspects were used to obtain information about the stability and nature of the colloidal system. Analyses of NLC were performed 24 hours after preparation and after 15, 30, and 60 days of storage at room temperature (25°C). Distinctively, NLC samples were further prepared, lyophilized, and analyzed after 90, 180, and 360 days (Table 3).
The average diameter of the dispersed samples with and without AmB, named AmB-NLC and AmB-NLC, respectively, showed a slight increase up to day 60 of the study, suggesting a tendency to form aggregates. After this period, the first signs of instability such as agglomeration and jellification were observed in the samples. On the other hand, lyophilized samples remained unchanged regarding their visual appearance throughout 360 days, with no significant alteration in the average diameter when redispersed. In addition, the encapsulation of AmB did not promote a significant increase in the size of the carriers (Table 4).
The analysis of the PDI values also leads to the conclusion of de-stabilization of the nanocarriers, as the values also kept increasing over time. For this parameter, values around 0.2 are desirable and dispersions with values above 0.2 may characterize a non-uniform
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distribution of particle size, becoming a limiting factor to determine the drug administration pathway [70, 71]. For lyophilized samples, a smaller PDI value was observed when compared to those samples that had not undergone the drying step, probably because of the stresses to which the particles were submitted during this process [72].Besides the average diameter and the PDI, the zeta potential is usually analyzed as a stability parameter since it is a measurement of the surface charge. This characteristic of colloidal particles has a significant impact on their in vivo behavior and the understanding of their stability. Typically, high zeta potential values are indicative of colloidal stability [73]. However, in this study, the zeta potential could not be used as a measure of stability due to the use of Pluronic® F68. This surfactant agent has a steric stabilization effect and, then, the
electrostatic repulsion surface may not be considered as the major parameter that influences the stability of the colloidal particles [74]. Nevertheless, the values obtained for this parameter remained negative and demonstrated an increase in the samples containing AmB, suggesting that part of the incorporated drug can play a role in the organization of the surfactants at the interface, slightly changing the surface charge.
DSC analysis was used to characterize the state and the crystallinity degree of the sesame oil (Figure 2e), the glyceryl monostearate (Figure 2d), and the AmB (Figure 2c), as well as the lyophilized NLC (Figure 2b). This analysis allowed the study of the melting and crystallization behavior of crystalline materials such as lyophilized NLC (Table 5). The AmB and the sesame oil itself presented no thermal events in the range of temperature studied (Figures 2c and 2e). However, it was shown that the melting temperatures of AmB-NLC and LYO-NLC were lower than the melting point temperature of the isolated glyceryl monostearate, Pluronic® F68 (242.3°C) [75], and maltose (66.5°C) 81, which can be attributed to the alteration
of the crystal structure and the increased number of lattice defects in the crystal lipid [76]. On the other hand, the diffraction patterns exhibited by lyophilized NLC and AmB-NLC formulations were very similar and did not show the influence of AmB on the crystal structure of the particles, confirming the DSC data, which suggest that solubilization of the drug in a crystalline lipid matrix follows the second model of Muller [59].
