Seleção de estirpes de Rhizobium leguminosarum bv, phaseoli tolerantes a fatores de acidez e resistentes a antibióticos

Texto

(1)SELEÇÃO DE ESTIRPES DE RhlZDO/um Jegumlnosarum bv. pnaseaJI TOLERANTES A FATORES DE ACIDEZ E RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS. NORIMAR D'4VILA DENAROIN BIÓLOGA. Orientador: Prof. or. 41varo Augusto Teixeira Vargaa. Dissertação apresentad� à Eocola Superior ae Agricultura »Luiz de Queiroz » , da Universidade de São Paulo, para obtenção do t(tulo de ·Mestre em Agronomia, 4rea de concentração: Solos e Nutrlcão de Plantas. P I. R A C. I. G A. B. A. Estado de Sao Paulo - Brasil Janeiro - 1991.

(2) Ficha catalográfica preparada pela Seção de Livros da Divisão de Biblioteca e Documentação - PCAP/USP Denardin, Norimar D'Avila D391s Seleção de estirpes de Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli tolerantes a fatores de acidez e rePiracicaba, 1991 • sistentes a antibióticos. 89p. Diss. (Mestre) - ESALQ Bib 1 iografia. 1. Bactéria fixadora de nitrogênio - Resistê� - Nodulação 3. Nitr� eia ao antibiótico 2. Fixação 4. Solo - Acidez I. Esgênio -'"cola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. CDD.

(3) 11. SELEÇÃO DE ESTIRPES DE RhJzablum legumlnosarum bv. phaseoJI TOLERANTES A FATORES OE ACIDEZ E RESISTENTES A ANTIBIOTIGOS. NORIMAR D'4VJLA DENARDIN. Aprovada em: 05/03/1991.. comissão Julgadora:. Prof. Dr. Alvaro August� Teixeira vargas. GEMA/USP. Profa. ora. Elke Jurancty Bran Nogueira Cardoso. ESALQ/USP. Prof .. or. Luiz Gonzaga do Prado Flltlo. ESALQ/USP. Prof. Dr. Orlentae!or.

(4) 1 1 1 •. Ao meu esposo José Aos meus fl lhos Grezlela larissa Matheus D E D I C O.

(5) I. v•. AGRADECIMENTOS. Ao. professor Dr. álvaro. Augusto. Teixeira. Vargas pela orientação, apolo e amizade. A Escola Superior de Agricultura Queiroz. (ESALQ/USP). e. ao Centro de. Energia. Luiz. de. Nuclear. na. Agricultura (CENA) pelas faci I Idades proporcionadas. Ao. Conselho. Nacional. de. Desenvolvimento. Clentrflco e Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro. Aos funcionários da Seção de. Microbiologia. do Solo do Centro de Energia Nuclear na AgricUltura Slu. Mui. Tsal,. Francisco. C.. Marli de Fátima Montrazzl,. Flore,. Roberto. Mário Bizetto e. em. (CENA) Bonettl,. especial. a. Márcio A. Gava e a estagiária Valéria C. Franco. Ao Dr. Itamar. Soares. de. Melo. e. a. Ora.. Beatriz Mendes pela amizade. A todos. 05. professores e. funcionários. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz e do Centro d I reta. ou. de. deste trabalho.. (ESALQ/USP). Energia Nuclear na Agricultura. I nd I retamente contr I ou I ram. para. da. a. (CENA) que rea I I zação.

(6) V'.. SUl\iÂRIO. Págl n.a RESUMO.. til. •. li. e. 11. 11. .............. 11. li. li. •. li!. ". 11. ••. li. ~. li. •. :a. 111. •. li. li. ••. ~. ali.. I NTRODUCnO.. :a. li. li. li. ...... li. •. It. a. D. li. Ib. li. li. to. .;. 111. :li. /I. SUMMARY.. 1. li. 2.. 11. ...... li. 11. ". 11.. .... 11. ••. ",. :I. •. o. .... li. ••••••. D. ". li. 11. li. Iil. li. li. IJ. li. li. ........ "'.. li. li. S. ". 11. .... I!I. •. li. •. 11.'. li. 11. S. 11. li. li. li. li. S.. li. li. REVISt\O DE LITERATURA ..." . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2.1. Nodulação e. li. ~. li. ... li. •. li. li. li. A. li. li. iI. 11. li. li. •. li. .... li. •••. li. ..... li. .:. 2.2. TOlerância do Rhlzoblum a pH baixo........... 2.3.. I}( 1 3. de nitrogênio. flxaç~o. a ttno s f é r I co ...... VI I. 3. 9. Tolerância do Rhlzoblum a nrveis t6xicos. !I.. 15. Resistência do Rhlzoblum a antlb!6tlcos ... '\, .••. 17. MATERIAL E METODOS •• , ••••• , ••••••••••••••••••••••••. 23. 3.1. Coleta das amostras de solo ............... ,.... 23. ::1.2. Análises qu(mlcas das amostras de solo......... 24. 3.3.. Isolamento de rlz6blos a partir ele nÓdulos·. de alumrnlo ••••. III. ••. ".lII.~. •••••. e.IJ.II. ••. :lOlIll.(!. •••. .. q1-.•. 3.. obtidos em Phaseolu9 vulgar/s. •••••••• ••• •••••. 24. 3.Q. Teste de Infectlvldade e eficiência na fixação. do nitrogênio atmosférico de Isolados de Rh/zobllJm em Pf18seolus. ~llIf9arls................ 26. 3.5. Talerancta ele isolados de Rhlzoblum a pH 4,5. e a pH 4,5 + 100 uM de alumrnlo....... .•. .•.•. 3.6. Resistência de Isolados de Rhlzob/um a. 30.

(7) \I. I •. !lIi........ 31. rarzes de Leucaena leucocephala. ......... ...... 33. o...................... 35. antlbI6tlcoS.CI."1I3Dca. .e!l. õ:1I. ••••••••. !lI1./J. ... ,. 3.7.. Avaliação. da habi Ildade de. Isolad05 de. Rhlzoblum legumlnosarum em Infectar. 4. RESULTADOS E OISCUSSno .. ; •.... 4.1. Caracterrstlcas da acidez dos solos utll izados para. Isolamento. estirpes. de. Rl1lzoblutn. ....... de. 35. 4.2. caracterrstlcas morfológicas das colônias de Rhlzoblum legumlnoBsrum bv. phaseoll i s o I fi das.. 11. ••. li. ••. li. 11. •. •••••. 11. ....... li. ••. 11. •••. 11. 111. .ai. li. ••. •. 11. .~. 37. 1,1. 4.3. Capacidade Infectlva e eficiência de fixação de nitrogênio atmosférico de Isolados de. Rhlzoblum legumlnasarum bv. phaseoll em Phasolus vu/garls ..... .,.r. tC}2. e à toxldez de alumrnlo........................ 50. 4.4. Toler§ncla. de. legumlnosarum. "a •• o • • • •. Isolados de. phaseoll. bv.. IlIi.Q.CJ. ••. It. •. .''II •. Rhlzob/um baixo. a pH. 4.5. ResistêncIa de Isolados de RhJzoblum. legumlnosarum bv. Phaseoll a antibióticOs..... 4.6. Habilidade de estirpes de. 59. legumlnosarum,. Rll/zobium. Isoladas de nÓdulos de PhaSeo!us vulgar/s, ~. em Infectar rarles de Leucaena leucocephala... 5.. C ONC LU S OE S. REFERêNCIAS APêNDICES. lta. 11. li. li. •••••••. 11. •. S. ~. ••. S. •. BIBlIOGR~FIGAS...... 70. •. 74. ..•...•.•...... ... ...... 76. li. ••••. e. li. •. 1&. •. 8. ................................ •. :r. li. ". ••. ".a2aa. .o. •• ". •. ••••••. 87.

(8) vI. I ,. SElECIO DE ESTIRPES DE Rhlzoblum legumlnosarum bv. phsseoll. TOLERANTES A FATORES OE ACIDEZ E RESISTENTES A ANTIBIÔTICOS. AUtOt'8:. Norlmar O't{vlla Denardln. Orientador: Alvaro Augusto Teixeira Vargas. RESUMO. De regiões estado. 31. amostras. de. solo). de cultivo do feljoelra (PhaseolUS de. São. Rh/zoblum. foram. obtidos. bv.. phaseol'.. Isgumlnosarum. ª. Isolados. Paulo,. foram. morfologicamente. purificados, e. submetidos. em. vulgar/a),. no. Isolados. de. 151. Esses. partir de nÓdulos radlculares. -feljoelro,. coletadas. em. plantas. autenticados, a. uma. rhlzoblos,. seleção. descritos quanto. eficiência. slmbl6tlca, tolerância a fatores de acidez,. 4,5. 4,5. e. pH. antibióticos. InocUlaçlo. Parte. cruzada. obJetlvtllHJo-se. eficiência. + 100. UM~. de. alumrnlo,. avaliar. slmblótlca. a. nesta. testados. Lwucaena. tlab II I dade. I. leguminosa.. a pH. resistência. 8. desses isolados foram em plantas de. de. a. para. leucocephalD,. nfect I va. Os. Isolados.

(9) li I I I •. upreaentaram elevada lIarlab! I Idade comportamental quanto eficiência. aos. elmblótlc8, tOlerância à acidez. 7 nrvels dos 7 antibióticos estudados.. e. resistêncIa. Os. resultados. permitiram destacar estirpes com atividades da superiores. às da. testemunh~. GM 02 (CIAT. a. 899),. nltrogenaie tolerância. aos. fatores de acIdez e resistência aos. antibióticos.. De. 140. Isolados testados para Infectar e fixar nitrogênio. em. Leucaena destes. leucocephaJa, 106 formaram nÓdulos, sendo que apresentaram eficiência slmblótlca e. aos fatores de acidez.. .57. 89. toleraram.

(10) I. x•. . SELECTION OF STRAINS DF Rh/zob/um legumlnosarum. bv.. phaseoll. TOLERANT TO AGIDITY FAGTORS. ANO RESISTANT TO ANTIBIOTICS. Autora: No,'imar. O't{vlla. Oenardin. Orientador: Alvaro Augusto Teixeira Vargas. SUMf"iARY. From. Rft/zoblum stralns bean. 31 sol 1 samples !.Ised, 151 atrairia. legumlnosarum bv. phaseol/ were Isolated. wera. Isolated from nodules obtalned. (Phaseolus. vulgar/e). plant,. purlfled,. from. of. Thea6. commom. Identlfled,. morphologlcally descrlbed anel selected for efflcletlcy In 1\12 flxatJon, tOlerance to acldltv factors 100. uM. Ai). and reslstance to. cross-lnoCulatlon. Leucaena. ablllty ..,. leucocepnala In. Yarlabll~tv. tolerance. antlblotlcs. to. sol I studled.. antlblotlcs.. stralns. plants. The. symblotlc. (pH 4.5. were. acldlty Stralns. factors wlth. To. evaluate. Inoculated. leolates. afflclency. and pH 1.5 +. showed. . In hlgh. for and. reslstance. nltrogenase. to. actlvlty.

(11) x• hlgher. than the control. reslstant tested. for. I. tolerant to acldlty. to ant!blotlc were selected. From Infectlon and nltrogen. flxatlon. 1:actors 140. Isolates. In. Leucaena. leucocephala plaot 106 nodulated, and frDm these 99 symblotlc factors.. effectlveness. ând. 57. tolerance. anã. to. showed acldlty.

(12) 1. 1.. I NTR OOUC1{O. o feljoelro cultivado no Brasl I,. como. cultura. (Phaseolus. baslcament~,. por pequenos. de subsistência, sem o. l.>. vulgar/s,. emprego. produtores,. de. Insumos. potencialmente, promotores de uma elevada produtividade. rendimento médio, obtido sob tal sistema de produção. I Imitado. a. superiores. áreas. a. 60b. deficiênCias aquelas. contrastando. 500 kg/ha,. 3.000 kg/ha de áreas. o. emprego. de. nutricionais. ocasionadas. pelo. nessa. das. produtividade do felJoelro,. nltrogên!o,. SBm. ~rodutoras. alternativas. são. principalmente. comuns. do Pars. para. aumentar. em condições de deficiêncIa. elevar, significativamente,. resultar em benefrcfos é necessário. simbiose entre o felJoelro e o nhlzoblum.. fIe. apropriadas.. cUltura,. nltro9ênl~,. ou. os custos. uma. de de. sementes. estirpes de Rh/zobJum especrfiCOS. Contudo, para. tácnlca. está. -'~. produção, é fazer uso da prática de Inoculsçãa de com. O. produtividades. experimentais,. técnicas. praticamente, todas as regiões. Uma. com. é. esta. adequada.

(13) 2. condições. Sob. nltrogênlo pode. atmosférico. fixado, por melo. o. adequadas,. amblen~alB. dessa. atender a maior parte das necessidades do. simbIose, felJoelro,. para com este elemento. Entretanto, os fatores da acidez do solO,. pH. baixo e. frequentemente,. concBntraç~e5. I Imitam. elevadas de alum(nio tÓXico,. todas as etapas. do. processo. das ra(zes, formação de nódulos e asslml. Infecção. de. de. laç~o. nitrogênio na planta. Partindo da hlp6tese de que no solo. de Rhlzoblum com. estirpes. quanto. diversIficadas. ao comportamento frente à tolerância a. acidez, sensibilidade a e. Cáracter(stlcas. eficiência. a~tlbI6tlcDS,. fatores. capacidade. na fixação do nitrogênio. existam. de. !nfoctlva. atmosférico,. este. estudo tem por objetivos:. - Isolar, puriflcar e. l. autenticar, selecionar. conservar estirpes de Rhlzoblum com potencial Idade. Infectar feljoelro,. e. fixar nitrogênio atmosférico, tolerar. a. fatores. de. acidez. para. em. plantas. e. resistir. de a. antibióticos:. selecionar legumlnosarum. com. estirpes. potencial Idade para ~. de. Infectar. nitrogênio em plantas de Leuc8ena leucDcephala.. Rhlzoblum a. fixar.

(14) 3. 2. REVisno Df LITERATURA. 2.1. Nodu!ação e fixação de nitrogênio atmosférico. relacionadas. Questões. do. ecologia. Rhlzoblum, tais como, habilidade colonizadora e. competição. de. necessitam. estirpes. por srtlos de. Infecção. nodulsr,. melhores conhecimentos.. o. aumente da eficiência da slmbloSB. o Rhlzoblum e a planta partIr. hospedeira, somente será. do momento em que estirpes. eficientes. entre. I. obtido. a. tornarem-so. viáveis b Inoculação.. o a. bactéria. processo slmblótlco é estabelecido quando. Infecta. estabelecimento. de. e. nodula o. uma. simbIose. hospedeiro. efIciente. Contudo, depende. propriedades IntrfnsSC8s dos slmblontss, bem como. da. l. o de. ação. J. exercida pelos fatores ambientais, sejam; eeparadamente, ou por. melo. Interações. entre. estes. fatoras. (VINGENT,. 1980).. AS estirpes de Rhlzoblum apresentam. grande.

(15) varlabl I Idade quanto a habl I Idade em Infectar e nodular a planta hospedeira (NUTMAN, 1967). frequentemente,. Ineficientes produzem mais n6dulos por planta que. estirpes eficientes, em função da. estirpes. h~spedelra. do. nodular. f1Slo109!8. que apresentam (OART, 1974)." fRENEY & GIBSON (1974) sugerem propriedades. as. que. Intr(nsecas. às. estirpes. pOdem. diferenciá-Ias quanto a capacld3de de retenção e transporte de nitrogênIo fixado. Estirpes. de rlzdblos. que nodulam e. ª. nitrogêniO,. eficientemente, quando assocLadas espécies,. ou. cultivares. plantas. de. fixam algumas. hospedeiras,. pOdem. apresentar baixa efiCiência de flKação quandO associadas. outras. Desse. (fRANGO & DOBEREINER, 1967; modo, a eficiência das. Isoladamente,. ~6tlrpe6,. não levando-se em conta. pouca validade (VINGENT,. Em (1976b), para testar. de. LOPES et al i!. hospedeiro,. conduzido por lOPES. tem. at. ai I I. efIciência slmbl6tlca de 19 estirpes. Rhlzoblum phaseoll, em 4 cultivares. observa~o. conSiderada. 197~).. trabalho. ª. 1976a).. I. ~~. quando. o. que 13 destas estirpes. de felJoelro,. mostraram-se. foi. eficientes. nas cultivares Carioca e Plratã, q na cultivar Moruna na. cultivar Goiano-Precoce. As estirpes SMS 371. foram,. Igualmente,. que. estirpe SMS 377 nOdulou, mas não foi. a. a. e. eficientes nessas 4 cultivares,. fixação de nitrogênio nas cultivares testadas.. e. 5. SMS 376 sendo. eficiente. na.

(16) 5. et. VARGAS de. Jocals. natural,. cultivo. multo. de. ai I I. feljoelro,. embora. encontraram,. (1983). fossem. nodulação. abundante. nrtldos. os. em. sintomas. de. deficiência de nitrogênio. A população nativa de Rh/zobluM, já. estabelecida. fREDERIGK,. no. (1974),. Bolo, "representa,. (1981), MOAWAO & 60HLOOL,. sucesso outros. da. Inoculação. de. alll,. WEAVER. & GRAHAM. estirpes, (1988). Rhlzoblum legumlnosarum bv.. o. de. solecionaram. 20. phaseoll. um. flxaçlo slmbl6tlca de. Embo'ra os resu i tados no campo. I. o. oriundas. total de 225 estirpes estudadas para a tolerância à. dO solo e eficiência na. &. GRAHAM,. (1976),. a maior limitação para. (198"'0,. com novas. locaiS. VARGAS. estirpes. et. ROUGHLEY. segundo. de. acidez. nltrog8nlo.. em quatro regi ões do Bras lI, .,oO~oi:;. com. algumas. dessas estirpes,. oubstanclals na. prDduç~o. tenham. apresentado. ganhos. de grãos de feiJão, em pelo. menos. 25 % desses experimentos não houve nenhum benefrClo com Inoculaçlo. A cauoa mais provável para esse Insucesso, vez. que. os. deficientes. experimentos em. foram. nitrogêniO mineral. conduzIdos I. foi a. estabelecimento das estirpes Introduzidas por ertlos de. Infe~ç~o. em. a. cItam. que. o'. d~. feljoelrO com seu Rhlzoblum. resultado Incerto. PESSANHA. na. no. competição. homÓlogo fOI, durante multo tempoJ considerada uma de. solos. nodular.. A Inoeulaçlo. 8grrcola. uma. dificuldade. e. a. lIteratura. há. exemplos. et de. ai I I. prática (1972). correlações.

(17) 6. negativas entre o ndmero de n6dulos formados pelo Rhlzobium e. a. produção de grãos.. mostram. o. que. micrOorganismos das. Entretanto,. tratamento. das. resultados sementes. melhora, sensivelmente, o. plantas, podendo aumentár o rendimento. & HALlIDAY, 1977;. GRAHAM & ROSAS 1 1977:. recentes. com. esses. desenvolvimento de. grãos (GRAHAM. RUSCHEl & SAlTO,. 1977; RUSGHEl et aI I I, 1982; VARGAS et ai I I, 1983; DUQUE et a I I I, 1 985; VARGAS 8. GRAH AfJj ,. de. comportamento,. 'I 989 )... torna-se. c: om e 5 S a. necessário. v fi r t a b I I I cI a ti e. que. as. estirpes. componentes de um Inoculante apresentem alta eficiência com o maior ndmero possrvel de cultivares, para proporcionar estas,. condições. sob. nutricionais. favoráveis, a maxlmlzação A. da. e. ~. 'fisiológicas. fixação slmbl6tlca de N2" da rlzosfera com. coloniz~çlo. popUlações. de RhJzoblum pode ser Influenciada por excreções e exudatos. radlculares, orgânicos. cuja. açucares. e. BROUGHTON,'. 1978) •. na. se I at.1 vamente,. capacidade. de. estirpes.. composlC~o. varia em aminoácidos,. (ROV1RA ,. Essas pOPUlação. et. aI i I. c'. de. (1978). através. compostos c I tam. leguminosas. fenômeno em. sementes. e. pelas. Infecção. pelo Rh/zoblum espec(flco, atribuIndo. às 911coprotelnas (Iectlnas) que são. na. superfrCle. das. rarzas. da. Inllmeros. em. trabalhos o mecanismo de atração qulmlostátlcª na de. atual',. podem. Rh/ZDblum. desses. 1977;. VINGENT /. substâncias. metabollzacão. PUEPPKE. 1969;. ácidOS. este. encontradas. e. dos. pêlOS.

(18) 7. radlculares. desta. famrl la de plantas. Segundo. BOHLOOL. &. SCHMIDT (1974), WOLPERT & ALBERSHEIM, (1976) e DAZZO (1982). este. reconhecimento. leguminosa. entre. hospedeira. se. o dá. ospec(fico. Rh/zobium. através. da. e. ligações. a com. pol 18sacarrdeos presentes na superf(cle da bactéria. de. ~felto5. sobre. a. nadUlação A. observados.. hospedeiro. e. fixação de. toler~ncla. à. fatores. acidez,. sidO. apresentada. permitido. tem. ácidos (MUNNS, 1978). O efeito da acidez do solo. na. na eficiêncIa. prInCipalmente, ao pH. 1. •. (DOBEREINER, 1966) e. ~. bal~a. essênclals. de. pelo. em. e. o comportamento. têm. leguminosas. nadulação. nobre. ambientais. nitrogênio. pelas estirpes de Rh/zoblum,. generalizações solos. e a. diversos. slmb!6tlca. relacIonado,. está. toxldez de s.lumfnlo e de. disponlbl I Idade de. à simbiose, como cálcio, f6sforo. manganês. nutrientes. e. mo! Ibdãnlo. (NOP.RIS & DATE, 1976).. /. o procasse leguminosas. precedem. infecção. das. pelos rlzõblos consiste de várias. ra(zes. etapas. entre os. e. rl~dblos. (BOHOOL &SCHMIDT, 1974;. a. planta. do. hospedeira. BOHOOL & SCHMIDT, 1976:. BHUVANESWARI & BAUER, '.978;. de. que. a formação de n6dulos, Essas etapas consistem. reconhecimento. 1979;. de. SGHMIDT,. DIZZa & HUBBELL, 1975),. adsorção dos rlz6bloB à superf(cle das rarzes do hospedeiro (SCHMIDT, 1979; BAUER, 1881; DAZZO et ai i I, 1976; DAZZO. a 11. I. I. 1984),. curvamento. dos. pêlos. radlculares. et. pelOs.

(19) 8 exudatos dos. rlz6blos. (ElAUER,. 8. SOUIEIM,. 198L ElHLJVANESWARI. VOA & VINCENT, 1969; HUBBELl, 1970) e a formação. 1985;. II'l"fectlvo. cordão. (BAUER,1981;. GALLAHAM & TORREY, 1981).. 1985;. Importantes. biológico pOderá. BHUVANES\'JAR!. 11. Todas. etapas. essas. para o sucesso 'da nodulação. ou. ambienta!. comprometer. s~o. fator,. dessas. etapas,. sUbsequente,. a etapa. SOlHEIM,. Qualquer. que afete alguma. I. do. prejudicando. a. eficiência desse processo slmbl6tlco. Observações real izadas por ElHUVANESWARI. ai. I I. (1980). na cultura da. constataram que. 50ja,. os. pêlos. radlculares capazes de serem Infectados pelos rlz6blos, momento da I noeu I ação,. de. ponto. alongamento. emergência (1989) da. est~o. da. loca I I zaclos na 1a I xa se Ima. rarz. e. abaixo. do. et. ponto. no do. de. & GRAHAM. do pêlO radlcUlar mais Jovem. VARGAS. encontraram no felJoelro uma situação semelhante. soja quanto a. dlstrlbUlçã~. dos nódulos, embora. a. existam. varlaçõea entre a distribuição de nódulos entre estirpes cultivares.. multiplicação. Assim, dos. caso. exIsta. rlz6blos,. na. alguma. limitação. rlzosfera. da. vez. que. o. perrodo. -'. em. que. os. pêloS. na. planta,. nodu!acão Induzida pelo Inocu!ante não terá multo. uma. e. a. sucesso,. radlculares. permanecem 5usceptrvels à Infecção é multo curto. Aumentando-as. fi. dosagem. de. Inoculante. aplicado. às sementes das leguminosas pOde,. melhorar. a nOdulação, tanto peia sObrevivência da. algumas vezes. l. estirpe.

(20) 9. Inoculada. na rlzosfera da planta, quanto pelo fato de. pOPulação. mais. alta favorecer a competição. pelos srtlOs de Infecção nodular. dos. uma. rlz6blos. (BOHLDOL & SCHMIDT, 1973:. VARGAS & GRAHAM, 1989). JOHNSON & MEANS (1964),. aumentando. em 25 vezes a dose de Inoculante normalmente utl I Izada. por. produtores de soja, encontraram um aumento médio de 5 vezes no. percentual. estudadas.. de n6dulos formados. por. algumas. Gontudo, esse aumento na dosagem de. inoculante. nlo tem vai Idade prática num sistema de produção pois. gastos. adicionais com Inoculantes, além. estlrPBs. agr(cola, dos. custos. operacionais, tornaria essa alternativa Inviável.. Estirpes. de. Rhlzoblum. recomendadas. para. inoculantes de leguminosas, além de serem eficientes para a fIxação slmbl6tlca do nitrogênio, devem ser capazes. comp~tltlvas. de persistir no solo mesmo na ausência. da. e. planta. hospedeira.. 2.2. Tolerância do Rhlzoblum a pH baixo. Uma do felJoeiro,. prática para aumentar a. produtividade. em condições de defIciência de nitrogênio, é. melhorar. a. simbiose entre esta planta e. ambientes. favor~velS,. a fixação dO. ~. Rhlzoblum.. Em. nitrogênio. atmOSférico, através de simbiose, pode suprir a maior parte das. necessidades deste elemento para o desenvolvimento. da.

(21) 10. Entretanto,. planta.. frequentemente,. fatores. I Imitam. como. a. acidez. simbIose,. a. solo,. do. todas. afetando. etapas do processo de Infecção das rarzes pelo Rhlzoblum Inibindo. a. formação. de. n6dulos.. A. seleção. estirpes. de. as. a de. Rhlzoblum tolerantes à acidez, como uma técnica alternativa. para. superar as I Imitações do suprimento de nitrogênio' ao. "feljoelro em solos áCidos, tem sido realizada com. sucesso,. melhorando o desenvolvimento de Inoeulantes. danos. Os. sobrevivência. no. crescimento. através. do. aumento. algumas. vezes,. dosagem. da. e. do. (ROBSON & LONERAGAN, 1970; MUNNS, 1977b; MUNNS.. Inoculante 1977a;. acidez. do Rhlzoblum no solo podem,. solucionados. ser. da. &OLSEN,. RICE. 1983)... Entretanto,. a magnitude. das. dosagens requeridas para o sucesso dessas InocUlações não é prátiCO para uso comum por parte de agrIcultores. Por outro. lado, tem se dado ênfase à seleção de estirpes de Rh/zoblum. tolerantes. à. tolerantes. à. geralmente,. acidez. aCidez, têm. do. solo.. Estirpes. selecionadas em. apresentado. boas. de. melo. RhlzolJllJn1. cUltura,. de. respostas. quandO. I. Inoculadas em solos ácidos, colonizando o solo e Infectando as. plantas. estirpes. hospedelras,.,em nrvels superiores. consideradas sensrvels. 1979; GRAHAM. et ai I I. I. 1982;. a. acidez. (KEYSER & MUNNS,. THORNTON & OAVEY, 1983b).. Rlz6blos são microorganismos. que. crescem. numa. aqueles" de. faixa de pH entre. neutt'Ofri Icos. 1,0 e 9,5. (GRAHAM &.

(22) 11. PARKER, 1964), um. pH. ótimo. multo embora, a maioria das estirpes. tenha. & PARKER,. 1964;. em. torno de 7,0. (GRAHAM. BROMFIELD & JONES, 1880). DATE & HALLIDAY (1979) citam duas. de. ~stirpes. Incapazes. Bradyrhlzoblum,. de. Resultados. Isoladas. de. crescer em mélo de cultura. ácidOS,. SOl05. com. slml lares foram encontrados por. pH. neutro.. SOUZA et ai I I,. (1984), demonstrando que a maioria dOs rlzdblos Isolados de I eguml. ácidos. da. foram capazes de crescer em melo de cultura. com. florestais. nosas. Amazônia,. pH 5,0,. 8gar a. mas. nativas,. em. BoloS. poucos Isolados puderam crescer em. com pH 7,0. Alguns Isolados de Bradyrhlzoblum sao. m~lo. citadoS,. por VINCENT, (1965), como tolerantes a pH 3,5. Contudo,. experimentos após. onde o PH do melo de cultura. autoclavagem e a Inoculação foi. a. foi feita. verificado. com. baixo. ndmero de células, observou-se uma pequena percentagem. Isolados. testados. tolerante~. a pH 4,5. 1979; GRAJ-HH'i et alll, 1982; VARGAS. Considera-se. &. CKEYSER. em. dos. & MUNNS,. GRAMA!"I, 1988).. que, normalmente, dentro. Rhlzoblaceas o Bradyrhlzoblum de crescimento lento, é. das. mais. tolerante à acidez do que o Rhlzoblum de crescimento rápido CGRt\HAI'-1. &. PARKER,. 1964;. VINGENT,. 1965;. MU!\!NS,. 1978).. ~. Estirpes de Bradyrh/zoblum, normalmente, produzem aleal I em mel\'). de. cul,turs,. uma-. caracter(stlca,'. originalmente,. Interpretada como uma resposta evolucionária para a vida em' regiões. tropicais. de. SOl08. é1clclos. (NORRIS,. 1965)..

(23) 12. Entretanto, tem sido demonstrado que. de pH em melo. m~dança5. ). de. cultura,. dependem da fonte de carbono e. da. quatldade. (SKOTNIGKI & ROLFE, 1977:. dlspon(vel de tampão com fósforo ZA6l0TOWIGZ & FOCHT, 1981).. & FOGHT. HERNANOES. estirpes. de. encontraram em. melo. Rh/zobJum do grupo. de. caupl,. cultura. não. estão. relacionadas,. e. que. dos rlz6blos do grupo caupl, como sendo. crescimento lento e produtores de aleall,. de. 103. que a taxa de crescimento e as mUdanças de. caracterização grupo. e. Bradyrh/zoblum. estudando. (198~),. é. pH. a do. um. conceito Inválido. Dentro de cada espécie de Bradyrhlzoblum Rh/zoblum. existe uma grande variação para a tolerancla. pH. (KEYSER & MUNNS,. ba I xo. VARGAS & GRAHAM,. entre. 1979;. GRAtiAM. et. ao. 1982;. As diferenças. GOOPER, H185>.. 1988; WOOD &. a I I I,. e. estirpes de Rhlzoblum para a tOlerância a acidez. em. melo de cultura I rquldo, poderá se tornar difrcl I devido ao metabollamo. substrato. do. pelas. ~ctérlas,. que. provocar. modificações do pH do melo. Assim, o consumo. açucar,. ou. acidificação aminoácidOS,. açucar-álcool, do. me lo,. resulta,. enquanto. que. fi. podem. de. geralmente,. na. ut II I zação. de. como fonte de energia, provoca um aumento. da. alcallnldade (HOWIESON, 1985>. Os. requerimentos. rlz6blos. nutricionais. variam, para. seu. grandemente, crescimento,. nos mesmo.

(24) 13. entre. diferentes. mesma. & PARKER, 1964;. 1961; GRAHAM GRAHAM. estirpes da. et ai I I (1982). espécie. (BERGERSEN,. & FOCHT, 1984).. HERNANOES. Introduziram um método. mas. simples. rigoroso, onde a toteraneta dOS rlzóblos à acidez é baseada na. formação. para. acidificado. utl I Izando. I~oladas. de colônias. este. pH. 4,5.. em. melo. contendo. & MUNNS. GUNNINGHAN. método, observaram que apenas. agar. (1984),. 5,. de. 55. Isolados de Rhlzoblum legumlnosarum bv. Phaseol', cresceram -. nesse melo, e que algumas destas estirpes, foram capazes de crescer. numa. faixa tampões. sUbstâncias. de. pH. têm. em. torno. de. 4,0.. sidO· utilizadas. Multas. durante. o. crescimento dos rlz6blos para manter o pH constante, porém, I Imitações. são. observadas (BROMFIELD & JGNES,. Estudos. sobre. o. regulamento. 1980). do- pH. em. citoplasma de Rh/zoblum, mais precisamente sobre pH externo elevado. e. sua relação com a fixação. recebido,. recentemente,. NICHOLAS, 1885:. grande. de. nitrogênio,. têm. (BHANDARI. atenção. GOBER & KASHKET, 1986), porém tem-~e. pouca Importância para este mecanismo na sobrevivência. dado dos. rlz6blos em ambientes ácidos.. Trabalhos. ~. com. células. vegetativas. Rhlzoblum melllatl mostraram um pH citoplasmático ao. de. redor. de 6,5 a diversos valores de pH externos em uma faixa de pH. oscilando. de. apresentaram. 5,0 a 9,0, enquanto que os nenhuma. evidência de. bacter61des. controle. não. homeostátlco.

(25) 14. (TREMBLAY & MILLER, 1984),. um. dos. fatores. bacteróldes. Esse comportamento talvez. responsável pela. após. serem. Isolados. baixa. viabilidade. n6dulos. dos. seja. dos. &. (SUTrON. PATTERSON, 1983: YANZHEN & JUNCHU, 1984).. CUNNINGHAM. correlação. positiva. "&. MUNNS (1984) encontraram uma. entre a producão. de. pOllssacarrdeos. extracelulares. (EPS) e a. de. O efeito do EPS do Rhlzoblum no. feljoelro.. tolerâncIa à acidez no. Rhlzob/um aumento. à. tOlerância. não foI provocado pelo tamponamento do. pH,. diminuição. do efeIto t6xlco do alumrnlO, mas pelo. aumento. da. dlsponlbl I Idade de fosfato (CUNNINGHAN & MUNNS,. sendo uma Importante preocupaçlo para os solos dcld08. ou. 1985), J. onda. a deflC)lncla de fósforo também é um problema. movimento. O. componentes. qurmlcos. (qulmlotaxia). trabalhos. (BOWRA & OILWORTH,. RIZ6blos. Isolados. dependente efe!~o. do. PH. do Rhlzoblum. de. ervilha. de. em. vários. GOTZ et alll,. 1982).. é. 1981;. direção. na. citado. mostral'am. do melo (EL-HAlOUI et ai I I. I. motl! Idade 1986) com. um. qulmlotáxlco na faixa de pH 7,0 a 7,5. A diminuição. da motllldade em Pt-I bal xo pode ser Importante, desde que. a. qUlmlotaxla possa Influenciar a competição do Rh/2oblum por. .". 6ftlos de Infecção nodular nas ra(zes de leguminosas.. ".

(26) 15. 2.3. Tolerância. do. RhlzobJum. a. orvels. tóxicos. de. alumrnlO. A toxldez do alumrnlo tem com de. sido. associada. a redução da produtividade das culturas. A combinação concentrações. elevados. bal~as. de f6sforo, baixo. PH. alumrnlo caracterIzam 60ndlcões. de. e. teores estresse. de. para as plantas.. A tolerância dos microorganismos aos metais pesados. determinada. é. constituintes. pela. toxldez. ao. celulares (KARlIK et ai I I. DNA. 1980). De. I. a tolcrlnela dos. com. MISRA et ai. aos. metais pesados é determinada por DNA n§o. I I. (1983). outros. e. acordo. microorganismos cromossômico. (PlasmrdIO). Ainda. é. o. desconhecido. mecanismo. de. tolerância ao alumínio. Para Rhlzobium , a tolerância ao baixo. pH. e ao alumrnlo são caracterfstlcas estáveis (MUNNS. KEYSER,. provavelmente,. 1981 ) ,. reguladas. & ONA. pelo. cromossômico.. o alum(nlo causa múltiplos efeitos sobre as células procarl6tlcas e eucarldtlcas, podendO Interagir com -' o. DNA. (SIROVER. Inibindo. LOEB,. 1976;. KARL11<. a atividade de-enzimas,. gllceroqulnase diminuindo. &. a. em. leveduras. permeabilidade. alll,. 1980),. como a hexoqulnase. (VIOLA da. et. et. alll,. membrana. e. a. 1980). e. IIP(dlca. do.

(27) 16. Thermoplasma acldophllum (VIERSTRA & HAUG, 1978).. Em absorvido. Anabaena com. Interage. deficiência. PETTERSSON et ai I I. I. do. em cultura pura,. e 100 uM, (KEYSER. (PETTERSSON. têm. alumrnlo. Induz. ai I I,. um~. 19858;. demonstrado. sido. crescimento. no. nas concentrações entre por. & MUNNS, 1979; GRAMAM et. diferentes. I I, 1982;. ai. WOOD & GOOPER, 1984;. DAVEY, 1983a;. et. e. alum(nlo. 1985b; PETTERSSON et ai I I, 1986).. Efeitos rlz6blos. o. a membrana celular. fósforo. de. cy/fndrlca,. dos. 4,0 UM autores. THORNTON. &. VARGAS & GRAHAM, 1988;. AYANA6A et ai I I, 1983).. MUNNS. & KEYSER (1981). observaram. que. a. frequêncla de divisão celular-foi reduzida pelo alumrnlo, e conclulram. que. 05. rlzÓblos, em. fase. multiplicação,. de. mostram evidências de alta sanelol I Idade para o alumfnlo. e. (ons hidrogênio. A associação de rona alumfnlo e hidrogênio. afetam. a sobrevivência dos rlz6bloB em solos. ácidoS,. que. possuem altas concentrações de alumrnlo trocável (GRAHAM et ai. I I, 1982;. lOWENDORF & ALEXANDER, 1983; THORNTON & DAVEV,. 1983a).. HOLOING. Infectlvldade. legumlnosarum. da. tu.. ~&. KING. popUlação. phasêoll no. (1963). nativa 6010. foi,. citam de. que. a. Rhlzoblum. negativamente,. correlaclonada com o decréscimo de bases nesses solos.. VAN. SCHREVEN (1972) encontrou um decréscimo na Infectlvldade de.

(28) 17 de. fi h I z o b ! um. e 5 t I r p e5. a ! 9 uma s. If oI! J. t r. li m. a Pli 5. I on9 o. per(odo de sUb-cultura em melo ácido.. 2.4. Resistência do Rhlzoblum a antIbiÓticos. Estirpes de. Inoculação. fixação. leguminosas, além de. slmbl6tlca. competitivas. de Rhlzoblum recomendadas pAra. e. serem. eficientes. do nitrogênio atmoaférlco,. capazes de. persistir no. a. devem. solo,. na ser. mesmo. na. ausência da Planta hospedeira. utilização. A. selecionadas. para. contribuir rlz6blos. para. no. resistência o. sucesso. estirpes. de. a. do. de. Rhlzoólum. antibióticos. poderia. estabelecimento. soio. Embora existam trabalhos. que. desses. citam. ausanela de efeito antagonista de microorganismos do. sobre. BOHLOOL,. solo,.. 8.. 1985), é comum encontrar uma flora mlcroblana. no. principalmente. 8.. JOHNSON,. 1966;. de actlnomlcetos,. que. ao. excretar. substâncias antibióticas, podem afetar os rlzÓblo5. et. soja. solo,. KOSSLAK. R/112Gb/um. (OAMIRGI. a. SeOTTI. ai I I (1982) mencionara que o fracasso da InoCUlação. de . ~. e. sty/osanthes. Japonlcum. e. relacionado antlbl6tlcos.. com. estirpes. Bradyrhlzoblum sp., com Esses. a. de. fJ r a d y r 111. respectIvamente,. tolaraneta autores Citam,. destas também. z o b I um estava. estirpes. que. a. estirpes.

(29) 18. capazes de se estabelecer e prOduzir n6dulos chegaram a ser. a. tolerantes. nrvels de 160 ppm para. alguns. antlblót!cos. testados. A. ação. dos antlbl6tlCos. sobre. pode estar relaCionada com a. bacterlana estrutura. da. a. célula. Interferência. parede celular, ou na membrana. na. celular,. ou. ainda com a Inibição cio processo metab611co Interno. Estudos espéCies. duração,. em. de Rh/zob/um, sob condições de campo, depende. da. estabi I Idade estirpe tem. dos. de longa. ecol6gl~o6. marcadores usados. distinguir. para. da outra. A técnica de resistência a. sido empregada com bons resultados.. ocorrer,. condições. em. caracterfstlcas. de. campo,. antlbl6tlcos. Entretanto,. aiguma. !munológlcas. uma. pode. perda. das. resistência. 8. Identificação. de. estreptomicina. In. vltro, não têm esse mesmo comportamento no campo. O uso. de. antlbl6tlcos.. Em. 95 % dos. estirpes selecionadas para. de. casos. de. re~lstêncla. ~. outros marcadores permitiria resolver questões relativas outras. a. caracterrstlcas de Identificação (BROCKWEtL et alll ,. 1977) • A. reSistência. de. estirpes. 48. .~. Brad,rhlzoblum Japonlcum a vários antibiótiCos, utilizadOS,. foi. estudtH.la. por. COLE. &. de. largamente. ElI<AN. empregando discos de papel Impregnados com antibióticos.. A. reSistência. e. (las estirpes. fi. cloranfenlcol, pollmlxlna. B.

(30) 19. chegou a 60 %, enquanto que 47 , das estirpes,. erltr~miclna. ou mais, foram resistentes a neomlclna e. et alll (19B2), visando. SCO"iTl. bl6tlcos. fatores nodulação. de. avaliaram. a. de. estar. sp.. kanamlclna. e. de. toleraram. de. cerrado,. aos. Stylosanthes,. cloranfenlcol.. nrvels. de. na. Bradjlrhízoblum. de. que a maioria das estirpes. Japonlcum. estabelecer. Interferindo solos. estirpes. ~radyrhlzoblum. antibl6tlcos observaram. pOderiam. e Stylosanthes em. tolerância. e. Japonlcum. que. soja. penicilina G.. Esses. da. 20, 40. autores. fjf{;J(jyrh I zotJl um. e. 300. ug/ml. de. kanamlclns, tetraclcllna e cloranfenlcol, t'Gspectivamente. HAGEDORN. trlfolll,. Rhlzoblum. InfectlvldeCle. (1979). estudou. divididos. em. a 15 antibióticos. A. ocorreu. 12 %. Infectlvldade. Isolados. categorias. 5. examinando-os. slmbl6tlcéI,. resistência. em. 50. reauç~o. de de. 'quanto. da. infectlvldade. dos Isolados resistentes e o. em apenas 3 sUb-culturas (2,5 '),. aumento. da. ocorrendo. aleatoriamente, entre as 5 categorias de Infectlvldade,. A resistência alterações. em. um,. ou. Q. mais. qualquer antibiótico genes. resultar em mUdanças de .. poderiam. genéticas. que. a. algumas. poderiam, ou não, Incluir. (HAGEOORN, 1979).. estas. Induz. alterações. c a r a c t e I' t s t I. c a s a .Infectlvldade. A perda da Infectlvldade seria mais. função. particular. de. mutação. do. que. propriamente. classe. de roslstêncla associada a qualquer antibiótico. uma uma a,.

(31) ê!O. de existirem muitos antlbl6tlcos que. apesar. poderiam. ser. usados para selecionar estirpes de riz6blos tolerantes,. que. aqueles. pOdem prejudicar. caracterrstlcas. há. essênclals. como a eficiência 5lmblótlca.. & MONTGOMERY. Observações "feitas por lEVIN. mostraram que nao houve a perda da Infectlvldade. (1874). nem da eficiência slmblótica em mutantes de. joponlcum a. aradyrhlzoblun1. resistentes a vlomlclna. Os autores sugerem. relaÇao. entre. Infectlvldade simb!ót!ca. e. estar. que. resposta. antlbl6tlco "não é geral entre rlz6blos, e que Inibidas. as. com a simbiose entre. a. funções. por v!omlcina e outros antibl6tJcoe poderiam. relacionadas. 8. Rhlzoblum. nãu e. a. leguminosa, ou com a eficiência 51mb/ótica. et a! II (1986) testaram. TURCO. de. Rhlzoblum legumlnosarum e 3 Isolados de. Japonlcum,. duplamente. eficiência. na. Desses. 38 %. aos. antlbi6tlCOS. rlz6blo3. Entretanto,. reduziram. Isolados. e. a. para. 1. para. foram. Isolados,. na formação de nódulos.. Isolados. Bradyrhlzoblum. fixação de nitrogênio molecular. competltlvld~de.. competltJvo5. resistentes a. 30. a. menos. somente. eficiência. de. fixação do nitrogênio atmosférico. , JOSEY estirpes observaram. permaneceu. et. ai I I. (1979),. trabalhando. legumlnosarum,. de Hh/zoblum pnaseoll e Rhlzoblum que. o. estável. padrão de tanto. resistência em. com. a. SUb-cultivos. antlbl6tlcos. como. em.

(32) 21. relsolamentos de. n6du~os.. a. A resistência à estreptomicina, tem sido. mais. para. usada. resistentes. experimentos genéticos. porque. mutantes. são facilmente Isolados e permanecem. estáveis. em cultivo ou em passagem pcir plantas (SCHWINGHAMER, 1977), COLE. resistência. & ElKAN. (1979). observaram. aos antibióticos penlel I Ina. e. estreptomiCina. são caracterrstlcas variáveis, ao contrário da à. neomlclns, cloranfenlcol e pOllmlxlna laoiando. japonlcum,. diferentes. variantes na. resIstência. El.. Bradyrhizoolum. de. morfologia,. & PUEPPKE. MEYER. (1980), varlflcaram que as variantes que formavam grandes. eram as maIs sensrvels aos anttbldtlcos. enquanto. que as que formavam colonlas pequenas. tolerantes. correlação. & AHMAD. MACLAUGHLIN entre. a. que. (1984). calunias testados eram. mais. uma. observaram. a morfologia da coloola de. I. estirpes. de. Rhlzoblum do caupl e altos nrvels de resistência Intrroseca. a. antibióticos.. morfologia contrário. As. estirpes. resistentes. mostraram. uma. colonial gomosa e crescimento lento enquanto n~o. foi verdadeiro. SINClAIR & EAGlESHAM ~. resistência a 5 antibióticos, kanamlclna,. o. (198~),. ~streptomlclna,. estudando. a. gentamlclna,. penicilina G e r;-famplclna , verificaram, em 128. culturas. de. culturas. resistentes a no mrnlmo três. Rhlzoblum. Isolados de caupl,. que. entre. antibiótiCos,. as 87 %.

(33) 22. formaram. colÔnias. achatadas,. e. antibióticos,. tranSlúcidas,. 89 % das ou. culturas. menos,. pastosas.. Entretanto,. existentes. para. aquosas,. formaram a. confluentes. resistentes. a. colônias. opacas. diversidade. de. resistência a antibióticos. e. dois e. Informações em. Rhizoblum. parece não admitir generalizações (HAGERDON, 1979)..

(34) 23. 3. MATERIAL E. M~TODOS. Para estudo,. atingir. 05. objetivos propostos. o trabalho de pesquisa foi subdividido em. neste etapas,. abrangendO atividades a n(vel de campo, casa de vegetação e laboratÓrIo.. a. exce8são da etapa referente à coleta. de. amostras de solo, desenvolvlda,em lavouras de felJoelro. no. .~. estado. de São Paulo, todas as "demais foram. Centro. de. EnergIa. Nuclear. na. Agricultura. Universidade de São Paulo (USP), em. realizadas. no. (CENA),. da. Piracicaba,. s~o. Paulo.. 3.1. Goleta das amostras de solo. As amostras de solo, destinadas ao trabalho de Isolamento de rlZóblos, foram coletadas em. 31. lavouras. de feljoelro do estado de São Paulo. As amostras, compostas de 10 6ubamo6tras por lavoura, foram coletad86 na camada de. o. a 10 em de profundldade. l. Junto à rlzosfera do. aproximadamente um mês após a semeadura.. fel Joeiro "~.

(35) 24. Uma fração de cada amostra foi submetida análises qu(mlcas e o restante utll !zada para o cultivo. à. do. feljoelrO com a finalidade de Isolar n6dulos de t'I'l6blo5. Os locais de amostragem estão. apresentados. na Tabela 1.. 3.2. Análises qurmlcas das arnostl'8S de solo. Os solos. fOl'am. em água, na proporção de 2:1, seguindo. submetidos as análises de pH de hidrogênio e de alumrnlo,. as técnIcas descritas por RAIJ et ai I I. VETTOR I (1969). Os resu I tados dessas aná I I ses. (1987). e. encontram-se. expostas na TaDela 1.. 3.3. Isolamento de rlz6blos a partir de nÓdulos. obtidos. em Phaseolus vu/garls. Em deslnfestados com 10 %,. durante. 30. copos. uma. previamente,. Plásticos,. solução de hlpoclorlto de sÓdio. minutos,. cOlocou-se,. a. aproximadamente,. 500 9 de cada uma das 31 amDstras de 8010, com a final Idade ~. de. CUltivar-se Phaseolus vulgarls (feIJoelro). e. Obter-se. nódulos para o Isolamento de colônias de RhizobJum. Em. cada vaso foram semeadas 4 sementes. feijão, da variedade Carioca,. 86. de. quais foram deslnfestadss,.

(36) superficialmente, com dlco~1 98 0 GL, durante 5 minutos, e a. em. seguir Imersas. uma. solução de blcloreto. acldlflcada com ácido clor(drlco. 0,02 %,. por. vezes. 6. (VINGENT, 1970),. ApÓs a deslnfestação, as sementes foram. durante 3 minutos. lavadas. mercdrlo. de. sutesslvas. com. destilada,. água. delonlzada e esterilizada. Quatro dias ap6s a emergência das plântulas· de I xando-se apenas 2 p I ântu I as. por. Os vasos foram Irrigados com água comum. de. rea I I zou-se um desbaste,. vaso.. torneira por um per(odo de 35 dias. Aos. dias após a semeadura. 35. coletados das plantas e acondl.clonado5. foram. nÓdulos. os. pequenas. em .-."'~,. embalagens de Vidro, as qUais foram fechadas, etlquetadas e. em. conservadas. freezer. a -10 0 C até. o. ! 50! amento. dos. rlz6blos. Glnco. acaso, foram. nódulos. deslnfestados,. de cada. vaso,. tomados. superficialmente,. ao. com élcool. 98° GL', durante 5 minutos, e a seguir imersos na solução de mer~drlo. blcloreto de. lavados. por. detonlzada colocados de ap6s. seis. e. vezes ., sucessivas. esterl I Izada.. á9~a. com. A seguir,. os. destIlada,. nÓdulos. foram. em placas de petrl esterl I Izades, masserados. cada vez, com o cada. (VINCENT, 1970), durante 3 minutos, e. 8U)(. masseração,. r I lo de um bastão de foi. lavado. com. \J. um. I cl ro ,oque I,. álcool.

(37) 26. flambadO e, ligeiramente, resfriado. Cada n6dulo foi. transferido. para. uma placa. de. masserado. esterilizada,. petrl. contendo o melo de cultura extrato levedura e manltol - YM <VINGENT,. Indicadora. adicionado. 1970),. vermelho congo. na. de. 10. mlll. solução. da. concentração de 2,5. 9/1. de. água. AP6s 5 dias de Incubação as colônias, caracterrstlcas de. foram. Rhlzoblum,. transferidas para. tubos. ensaio. de. contendo o melo YM Inclinado.. 3.4. Teste de infectlvldade. e. efiCiência na fixação do. _atmosférico de Isolados de Rhlzoblum em. nitrogênio. Phaseolus vulgarls. Isolados phaseo/l,. obtidos. por. de. melo. Rhlzoblum legumlno56rum de. !'ep I. cagem. armazenado. no melo YM Incl loado,. placas. de. petrl. com uma solução salina. cloreto de. s6dlo. a. 0,4 %.. foram. A seguir. do. bV.. matel'ial. desprendidas esterilizada. das de. transferiu-se 1 ml. dessa suspensão para um fr~sco erlenmeyer contendo 25 ml do meio YM l(qUldo,. Incubando-se à temperatura amblerite e sob. durante 4 dfas, até a obtenção de uma aproximada de 10 9 rlz6blos/ml de melo. Os. agitação constante, concentração. ~. Inoculantes, assim produzidos, foram usados em pl2ntulas de feljoelro, Isolados,. para. bem. avaliar. como,. a. a. capacidade. lnfectlva. eficiência destes na. fixação. dos do.

(38) 27. atmosférico.. nltro9ên~o. o teste de Infectlvldade foi em. casa. de. vegetação utl I Izando-se o. modificado. Leonard encapad05. proporçgjo. na. esterilização. 1970).. dest I. água. de. 05. de. vasos. vasos. foram. I ada e de I on I 4. a. horas. zada 0. e. respectivamente.. 2: 1 ,. dos vasos foi real izada. conjunto durante 1 ,5. sistema. com papel pardo e preenchidos com vermlcullta. SrtlC8,. mesmos. (VINGENT,. desenvolvido. adicionando-se autoc I avando-se. J. A. de. cada vaso foram semeadas 4 sementes. de. G. uma. este. pressão. 126. sob. aos. a tm. Em. feijão. da. variedade Carioca, as quais foram. deslnfestadas. superficialmente com álcool 98 0 GL, d~rante 5 minutos, e seguir Imersas 0,02 %,. em. uma. sOlução. de. blcloreto de'mercdrlo. acldlflcada com ácido clorrdrlco. durante 3 minutos.. a. (VINCENT, 1970),. Após a deslnfestação, as sementes foram. lavadas 6 vezes sucessivas com água destllade delonlzada. e. ester II I zada. Quatro dias após a emergência das plântulas. realizou-se. um. desbaste,. deixando-se. apenas. 2. pl8ntuJas por. vaso.. A seguir procedeu-se a Inoculação das mesmas com ." I nocu I ante e i aborado. A I noeu I ação fo I rea 1I zada com 1. de. Inoculanta. por plântula. Dois vasos. foram. o rol. conduzidos. como testemunhas, não recebendo inOCUlação. Os. vasos. foram. Irrigados. com. SOlUção.

(39) 28. nutritiva. descrita. de. alternando-se. com. perrodo de 35. Após. uma. ava I I ação. cOloração. da. destll ada,. água. esterilizada, por um. dias. Apêndice. e. dias. foi. do . desenvo 1\/1 mento. das. de. 1I. delonlzada. cultivo. os 35. v I sua I. no. parte aérea, ndmero de n6dulos,. realizada antas,. p!. tamanho. de. n6dulos e coloração da parte Interna dos nódulos. O experimento foj conduzldo.sem repetições,. obtendo-se. 151. estirpes. de Rhlzoblum. dos. 155. os. 151 Isolados. que. se. Isolados. testados. TodoS. Infectlvos foram me I o. con5erva~os. YM i nc I I nado. I. em. mostraram. em tubos de ensaIo contendo. tubos de ensa I o contendo o. me I o. vertical com Óleo mineral e em ampolas liofilizados, estocados no banco de germoPlasma de Rhlzoblum. ~o. o Yí'l. senelo. Centro de. Energia Nuclear na Agricultura (CENA).. o eficiência. na. experimento,. fixação. do. nitrogênio. avaliação atmo6férlco. 1. da. foi. conduzido em casa de vegetação, utl I Izando-se o sistema. de. vasos Leonard modificado (VINCENT, 1970), como descrito. no. experimento anterior. Em. feijão. cada vaso foram semeadas 4 sementes. da variedade Carioca, as quais foram. deslnfestadas. superficialmente com álcool 98 0 Gl, durante 5 minutos, e seguir. de. a. Imersas na solução de blcloreto de mercdrlo 0,02 %,.

(40) 29. acldlflcada com ácido clorrdrlco. (VINCE~T,. 1970), durante 5. minutos. Após a deslnfestação, as sementes foram lavadas com. sucessivas. vezes. destilada. água. delonlzada. 6 e. esterilizada. Quatro di as "após a eme rgênc I a das p I ântu I as realizou-se um desbaste, deixando-se apenas 2 plântulas por vaso. A seguir procedeu-se Inoculante. elaborado,. SI. Inoculação das plântulas com o. utl I Izendo-se 1 ml . do. mesmo. por. plântula.. vasos. Os. nutritiva. Mc. de. foram. descrita. t(nlght,. com. alternanào-se. o experimento com. a. de. Rh/zoblum. estirpe. ~O. foi. com. no. Apêndice. conduzido. 899). como. com. de' R/112ob/um. é recomendada. felJoelro no Brasil (RELARE. Para. nltrogenase, reduzir. a qual. 1. e. as. testemunha,. para. 151. anterior,. repetições, aplicando-se. a técnica ele seleção massal. estl,'pe. 1I. dias.. obtidas no experimento. eM 02 (CIAT. solução. delonlzada. destilada,. esterl I Izada, por um perrodO de. estirpes. Irrigados. e ·sem. Essa. Inoculação. de. 1988).. allallar. a. atividade. .. capacidade. de. o acetileno; foram utl I Izadas rarzes noduladas. do. é. determinada pela sua. enzima. da. fe I J oe I ro,. co I ocando-se- as. capacidade. para 500 mi hermeticamente fechados com. apropriadas.. mesmas. em. frascou. A seguir, extraiu-se 50 ml de ar do. com tampas. Interior.

(41) 30. de. cada. frasco dos. Interior. cada. mesmos,. por. Incubar. a, Imediatamente, de. acetileno,. de ar. seringas. com. o. deixando-se. 30 minutos. Após esse per(odo retirou-se. 0,5 ml. frasco. 50 ml. para. Injetou--56,. tipo. de. "Alergo",. Injetando-se esta ai (quota no cromatógrafo de gás. (Beckman. GG-65) •. Ap6s. as rarzes foram retiradas. a leitura,. dos frascos, lavadas e extrardos os nódulos para contagem e. pesagem dos mesmos. foram. As rarzes,. bem como,. secas, até peso constante,. a parte. aérea,. em estufa, a 40 0 C,. com. circulação de ar e avaliada a massa de matéria seca.. 3.5. Tolerância de Isolados de Rhlzoblum a pH 4,5 e a pH 4,5 + 100 uM de alum(nlo. Para avaliar a tolerância Cios riz6blos a pH. 4,5 e. a pH 4,5 + 100 uM de al'umrnlo foi empregado o método. descrito. por GRAHAM et ali!. a 9 a r .d e Ke V5 e r - Mu n n 5. o. (1982), utilizando-se. ajustado para pH 4,5,. tltlllZêHldo-:-se. autoclavagem,. clorrdrl,co,. ácido. ou hldr6xldo de s6dlO, esterl I Izado6 por filtragem de. fi I t r o. tolerânCia. n. MI I I I Po r e. a. melo. mo d I f I c a d o Po r GRAHM1 e t a I I I (1 982 ).. melo de cultura, após ser esterl I Izado por. foi. o. VI. pH 4,5,. (. O, 45 m' c r a 6 ) e. I. Pa r a. adicionado. de. o. através teste. 100 uM. de de.

(42) 31 filtragem através de flltl'o nMIIIIPore- n <O,"l5 mleras),. o. àe toleraneia a pH Q,5 + 100 uM de. test~. meios. de. cultura. esterilizadas,. vertidos. em. alum(nio.. placas. crescimento. de. de. petrl. a. 28. 0. G,. durante. Incubaç~o. dias.. 4. como tolerantes aquelas estirpes. considerados. Os. /'eplcando-s6, a seguir, as 151 estirpes. e colocando-se estes conjuntos em. Rhlzoblum. câmara. foram. para. formar colônias Isoladas nesses-meios sob. de. na. Foram. capazes. de. condições.. ~s5a5. 3.6. Resfstêncla de Isolados de Rhlzoblum a antibiÓticos. DeterminOU-56. estirpes. Rhlzoblum. de. a. sensibilidade. antibióticos diferentes,. a 7. eles estreptomicina (INlAB), rlfamplclna cloranfenlcol. sendo. espectlnomlclna. (UPJOHN),. kazugamlClna. nas concentrações. (SIGMA), 640 ug/ml. (FRUMTOST S.A.),. 151. (LEPTIT-MERREll),. (flURA AG), neomlclna (SIGMA) e. tetraclcllna. das. tendo. I. como. e. testemunha. o. n(vel. zero. de. antlbl6tlco. As. rea II. necessidades,. neomlClna,. dOS. antibióticos. com d! ferente5 substânc I as,. ZéH1as. dlluldos. diluições. em. ou. seja:. tetraclcllna. em função de. cloranfenlcol. etano I a 90 %;. e. de. suas. kazugamlclna. e. espectlnomlclna, sulfato. foram. sulfato. de. estreptomicina. di luldos em água; e rlfamplclna di luldO em metanol a 95 ,..

(43) 32. As ester III zadas. soluções estoque de antlbl6tlcos. por'. f II tro. f I i tragem através de. foram. "MIIII pore". (0,45 mlcras),. Discos medindo, 0 / 5 em de e. delonlzadél,. esterellzados. em. estufa. A seguir,. umedecidos com água destilada. dlametro~. foram. em. colocados. autoclave, por discos. os. o 1), n-. (Whatman. f I I tro. papel. de. de. 40. placas minutos,. petrl,. de. e. em. secos. papel foram Impregnados. com. as diferentes concentrações dos diversos antibióticos. Para. a. Impregnação. perrodo. os discos de papel foram. de 72 horas,. por. um. 50 ml. de. Imersos,. em um erlenmever contendo. cada uma das soluções dos antibióticos. Após esse os. discos. co I acacias de. em p I. fluxo. papel, Impregnados. de. acas-. de petl". laminar. 8,. ester I. de. perrodo,. foram. antibiótico,. I I zadas,. posteriormente,. secos. c~mara. na. conservados. sob. refrigeração.. o. melo. utilizado. para. o. teste. doe. antlbl6tlcos foi o YM que após autoclavaao, foi mantido. em. banh~-marla a 52 0 C para que permanecesse no estado I (quldo. até. o. momento. Identificadas. de. ser. vertido. placas. e estarl I Izadas , contendo' ml ~. melo de cultura,. com uma Nas. em. placas de petrl,. ap6s. de. deste. petr I. mesmo. concentração de 10 9 rlz6blos/mi. a sol Idlflcaçãodo meio. bactérias, distrIbuiu-se, de forma ordenada sobre o. com. as. mesmo,. os sete discos de papel Impregnados, correspondentes aos. 7. I.

(44) n(vels. de. cada. crescimento. a. 28. antibiótIco, Incubando-se. em. 0. incubação. No quinto. G.. dia. de. câmara. de foi. avaliada a formação de halos In,Iblt6rlos de d8Genvolvlmento. de bactérias sobre o melo.. 3 .7.. A vai I ação. da. h a b j I I da d e de. legumlnosarum. de. ra(zes. de. Infectar. em. R11U ob I. I 5 I) I a dos. um. Leucaena. leucocephala. Colônias. pl1aseoll,. obtidas. armazenado. no. placas. petr I. de. cloreto. Rh/zoblum. de. melo. por. com uma. replcagem. de. me i o YM I nc I i nado. bv.. material. do. foram decprend I ae!s. I. 80 I ução. legum/nosarum. ~3a. I I na. das. estor II I Hlda. de. ~q~..... de. a D/~ %.. sÓdio. A' seguir. tranSferlu~se. 1. rui. dessa suspensão para um frasco erlenrueyer contendo 25 ml do. melo YM I (quldo,. Incubando-se à temperatura ambiente e sob. agitação constante,. pllntulas. assim. de. possibilitar. até a obtenção de uma. aproximada de 10 9 rlzóblos/ml. concentração InoeUlantes,. durante 4 dias,. (Leucaena. leucocephaJa).. Identificação de estirpes de. não. de. Infectar. leguminosas. de. e. Os. assim. Rhlzoblul11. tipo II e I, ou seja, rlz6blos de feljoelro com ou. melo,. produzlaos, foram usados para Inocular. leucena €i. de. do. habilidade. outl'OS. gêneros,. respectivamente.. o teste. de Infectlvldade de. Isolados. de.

(45) 34 Rhlzoblum. felJoelro. de. desenvolvidO. em. plantas. de. fel/cena. em casa de vegetação utl I Izando-se o. ele vasos leonard modificado (VINGENT,. foi. sistema. utilizando-se. 1970),. a mesma técnica descrita no Item 3.4. Em. Leucaena, em. cada vaso foram semeadas 4 sementes. as quais foram escarlflcadas por meio de Imersão. ácido eulfdrlco concentrado, lavadas. seguir. de. 6. durante 10 minutos,. vezes sucessivas. com. dgua. e. a. destilada,. delonizada e esterl I izada. Quatro dias após a emergência das plDntulas foi vaso.. feito. o desbaste,. A seguir. Inoculante. deixando-se apenas 2. elaborado.. com 'lO ml de Inoculante por. realizada. plantula~. procedeu-se a Inoculação das. preViamente,. Os. vasos. foram. A. plantas. por com o foi. Inoculação. 11850.. irrigados. com. sOlução. nutritiva de Hoagland,. descrita no Apêndice 2, alternando-. se com água desti lada;. de!onlzada e estar!! Izada,. por. um. perrodo de 60 dias.. o estl rpes. foi. conduzido. de Rhizoblum e 2 testsmunhas sem. tratamentos cultivado felJoelro. experimento. testemunhas com plantqs de. s. foram Leucaena. compostos. com. 140. Inoculação.. por. e outro com. um. Os. vaso. plantas. de. para determinar poss(veis contamlnantes. A. co I he I ta. to I rea I I zada 60 d I as. após. germinação, avaliando-se a presença, ou não, de n6dulos.. a.

(46) 35. 4. RESULTADOS E DISCUSSno. 4.1. Caracterrstlcas da acidez dos solos.utl I Izados para Isolamento de estirpes de Rhlzoblum. As. características. deac!dez. das. 31. amostras de solo, coletadbe em 11 munlcrp!Os do Interior do estado. de. Slo Paulo,. concentrações. expressas pelo pH em água. alumrnlo. de hidrogênio e. e. pelas. trocáveis,. estio. discriminadas na Tabela 1.. Das valores. de. pH. 31. amostras. Inferiores a. de. 6,0. solO, e. 27. teores. apresentaram de. alumfnlo. trocável superiores a 0,03 meJ100 9 de solol caracterizando esses solos como de carácter ácido. Os solos com valores de pH. superiores a 6,0 e. concentraç~es. Inferiores a 0,03 me/100 9 de solo,. de. aium(nlo. certamente,. tracável. são. que sofreram correção da acidez por melo de cal agem,. 50106. visto. que a região de amostragem é tipicamente, de solos ácidos. Multo embora, o feljoe!ronessa região, não receba InOCUlação com rlzdblos, todas as amostras de solO,.

(47) 36 Tabela 1. Local de amostragem dos 5010s, para o isolamento de rizóbios nativos de feijoeiro, e as análises qulmicas das respectivas amostras de solo ----------------------------------------------------~----------------------------------------------. Análise Gurmica. -------------------_.... _----_ .... _-_.,.--------Local. liunidpio. Isolado. A13+ + H+ -------- me/100g solo --------. FH água. A13+. H+. de Rb.lzonlJ.llII. ----------------------~-----------------------------------------------------------~~------------~---. Tatur-sp. 5,22. 0, 54. 0.40. 0,94. 5,00 4,76. 0,33. 0,09 0,20. 0r 42. eM 206-2i0. 0,72. eM 211-215. 5,40 4,66 5,25 6,07. 0,32 0,40 0,12. 0,20 0,19 0,13 0,08. 0,52 0,59 0,25 0,09. eM eM eM eM. 6.06 6,28 5,42 5,36 5,34. 0,02 0,01 0,08 0,29 0,02. 0,10. 2 :3 4 5. 0,12 0,11 0,18. eM 236-240 eM 241-245. 0,37. el1 251-255 eM 256-260. 1 2 3 4 5. 5,61 5,40 5,09 5,72 5,41. 0,09 0,19 0,52 0,03 0,09. (. oi.. Itapd i ni nga-SP. 1. 2 Cap~o. Bon ito-SP. i. 2 3. 4 Ihpeva-SP. i. Itaberá-SP. narar~-SP. (M0. 0,10 0,08. Cli 246-250. 0,11. 0,13. 0,16 0,0!l. 0,25. CK 261-265. ~.26. eM 266-270. C!i 271-275 C!l 276-280 eM 281-2a5. 0,07. O,59. 0.10. 13,13. 0,14. 0.23. 1. 6,13. 0,03. O,10. 0,i3. O,O8. 0,13 0,21. 0,03 0,39 0,41. 0,15. 0,18. eM 286-290 eM 291-295 eM 296-30'ô. 0,22 0,16. 0,66. OI. 5. 5,46 5,85 5,34 5,29. 0,64. CM 306-3i0. 1 2. 5,05 4,90. 0,48 0,53. 0,14. 0,62 0.77. CI1 316-320. i. 5,90 4,84. 3. 5,14. 0.09 0,48 0,42. 0,15. 2 1. 2. 5,45 4,97. 0,23 0,18. 1. S., 39. 1. 4,52. -4. Ihporanga-SP. 0,íH. 216-220 221-225 226-230 23i-235. 2 3. Riversul-SP. 0,52. eM 201-205. 0,24. 3~1-305. eM 311-315. 0.23 0,67 0,59. Cti 321-325. 0,23. 0,44 0,41. CM 336-340 eM 341-345. 0,55. 0,17. 0,71. eM 346. 0,52. 0,18. O,70. 0,19. 0,17. C/i 326-,330 eM 331·,335. .-'. Taqu<lrituba-SP Itar-Sp ParanapanEllla-SP --~-----------------. ..... eM =CENAíMicrobiolngia. O,21. _------_._-------------------------_ ...._------..,.---_.._----_ _.. ...... CM 347-351 _---------~-_. .... -.

(48) 37. Independentemente abundante. n(vel. do. nodulação. acidez,. de. nas plantas de. proporcionaram. fe/joelro. ut/llzadas. como hospedeiro para o Isolamento de 8ft/zob/um. Os Isolados de. Rh/2ob/um. SOIO~,. legumlnosarum. bv. phaseoll. obtidos. desses. estão apresentados ná Tabela 1.. 4.2. Caracterrstlcas. morfológicas. das. colônias. de. Rft/zob/um legumlnosarum bv. phaseoll Isoladas. As. caracterrstlcas. morfol6glcas. das. colônias de Rft/zoblum leguminosarum bv. phBseol', das 31 amostras de Incubação manltol,. em. 9010. melo. Isoladas. estudadas, descritas após 5 dias de. de. adicionado. 151. cultura. com. extrato. levadura. e. da solução Indicadora vermelho congo,. encontram-se discriminadas no Tabela 2. pel'ceptfvel apresentaram. grandes. variações. que. morfológicas. predominando colônias de forma circular, superfrcle. vermelho. I isa-brllhante,. congo,. textura. estl rpes. as. entre. 51. 1. elevação convexa,. ª. cor rósea, devido opaca,. não. consistência. aç~o. do. gomosa. e. presença de odor. Todos caracterrstlcas (convexa), Quanto. a. 05. Isolados apresentaram. quanto· a. superfrcle. forma. as. (circular),. mesmas elevação. (llsa-bri Ihante) e odor (presente).. cor, textura e consistência. houve. apenas. duas.

(49) 38. Tabela 2. Caracterfsticas gerais das co18nias de Rhlzohlum lp'gurolDosa(u~ bv. Buaseoll ap6s 5 dias de crescimento em mein de cultura com extrato levedura e manitol, adicionado da solu~~Q indicadora vermelho congo ------------------------------------------------------------------_._-------------------------~-----. Isolado. Forma. ElevaGão. Superffcie. Cor. Textura. Consist@ncia. Odor. ---~---------------------~-------------------------------------------------------------------------. CI1 CtI CM CM CM. 201. 202. 203 204 205. eM 206. CM 207 CM 20B CM 209 CM2i0 CM 211 CM 212 CM 213 CM 214 CM 215 eM 216 CM 217 CM 218 eM 219. CM CM CM CM CM CM CM CM eM Cli CM CM CM. 220. 221 222. 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232. Ctl 233. eM 234 CM 235 eM 236. eM 237 eM 238 CM 239 C~l 240 CM 241 CM 242. Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular CircIJIar Circular Cil'cular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular. Convexa. Convex~_. Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa ConvI:'xa Convexa Convexa Convl?xa Convexa ConlJexa Convexa Convexa Convexa Convp.xa Conv~xa. Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa. Lisa-br ilhante Li sa-hr ilhante Li sa-br i lhante li sa-br ilhante li !ia-br i1 han t e l j sa-br ilhante Lisa-br ilhante lisa-brilhante Li sa-hr i1hante lisa-br ilhante Li sa-br ilhant!? Li sa-br ilhanh Lisa-br ilhante lisa-oI" ilhanh: Lisa-brilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante lisa-brilhante Lisa-brilhante li sa-bF ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Li sa-br ilhanh Lisa-hr ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Li sa-br ilhanh Li sa-br ilhante Lisa-br i lhante Lisa-br i lhante Lisa-br ilhante lisa-br ilhante Li sa-br ilhante Li sa-Dr ilhanh Li sa~br i1 hanh li sa-br i lhanh Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Li sa-hr i lhant e Lisa-br ilhante li sa-br i lhante Lisa-br ilhante. Rósea R6sea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea R65~a. Rósea R6sea R6sea Rósea Rósea R6sea Rósea ROSE-a Rosea RÓsea Rósea Rósea RÓsea Rósea RÓsea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rosea Rósea Rósea Rósea. Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca ·Opacil. Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opüca Opaca Opaca Opaca Oprica Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Transldcida Tnmsldcida Transldcida Translúcida Translúcida Transldcida Transldcida Transldcida Transll~dda. Translúcida Translúcida Translúcida Translúcida Translúcida Translúcida Tnmsldcida Translúcida. Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Gomosa Gomosil Gomosa GOlllosa GOHiosa 6olllosa 6omosa GOlilosa GOlilosa GOlllosa GOlilosa GOlllosa GOlllosa GOllmsa GOfilosa,•.. lJi5cosa'~. Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa GOiilosa Gomosa GOillosa GOlllilsa. Gomosa GOlllosa GOlllosa GOillosa GOLtosa Gomosa GOlllosa Gomosa GOlilosa Gomosa GOlllosa 60810sa GOlilosa. Presente Presente Presente Presente Presenh Presente Presente Presente Presente Presente Presente PreSEnte Presente Presente Pres€!ltl? Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente PreSl::ilte Presente Presente PrEsente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente.

(50) 39. Tabela 2. Caracterfstic2S gerais das co16nias de RhlzDhiu~ lenuminosatum bv. ~basRoll após 5 dias de crescimento em meio de cultura com extrato levedura e aanitol, adicionado da soluGão indicadora vermelho congo (continua~ão) ________ m __________________________________________________________________________________________. Isolado. Forma. Eleva~ão. Superffcie. Cor. Textura. R6sea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rosea R6sea Rósea Rósea Rosea. Translúcida Trallsldcida Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca. Consist~ncia. Odor. ---------------------..-----"""----------------------------------._---_ ... _--------_ .... _.... _------------- ...CM 243 Circular Convexa Li sa-br i1 hant e Rósea Translúcida Gomosa Presente. CM CM CIi CIi eM CM. 244 245 246 247 249. 249. eM 250 CM 251. CM 252 Cli 253. CM CM CM eM eM CM CM CM CIi CM CM. 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263. CM eM CM CrI Cli Cli Cli CM Cri CM eM. 266 267. 264 eM 265. 2M3. 269 270 271 272 273 274 275 276. eM 277. CM 278 eM 279. eM 280 eli 281. CM 282 CM 283 eM 234. Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circl.!lilr Circular Cir'clllar Circuiar Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular. COilvexa Convexa Convexa Conve>:a COnV€Kil Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa . Convexa Convexa Convexa Convexa ConvE'}:a. Convexa Convex<i Convexa Convexa CooVl:ma Convexa Convexa Conve:<{\ Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa COllvexa Convexa. Lisa-hr ilhante Li sa-br i1hant Lisa-br ilhante Lisa-brilhante lisa-br ilhante Lisa-brilhante lisa-br ilhan!e Lisa-br ilhan!;e Lisa-br ilhante l isa-br iihante Lisa-br ilhante Li sa-br ilhante Lisa'-br ilhante Li sa-br ilhante Lisa-brilhanh Lisa-br ilhante Lisa-hr ilhante Lisa-br ilhante li sa-br ilhante Lisa-br i lhante Li sa-br ilhante Li sa-hr ilhante Li sa-br ilhante Li sa-br ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante li sa-br i1 hant€ Li sa-hr i lhanh Lisa-br ilhante lisa-br ilhanh lisa-b!" i lhante Lisa-br ilhante Li sa-br ilhante Lisa-br ilhante Lisa-hr i lhánte Lisa-hr ilhante Li sa-br ilhante Lisa-hrilhante Lisa-hr ilhante li sa-br i 1hanh Li sa-bl' i Ihant e. e. R6sea R6s~a. Rósea Rósl:'tI Rósea R6sea Rós~a. R6sea Rósea R6sea Rósea R6seil R6sea Rósea R6sea Rósea Rósea Rósea R6sea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea RÓsea. ÓPica. Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca úpaca Opaca Opaca Translúcida Translúcida Transldcida Translúcida Transl!1c ida Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca. GOillOSil. Gomosil Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa. Viscosa GOI!iDfiil. GOiliDsa GOi10sa GOillosa GOfllosa GQIDOSil. Gomosa 6omosa GOIllQsa GUli10sa Gomosa Gomosa GOIliOSil GOIilOSà. GOlllosa GOii1'JSa Gomosa GOlllosa GOlllo5a Gomosa GOlllosa GOlllosa Gomosa GOMosa. Presente Presente Presente Presente Presente Presente Pri?sente Presente Presénte Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Present.e Presente PresE'nte Presente Presente Presrm~e. Presente Pres€nh Presente Presente Presente Presente Presente Pres~llte. Presente Presente Presente.

(51) 40.. Tabela 2. Caracterfsticas gerais das co16nias de Rhizobium 1~gumlnD5atum bv. ~baseoli após 5 dias de cresciMento em meio de cultura com extrato levedura.e manitol, adicionado da solu(;~o i nd i cadora vermelho congo (conti ouaç;ào) ---------------------- .... _------------------------------_-.----_ ... _------------_..,----_ ... _-----_ ....-.... _---. Isolado. Forma. ElevaG~o. Superfkie. Cor. Textura. ... Coosist~ncia. Odor. ----------------------------------------------------------~-------------_ _-~----------------------. CM 285 C~I 286 CM 287 eM 288 CM 289 eM 290 eM 291 CM 292 CM 293 CM 294 CM 295 CM 296 CM 297 CI1 298 CM 299 eM 300 eM 301 CM 302 Ct-l 303. CM 304 eM 305 eM 306. eM 307 eM 3013 eM 309 CM 310. CH 311 eM 312. eM eM CM eM eM CM CM eM eM. eM. eM CM Cli CM. 313 314 315 316 317 318. 319 320 321 322 323 324 325 326. Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Cift\llar Circular CircI!hr Circular Circl.!lar. Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circ~tlilr. Circular Circular Circular Circular Circular Circular Circular. Convexa Conve>:a Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Conv€>:a Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convel<a ConlJ€>:a Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convexa Convp.>:a. Lisa-hr ilhante Lisa-brilhante Lisa-br i lhante Li sa-br ilhant e Li sa-br i1hant e Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br i lhante Lisa-br i lhante Lisa-br ilhant€ Li sa-br ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Li sa-br i lhante Li sa-br ilhante Li sa-br i lhante Li sa-br i1 hant ~ Lisa-brilhante Li sil-br i1hant e Li sa-br i1 hant e Lisa-br ilhante Lisa-hr ilhante lisa-hr ilhante Li sa-b\' ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante Lisa-br ilhante lisa-br ilhante Li sa-br i lhante Lisa-brilhante li sa-br i1hante lisa-brilhante Li sa-br ilhante lisa-br ilhante Lisa-brilhante Lisa-br i lhante Li sa-br ilhante Li sa-br ilhante li sa-br i1hante Lisa-brilhante li sa-br i1hante. R6sea R6sea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rósea Rosea R6séa Rósea Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa. Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa Roxa ROl<a. Roxa Roxa Roxa Roxa. Roxa Rósea Rósea Rósea Rósea RÓsea Rósea. Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Translúcida Translúcida Translúcida Tnmsl.kida Translúcida Transldcida Translúcida Transhkida. Transldcida Translúcida Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opaca Opilca Opaca. GOUlosa. GOillosa Gomosa Gomosa GOillosa Gomosa Gomosa GOnIosa Gomos/! Gomosa Gomosa Gomosa GOlilosa Gomosa GOlllosa GOlnosa Gommm GOlilosa GOlllosa GOlllosa. GORlOSil GOlllosa GOIDosa Gomosa GOl!iosa GOillosa Gomosa. Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Pr-esente Presenh Presenh Presente Presente Presente PFl~sente. Presl:!nte Presente Presente Presente Presente Presente Presente Presente Preseotl? Presente Presente Presenh Presente. GO!i10Si!. Pres~nh. GomOSil Gomosa. Presente Presente Presente Presente Presenh Presente Presente. GQ~osa. GOlilosa Gomosa GO!i10Sil. GOfllosa. 6of;losa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa Viscosa. Pres~nte. Presente Presente Presente Presente Presente Presente.