Influência do polimorfismo R577X do gene ACTN3 no processo de aclimatação à alta altitude

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INFLUÊNCIA DO POLIMORFISMO R577X DO GENE ACTN3 NO

PROCESSO DE ACLIMATAÇÃO À ALTA ALTITUDE

Dissertação apresentada à Universidade Federal da São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia

SÃO PAULO 2019

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RICARDO MULLER BOTTURA

INFLUÊNCIA DO POLIMORFISMO R577X DO GENE ACTN3 NO

PROCESSO DE ACLIMATAÇÃO À ALTA ALTITUDE

Dissertação apresentada à Universidade Federal da São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia

Orientadora: Profa. Dra. Debora Cristina Hipólide

SÃO PAULO 2019

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Bottura, Ricardo Muller

A influência do polimorfismo R577X do gene ACTN3 no processo de aclimatação a alta altitude / Ricardo Muller Bottura. – São Paulo, 2019. xiv, 49f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia. Título em inglês: The influence of R577X polymorphism of ACTN3 gene during high altitude acclimatization

1. ACTN3. 2. Genética e Altitude. 3. Mal Agudo da Montanha. 4. Aclimatação. 5. Psicobiologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

Chefe do Departamento: Dr. José Carlos Fernandes Galduróz

Coordenador do curso de pós-graduação: Dra. Débora Cristina Hipólide

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A INFLUÊNCIA DO POLIMORFISMO R577X DO GENE ACTN3 NO PROCESSO DE ACLIMATAÇÃO A ALTA ALTITUDE

Presidente da banca:

Profa. Dra. Débora Cristina Hipólide

Banca examinadora:

Profa. Dra. Vânia de Almeida Prof. Dr. Marco Tulio de Mello

Prof. Dr. Paulo Correa Prof. Dr. Valdir de Aquino Lemos

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Dedicatória

Dedico este trabalho às minhas duas filhas que nasceram no decorrer de todo esse processo e foram, com certeza, minha maior fonte de energia.

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Diversas pessoas desempenharam papéis importantes durante a formulação desse trabalho e gostaria de elencar alguns nomes aqui para que cada um saiba da minha gratidão. Agradeço academicamente aos funcionários do Departamento de Psicobiologia (faxina, secretarias, portaria, biblioteca, etc.), ao Ernani e ao Santana que me deram o suporte no Clube Escola para as análises, à minha orientadora Débora Hipólide porque sem ela meu trabalho teria parado no meio do caminho, à professora Sabine Pompeia por ter disponibilizado muito do seu tempo, ao professor Ronaldo Vagner, que apesar de não termos finalizado este projeto juntos, foi quem abriu as portas do Mestrado para mim ao acreditar no meu projeto, ao professor João Bosco que também acreditou nas minhas loucuras, comprou a ideia e me incentivou através do seu grupo de estudos Atletas do Futuro do qual hoje faço parte e também à AFIP, Capes e FAPESP pelo financiamento. Pessoalmente, agradeço à minha esposa, pois não é fácil ser casada com um pós-graduando e passar por duas gestações nesse período, e aos meus pais que me deram base para lutar por aquilo que acredito e que me ensinaram que devemos fazer o que é certo, mesmo que o caminho seja mais difícil.

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vii Sumário Dedicatória ... v Agradecimentos ... vi Lista de figuras ... x Lista de tabelas ... xi

Lista de abreviaturas e símbolos ... xii

Resumo ... xiii Abstract ... xiv 1. INTRODUÇÃO ... 2 1.1 Fisiologia da Altitude ... 2 1.2 Altitude e Humor ... 3 1.3 Altitude e Cognição ... 3

1.4 Altitude e Mal Agudo da Montanha ... 4

1.5 Altitude e Genética ... 5 2. OBJETIVOS ... 8 3. MÉTODOS ... 10 3.1 Aspectos Éticos... 10 3.2 Critérios de Inclusão ... 10 3.3 Critérios de Exclusão ... 10

3.4 Seleção dos Voluntários ... 10

3.5 Desenho Experimental ... 11

3.6 Câmara Normobárica de Altitude ... 12

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3.10 Variáveis Fisiológicas ... 13

3.10.1 Saturação Periférica de Oxigênio (SpO2)... 14

3.10.2 Frequência Cardíaca (FC) ... 14

3.10.3 Pressão Arterial (PA) ... 14

3.11 Parâmetros Plasmáticos ... 14 3.12 Avaliação Genética ... 15 3.12.1 Extração do DNA ... 15 3.12.2 Quantificação do DNA ... 15 3.12.3 Genotipagem por qPCR ... 15 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 18 5. RESULTADOS ... 20 5.1 Variáveis Fisiológicas ... 20

5.2 Mal Agudo da Montanha ... 21

5.3 ACTN3 R577X e Mal Agudo da Montanha ... 22

5.4 Saturação de Oxigênio ... 25

5.5 Tempo de Reação e Lapsos ... 25

5.6 Estado de Humor (BRUMS) ... 26

6. DISCUSSÃO ... 33

7. CONCLUSÕES ... 38

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ix Anexos

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Figura 1. Fluxograma da formação dos grupos ... 11 Figura 2. Desenho Experimental ... 12 Figura 3. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento Antes. ... 28 Figura 4. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento 1 Hora... 28 Figura 5. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento 2 Horas ... 29 Figura 6. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento 3 Horas ... 29 Figura 7. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento 4 Horas ... 30

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Lista de Tabelas

Tabela 1. Características Descritivas dos Voluntários Divididos por Genótipo ... 20 Tabela 2. Resultado da análise do GLM das Variáveis Fisiológicas ao longo das 4 Horas de Exposição à Altitude Simulada de 4.500m ... 21 Tabela 3. Resultado da análise do GLM para as Variáveis Fisiológicas Associadas aos Genótipos da ACTN3 ao longo das 4 horas de exposição à 4500m de altitude simulada ... 23 Tabela 4. Resultado da análise do GEE para Lake Louise, SpO2, ACTN3 e Glicose de 3 e 4 horas ... 24 Tabela 5. Resultado da análise do GEE para Lake Louise, SpO2, genótipos da ACTN3 e Glicose de 3 e 4 horas ... 24 Tabela 6. Resultado da análise do GLM do Tempo de Reação entre Genótipos ao longo do tempo ... 25 Tabela 7. Resultado da análise do GLM dos Lapsos entre Genótipos ao longo do tempo ... 26 Tabela 8. Resultado da análise do GEE para Lapsos e Variáveis Fisiológicas ... 26 Tabela 9. Resultado da análise do GEE para BRUMS e Mal Agudo da Montanha 27 Tabela 10. Resultados do GLM para Estado de Humor (BRUMS) entre grupos ao longo das 4 horas de exposição à 4500m de altitude simulada ... 31

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xii ACTN3 alfa actinina 3

ACTN3 gene da alfa actinina 3 FC Frequência Cardíaca MAM Mal Agudo da Montanha

iPAQ Questionário Internacional de Atividade Física SaO2 Saturação Arterial de Oxigênio

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xiii Resumo

Introdução: A hipoxemia faz com que o organismo necessite ajustar os diversos processos metabólicos na tentativa de estabelecer uma melhor oxigenação aos tecidos. Durante este processo, chamado de aclimatação, é normal apresentar alterações de humor e cognição ou desenvolver alguns sintomas que podem levar às doenças da montanha. Porém, nem todo mundo apresenta tais sintomas ou alterações e indivíduos nativos de regiões de alta altitude apresentam diferenças genéticas em relação aos nativos de baixa altitude que podem contribuir para uma melhor adaptação de forma aguda. Uma destas diferenças é a maior proporção de fibras musculares do tipo I, que pode ter origem no polimorfismo R577X do gene ACTN3. Objetivo: O objetivo deste estudo foi comparar a resposta de indivíduos com diferentes genótipos da ACTN3 em altitude simulada a 4500m sobre a cognição, o estado de humor e a presença de sintomas do Mal Agudo da Montanha. Métodos: 23 voluntários (RR=7; RX=8; XX=8) passaram quatro horas expostos a uma altitude simulada de 4.500m dentro de uma câmara de hipóxia normobárica, onde foram analisadas as concentrações de lactato e glicose, a SpO2, FC, o tempo de reação, o estado de humor e os sintomas do Mal Agudo da Montanha. Todas as análises foram feitas imediatamente antes de entrar na câmara e a cada hora de exposição A análise estatística foi feita por meio do software IBM SPSS Statistics 21. Resultados: Nossos resultados apontam para uma associação entre os sintomas do MAM e a presença do alelo R do polimorfismo R577X. Isso pode estar relacionado com uma maior dependência do metabolismo de glicose, já que os grupos RR e RX demonstraram uma menor glicemia em relação ao grupo XX após 4 horas de exposição à 4500m de altitude. Não houve diferença entre grupos para Humor e Tempo de Reação. Conclusões: Concluímos que indivíduos com ao menos um alelo R do polimorfismo R577X são mais suscetíveis aos efeitos da hipóxia durante o processo de aclimatação, podendo apresentar os sintomas do MAM.

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Introduction: Hypoxemia is the decrease in arterial blood saturation. This condition leads the organism to adjust the various metabolic processes in an attempt to establish better oxygenation to the tissues. During this process, called acclimatization, it is normal to present mood and cognition disturbances or to develop some symptoms that can lead to mountain sickness. However, not everyone has such symptoms or alterations and individuals from high altitude regions present genetic differences in relation to low altitude natives that can contribute to a better adaptation of the acute form. One of these differences is the greater proportion of type I muscle fibers, which may originate from the R577X polymorphism of the ACTN3 gene. Objective: The objective of this study was to compare the response of individuals with different ACTN3 genotypes at simulated altitude at 4500m on cognition, mood and the presence of symptoms of Acute Mountain Sickness (AMS). Methods: Twenty-three volunteers (RR = 7, RX = 8, XX = 8) spent four hours exposed to a simulated altitude of 4,500 m inside a normobaric hypoxia chamber, where the concentrations of lactate and glucose, SpO2, FC, reaction time, the mood state, and the symptoms of AMS. All analyzes were done immediately before entering the chamber and at each hour of exposure. Statistical analysis was performed using the IBM SPSS Statistics 21 software. Results: Our results point to an association between the symptoms of AMS and the presence of the R allele of the R577X polymorphism. This may be related to a greater dependence on glucose metabolism, since the RR and RX groups showed lower glycemia than the XX group after 4 hours of exposure at 4500m altitude. There was no difference between groups for Mood and Reaction Time. Conclusion: We conclude that individuals with at least one R allele of the R577X polymorphism are more susceptible to the effects of hypoxia during the acclimation process and may present the symptoms of AMS.

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1 INTRODUÇÃO

Quanto mais ascendemos para distante do nível do mar, menor é a pressão de oxigênio presente no ar. Este fenômeno é conhecido como hipóxia hipobárica e acarreta em diminuição da pressão parcial de oxigênio no sangue arterial que é chamada hipoxemia (Kenney et al., 2013). Um ambiente de hipóxia hipobárica, como encontrada em altas altitudes, afeta diversos sistemas corporais mesmo que a exposição a este ambiente seja aguda (até sete dias) (Hodkinson, 2011; Ni et al., 2015). O simples fato de ascender e se expor a determinada altitude faz com que nosso organismo prontamente inicie uma série de adaptações para compensar a diminuição da oferta de oxigênio (Rahn e Otis, 1949; Bärtsch e Swenson, 2013; Kenney et al., 2013), como aumento da frequência cardíaca (Lipsitz et al., 1995), da ventilação pulmonar (Bärtsch e Gibbs, 2007), da utilização de glicose como substrato energético (Brooks et al., 1991; Brooks et al., 1992) e aumento de lactato (Ge et al., 2015).

1.1. Fisiologia da Altitude

O ar atmosférico é composto por aproximadamente 21% de oxigênio diluído em outros gases e esta composição não se altera independentemente da altitude (Kenney et al., 2013). Porém, com a diminuição da pressão barométrica, há uma diminuição da capacidade de difusão deste oxigênio do ambiente para a circulação sistêmica e, consequentemente, para os tecidos (West et al., 1983). Para se ter uma ideia, em uma altitude de 4500m é como se tivéssemos uma composição real de aproximadamente 60% do oxigênio do nível do mar, ou seja, apenas 12% (West, 2004). Essa menor difusão de oxigênio causa uma desaturação arterial (hipoxemia) que é percebida pelos quimiorreceptores periféricos (Weil, 2011) causando um aumento de ventilação e uma maior ativação simpática (Heistad e Abboud, 1980) elevando a frequência cardíaca e o débito cardíaco (Bärtsch e Gibbs, 2007). Os quimiorreceptores periféricos estão localizados no corpo carotídeo e aórtico, sendo que o carotídeo está diretamente conectado com os centros respiratórios, enquanto

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3

que o aórtico se conecta com os centros cardiovasculares, ambos no tronco cerebral (Pittman, 2011).

1.2 Altitude e Humor

Alguns dos efeitos evidenciados com a exposição aguda a hipóxia são euforia, irritabilidade e hostilidade (Bahrke e Shukitt-Hale, 1993) e começam a ser notados aos 3000m de altitude, sendo que quanto maior o tempo de exposição ou maior a altitude, mais severos serão os sintomas (Shukitt-Hale et al., 1988). Em estudo de Shukitt-Hale et al. (1990) ficou evidenciado uma diminuição do vigor e consequente aumento de fadiga em indivíduos que escalavam a uma altitude de 3080m, mesmo que a escalada tenha sido gradativa (< 300 metros/dia), devido ao fato de que o exercício implícito em escalar aumentou a demanda de oxigênio já diminuída pela hipóxia, influenciando a resposta afetiva dos indivíduos. Porém, mesmo sem esforço físico, a altitude pode influenciar o estado de humor como mostra estudo de Lemos et al. (2012) que encontraram diminuição de vigor e aumento de fadiga, raiva e depressão em indivíduos que passaram 24h em um quarto com altitude simulada de 4500m.

1.3 Altitude e Cognição

Além do humor, a função cognitiva também sofre influência da altitude, principalmente devido à hipoxemia, que pode levar a um edema cerebral (HACE) (Lopez et al, 2013) causando tontura, vertigem e retardo do tempo de reação (Carod-Artal, 2014), afetando assim a capacidade cognitiva de indivíduos nestas condições. Esta influência negativa da altitude sobre a função cognitiva ocorre em resposta à diminuição da SaO2 (Masschelein et al, 2014; Ando et al, 2013), porém, apesar de baixas altitudes (1300m e 2600m) não serem capazes de causar efeitos deletérios sobre a função cognitiva (Ando et al, 2013), a exposição a 5500m de altitude simulada por 90 minutos causa prejuízo em diversas dimensões associadas à cognição como aumento do tempo de reação (Dykiert et al., 2010), diminuição de

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memória, atenção e função executiva, que compreende a capacidade de organizar pensamentos, priorizar tarefas e tomar decisões (Turner et al., 2015).

Sabe-se que altitudes a partir de 1500m causam uma privação temporária de sono, diminuindo a sua eficiência (Bloch et al., 2015), e que isso pode levar à diminuição de algumas funções cognitivas que estão associadas às doenças da montanha (Issa et al., 2016). A alteração do padrão do sono em altitude é atribuída a uma instabilidade do sistema de controle respiratório em resposta à diminuição da concentração de dióxido de carbono no sangue arterial que leva a episódios de respiração periódica na maioria das pessoas (Bloch et al., 2015; Ainslie et al., 2013).

Um estudo realizado em câmara normobárica a 4500m de altitude encontrou uma correlação positiva entre a diminuição da qualidade do sono e a resposta cognitiva (Lemos et al., 2012), porém o impacto da altitude sobre a função cognitiva não é dependente do sono, pois mesmo no primeiro dia de exposição à altitude de 5050m há prejuízo de tempo de reação e atenção (Pun et al., 2018). Contudo, é preciso lembrar que existe uma diferença de resultados quando comparados estudos em ambiente de hipóxia normobárica (altitude simulada) e ambiente de hipóxia hipobárica (altitude real) (Coppel et al., 2015; Girard, 2012), pois além da diminuição da SaO2, em ambiente real temos baixa umidade relativa do ar e temperaturas bastante negativas (-30°C) que também influenciam no sono e nos parâmetros ventilatórios (Mees e de La Chaux, 2009).

1.4 Altitude e Mal Agudo da Montanha

Muitas pessoas trabalham em condições de altas altitudes, como por exemplo, mineradores no Chile e no Peru que chegam a 4500m, sendo que algumas destas minas empregam até 1000 pessoas (West, 1998), enquanto que muitas outras pessoas procuram altas altitudes como forma de esporte ou diversão (Shah et al., 2011). O grande número de pessoas que frequenta altas altitudes é preocupante, uma vez que 50% das pessoas que ascendem entre 4500m e 5000m acabam sofrendo com sintomas do Mal Agudo da Montanha (MAM) (Vardy et al., 2006) que

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5

envolvem dor de cabeça, fadiga, tontura, anorexia e náusea, sendo que dor de cabeça é o sintoma mais frequente (Carod-Artal, 2014).

A principal causa do MAM é a diminuição da saturação arterial de oxigênio (Burtscher et al., 2011; Karinen et al., 2010; Hsu et al., 2015). Um estudo feito com 74 indivíduos de oito expedições em diferentes locais (entre 1300m e 5300m de altitude) encontrou que os indivíduos que apresentaram sintomas do MAM tinham menor saturação arterial de oxigênio (Karinen et al., 2010). O principal meio utilizado para diagnosticar o MAM é um questionário de auto-avaliação denominado Lake

Louise Score (Roach et al., 1993). Para o diagnóstico é necessário que o indivíduo

esteja acima de 2500m e tenha a presença de pelo menos dois sintomas, sendo um deles dor de cabeça (Carod-Artal, 2014). Os fatores que predispõe indivíduos aos sintomas do MAM são foco de diversos estudos, inclusive na tentativa de encontrar alguma relação genética, mas sem nenhum resultado conclusivo (MacInnins et al., 2016). É fato que a presença do MAM causa um efeito deletério sobre a função cognitiva (Dykiert et al., 2010) e pode ter relação com o traço de ansiedade ao nível do mar (Boos et al., 2018).

1.5 Altitude e Genética

A verdade é que ainda existem muitas perguntas a serem respondidas sobre os efeitos das diferentes altitudes no processo de aclimatação, porém a literatura ajuda a entender os efeitos crônicos da hipoxemia, especialmente quando analisamos as populações que vivem em regiões de alta altitude. Segundo Hoppeler e Vogt (2001), a exposição à hipóxia provoca diminuição de cerca de 30% da densidade mitocondrial sem diminuição da densidade capilar, o que levaria a um aumento da oferta de oxigênio por mitocôndria, favorecendo o trabalho celular. Os Sherpas, Tibetanos (Gilbert-Kawai et al., 2014) e os Quechuas (Rosser e Hochachka, 1993) possuem maior proporção de fibras musculares do tipo I, que tem maior densidade mitocondrial do que as do tipo II, do que indivíduos nascidos em regiões mais baixas. Esta relação entre a distribuição dos tipos de fibra muscular

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com as populações nascidas em altas altitudes pressupõe uma predisposição genética.

Além da diferença de densidade mitocondrial entre os tipos de fibra muscular, existe uma diferença estrutural no sarcômero destas fibras. O filamento de actina se liga à linha Z por uma proteína que é encontrada em duas formas no músculo esquelético: α-actinina (ACTN2 e ACTN3), sendo que a ACTN2 está presente em todos os tipos de fibra, enquanto que a ACTN3 está presente apenas nas fibras do tipo II, principalmente nas do tipo IIx (North et al., 1999; North e Beggs, 1996).

Porém, o gene que expressa a ACTN3 sofre uma mutação que acarreta na troca de uma arginina por um stop códon na posição 577 da proteína fazendo com que alguns indivíduos não expressem ACTN3, sendo esta uma deficiência hereditária (North et al. 1999). Indivíduos que expressam ACTN3 possuem ao menos um alelo R, sendo que indivíduos homozigotos (RR) possuem maior número de fibras do tipo IIx do que indivíduos com o genótipo XX, que tem mais fibras do tipo I (Vincent et al., 2007), o que poderia favorecer uma aclimatação à altas altitudes, já que montanhistas profissionais possuem uma relativa predominância do alelo X para o gene ACTN3, sugerindo uma melhor adaptação destes indivíduos devido a uma produção de energia mais eficiente (Djarova et al., 2013).

No entanto, pouco há na literatura sobre os efeitos da exposição aguda à hipóxia em relação às diferenças genéticas e, portanto, é necessário que se investigue mais detalhadamente como diferentes genótipos podem influenciar no processo de aclimatação. A hipótese deste trabalho é que indivíduos com genótipo XX sofram menos os efeitos da altitude em relação a presença do Mal Agudo da Montanha e, por conseqüência, sobre a função cognitiva e o estado de humor.

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2 OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho foi verificar se existe influência do polimorfismo R577X do gene ACTN3 sobre o humor, a cognição e os sintomas do Mal Agudo da Montanha durante o processo de aclimatação em indivíduos saudáveis expostos quatro horas a alta altitude simulada (4500m).

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3 MÉTODOS

3.1 Aspectos Éticos

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo sob o número 2.001.055 (Anexo 1) e respeitou as normas estabelecidas pela Legislação Brasileira na Resolução n. 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde. Para participar do estudo, os voluntários receberam todas as informações necessárias, inclusive a respeito das avaliações, assinando posteriormente um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 2).

3.2 Critérios de Inclusão

- Ambos os gêneros;

- Ser fisicamente ativo, segundo classificação do iPAQ (MATSUDO et al, 2001);

- Idade entre 17 e 45 anos;

- Grau de escolaridade: 10 anos de estudo (ensino médio completo);

3.3 Critérios de Exclusão

- Ser fumante, fazer uso de drogas lícitas ou ilícitas e/ou ingerir bebidas alcoólicas com freqüência (mais de três vezes na semana);

- Fazer uso de medicações psicotrópicas;

- Exposição à hipóxia/altitude acima de 2000m nos últimos 6 meses; - Apresentar distúrbios cognitivos ou neurológicos.

3.4 Seleção dos Voluntários

Todos os voluntários receberam informações sobre os procedimentos e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Depois foi

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realizada a coleta das células epiteliais da mucosa bucal para avaliação genética do polimorfismo R577X do gene ACTN3 e os voluntários responderam ao Questionário Internacional de Atividade Física (IPAQ). No total foram avaliados 61 indivíduos (39 homens e 22 mulheres), sendo vinte e um RR (36%), trinta e dois RX (54%) e oito XX (14%). Os voluntários dos genótipos RR e RX foram sorteados até completarmos oito indivíduos em cada grupo.

Figura 1. Fluxograma da formação dos grupos

3.5 Desenho Experimental

Após a genotipagem e separação dos grupos, os indivíduos voltaram ao laboratório para o procedimento experimental dentro da câmara normobárica a 4500 metros de altitude. Nesta situação os voluntários foram avaliados em cinco momentos distintos, sendo eles: (1) imediatamente antes de entrar na câmara, (2) uma hora de exposição à hipóxia, (3) duas horas de exposição à hipóxia, (4) três horas de exposição à hipóxia e (5) quatro horas de exposição à hipóxia. Em cada momento foi aplicado um questionário de avaliação do estado de humor (BRUMS) e um para avaliar o Mal Agudo da Montanha (LAKE LOUISE SCORE), além de coleta

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de sangue para mensuração das concentrações plasmáticas de lactato e glicose e de uma avaliação do tempo de reação através do PVT-192. Também foram aferidos os parâmetros fisiológicos freqüência cardíaca, pressão arterial e saturação arterial de oxigênio a cada momento. Todos os voluntários foram avaliados no período da manhã e foi solicitado que chegassem em jejum.

Figura 2. Desenho Experimental

3.6 Câmara Normobárica de Altitude

O simulador de altitudes (normobaric chamber, CAT - Colorado Altitude Training™/12 CAT-Air Unit), simula até 4500m. Este equipamento apresenta duas unidades de ar instaladas do lado de fora da câmara, que realiza a troca gasosa, aumentando nitrogênio e reduzindo O2. Esta troca gasosa gera diferença na concentração de O2 dentro da câmara que é visível em um display que exibe a altitude simulada em tempo real, mensurada por um módulo que contém uma célula de O2 sensível às suas variações.

3.7 Tempo de Reação

A avaliação do tempo de reação foi realizada através do aparelho PVT-192 (psychomotor vigilance test) para verificar influência da diminuição da pressão arterial de oxigênio sobre esta função cognitiva. Durante o teste, os voluntários foram instruídos a prestar atenção em uma luz vermelha, que acenderia em tempo aleatório em um visor retangular no alto do aparelho, e apertar o botão no menor tempo possível assim que a luz ficasse visível. Foi utilizado o protocolo de três

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minutos (Basner et al., 2011) para que desse tempo de fazer todas as análises com os indivíduos de hora em hora, uma vez que tivemos até cinco voluntários por dia de experimento.

3.8 Avaliação do Estado de Humor

A avaliação do estado de humor foi feita através da Escala de Humor de Brunel (BRUMS). Desenvolvida para medir rapidamente o estado de humor (Terry et al., 2003), adaptado do “Profile of Mood States (POMS) e traduzida para o português, consiste em uma lista com 24 adjetivos relacionados ao estado de humor, onde o avaliado deve anotar como se sente em relação a cada adjetivo, conforme as instruções considerando uma escala tipo Likert de 0 a 4. Seis fatores de humor ou estados afetivos são medidos por esse instrumento: tensão, depressão, raiva, vigor, fadiga e confusão. É esperado nesse teste que os valores encontrados para a dimensão vigor sejam maiores que os valores apresentados nas outras dimensões, o que denotaria um perfil de humor em forma de “Iceberg” (Terry et al., 2003).

3.9 Avaliação dos Sintomas do Mal Agudo da Montanha

Para diagnosticar o MAM utilizamos um questionário de auto-avaliação denominado Lake Louise Score (Roach et al., 1993; Roach et al., 2018) que consiste em pontuar de zero a três (0 = ausência; 1 = leve; 2 = moderado; 3 = severo) a presença de quatro sintomas (dor de cabeça, náusea ou falta de apetite, fadiga ou fraqueza, tontura) que podem levar à sua identificação. Para o diagnóstico é necessário que o indivíduo esteja acima de 2.500m e tenha a presença de pelo menos dois sintomas (totalizando ao menos 3 pontos), sendo um deles dor de cabeça (com pelo menos 1 ponto) (Carod-Artal, 2014; Roach et al., 2018).

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3.10.1 Saturação Periférica de Oxigênio (SpO2):

A SpO2 foi monitorada através de um oxímetro de dedo Fingerpulse®, modelo MD300C202, através de uma dupla fonte luminosa (um LED vermelho e um LED vermelho de infravermelhos) e um fotodetector que detecta variações de absorção de luz no sangue arterial, uma vez que outros tecidos como ossos e vasos venosos absorvem normalmente uma quantidade constante de luz ao longo do tempo. O comprimento de onda do LED é de 660 nm e do LED Infravermelhos é de 905/880 nm com uma potência de saída óptica máxima de 4mW.

3.10.2 Freqüência Cardíaca (FC):

A FC foi mensurada através do mesmo oxímetro de dedo uma vez que a utilização deste tipo de aparelho em repouso se faz adequada (Iyriboz et al., 1991).

3.10.3 Pressão Arterial (PA):

Foi aferida por meio de esfigmomanômetro eletrônico digital de punho modelo INCOTERM MP100.

3.11 Parâmetros Plasmáticos

A coleta de glicose e lactato foi realizada através de uma gota de sangue proveniente da ponta dos dedos das mãos. Em cada coleta a ponta do dedo dos voluntários foi higienizada com swab de álcool BIOSOMA e, posteriormente, perfurada com uma auto lanceta BIOLAND Modelo SB-323. A quantificação destas variáveis foi realizada através de fotometria de reflectância através do Monitor Accutrend Plus da ROCHE, um analisador portátil para determinação quantitativa de glicose, lactato, colesterol e triglicerídeos (Baldari et al., 2009).

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Para verificar o polimorfismo R577X do gene ACTN3, células epiteliais da mucosa bucal foram coletadas utilizando-se o esfregaço de um swab na parte interna da bochecha, por aproximadamente trinta segundos. Logo após, as amostras foram armazenadas em uma caixa térmica resfriada, para conservar o material em baixa temperatura (4ºC) até ser transportado para o local de análise. Este método de coleta foi escolhido por ser um procedimento rápido, pouco invasivo, indolor, de baixo custo, e ainda fornecer uma amostra de DNA genômico de qualidade.

3.12.1 Extração de DNA

O DNA genômico das células epiteliais da mucosa bucal foram extraídos utilizando a resina Chelex 100. Essa resina se liga a componentes celulares após a lise das células do epitélio bucal, deixando o DNA livre na fase aquosa. Ela é um quelante de íons bivalentes que preserva o DNA evitando a degradação deste por DNAses que necessitam de magnésio para catalisar a reação (Walsh et al., 2013).

3.12.2 Quantificação do DNA

A quantificação do DNA genômico foi realizada em espectrofotômetro NanoDrop® - ND1000. Este equipamento, que além de avaliar a quantidade de DNA, utiliza volumes pequenos (1μL) sem necessidade de diluição, e fornece parâmetros para avaliar sua pureza, quanto a presença de proteínas e compostos fenólicos (Desjardins e Conklin, 2010).

3.12.3 Genotipagem por qPCR

As análises dos SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) do gene ACTN3 foram feitas por discriminação alélica por qPCR (PCR quantitativo) utilizando os ensaios comerciais TaqMan® SNP genotyping assays (Applied Biosystems, Foster City, CA) e o equipamento QuantStudio 5 (Applied Biosystems®). A técnica permite a análise dos dois alelos variantes de um SNP em um determinado segmento de

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DNA. Para essa abordagem experimental, escolhemos ensaios TaqMan® que já foram funcionalmente testados (ACTN3 rs1815729), por oferecerem melhor desempenho e custo mais acessível comparado com a customização dos ensaios. Nesse sistema, duas sondas de hidrólise específicas para cada alelo são marcadas com fluoróforos diferentes, permitindo assim que se identifique o genótipo de cada indivíduo (Schadock et al., 2015).

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4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O número de voluntários deste trabalho foi determinado através de cálculo amostral pelo software GPower 3.1. As variáveis descritivas da amostra passaram pelo teste de Shapiro-Wilk, devido ao N de 23 voluntários (Miot, 2017), e por terem se mostrado normais, seus dados foram apresentados em média e desvio padrão. Para as análises entre grupos (ACTN3) e tempos (horas de exposição) foram utilizados Modelos Lineares Gerais Multivariados (GLM) com post-hoc de Bonferroni. Para as análises de associação entre as variáveis fisiológicas e a presença dos sintomas do MAM foi utilizado Modelo de Equações de Estimações Generalizadas (GEE) com distribuição Poisson no qual os valores de cada tempo foram condensados em uma única variável contando com 115 valores (23 indivíduos vezes 5 tempos). Para análise de associação entre a quantidade de lapsos e as variáveis fisiológicas foi utilizado também um GEE, porém, com N de 111, devido às perdas durante as coletas. O nível de significância adotado foi de α ≤ 5%. Para a realização dos testes foi utilizado o software IBM SPSS Statistics 21.

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5 RESULTADOS

A Tabela 1 apresenta as características descritivas da amostra em relação às variáveis antropométricas divididas pelos genótipos de ACTN3 R577X. As comparações entre os grupos não apresentaram diferenças significativas para nenhuma das variáveis. Um voluntário do grupo RR foi excluído do estudo por apresentar glicemia basal de 162 mg/dl, valor acima da normalidade (<125 mg/dL). Outro valor excluído da análise foi o lactato (1 Hora) de um voluntário que apresentou 19,1 mmol/L, valor também muito acima da normalidade para a amostra (2,59 ± 0,96 mmol/L).

Tabela 1. Características Descritivas dos Voluntários Divididos por Genótipo

XX RX RR F P

Idade (anos) 27,0 (7,3) 32,8 (9,1) 26,4 (7,2) 1,54 0,23

Peso (kg) 69,1 (7,5) 72,1 (22,7) 69,2 (11,8) 0,09 0,91

Altura (m) 1,70 (0,05) 1,66 (0,14) 1,67 (0,06) 0,30 0,74

IMC (kg/m²) 23,9 (2,4) 25,5 (4,4) 24,4 (3,2) 0,44 0,64

Nota: Valores descritos em média (desvio padrão). XX, RX e RR são os Genótipos da ACTN3. XX (N=8), RX (N=8), RR (N=7). IMC = Índice de Massa Corporal. Valores das variáveis Idade, Peso, Altura e IMC estão descritos em Média ± Desvio Padrão. F é o valor da análise GLM. Foi considerado p<0,05.

5.1 Variáveis Fisiológicas

Entre os parâmetros fisiológicos analisados, a glicose após quatro horas de exposição à hipóxia [F(8, 400,1)= 2,003, p= 0,05] apresentou diferença entre os grupos. Os grupos RX (68,1 ± 11,7mg/dL; 88,7 ± 14,1mg/dL; F (-3,068); p= 0,006) e RR (71,7 ± 14,4mg/dL; 88,7 ± 14,1mg/dL; F (-2,448); p= 0,02) apresentaram diminuição da taxa de glicose sanguínea comparado ao grupo XX. Além disso, o grupo RX apresentou diferença entre os tempos 1 Hora (p= 0,02) e 2 Horas (p= 0,01) quando comparados com o tempo 4 Horas. Os valores de todas as medidas fisiológicas por grupo e tempo estão apresentados na Tabela 3. As variáveis SpO2 [F(4, 427,3)= 36,4, p= 0,0001] e frequência cardíaca (FC) [F(2,2, 363,2)= 4,896, p=

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0,009] apresentaram diferenças ao longo do tempo. A SpO2 antes de entrar na câmara foi maior do que todos os tempos em hipóxia (p= 0,0001). Em relação à FC, o momento antes de entrar na câmara apresentou valores menores do que 3 (p= 0,04) e 4 horas (p= 0,0001) de exposição à altitude. Os valores comparativos das variáveis fisiológicas ao longo do tempo estão descritos na Tabela 2.

Tabela 2. Resultado da análise do GLM das Variáveis Fisiológicas ao longo das 4 Horas de Exposição à Altitude Simulada de 4.500m

ANTES 1 HORA 2 HORAS 3 HORAS 4 HORAS

FC (bpm) 73,2 (12,5) 78,3 (9,1) 76,9 (10,5) 79,2 (9,9)a _{80,8 (13,6)}a Glicose (mg/dl) 82,0 (1,6) 91,4 (3,0) 84,5 (3,5) 78,5 (2,2) 76,3 (10,9) Lactato (mmol/L) 1,8 (1,1) 2,5 (0,9) 2,1 (0,7) 2,4 (0,9) 2,1 (1,0)

SpO2 (%) 96,2 (0,9) 85,8 (0,9)a 85,8 (1,4)a 88,3 (0,4)a 88,8 (1,2)a Lake Louise (escore) 0,4 (0,2) 0,4 (0,2) 0,4 (0,4) 0,6 (0,4) 0,9 (0,5)

Nota: Valores descritos em média (desvio padrão). (n= 115). a_{Diferença em relação ao tempo ANTES}

(FC 3 Horas, p= 0,04 / FC 4 Horas, p= 0,0001 / SpO2 em TODOS os tempos, p= 0,0001). Foi considerado p<0,05.

5.2 Mal Agudo da Montanha

Não houve diferença entre os grupos em relação aos escores do questionário. Porém, ao longo das 4 horas de exposição à altitude, três voluntários apresentaram escores relacionados ao MAM através do Lake Louise. Um desses voluntários (RX; IMC = 24,7 kg/m2_{) apresentou escore 4 entre os momentos 2 Horas e 3 Horas,} porém, sem presença de Dor de Cabeça, o que elimina o diagnóstico. Dos outros dois voluntários que apresentaram sintomas (ambos RR), um deles (IMC = 24,8 kg/m2_{) apresentou escore 4 no momento 3 Horas e escore 6 no momento 4 Horas,} enquanto que o outro voluntário (IMC = 21,7 kg/m2_{) apresentou escore 4 no} momento 4 Horas (Tabela 3). Nos dois casos, um dos sintomas relatado foi Dor de Cabeça, o que valida o diagnóstico do MAM. Para verificar quais variáveis fisiológicas poderiam explicar a presença de sintomas do MAM, realizamos um Modelo de Equações de Estimações Generalizadas (GEE) no qual utilizamos as variáveis de FC, glicose, lactato e SpO2 analisadas durante todo o tempo de

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exposição a hipóxia (N = 115) e encontramos associação apenas da SpO2 [X2_{(1, N=} 115)= 4,44, p= 0,03] com os sintomas reportados através do questionário do Lake

Louise. Este resultado indica que existe uma relação inversa entre as variáveis, ou

seja, para cada valor da SpO2 que baixa, aumenta a chance do voluntário reportar um sintoma no questionário (B = -0,05, IC = -0,09/ -0,00, p= 0,03).

5.3 ACTN3 R577X e Mal Agudo da Montanha

Para testar nossa hipótese sobre a diferença de aclimatação do polimorfismo R577X do gene ACTN3, incluímos no modelo estatístico a ACTN3 e os dados da glicose após 3 e 4 horas de exposição, uma vez que foram nestes momentos que os voluntários apresentaram os sintomas do MAM (N= 115). Os resultados estão na Tabela 4. O modelo estatístico mostrou associação dos sintomas do MAM com SpO2 [X2_{(1, N= 115)= 5,16, p= 0,02] e ACTN3 [X}2_{(1, N= 115)= 6,72, p= 0,03]. Em relação} ao ACTN3, os genótipos associados com o Lake Louise, quando controlado pelos níveis de glicose após 3 e 4 horas, onde os voluntários apresentaram os sintomas, foram o RX (B = 1,30, IC = 0,16/ 2,60, p= 0,04) e o RR (B = 1,43, IC = 0,33/ 2,54, p= 0,01). Os dados que expressam estas associações estão na Tabela 5.

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Tabela 3. Resultado da análise do GLM para as Variáveis Fisiológicas Associadas aos Genótipos da ACTN3 ao longo das 4 horas de exposição à 4500m de altitude simulada

XX RX RR XX RX RR XX RX RR XX RX RR XX RX RR Glicose (mg/dl) 80,1 (10,8) 82,8 (18,6) 71,8 (7,5) 93,5 (16,4) 92,8 (19,7) 76,1 (19,2) 80,5 (8,2) 85,6 (14,4) 86,2 (14,6) 76,1 (12,4) 80,5 (23,1) 79,8 (9,0) 88,7 (14,1) 68,1 (11,7)ab 71,7 (14,4)a Lactato (mmol/L) 2,0 (1,5) 2,0 (1,0) 1,4 (0,8) 2,7 (1,0) 2,6 (0,9) 2,5 (0,7) 2,4 (1,0) 2,2 (0,6) 1,8 (0,6) 2,7 (0,9) 2,4 (1,0) 1,9 (1,0) 2,4 (0,7) 2,3 (1,3) 1,7 (0,7) FC (bpm) 75,7 (13,6) 72,8 (10,3) 71,1 (14,6) 79,6 (10,2) 78,7 (6,9) 76,7 (10,6) 81,7 (11,4) 75,1 (10,1) 74,0 (9,5) 81,8 (10,3) 80,6 (10,1) 75,1 (9,0) 85,0 (14,7)c 82,7 (12,9)c 74,7 (12,5) SpO2 (%) 95,8 (2,6) 95,6 (1,3) 97,5 (0,5) 85,3 (4,1) 87,0 (5,4) 85,7 (2,4) 87,2 (2,6) 84,3 (6,1) 85,2 (2,9) 88,2 (4,1) 88,7 (3,0) 88,1 (5,3) 89,0 (3,5) 87,5 (2,5) 90,4 (4,9) Lake Louise (escore positivo) - - - 1 - - 2

Nota: XX, RX e RR são os Genótipos da ACTN3. XX (N=8), RX (N=8), RR (N=7), FC = Frequência Cardíaca, SpO2 = Saturação Periférica de Oxigênio, mg/dl

= miligrama por decilitro, mmol/L = milimol por litro, bpm = batimentos por minuto, mmHg = milímetros de mercúrio, % = porcentagem. Os valores estão descritos em Média (Desvio Padrão), exceto Lake Louise que mostra quantos indivíduos apresentaram diagnóstico positivo por tempo. a_{diferença entre RR e}

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Tabela 4. Resultado da análise do GEE para Lake Louise, SpO2, ACTN3 e Glicose de 3 e 4 horas Variável Teste de Hipótese X gl P FC 0,001 1,0 0,97 SpO2 5,162 1,0 0,02* Lactato 0,943 1,0 0,33 ACTN3 6,725 1,0 0,03* glicose 3 horas 0,001 1,0 0,97 glicose 4 horas 1,388 1,0 0,23

Nota: A associação entre as variáveis fisiológicas, a ACTN3 os escores do Lake Louise foi verificada através de uma análise de GEE incluindo todos os valores de cada voluntário nos cinco tempos (antes, 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas), totalizando 115 valores para cada variável. Entraram no modelo estatístico as variáveis Frequência Cardíaca (FC), Saturação Periférica de Oxigênio (SpO2),

ACTN3, Lactato, Glicose 3 Horas e Glicose 4 Horas. *associação com o aumento dos sintomas do

Lake Louise.

Tabela 5. Resultado da análise do GEE para Lake Louise, SpO2, genótipos da ACTN3 e Glicose de 3 e 4 horas

Variável B (95% IC) P FC 0,00 (-0,03 a 0,03) 0,97 SpO2 -0,04 (-0,07 a 0,00) 0,02* Lactato -0,26 (-0,78 a 0,26) 0,33 RR 1,43 (0,33 a 2,54) 0,01* RX 1,30 (0,01 a 2,60) 0,04* XX 0a glicose 3 horas -0,00 (-0,02 a 0,02) 0,97 glicose 4 horas 0,02 (-0,01 a 0,07) 0,23

Nota: A associação entre a Saturação Periférica de Oxigênio (SpO2), os Genótipos da ACTN3, a

Glicose 3 e 4 Horas e os escores do Lake Louise foi verificada através de uma análise de GEE incluindo todos os valores de cada voluntário nos cinco tempos (antes, 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas), totalizando 120 valores para cada variável. Os valores dos Genótipos são comparativos entre eles, sendo XX o valor de referência. IC = Intervalo de Confiança; *associação entre SpO2 e os

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25

5.4 Saturação de Oxigênio

Com a finalidade de investigar quais variáveis fisiológicas poderiam explicar a diminuição da SpO2 ao longo do tempo, relacionamos FC, lactato e glicose para verificar o comportamento delas frente à SpO2 e não encontramos nenhuma variável que demonstrasse valores significativos.

5.5 Tempo de Reação e Lapsos

Avaliamos também o tempo de reação e a quantidade de lapsos (tempos maiores de 355mseg) ao longo das quatro horas de exposição para verificar possíveis alterações em decorrência da hipoxemia. Não foram verificadas diferenças entre grupos para tempo de reação [F(2, 5469,8)= 2,494, p= 0,11] (Tabela 6) ou lapsos [F(2, 10,393)= 1,558, p= 0,23] (Tabela 7). Para verificar associação entre o tempo de reação, a quantidade de lapsos e as variáveis fisiológicas, realizamos um GEE. O tempo de reação não apresentou influência das variáveis fisiológicas, porém a quantidade de lapsos apresentou associação com Lactato [X2_{(1, N= 111)= 3,69, p=} 0,05]. (Tabela 8).

Tabela 6. Resultado da análise do GLM do Tempo de Reação entre Genótipos ao longo do tempo

RR 242,2 (24,1) 256,7 (15,9) 241,5 (17,6) 240,3 (15,1) 240,2 (16,9) RX 263,9 (21,9) 265,2 (32,4) 272,1 (45,4) 275,8 (40,0) 264,6 (28,9) XX 257,4 (31,0) 251,7 (21,0) 257,5 (32,4) 259,9 (26,8) 249,6 (17,6)

Nota: Comparação entre grupos e tempos para a variável Tempo de Reação (milisegundos). RR (n=7), RX (n=8), XX (n=6). Não há diferença entre grupos e tempos.

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Tabela 7. Resultado da análise do GLM dos Lapsos entre Genótipos ao longo do tempo

RR 0,8 (0,6) 1,8 (1,3) 0,8 (0,8) 0,5 (0,7) 0,7 (0,7) RX 1,5 (1,3) 2,0 (2,2) 2,5 (1,9) 2,2 (1,9) 1,7 (2,2) XX 1,8 (1,7) 1,0 (0,8) 1,3 (2,4) 1,5 (1,9) 0,8 (1,3)

Nota: Comparação entre grupos e tempos para a variável Lapsos (mais de 355 milisegundos). RR (n=7), RX (n=8), XX (n=6). Valores expressos em Média (Desvio Padrão). Não há diferença entre os grupos e tempos.

Tabela 8. Resultado da análise do GEE para Lapsos e Variáveis Fisiológicas

Variável B (95% IC) P FC 0,00 (-0,02 a 0,02) 0,92 SpO2 -0,04 (-0,06 a 0,02) 0,43 Lactato -0,26 (-0,00 a 0,43) 0,05* Glicose 0,02 (-0,01 a 0,02) 0,49

Nota: A associação entre as Variáveis Fisiológicas e a quantidade de lapsos foi verificada através de uma análise de GEE incluindo todos os valores de cada voluntário nos cinco tempos (antes, 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas), totalizando 111 valores para cada variável. IC = Intervalo de Confiança; *associação entre Lactato e Quantidade de Lapsos, p<0,05.

5.6 Estado de Humor (BRUMS)

Analisamos o comportamento do estado de humor dos voluntários ao longo das quatro horas para verificar se a exposição aguda à altitude extrema resultaria em diferença de humor, especialmente em vigor e fadiga, entre indivíduos com diferentes genótipos. Nossos resultados mostram que não houve mudanças significativas ao longo do tempo para nenhum dos grupos. Não houve diferença também, entre grupos, para as dimensões Tensão [F(2, 7,656)= 1,690, p= 0,21], Depressão [F(2, 4,259)= 3,059, p= 0,69], Raiva [F(2, 9,230)= 1,313, p= 0,29] e Confusão [F(2, 0,794)= 0,183, p= 0,83] enquanto que as dimensões Vigor [F(2, 102,767)= 2,970, p= 0,04] e Fadiga [F(2, 40,615)= 2,494, p= 0,01] apresentaram diferenças entre grupos. A dimensão Vigor apresentou diferenças entre RR e XX já no momento 1 Hora (9,86 ± 4,18; 6,25 ± 3,15; F (-3,607); p= 0,05) e depois entre RR e RX nos momentos 2 Horas (9,71 ± 5,06; 5,63 ± 1,19; F (-4,089); p= 0,02) e 4

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Horas (9,71 ± 4,75; 6,00 ± 2,14; F(-3,714); p= 0,04). Já a dimensão Fadiga apresentou diferença significativa entre os grupos RR e XX no momento 4 Horas (3,43 ± 4,39; 0,38 ± 0,52; F(-3,054); p= 0,03). A comparação dos perfis de Estado de Humor dos genótipos por momento de exposição à altitude estão representados nas figuras de 3 a 7. Além disso, realizamos um GEE no qual as dimensões Depressão [X2_{(1, N= 115)= 5,25, p= 0,02] e Fadiga [X}2_{(1, N= 115)= 27,18, p= 0,0001]} demonstraram associação com os sintomas do MAM (Tabela 9). Os resultados de todas as análises por grupo e tempo do questionário BRUMS estão na tabela 10.

Tabela 9. Resultado da análise do GEE para BRUMS e Mal Agudo da Montanha

Variável Teste de Hipótese X gl P Tensão 0,701 1,0 0,40 Depressão 5,253 1,0 0,02* Raiva 1,006 1,0 0,31 Vigor 0,716 1,0 0,39 Fadiga 27,188 1,0 0,00* Confusão 0,145 1,0 0,70

Nota: A associação entre as dimensões do BRUMS e os escores do Lake Louise foi verificada através de uma análise de GEE incluindo todos os valores de cada voluntário nos cinco tempos (antes, 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas), totalizando 115 valores para cada variável. Entraram no modelo estatístico as variáveis Tensão, Depressão, Raiva, Vigor, Fadiga e Confusão. *associação com o aumento dos sintomas do Lake Louise.

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Figura 3. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento Antes

Nota: XX, RX e RR são os Genótipos da ACTN3. XX (N=8), RX (N=8), RR (N=7). Os valores descritos representam a Média dos Escores obtidos por grupo.

Figura 4. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento 1 Hora

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00

tensão depressão raiva vigor fadiga confusão

RR RX XX 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

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Figura 5. Comparação entre os perfis de Estado de Humor dos grupos no momento 2 Horas

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

RR RX XX 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00

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0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

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Tabela 10. Resultados do GLM para Estado de Humor (BRUMS) entre grupos ao longo das 4 horas de exposição à 4500m de altitude simulada

RR RX XX RR RX XX RR RX XX RR RX XX RR RX XX Tensão 2,43 (1,62) 2,63 (2,50) 1,38 (1,30) 0,71 (1,11) 1,25 (1,39) 0,13 (0,35) 0,29 (0,76) 0,88 (1,46) 0,25 (0,71) 0,57 (1,51) 1,25 (1,39) 0,13 (0,35) 0,57 (1,13) 0,75 (1,39) 0,50 (0,76) Depressão 1,14 (1,95) - 0,13 (0,35) 0,43 (1,13) - - 0,29 (0,76) 0,13 (0,35) 0,13 (0,35) 1,00 (1,91) - - 0,86 (2,27) - - Raiva 1,14 (1,21) 1,88 (1,55) 0,63 (0,52) 1,14 (1.86) 1,13 (1,81) 0,50 (0,76) 0,86 (0,90) 1,00 (1,69) 0,25 (0,46) 1,86 (3,29) 0,88 (1,13) 0,13 (0,35) 1,29 (2,63) 1,00 (1,41) 0,38 (0,52) Vigor 9,43 (2,51) 8,13 (2,17) 8,00 (2,14) 9,86 (4,18) 7,63 (2,62) 6,25a (3,15) 9,71 (5,06) 5,63b (1,19) 6,63 (2,62) 9,00 (5,35) 5,88 (2,53) 5,88 (2,53) 9,71 (4,75) 6,00c (2,14) 6,38 (2,72) Fadiga 3,00 (2,89) 2,75 (2,19) 1,50 (1,85) 2,14 (1,57) 2,50 (2,73) 1,00 (1,77) 2,14 (1,95) 1,88 (1,64) 0,75 (1,04) 3,57 (3,46) 2,38 (3,20) 0,75 (1,04) 3,43 (4,39) 2,25 (1,67) 0,38d (0,52) Confusão 0,29 (0,76) 1,13 (1,81) 0,88 (1,36) 0,14 (0,38) 0,88 (1,73) 0,25 (0,71) 0,14 (0,38) 0,75 (1,39) 0,38 (1,06) 0,86 (2,27) 0,13 (0,35) 0,25 (0,71) 0,86 (1,86) 0,38 (0,74) 0,13 (0,35)

Nota: XX, RX e RR são os Genótipos da ACTN3. XX (N=8), RX (N=8), RR (N=7). Os valores estão descritos em Média (Desvio Padrão).(-)significa zero.

a_{diferente de RR no momento 1 Hora (p=0,05);}b_{diferente de RR no momento 2 Horas (p=0,02);}c_{diferente de RR no momento 4 Horas (p=0,04);}d_{diferente de}

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6 DISCUSSÃO

Neste estudo, apresentamos que indivíduos que possuem ao menos um alelo R do gene ACTN3 R577X tem uma maior dependência do metabolismo de glicose do que indivíduos XX e isso pode ser um fator chave no desencadeamento do MAM, uma vez que, apesar de não haver diferença entre grupos na quantidade de indivíduos que apresentaram os sintomas, apenas voluntários do genótipo RR desenvolveram a doença.

O primeiro resultado que é importante ressaltar é o fato de que neste estudo, a SpO2 demonstrou associação com os sintomas do MAM, uma vez que a diminuição da SaO2 é o seu principal fator indutor. Um estudo feito durante três meses nos Alpes entre 2.200m e 3.817m que aplicou o questionário Lake Louise e mediu SaO2 e FC em 506 montanhistas de diversas nacionalidades demonstrou que o principal sintoma do MAM, a dor de cabeça, está diretamente relacionado à baixa SaO2, além de alta percepção de esforço e baixo consumo hídrico (Burtscher et al. 2011). Nosso resultado reforça esta interação, pois entre todas as variáveis fisiológicas analisadas, somente a SpO2 apresentou associação com os sintomas relatados pelos voluntários. Apesar de a FC ter apresentado aumento significativo em toda a amostra desde a primeira hora de exposição comparado com o momento Antes, não encontramos associação com o MAM, diferentemente de outros artigos (Bian et al., 2015).

Porém, o principal resultado do nosso estudo foi a associação do alelo R do polimorfismo R577X da ACTN3 com a presença de sintomas do MAM. Apesar de vários genes terem sido estudados na tentativa de encontrar uma relação com os sintomas (Tomar et al., 2015; MacInnis et al., 2010), nosso estudo é o primeiro a relacionar esta condição com os genótipos da ACTN3 R577X, mostrando que indivíduos com genótipo XX sofrem menos os efeitos da hipóxia durante aclimatação. Esse resultado, de certa forma, corrobora achados anteriores que mostraram existir maior prevalência do alelo X em montanhistas profissionais quando comparados com indivíduos normais (Djarova et al., 2013) e maior percentual de fibras do tipo I em populações residentes em altas altitudes como os

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Quechua do Peru (Rosser e Hochachka, 1993) e os Sherpas e Tibetanos (Gilbert-Kawai et al. 2014).

Sabendo que a exposição à altitude aumenta a metabolização de glicose (Brooks et al., 1991; Chen et al., 2015), assim como a prática de atividade física e que estes dois fatores poderiam induzir os sintomas do MAM (Litch, 1996; Roach et al., 2000), os voluntários do presente trabalho receberam um lanche padrão imediatamente antes de entrar na câmara normobárica, para normalizar a glicemia, e ficaram o tempo todo de exposição sem realizar nenhum esforço físico. Entretanto, dois de nossos voluntários apresentaram sintomas do MAM. Tal fato poderia ser explicado nesses indivíduos se os mesmos apresentassem IMC acima de 25 kg/m2_, que é considerado como fator de risco para desenvolvimento do MAM (Maltin, 2008; San Martin et al., 2017; Yang et al., 2013, Ri-Li et al., 2003), porém, nenhum dos dois (24,8 kg/m2_{e 21,7 kg/m}2_{) se enquadra nesta categoria. Esse resultado é} importante, pois os trabalhos que ligam IMC ao MAM justificam tal resultado baseado no fato de que indivíduos com maiores IMC apresentam distúrbios do sono que levam a um aumento de desaturação arterial de oxigênio, que é justamente o principal indutor dos sintomas do MAM (Burgess et al., 2004; San Martin et al., 2017), porém, nossos voluntários não passaram a noite sob efeito da altitude.

Essa associação entre qualidade do sono e MAM esteve presente no questionário original do Lake Louise (Roach et al. 1993), mas um estudo feito com 491 indivíduos residentes abaixo de 2.500m que ascenderam a 4.380m durante 6 dias encontrou baixa correlação entre qualidade do sono com os sintomas do MAM e maior consistência de resultados quando esta variável era excluída da análise (MacInnins et al., 2013). Posteriormente, questionamentos foram feitos sobre a real importância do sono para os sintomas do MAM (Milledge, 2014), até que recentemente o próprio questionário Lake Louise foi modificado por seus idealizadores, que excluíram os distúrbios do sono como preditores do MAM (Roach et al., 2018).

Neste trabalho, não encontramos associação entre IMC e a presença do MAM. A única semelhança entre os voluntários que apresentaram os sintomas é o genótipo RR da ACTN3. Isso corrobora nossa teoria de que os dados que

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relacionam IMC com o MAM estão, provavelmente, atrelados à distribuição dos tipos de fibra muscular, principalmente com fibras do tipo IIx (Tanner et al., 2001), já que, além dos indivíduos nativos de altas altitudes possuírem maior quantidade de fibras musculares do tipo I (Kayser et al., 1996; Kayser et al;, 1991), possuem também maior número de capilares por área de secção transversa muscular (Kayser, et al., 1996), o que poderia facilitar a oferta de oxigênio aos músculos ativos. Segundo Hoppeler e Vogt (2001), a exposição à hipóxia provoca diminuição de cerca de 30% da densidade mitocondrial sem diminuição da densidade capilar, o que levaria a um aumento da oferta de oxigênio por mitocôndria, favorecendo o trabalho celular.

A associação demonstrada em nosso trabalho entre os sintomas do MAM e os genótipos está relacionada com a diminuição da SpO2 e a diminuição da glicose sanguínea após três horas de exposição. A diminuição da SpO2/SaO2 é a principal responsável pela presença dos sintomas do MAM, principalmente a dor de cabeça (Karinen et al., 2010; Burtscher et al., 2011). Além disso, durante exposição à altitude, ocorre aumento da dependência da glicose como substrato energético, uma vez que a diminuição da SaO2 aumenta a dependência metabólica da glicose (Brooks et al., 1991; Brooks et al., 1992). Porém, o grupo XX conseguiu manter a glicemia estável mesmo após quatro horas de exposição, quando comparados com os grupos RX e RR. Uma possível explicação para este fato é que indivíduos com genótipo XX e, possivelmente, mais fibras do tipo I sejam favorecidos pela maior densidade mitocondrial destas fibras, comparadas com as do tipo IIx, possibilitando uma maior oferta de energia mesmo com glicose como fonte primária. Este dado reforça nossa hipótese de que o genótipo XX possa ter uma aclimatação mais rápida em situações de extrema altitude. Na prática, esses dados podem auxiliar montanhistas que possuem ao menos um alelo R a ampliar o tempo de aclimatação a cada nova altitude e controlar a glicemia, na tentativa de impedir o aparecimento dos sintomas do MAM.

Sobre o Estado de Humor, nosso trabalho associação entre as dimensões Depressão e Fadiga com os sintomas do MAM. Em estudo com 163 voluntários com idade entre 18 e 60 anos avaliados entre 18 e 22 horas de exposição a 3700m de altitude, pesquisadores encontraram que o estado de humor tem um papel crucial no

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desenvolvimento do MAM, entre as quais estão as dimensões depressão, raiva, fadiga e confusão (Bian, et al., 2015). Além disso, nosso trabalho mostrou diferenças entre genótipos, especialmente para Vigor e Fadiga, sendo que o grupo RR apresentou Vigor maior do que o grupo XX na primeira hora de exposição e do que grupo RX nos momentos 2 e 4 horas. Esta manutenção do Vigor pelo grupo RR pode estar relacionada ao aumento da utilização de glicose mostrada anteriormente, o que pode ter levado também ao aumento da Fadiga em relação ao grupo XX após quatro horas de exposição à altitude, justamente no momento em que os grupos apresentaram diferenças nos níveis de glicose e dois voluntários RR apresentaram MAM. Baixa sensação de Fadiga em altitude pode estar relacionada a uma melhor capacidade aeróbia em normóxia (Rossetti et al., 2017), que é maior em indivíduos XX comparados com RR (Silva et al., 2014). No caso dos trabalhadores das minas em alta altitude no Chile, por exemplo, a genotipagem da ACTN3 poderia contribuir para definir que tipo de trabalho seria mais indicado aos funcionários, levando em consideração os fatos relatados acima.

Avaliamos também a função cognitiva ao longo do tempo e, apesar de não termos encontrado diferença entre grupos para o tempo de reação, verificamos que a quantidade de lapsos tende a aumentar conforme aumenta a quantidade de lactato (B = -0,26, IC = -0,00/ 0,43, p= 0,05). Esta relação pode ser explicada pelo fato de que o aumento de lapsos está diretamente associado a sintomas físicos de fadiga (Lee et al., 2010) assim como o lactato. Desta forma pudemos demonstrar que a hipoxemia influencia diretamente o metabolismo energético, o que causa efeitos sobre outros sistemas podendo comprometer o estado de humor e a cognição em indivíduos que não conseguem se aclimatar rapidamente.

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7 CONCLUSÕES

Concluímos que existe uma associação entre os sintomas do MAM e o alelo R do polimorfismo R577X do gene ACTN3 que é consequência de uma maior dependência de glicose como substrato energético em indivíduos que possuem este alelo. Além disso, o aumento da utilização de glicose por indivíduos homozigotos RR em comparação a homozigotos XX causa uma maior sensação de vigor seguida de uma aumento de fadiga que pode propiciar o aparecimento do MAM. Nenhuma relação entre os genótipos e o tempo de reação foi encontrada neste estudo. Salientamos, porém, que este estudo foi realizado em ambiente de hipóxia normobárica, onde situações adversas como o frio, o vento e a atividade física envolvidos no processo de subir a altas altitudes não estiveram presentes, o que pode ter suprimido algum resultado. Por esta razão, sugerimos a confirmação destes achados em estudos com hipóxia hipóbárica.

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