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PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS SILVESTRES DE DISTINTOS BIOMAS DO ESTADO DE SÃO PAULO PARA PRODUÇÃO DE
COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS
CAMPINAS 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
PAULA DE PAULA MENEZES BARBOSA
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS SILVESTRES DE DISTINTOS BIOMAS DO ESTADO DE SÃO PAULO PARA PRODUÇÃO DE
COMPOSTOS ANTIMICROBIANOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Gabriela Alves Macedo Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Paula de Paula Menezes Barbosa e orientada pela Prof.ª Dr.ª Gabriela Alves Macedo.
__________________________________________ Assinatura da orientadora
CAMPINAS 2014
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Barbosa, Paula de Paula Menezes,
B234i BarIsolamento e seleção de fungos filamentosos silvestres de distintos biomas do Estado de São Paulo para produçao de compostos antimicrobianos / Paula de Paula Menezes Barbosa. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
BarOrientador: Gabriela Alves Macedo.
BarDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Bar1. Bioprospecção. 2. Compostos bioativos. 3. Antibióticos. I. Macedo, Gabriela Alves. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Isolation and selection of filamentous fungi from distinct biomes of State of São Paulo for antimicrobial compounds production
Palavras-chave em inglês: Bioprospection
Bioactive compounds Antibiotics
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Gabriela Alves Macedo [Orientador] Danielle Branta Lopes
Marta Cristina Teixeira Duarte Data de defesa: 24-10-2014
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
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BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________ PROF.ª DR.ª GABRIELA ALVES MACEDO
ORIENTADORA
__________________________________________________________ DR.ª DANIELLE BRANTA LOPES
CNPEM
(MEMBRO TITULAR)
_________________________________________________________ PROF.ª DR.ª MARTA CRISTINA TEIXEIRA DUARTE
CPQBA/UNICAMP (MEMBRO TITULAR)
_________________________________________________________ PROF.ª DR.ª HÉLIA HARUMI SATO
FEA/UNICAMP (MEMBRO SUPLENTE)
_________________________________________________________ DR.ª DARLILA APARECIDA GALLINA
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vii RESUMO
Compostos bioativos são moléculas orgânicas derivadas de vegetais, animais ou micro-organismos que estão relacionados a alguma atividade biológica e, a microbiota do solo, representa uma importante fonte destas substâncias. O ponto crítico na descoberta de novas moléculas bioativas a partir desta fonte é o isolamento de grupos de micro-organismos pouco explorados e conhecidos, que são ao mesmo tempo bons produtores de metabólitos secundários. Os fungos filamentosos são conhecidos como produtores de uma grande variedade de metabólitos secundários, diante disso, o objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar linhagens de fungos filamentosos silvestres de duas regiões do Estado de São Paulo (Biomas de Mata Atlântica e Cerrado), com o intuito de produzir compostos antimicrobianos ativos contra os micro-organismos alvo escolhidos nesta pesquisa:
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis e Candida albicans, responsáveis por grandes problemas nas áreas de alimentos e saúde. A
partir das amostras de solo coletadas na região de Mata Atlântica (Ilhabela) e na região de transição dos biomas Mata Atlântica e Cerrado (Barão Geraldo, Campinas), 118 culturas de fungos filamentosos foram isoladas. Dentre elas, 22 apresentaram elevado potencial antimicrobiano contra pelo menos um dos micro-organismos alvo e foram estudadas quanto ao seu efeito antimicrobiano. No caso do B. cereus, 4 extratos de fungos (IB36A, BG11A, BG13D e BG13E) apresentaram efeito bactericida e bacteriolítico sobre este micro-organismo alvo. Para a cepa de S. aureus, 6 fungos apresentaram efeito bactericida (IB6A, IB36A, IB45B, IB49C, BG13D e BG13E) e 6 apresentaram efeito bacteriolítico (IB6A, IB36A, IB45B, BG5A, BG13D e BG13E). Para E. coli e S. choleraesuis, apenas um fungo possuiu efeito bactericida (IB6A e IB38E, respectivamente). Para C. albicans, todos os extratos analisados apresentaram efeito fungistático. Em resumo, foram obtidas culturas de fungos filamentosos com elevado potencial para produção de metabólitos com atividade antimicrobiana, os quais poderão ser identificados e explorados futuramente.
viii ABSTRACT
Bioactive compounds are organic molecules from vegetables, animals or microorganisms that are related to some biological activity and, soil microbiota, is an important source of these substances. The isolation of unexplored and unknown microorganisms that are both good producers of secondary metabolites, provides the potential for novel bioactive molecules. Filamentous fungi are known as good producers of a great variety of secondary metabolites, therefore, this work goal was to isolate and select filamentous fungi strains of two regions of São Paulo State (Biomes of Cerrado and Atlantic Forest), capable to produce antimicrobial compounds against the microorganisms: Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis and Candida albicans, responsible for
important problems in food and health areas. 118 filamentous fungi strains were isolated from soil samples collected at Atlantic Forest region (Ilhabela) and transition region between Atlantic Forest and Cerrado biomes (Barão Geraldo, Campinas). Among them, 22 strains showed high antimicrobial activity against at least one of the pathogenic microorganisms target and their antimicrobial effect were studied. In the case of B. cereus, 4 fungi extracts (IB36A, BG11A, and BG13D BG13E) showed bactericidal and bacteriolytic effect on this target microorganism. For the strain of S. aureus, 6 fungi showed bactericidal effect (IB6A, IB36A, IB45B, IB49C, BG13D and BG13E) and 6 had bacteriolytic effect (IB6A, IB36A, IB45B, BG5A, BG13D and BG13E). In the cases of E.
coli and S. choleraesuis, only one fungus possessed bactericidal effect (IB6A and IB38E,
respectively), and for C. albicans, all analyzed extracts showed fungistatic effect. In conclusion, potentially filamentous fungi strains producers of antimicrobial activity metabolites were obtained, which can be identified and future explored.
ix SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ... 1
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3
1.1 Compostos bioativos naturais ... 3
1.1.1 Biomas Mata Atlântica e Cerrado e a obtenção de micro-organismos produtores de compostos bioativos ... 4
1.2 Compostos bioativos com atividade antimicrobiana ... 6
1.2.1 Métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos naturais ... 9
1.2.2 Pesquisa de novos antimicrobianos naturais e sua importância ... 10
1.2.3 Estratégias na prevenção de desenvolvimento de micro-organismos resistentes ... 13
1.3 Fungos filamentosos ... 13
1.3.1 Características e importância ... 13
1.3.2 Metabólitos bioativos de fungos ... 14
1.3.3 Cultivo e produção de compostos bioativos ... 16
1.3.4 Principais antibióticos produzidos por fungos filamentosos ... 18
1.4 Importância dos micro-organismos em alimentos e saúde escolhidos para o presente estudo ... 24
2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 27
2.1 Meios de cultura ... 27
2.2 Isolamento das culturas de fungos filamentosos ... 28
2.2.1 Coleta das amostras ... 28
2.2.2 Isolamento e conservação das culturas de fungos filamentosos ... 30
2.2.3 Estudo morfológico macroscópico das linhagens fúngicas estudadas ... 30
2.3.1 Culturas de fungos filamentosos estudadas ... 31
2.3.2 Cultivo e preparação do extrato ... 32
2.3.3 Atividade antimicrobiana ... 33
2.4 Estudo da atividade antimicrobiana das culturas de fungos selecionadas ... 35
2.4.1 Preparação do extrato dos fungos com maior potencial antimicrobiano ... 35
2.4.2 Determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) pela técnica de microdiluição e monitoramento da atividade antimicrobiana ... 36
x
2.4.3 Determinação da concentração mínima bactericida/fungicida (MBC/MFC) ... 38
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40
3.1 Isolamento das culturas de fungos filamentosos ... 40
3.2 Seleção de micro-organismos com maior potencial antimicrobiano ... 41
3.2.1 Atividade antimicrobiana contra B. cereus ... 42
3.2.2 Atividade antimicrobiana contra E. coli ATCC 11229 ... 48
3.2.3 Atividade antimicrobiana contra S. aureus ATCC 6538 ... 51
3.2.4 Atividade antimicrobiana contra S. choleraesuis ATCC14028... 56
3.2.5 Atividade antimicrobiana contra C. albicans ATCC 10231 ... 59
3.2.6 Discussão geral ... 62
4 CONCLUSÕES ... 68
5 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 69
REREFÊNCIAS ... 70
APÊNDICES ... 86
ANEXO A - ... 116
xi
Dedico este trabalho à minha família Regina, Itamar e Laís por estarem sempre presentes em minha vida sendo meu porto seguro e aquilo de mais precioso que tenho.
xiii
AGRADECIMENTOS
À Deus por me iluminar, fortalecer e por colocar pessoas tão especiais em meu caminho.
À Professora Gabriela, pela disponibilidade de orientação, confiança depositada em meu trabalho e principalmente pelos ensinamentos transmitidos.
Aos meus pais Itamar e Regina, pelo amor, ensinamentos, apoio em minhas escolhas, valores transmitidos e conselhos que promovem meu crescimento pessoal diário.
À minha irmã Laís, pela fidelidade, amizade, companheirismo e puxões de orelha quando necessário.
Ao Danilo, por dividir comigo durante esses anos de relacionamento amor, momentos de felicidade, companheirismo e carinho.
Aos meus amigos Ana Paula, Bia, Bruninha, Bruno, Camilo, Cínthia, Elaine, Fabiano, Fabíola, Giba, Giulia, Gustavo, Gyorgy, Isa, Jô, Júlia, Léo, Liege, Lívia, Krébs, Ricardo, Taun, Val, Vivi e Zé pela ajuda com os experimentos e principalmente por tornarem o Laboratório de Bioquímica um ambiente único e acolhedor.
Aos amigos Paulinha e Ruann em especial, que tanto colaboraram nos primeiros passos desta pesquisa, pela paciência, prontidão em sempre ajudar e ensinamentos.
Às minhas queridas amigas Débora, Fernanda e Jessika que me socorrem, me fazem rir, chorar e que eu agradeço a Deus por tê-las conhecido. Vocês são ótimas!
Aos meus amados amigos de Lavras Manu, Mayara, Douglas e Lud e os de Sertãozinho PV e Marcela pelos ótimos momentos que temos quando estamos juntos!
Ás amigas que fiz no Apto 22C Marluce, Laís, Monyca e Paola pela convivência, companheirismo e aprendizado.
Às minhas famílias Menezes e Barbosa, em especial Tia Elza, Tia Landa, Vó Maricota, Vó Aparecida, Madi, Madrinha e Fernando (in memorian) por estarem sempre comigo me ajudando de alguma forma.
Aos professores da FEA, especialmente à Prof.ª Dr.ª Marta Cristina Teixeira Duarte e à Prof.ª Dr.ª Hélia Harumi Sato pela disponibilidade em ajudar.
xiv
A banca examinadora pela contribuição dada ao trabalho. À todos os funcionários da FEA pelos auxílios prestados. Ao CNPq pela bolsa de mestrado concedida.
xv
“Coloque Deus no início e Ele cuidará do fim”. Autor desconhecido
“A persistência é o menor caminho do êxito”. Charles Chaplin
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Mapa dos principais biomas brasileiros...5 Figura 2. Microplaca de 96 compartimentos antes (a) e depois (b) da adição do reagente cloreto de iodonitrotetrazólio (INT), em que na presença de atividade microbiana a solução dentro do compartimento se torna vermelha...10 Figura 3. Estrutura química dos antibióticos penicilina G (1), cefalosporina C (2), griseofulvina (3), ácido fusídico (4), equinocandina B (5), sordarina (6), esclerotiorina (7) e ácido kójico (8)...23 Figura 4. Inventário Florestal da vegetação nativa do Estado de São Paulo...29 Figura 5. Modelo da disposição das amostras na microplaca de 96 poços nas análises de MIC, em que as três primeiras linhas representam a triplicata de cada concentração de extrato analisada, e os números de 1 a 10 representam as concentração de extrato analisadas, da maior para a menor concentração (mg mL-1): 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,63; 0,31; 0,16; 0,08 e 0,04...38 Figura 6. Número de culturas de fungos obtidas para cada tipo de amostra coletada nas regiões de Mata Atlântia e de transição entre Mata Atlântica e Cerrado...41 Figura 7. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do crescimento de B. cereus...43 Figura 8. Crescimento de B. cereus (% D.O.), na presença de diferentes concentrações (mg mL-1) de extrato dos fungos BG11A (A), IB36A (B), BG13D (C) e BG13E (D), durante 20 h de exposição...46 Figura 9. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição de crescimento de E. coli ATCC 11229...49 Figura 10. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do crescimento de S. aureus ATCC 6538...52
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Figura 11. Crescimento de S. aureus ATCC 6538 (% D.O.), na presença de diferentes concentrações (mg mL-1) de extrato dos fungos BG13D (A), BG5A (B), IB6A (C), IB36A (D), IB45B (E) e BG13E (F) durante 20 h de exposição...55 Figura 12. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição de crescimento de S. choleraesuis ATCC14028...57 Figura 13. Classificação das culturas de fungos filamentosos pelo percentual de inibição do crescimento de C. albicans...60 Figura 14. Cultura dos fungos BG13E (A) e BG13D (B), cujos extratos apresentaram atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram-positivas estudadas...64 Figura 15. Cultura dos fungos IB4C (A), IB6A (B), IB6B (C), IB36A (D), IB36C (E) e IB45B (F), cujos extratos apresentaram atividade antimicrobiana de amplo espectro...65 Figura 16. Cultura dos fungos BG 8C (A) (cujo extrato apresentou atividade contra as bactérias Gram-negativas); BG5A (B) (apresentou atividade de amplo espectro); IB49C (C) (apresentou atividade contra S. aureus ATCC 6538); BG4B, BG11A, BG14K e Aspergillus sp. (1099) (D) (apresentaram atividade contra a cepa de B. cereus); IB14B, IB27B, IB38E e IB40A (E) (apresentaram atividade contra S. choleraesuis ATCC 14028) e IB8A, BG10C, RP478 (F) (apresentaram atividade contra C. albicans ATCC 10231)...66
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Micro-organismos isolados nas regiões brasileiras de Cerrado e Mata Atlântica produtores de compostos bioativos e moléculas de alto valor agregado...7 Tabela 2. Vantagens do cultivo de fungos em superfície de ágar com relação à FS e FES...18 Tabela 3. Características dos micro-organismos estudados para atividade antimicrobiana...26 Tabela 4. Composição dos meios de cultura utilizados neste estudo...28 Tabela 5. Fungos filamentosos estudados, pertencentes à CMLB...31 Tabela 6. Fungos filamentosos estudados, isolados da região de Mata Atlântica, do município de Ilhabela e da região de transição entre Mata Atlântica e Cerrado do distrito de Barão Geraldo (Campinas)...32 Tabela 7. Condições de cultivo para o preparo do inóculo dos micro-organismos alvo deste estudo...34 Tabela 8. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem e B. cereus...44 Tabela 9. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente ao B. cereus...45 Tabela 10. Atividade bacteriolítica (%) dos extratos de IB36A, BG11A, BG13D e BG13E sobre a bactéria B. cereus...47 Tabela 11. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de E. coli ATCC 11229...50 Tabela 12. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à de E. coli ATCC 11229...51
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Tabela 13. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de S. aureus ATCC6538...52 Tabela 14. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à linhagem de S. aureus ATCC 6538...53 Tabela 15. Atividade bacteriolítica (%) dos extratos de BG13D, BG5A, IB6A, IB36A, IB45B e BG13E sobre a bactéria S. aureus ATCC 6538...56 Tabela 16. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de S.
choleraesuis ATCC14028...57
Tabela 17. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima bactericida (MBC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à S. choleraesuis ATCC 14028...58 Tabela 18. Fungos com maior atividade antimicrobiana contra a linhagem de C. albicans ATCC10231...60 Tabela 19. Concentração mínima inibitória (MIC), concentração mínima fungicida (MFC) e efeito antimicrobiano dos extratos fúngicos frente à C. albicans ATCC 10231...61
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome BDA Potato Dextrose Agar
CMLB Coleção de Micro-organismos do Laboratório de Bioquímica da FEA-UNICAMP
CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquidas Químicas Biológicas e Agrícolas da Unicamp
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico DCA Departamento de Ciência de Alimentos
DNA Deoxyribonucleic Acid
DTA Departamento de Tecnologia de Alimentos DTAs Doenças Transmitidas por Alimentos
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FDA Food and Drug Administration
FEA Faculdade de Engenharia de Alimentos FES Fermentação em Estado Sólido
FS Fermentação Submersa HTS High Throughput Screening INT Cloreto de Iodonitrotetrazólio
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MIC Concentração Mínima Inibitória
xxii MFC Concentração Mínima Fungicida NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
OMS Organização Mundial da Saúde pH Potential of Hydrogen
RDC Resolução de Diretoria Colegiada RNA Ribonucleic Acid
SDA Secretaria de Defesa Agropecuária UFC Unidades Formadoras de Colônia UNICAMP Universidade Estadual de Campinas YMA Yeast Malt Agar
1 INTRODUÇÃO
Compostos bioativos são moléculas derivadas de fontes vegetais, animais ou microbianas que podem apresentar diferentes estruturas e atividades biológicas, possuindo um amplo espectro de aplicação. Embora o conhecimento científico destas moléculas tenha apenas se desenvolvido ao longo dos últimos 100 anos, a aplicação prática de produtos naturais é conhecida desde as culturas antigas, as quais utilizavam extratos vegetais e queijos mofados em tratamentos terapêuticos (ZERIKLY; CHALLIS, 2009). Atualmente, os produtos naturais representam uma valiosa fonte na descoberta de novos medicamentos e, juntamente com os seus derivados, contribuem com um terço dos medicamentos mais vendidos no mercado (ZHOU; LI; CHEN, 2010).
Segundo Demain (1999), os compostos naturais bioativos mais conhecidos são os antibióticos, que são definidos como metabólitos secundários produzidos por micro-organismos que inibem o crescimento de outros micro-micro-organismos. São amplamente empregados na medicina humana e veterinária, na fitopatologia e na preservação de alimentos. Sua descoberta foi, sem dúvida, um marco na melhoria e expectativa de vida no planeta. (AWAD et al., 2013). No entanto, atualmente, seu consumo indiscriminado tem gerado um problema eminente relacionado ao surgimento de micro-organismos resistentes aos antimicrobianos existentes (KAVITHA et al., 2010). Diante disso, novos compostos são objeto constante de busca.
A triagem de micro-organismos produtores de compostos antimicrobianos é uma alternativa viável para o descobrimento de novos antibióticos. Dentre eles, os fungos e os actinomicetos são os mais estudados (AWAD et al., 2013). Os fungos são metabolicamente versáteis (ARCHER et al., 2008) e têm se mostrado importantes fontes de compostos biologicamente ativos, derivados do seu metabolismo ou subprodutos deste (PELÁEZ, 2005).
A investigação por metabólitos fúngicos bioativos começou com o descobrimento da penicilina, produzida pelo Penicillium notatum, por Alexander Fleming. Desde então, a diversidade taxonômica de fungos é uma importante fonte a ser explorada na busca por novos compostos naturais bioativos de alto valor agregado (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011).
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Os biomas brasileiros Cerrado e Mata Atlântica são considerados uns dos ecossistemas de maior biodiversidade. A bioprospecção em regiões pouco exploradas e de grande diversidade biológica possibilita a coleta de variados gêneros fúngicos e, consequentemente, diferentes metabólitos secundários, permitindo o descobrimento de novos compostos bioativos e moléculas de grande interesse econômico.
Dentre as maiores causas de morte no mundo, a diarréia está em quinta posição e, na maioria das vezes é causada pelo consumo de alimentos contaminados (OMS, 2013). No Brasil, Salmonella sp. , Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Escherichia coli, são os agentes etiológicos associados aos maiores números de surtos de doenças transmitidas por alimentos (BRASIL, 2013). O mau uso terapêutico dos antibióticos e o consumo de carnes e alimentos com essas substâncias são os maiores contribuintes para o desenvolvimento de bactérias resistentes (GORBACH, 2001). Sendo assim, se faz necessário o descobrimento de novos compostos antimicrobianos eficientes, que possam ser aplicados na conservação de alimentos e no tratamento de infecções. Outro grande problema enfrentado são as infecções causadas por fungos, como a Candida albicans. O efeito tóxico e a falta de eficácia dos antifúngicos sintéticos existentes fazem necessário o descobrimento de novos antifúngicos naturais eficientes (JIANG; AN, 2000; SASIDHARAN et al., 2008).
Diante dos problemas expostos, o presente trabalho teve como objetivo selecionar linhagens de fungos filamentosos, isolados das Regiões de Cerrado e Mata Atlântica do Estado de São Paulo, com potencial para produção de compostos antimicrobianos. O trabalho desenvolvido é parte do Programa de Pesquisas em Caracterização, Conservação, Recuperação e Uso Sustentável da Biodiversidade do Estado de São Paulo (BIOTA-FAPESP) e esteve vinculado ao projeto coordenado pela Prof. Drª. Gabriela Alves Macedo, sob “Bioprospecção de fungos filamentosos e leveduras silvestres de distintos biomas do Estado de São Paulo visando à produção de enzimas, vitaminas de interesse industrial e compostos bioativos”.
3 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Compostos bioativos naturais
Segundo Biesalski e colaboradores (2009), os compostos bioativos podem ser definidos como compostos essenciais ou não ao funcionamento do organismo (como por exemplo, vitaminas e polifenóis), encontrados na natureza e que apresentam algum benefício à saúde humana ou animal, podendo apresentar atividade antimicrobiana, hipocolesterolêmica, imunossupressora, antitumoral, antioxidante e antiinflamatória (BIESALSKI et al., 2009). São moléculas orgânicas derivadas de vegetais, animais ou micro-organismos e representam o ponto crítico para o descobrimento de novos compostos bioativos. Desta forma, a avaliação terapêutica de substâncias químicas de fontes naturais tem sido estudada para diversos tipos de aplicações biológicas com o objetivo de isolar novos compostos bioativos (SU et al., 2007).
Devido ao seu potencial de aplicação nas áreas de alimentos, fármacos, indústria química e outros mercados, o interesse no desenvolvimento de bioprocessos para a sua produção e extração a partir de fontes naturais aumentou muito nos últimos anos e têm sido muito valorizada pela indústria. Muitos desses compostos bioativos são metabólitos secundários de plantas, fungos, bactérias, protozoários, insetos e animais. A propriedade bioativa dessas substâncias faz com que estas sejam isoladas e desempenhem um importante papel como uma das principais fontes de novos fármacos (STIERLE; STIERLE, 2000).
No século XX, o uso de metabólitos secundários microbianos e de plantas revolucionou a medicina. Estes foram responsáveis por dobrar a expectativa de vida, e diminuir sofrimento e dor (DEMAIN, 2014). Sendo possível citar moléculas como a Penicilina, o primeiro antibiótico, a Actinomicina D, utilizada no tratamento de tumores em crianças e a Estreptomicina, o primeiro antibiótico ativo contra a bactéria da tuberculose (DEMAIN, 2006). Estima-se que aproximadamente 50 % dos fármacos mais vendidos atualmente são compostos naturais ou compostos relacionados a produtos naturais (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2003; NEWMAN; CRAGG, 2007). Esta constatação comprova a importância dessas substâncias como fontes significativas para a obtenção de
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novos medicamentos, assim como, protótipos para síntese de novos fármacos (CARTER, 2011; CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013).
Os micro-organismos desempenham um papel fundamental na produção de compostos bioativos, os quais são representados principalmente pelos metabólitos secundários microbianos. Sua habilidade na produção desses componentes com diferentes estruturas químicas está relacionada particularmente a alguns grupos de micro-organismos, como as actinobactérias, as mixobactérias, espécies de Pseudomonas, as cianobactérias e os fungos filamentosos. Além disso, diferentes espécies são capazes de produzir diferentes compostos (CHAPLA; BIASETTO; ARAUJO, 2013; DONADIO et al., 2002). Isso significa que o estudo de uma grande diversidade genética de micro-organismos pertencentes aos grupos anteriormente citados possibilita o isolamento de diferentes compostos bioativos de interesse na indústria farmacêutica (humana e animal), alimentícia e agrícola.
1.1.1 Biomas Mata Atlântica e Cerrado e a obtenção de micro-organismos produtores de compostos bioativos
A bioprospecção é uma atividade exploratória que visa identificar componentes do patrimônio genético com potencial uso comercial, como organismos, genes, enzimas e compostos, sendo uma maneira de se extrair valor econômico da biodiversidade. Na bioprospecção de micro-organismos, a obtenção de uma grande variedade de metabólitos secundários bioativos se deve principalmente ao estudo de uma grande diversidade genética de culturas. Isso é possível através do isolamento de micro-organismos de diferentes áreas geográficas em que a biodiversidade ainda é mantida (KNIGHT et al., 2003).
Devido à sua grande extensão e localização, o território brasileiro exibe uma grande diversidade climática. Isso implica em uma variedade ecológica, que permite a diferenciação de regiões em biomas ou zonas biogeográficas (Figura 1). A biodiversidade é resultante da história evolucionária, e ela implica não somente na diversidade de espécies de plantas, como também de animais e até mesmo de micro-organismos (ALHO, 2008). A presença de diferentes biomas e nichos ecológicos no Brasil explica o fato dele abrigar mais de 20 % das espécies existentes no planeta (SILVA; CASTRO-GAMBOA; BOLZANI, 2010).
5
Figura 1. Mapa dos principais biomas brasileiros.
O Estado de São Paulo é formado basicamente pelos Biomas Mata Atlântica e Cerrado. Entretanto, segundo o Inventário Florestal do Estado de São Paulo de 2001, apenas 13,94 % do território paulista possui vegetação nativa (KRONKA et al., 2005), além de serem ecossistemas que possuem uma das maiores biodiversidades do mundo, com um grande número de espécies endêmicas e, devido a grande exploração dessas regiões, estão ameaçadas de extinção. Diante da importância em preservar a biodiversidade da Terra, principalmente em áreas ameaçadas de extinção, essas regiões foram identificadas e denominadas hotspots mundiais. No Brasil duas regiões obtiveram esta classificação: a Mata Atlântica e o Cerrado (MYERS et al., 2000).
Lançado em março de 1999, o programa BIOTA-FAPESP tem por objetivo caracterizar, conservar, restaurar e promover o uso sustentável da biodiversidade do Estado de São Paulo. Este tem desempenhado papel fundamental no mapeamento e na análise da biodiversidade distribuída nos ambientes paulistas, incluindo a fauna, a flora e os micro-organismos. Além disso, tem avaliado possibilidades de exploração sustentável desta
6
biodiversidade com potencial econômico e de subsidiar a formulação de políticas de conservação dos remanescentes florestais (BIOTA FAPESP, 2014).
O solo é um ecossistema de grande diversidade microbiana e representa uma importante fonte a ser explorada no isolamento de compostos biologicamente ativos (DONADIO et al., 2002). A interação entre os micro-organismos e este habitat pode influenciar no metabolismo microbiano (TAKAHASHI et al., 2008). O solo do Bioma Mata Atlântica é rico em nutrientes e possui elevada atividade de água (CRUZ et al., 2013). Já o Cerrado é caracterizado por clima seco com altas temperaturas, além de ser um solo pobre em nutrientes, porém com uma grande biodiversidade de plantas, animais e micro-organismos (GARCIA et al., 2007; MARQUES et al., 2004; NASCIMENTO et al., 2005). Essa baixa disponibilidade de nutrientes provavelmente cria um ambiente hostil aos micro-organismos que nele vivem, fazendo com que estes desenvolvam um metabolismo diferenciado, sendo possível a produção de novas moléculas com propriedades biológicas de interesse (LUCAS; DE CASTRO; TAKAHASHI, 2007).
Visto a importância da diversidade genética de micro-organismos na bioprospecção de compostos bioativos, o estudo de espécies isoladas em locais em que a diversidade biológica é preservada, pode ser o ponto crítico na descoberta de novos compostos bioativos e moléculas de interesse industrial. Alguns estudos realizados com micro-organismos isolados destas regiões, confirmam o potencial destes como novas fontes de compostos bioativos (Tabela 1).
1.2 Compostos bioativos com atividade antimicrobiana
Segundo Demain (1999), os compostos bioativos naturais mais conhecidos são os antimicrobianos e estes são definidos como produtos naturais orgânicos de baixa massa molecular, sintetizados por micro-organimos e, quando em baixas concentrações, inibem o crescimento de outros micro-organismos (DEMAIN, 2009; GUO et al., 2008). Podem ser classificados segundo seus efeitos antimicrobianos, espectros de atividades e mecanismos de ação. De acordo com o seu espectro de ação, os antimicrobianos são divididos em três categorias: amplo espectro, espectro intermediário e espectro reduzido. São moléculas com diferentes estruturas e mecanismos de ação. Atuam sobre o DNA, o RNA, na síntese de
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Tabela 1. Micro-organismos isolados nas regiões brasileiras de Cerrado e Mata Atlântica produtores de compostos bioativos e moléculas de alto valor agregado.
Micro-organismo Região do isolamento Composto isolado/ Bioatividade Referência Bactérias
Streptomyces sp. Cerrado (solo) Enzima – Protease (AZEREDO et al.,
2004)
Bacillus amyloliquefaciens Mata Atlântica
(solo)
Tipo de Bacteriocina antibacteriana
(LISBOA et al., 2006)
Streptomyces sp. Mata Atlântica
(solo) Extrato antibacteriano, antifúngico, antiviral e antitumoral (SACRAMENTO et al., 2004)
Streptoverticillium sp. Cerrado (solo) Metabólito com efeito
anti-inflamatório (CRUZ et al., 2013) Fungos filamentosos
Neosartorya spinosa Cerrado (solo) Enzima – Xilanase (ALVES-PRADO et al., 2010)
Periconea atropurpurea Cerrado (Xylopia aromática)
Enzima – Esterase (LISBOA et al., 2013) Metabólitos com atividade
citotóxica (Periconicina B) e antifúngica (TELES et al., 2006) Nigrospora cf. oryzae Cerrado (Stryphnodendron adstringens)
Extrato com atividade
antifúngica (CARVALHO et al., 2012)
Diaporthe cf. phaseolorum Extrato com atividade
anticâncer
Penicillium sp. Cerrado (solo) Metabólito secundário
antibacteriano e antifúngico (PETIT et al., 2009)
Mycelia sterilia, P. griseofulvum e P. aurantiogriseum Mata Atlântica (Spermacoce verticillata)
Metabólitos com atividade
antibacteriana (CONTI et al., 2012)
Penicillium sclerotiorum Cerrado (solo) Metabólito secundário antibacteriano (Esclerotiorina) (TAKAHASHI et al., 2008) Penicillium simplicissimum Metabólito secundário antibacteriano (Ácido penicílico)
Paecilomyces lilacinus Cerrado (solo)
Metabólitos secundários inibidor da AChE (Paecilomide) e antimicrobiano. (TELES; ATALIBA; TAKAHASHI, 2013; TELES; TAKAHASHI, 2013) Metarhizium spp.,
I. cateniannulata Cerrado (solo)
Metabólito tóxico ao vetor de Chagas (Triatoma infestans)
(ROCHA; LUZ, 2011)
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proteínas, na função da membrana plasmática, no transporte de elétrons, na esporulação, na germinação e muitos outros alvos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). São aplicados na medicina humana e veterinária, na agricultura, na conservação de alimentos e na suplementação de rações de aves e outros animais, como promotores de crescimento (DEMAIN, 2000).
Os agentes antimicrobianos também podem ser classificados quanto ao efeito causado por eles no crescimento dos micro-organismos. São chamados de bacteriostáticos ou fungistáticos aqueles que inibem o crescimento e multiplicação do micro-organismo, sem que haja morte das células. O mecanismo de ação dessas substâncias frequentemente ocorre através da sua ligação aos ribossomos, inibindo a síntese protéica. No entanto, quando a concentração do composto é reduzida, essa ligação se desfaz e os micro-organismos voltam a se multiplicar. Os compostos bactericidas ou fungicidas, não apenas impedem o crescimento microbiano, como também desencadeiam processos que levam as células microbianas à morte, sendo irreversíveis (BROCK et al., 2004). Em geral, atuam em alvos como parede celular, membrana plasmática ou DNA (BOOTHE, 2006).
Experimentalmente, a classificação do efeito de agentes antimicrobianos em bacteriostáticos/fungistáticos ou bactericidas/fungicidas podem ser determinadas in vitro por diferentes técnicas microbiológicas, dentre elas, o estudo da curva de morte microbiana e da concentração mínima bactericida/fungicida (MBC/MFC). A padronização dos métodos é importante para reprodutibilidade e o estudo clínico dos resultados. Desta forma, nas técnicas de determinação do efeito bactericida e fungicida (para leveduras) é utilizado como inóculo um número mínimo de micro-organismos de 5x105 UFC mL-1, inoculados entre 30 e 37 ºC e 18 e 24 h (PANKEY; SABATH, 2004).
A MBC/MFC é definida como a concentração mínima do composto antimicrobiano em que se observa uma redução microbiana de 99,9 %, ou de três unidades de log10, do inóculo inicial (PANKEY; SABATH, 2004). A classificação do efeito antimicrobiano de um composto é comumente fornecida através da relação existente entre a MBC ou MFC e a concentração mínima do composto capaz de inibir o crescimento do micro-organismo estudado (MIC). Quando a relação MBC:MIC, para as bactérias ou para os fungos, estiverem entre 1:1 ou até 2:1, o composto antimicrobiano em estudo é considerado bactericida/fungicida. Nos casos da relação ser maior que 2:1, o efeito antimicrobiano é
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classificado como bacteriostático/fungistático (HAFIDH et al., 2011). A determinação in vitro do efeito antimicrobiano em bacteriostático/fungistático e bactericida/fungicida fornece informações importantes do potencial de um agente antimicrobiano em estudo, porém é apenas um dos fatores necessários para prever a evolução clínica destes compostos.
1.2.1 Métodos para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos naturais
Diferentes metodologias podem ser empregadas na avaliação da atividade antimicrobiana de compostos naturais. Estas são divididas em dois grupos: métodos de difusão em ágar e métodos de diluição em caldo.
Os métodos de difusão em ágar são qualitativos. Baseiam-se no cultivo do micro-organismo alvo em um meio de cultura sólido e a substância a ser analisada é aplicada em discos de papel dispostos sobre o meio de cultura ou depositada em orifícios feitos no ágar. A difusão da substância no ágar produz uma zona ou halo de inibição quando o composto estudado apresenta potencial antimicrobiano e a atividade antimicrobiana é quantificada pela medida do raio das zonas de inibição (STRÖMSTEDT; FELTH; BOHLIN, 2014). As vantagens dos métodos de difusão em ágar são baixo custo e simplicidade de execução. Porém, estes métodos possuem limitações no estudo de um grande número de amostras e na determinação da concentração mínima inibitória da amostra (VOLK, 2008).
Os métodos de diluição em caldo são quantitativos e podem ser realizados de duas maneiras distintas, através da macro ou microdiluição. A macrodiluição envolve procedimentos em tubos de ensaios, enquanto que a microdiluição utiliza placas de microdiluição com múltiplos compartimentos (96 compartimentos em formato de U). Estes métodos consistem em inocular a suspensão do micro-organismo alvo em um meio de cultivo líquido contendo a substância a ser analisada. Após a incubação, o crescimento microbiano é avaliado pela turbidez do meio de cultivo provocada pelo crescimento microbiano, sendo mensurada através da leitura da densidade óptica (OSTROSKY et al., 2008). Muitos estudos têm utilizado a adição de sais de tetrazólio como indicadores de crescimento bacteriano para melhorar a detecção de atividade antimicrobiana (KLANCNIK et al., 2010). Os sais de tetrazólio atuam como aceptores de elétrons e, na presença de atividade microbiana, são
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reduzidos a produtos vermelhos de formazano (ELOFF, 1998). Nas situações de inibição do crescimento microbiano, a solução dentro do compartimento da microplaca se manterá clara após a adição do reagente. Como descrito, tal reação pode ser observada na Figura 2.
Figura 2. Microplaca de 96 compartimentos antes (a) e depois (b) da adição do reagente cloreto de iodonitrotetrazólio (INT), em que na presença de atividade microbiana a solução dentro do compartimento se torna vermelha.
A microdiluição tem sido amplamente utilizada na avaliação da atividade antimicrobiana de diferentes compostos. Isso se deve as vantagens que esta metodologia apresenta: (1) baixo custo quando comparada à macrodiluição, (2) boa reprodutibilidade, (3) é mais sensível que os outros métodos citados, (4) requer uma pequena quantidade de amostra e (5) permite o estudo de várias amostras de uma só vez (ELOFF, 1998). No estudo da atividade antimicrobiana de um grande número de amostras é desejável que o método empregado seja simples, rápido, de baixo custo e reprodutível (KLANCNIK et al., 2010). Desta forma, uso da técnica de microdiluição na bioprospeção de compostos antimicrobianos naturais é vantajosa.
1.2.2 Pesquisa de novos antimicrobianos naturais e sua importância
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), doenças infecciosas são aquelas que podem ser transmitidas pelo contato direto entre pessoas, ou de forma indireta, causadas por micro-organismos patogênicos através do contato com alimentos, objetos ou ambientes contaminados. Com a descoberta do antibiótico, acreditou-se que ocorreria a erradicação das
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doenças infecciosas (SPÍŽEK et al., 2010). Porém, dados recentes demonstram que, entre os anos de 2000 e 2011, as doenças infecciosas continuam sendo uma das dez maiores causas de morte no mundo (OMS, 2013). Isso se deve principalmente à seleção de micro-organismos mais resistentes, devido ao consumo indiscriminado de antibióticos em tratamentos terapêuticos, assim como, o consumo de carnes, leite, ovos e outros alimentos com essas substâncias, utilizadas, na alimentação animal como promotores de crescimento e na conservação de alimentos (NIKAIDO, 2009). O desenvolvimento de resistência pelos patógenos, a toxicidade de alguns antibióticos, a existência de bactérias naturalmente resistentes e o surgimento de novas doenças, fazem da busca por novos compostos antimicrobianos, com diferentes modos de ação, uma pesquisa incessante (DEMAIN, 2006).
A importância científica dos metabólitos secundários com atividade antimicrobiana apresentou expansão na década de 1940 com o impacto do descobrimento da penicilina à saúde humana. A penicilina, descoberta acidentalmente por Fleming em 1928, é produzida pelo fungo Penicillium notatum e a sua produção em larga escala marca o surgimento da indústria farmacêutica, e consequentemente, o desenvolvimento de outros antibióticos. A “era de ouro dos antibióticos” ocorreu entre os anos 1940 e 1980 e foi marcada pelo grande número de antibióticos descobertos em um ritmo surpreendente. Penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, aminoglicosídeos, cloranfenicol e macrolídeos são as classes de antibióticos de maior importância que surgiram durante essa fase. Entretanto, após o ano de 1980, o ritmo da descoberta de novos antibióticos sofreu uma grande desaceleração, e a descoberta de novos compostos no século XXI é ainda menor (DEMAIN, 2014). Isso é devido ao desestímulo de companhias farmacêuticas no desenvolvimento de novos antibióticos, cujo processo: (1) demanda longos estudos pré-clínicos e clínicos, (2) possui um tempo reduzido de venda antes da expiração das patentes, permitindo que companhias de medicamentos genéricos forneçam esses medicamentos e (3) são fármacos utilizados em um curto período, diferentemente daqueles cujos pacientes fazem uso diário, como por exemplo, no controle de colesterol, asma e humor (PEALÉZ, 2005; DEMAIN, 2014; WRIGHT, 2014).
Em geral, os antibióticos podem ser produtos naturais (isolados de plantas, animais ou micro-organismos), compostos semi-sintéticos (sintetizados a partir de produtos naturais) ou sintéticos (sintetizados quimicamente com base na estrutura química de antibióticos naturais). Dentre esta classificação, alguns antibióticos podem ser citados como exemplos de
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antibióticos naturais, como a penicilina, a cefalosporina, a estreptomicina, a eritromicina e a vancomicina. No caso dos antibióticos semi-sintéticos, a clindamicina, a quinupristina, a dalfopristina e a dalbavancina são representantes desta classe. E quanto aos antibióticos sintéticos, podem ser citados os compostos isoniazida, trimetropim e metronidazol (DEMAIN, 2009; GUIMARÃES; MOMESSO; PUPO, 2010).
A exploração de novos antibióticos naturais é um desafio que demanda tempo e elevados custos. A indústria farmacêutica tem em grande parte abandonado estes compostos em favor do grande número de moléculas sintéticas já conhecidas e descritas na literatura (WRIGHT, 2014). Porém, os antibióticos naturais possuem algumas características que fazem a busca dessas moléculas necessária. São moléculas originais, com uma imensa diversidade de estruturas químicas e atividades biológicas. A complexidade desses compostos permite que possuam diferentes modos de ação inibitória sobre os micro-organismos alvos e os antibióticos de origem microbiana possuem propriedades privilegiadas de penetração na célula microbiana e afinidade por alvos bacterianos (WITTING; SÜSSMUTH, 2011; WRIGHT, 2014). Além disso, atualmente os órgãos legisladores da produção de alimentos e os consumidores demonstra uma progressiva afinidade pelo consumo de produtos naturais, demonstrando a importância na busca por novos antibióticos naturais. Segundo a consultora internacional IMS Health Intelligence Applied o mercado farmacêutico global espera ver até 2020 uma mudança contínua em direção aos fármacos naturais. O mercado brasileiro atingirá 87 bilhões de reais em vendas, refletindo assim a importância da descoberta de compostos naturais com atividades biológicas (GATYAS; SAVAGE, 2010). As técnicas conhecidas como High Throughput Screening (HTS) são popularmente empregadas na obtenção de novos compostos biologicamente ativos. Estas permitem o estudo de um grande número de amostras por vez e podem ser utilizadas no estudo de novos antibióticos naturais, reduzindo tempo e custos da pesquisa e aumentando o número de compostos obtidos para testes pré-clínicos (MISHRA et al., 2008).
Diante da importância e necessidade de novos antimicrobianos naturais, e devido à falta de apoio governamental às indústrias farmacêuticas no desenvolvimento destes compostos, restam aos institutos de pesquisas o estudo e seleção de novas fontes de compostos antimicrobianos, assim como novos antimicrobianos naturais, seus modos de ação, aplicação, segurança e purificação.
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1.2.3 Estratégias na prevenção de desenvolvimento de micro-organismos resistentes
O mau uso terapêutico dos antibióticos e o uso destes compostos na alimentação animal (como promotores de crescimento) são os maiores contribuintes para o desenvolvimento de bactérias resistentes (GORBACH, 2001). A administração contínua de certos antibióticos em pequenas concentrações à ração de animais proporciona aumento significativo do ganho de peso e previne o desenvolvimento de doenças em animais. Porém, a presença de resíduos dessas substâncias em produtos para alimentação humana tem gerado riscos à saúde pública, tornando certos antibióticos ineficientes no combate a determinadas bactérias (LATHERS, 2001). A União Européia proibiu o uso de antibióticos como promotores de crescimento desde janeiro de 2006. O Brasil com o objetivo de se adequar às regras estabelecidas pela União Européia (um dos maiores consumidores de carne brasileira) e preocupado com as questões de saúde pública, lança o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes em carnes (bovina, aves, suína e equina), leite, pescado, mel e ovos. A qualidade destes produtos é regulamentada pela Instrução Normativa SDA nº 11, do MAPA de 07 de maio de 2014, para o exercício no ano da publicação (BRASIL, 2014). Além disso, com a finalidade de evitar o mau uso terapêutico dos antibióticos e restringir o consumo indiscriminado dessas substâncias, a Anvisa determina como sendo obrigatório a apresentação de prescrição médica de antibióticos na compra destas substâncias. A RDC nº 20/2011 prevê a nova norma que regulamenta a venda de antibióticos no Brasil (BRASIL, 2011).
1.3 Fungos filamentosos
1.3.1 Características e importância
Durante muito tempo os fungos foram classificados no Reino vegetal. Características como ausência de celulose na parede celular (exceto no caso de fungos aquáticos), ausência de clorofila e incapacidade de armazenar amido como fonte de reserva diferenciam os fungos das plantas (TRABULSI; TOLEDO; LEMOS, 2008). Por isso, a partir do ano de 1969, os fungos foram classificados em um novo grupo, o Reino Fungi. Dentro do Reino Fungi existe
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uma grande variedade ecológica, fisiológica e morfológica de organismos que podem ser diferenciados em três grupos distintos, ou seja, leveduras, fungos filamentosos e cogumelos. Algumas características são intrínsecas desses organismos. São organismos eucarióticos, heterotróficos, com presença de quitina na parede celular e quase todos aeróbios. São capazes de se desenvolver em condições hostis de crescimento como baixo pH, alta pressão osmótica, baixo teor de umidade e metabolizar substratos complexos. A capacidade destes organismos em produzir diferentes enzimas permite que o material orgânico seja degradado e os nutrientes resultantes sejam absorvidos. Além disso, são capazes de se adaptar a diversas condições de crescimento, o que permite que estes estejam amplamente distribuídos no ambiente (AZEVEDO, 1997; ESPOSITO; AZEVEDO, 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2005; MUELLER; SCHMIT, 2007).
A compreensão do metabolismo ou mecanismo de ação de alguns fungos permitiu o uso destes seres vivos em muitos processos industriais, como nas áreas química, farmacêutica e de alimentos, que são de grande importância na sociedade. Dentro deste contexto, os fungos são utilizados em processos biotecnológicos para a obtenção de produtos como antibióticos, enzimas, vitaminas, polissacarídeos e pigmentos (DEMAIN, 1999). A levedura
Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, é amplamente empregada em escala industrial para a
produção de pães e bebidas alcoólicas. O Aspergillus niger é explorado para a produção de ácido cítrico e enzimas como: α-amilase, celulase, lipase e protease (BENNETT, 1998; JIANG; AN, 2000; MEYER, 2008). Na indústria farmacêutica, muitos medicamentos foram obtidos do metabolismo secundário de fungos.
1.3.2 Metabólitos bioativos de fungos
O metabolismo fúngico pode ser dividido em primário e secundário. O primeiro corresponde às reações químicas que formam produtos essenciais para o crescimento, desenvolvimento e reprodução desses organismos. Já o segundo, não é indispensável ao crescimento e sobrevivência do organismo. Os metabólitos secundários são sintetizados a partir de um ou mais produtos primários em várias rotas biossintéticas e muitos são biologicamente ativos (DEMAIN; ADRIO, 2008). Em geral, são produtos orgânicos de baixa
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massa molecular, específicos de cada espécie, com grande variedade estrutural (WILLIAMS et al., 1989). Esses compostos podem ser derivados de aminoácidos, peptídeos não ribossomais, policetídeos, ácidos graxos e híbridos de policetídeos-peptídeos (KEMPKEN; ROHLFS, 2010; ROZE; CHANDA; LINZ, 2011).
Os fungos são conhecidos como produtores de uma grande variedade de metabólitos secundários. A importância da síntese desses compostos ainda não está bem esclarecida, porém, segundo Demain (1996), esses metabólitos podem exercer funções importantes nos organismos que os produzem, como hormônios sexuais, armas competitivas contra bactérias, fungos, amebas, insetos e plantas, agentes de simbiose e efetores de diferenciação. Apresentam importante papel na indústria farmacêutica, alimentícia, agrícola e veterinária e condições da cultura, período de incubação, pH do meio, nutrientes e temperatura afetam a produção destes compostos (DEMAIN, 1996). Portanto, parâmetros como estes podem ser otimizados com o objetivo de aumentar a produtividade desses compostos de interesse industrial.
Segundo os autores Brakhage e Schroeckh (2011), estima-se que 23 000 produtos microbianos bioativos já foram isolados. Desse total, 42 % desses compostos bioativos são produzidos por linhagens do Reino Fungi (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011), sendo a classe dos Ascomicetos a mais envolvida. Os gêneros Aspergillus e Penicillium são responsáveis pela produção de aproximadamente 6 500 desses metabólitos (SURYANARAYANAN et al., 2009; TAKAHASHI; LUCAS, 2008).
O isolamento de metabólitos fúngicos teve início há muitos anos e esta prática ainda continua ativa (ARCHER; CONNERTON; MACKENZIE, 2008; SUN et al., 2011). A prospecção de metabólitos fúngicos é vantajosa quando se compara às demais fontes, porém o isolamento desses compostos a partir de plantas, algas, anfíbios e insetos podem causar sérios danos ao ecossistema. No caso dos fungos, estes podem ser cultivados em larga escala em fermentadores, ocupando um pequeno espaço e não oferecendo prejuízos à natureza. Outra vantagem observada é que os fungos se adaptam facilmente à mudanças ambientais de crescimento, permitindo que a cultura seja transportada da natureza para o laboratório (DEMAIN; ADRIO, 2008). Além disso, com exceção dos insetos, os fungos são os mais numerosos seres vivos existentes. Estima-se que existam aproximadamente 5,1 milhões de espécies e que apenas 99 000 tenham sido reportadas na literatura, o que implica que 98 %
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das espécies fúngicas existentes ainda podem ser descobertas e exploradas (BLACKWELL, 2011; MYOBATAKE et al., 2014). Além disso, estima-se que aproximadamente 10 % da diversidade mundial de fungos ocorra no Brasil (LEWINSOHN; PRADO, 2005). Desta forma, a biodiversidade e a habilidade dos fungos em produzir diversos metabólitos secundários fazem desses micro-organismos importantes fontes a serem exploradas no isolamento de novos compostos bioativos e moléculas de interesse econômico.
1.3.3 Cultivo e produção de compostos bioativos
Os fungos são micro-organismos metabolicamente versáteis e suas diferentes condições de cultivo influenciam na biossíntese de metabólitos secundários. A literatura demonstra que diferentes condições já foram exploradas na produção de compostos bioativos por fungos filamentosos (ARCHER; CONNERTON; MACKENZIE, 2008).
A fermentação submersa (FS) é um processo fermentativo que ocorre em situações de excesso de água e, de acordo com a literatura, é o mais empregado na indústria para produção de metabólitos secundários por fungos filamentosos, principalmente por facilitar processos em larga escala (GIBBS; SEVIOUR; SCHMID, 2000; LE KER et al., 2011). Porém, os fungos filamentosos se desenvolveram, na maior parte da história evolucionária, em ambientes terrestres, consequentemente, o cultivo destes micro-organismos em meio líquido pode reduzir sua eficiência metabólica destes (HÖLKER; HÖFER; LENZ, 2004).
A fermentação em estado sólido (FES) é designada como um processo que utiliza materiais sólidos como fonte de nutrientes, sendo que estes suportes físicos podem ser de diferentes naturezas. A produção de metabólitos secundários por FES permite a obtenção de um produto mais concentrado (ROBINSON; SINGH; NIGAM, 2001). Como exemplo, a produção de antibióticos nesta condição de cultivo está associada com elevados rendimentos em curto período de tempo de cultivo, quando comparada à FS (BIGELIS et al., 2006). A grande produção agroindustrial do Brasil é responsável pela geração de grandes quantidades de resíduos, os quais podem ser explorados para outras finalidades, como substratos da FES para produção de compostos bioativos (NIGAM, 2009; LOPES et al., 2012). As vantagens do
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uso destes resíduos são o baixo custo destas matrizes, a abundância com que são encontrados e diminuição dos prejuízos ambientais (LOPES et al., 2012).
O cultivo em superfície de ágar é o método mais utilizado no isolamento, seleção, cultivo e conservação de micro-organismos. Além disso, muitos trabalhos têm demonstrado o potencial deste método de cultivo na produção de metabólitos bioativos (ADELIN et al., 2011; CARVALHO et al., 2012; LE GOFF et al., 2013; LE KER et al., 2011). Alguns dos benefícios são os maiores rendimentos e a obtenção de uma grande variedade de metabólitos (Tabela 2). No estudo com o fungo endofítico Chaetomium globosum JN11454, por exemplo, isolado da folha de uma planta medicinal egípcia, foi avaliada sua atividade biológica quando cultivado em diferentes meios. Cinco meios foram analisados: aveia, arroz, caldo yeast malt glicose, ágar batata dextrose (PDA) e meio Czapek. O extrato do fungo C. globosum cultivado em PDA demonstrou ser o mais promissor na obtenção de compostos bioativos antioxidante, anticâncer e antimicrobianos (SELIM et al., 2014). Outros trabalhos, utilizando este meio de cultivo na produção de compostos bioativos também demonstraram bons resultados (CARVALHO et al., 2012; LIN et al., 2010).
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Tabela 2. Vantagens do cultivo de fungos em superfície de ágar com relação à FS e FES (adaptada de ADELIN et al., 2011).
Parâmetros FS Cultivo em superfície de
ágar FES
Substrato
Substrato solúvel, composição
controlada
Substrato solúvel, composição controlada
Substrato insolúvel, composição não
controlada Esterilização Eficiente Eficiente Ineficiente Consumo de água Elevado consumo Consumo limitado Consumo limitado
Aquecimento Fácil controle Fácil controle Baixa transferência de calor Oxigênio Elevado consumo Baixo consumo Baixo consumo Produção em alta escala Fácil Não disponível Ineficiente
Inóculo Homogêneo e fácil Homogêneo e fácil Heterogêneo
Consumo de energia Alto Baixo Baixo
Rendimento da produção
de metabólitos bioativos Baixo Moderado Moderado Concentração de
metabólitos bioativos Baixa Alta Alta
1.3.4 Principais antibióticos produzidos por fungos filamentosos
1.3.4.1 β-Lactâmicos
As moléculas deste grupo representam os antibióticos naturais de maior importância na história da medicina, sendo os primeiros utilizados no tratamento terapêutico de infecções
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bacterianas. Caracterizam-se por uma estrutura central, denominada núcleo, o anel β-lactâmico. A origem do grupo β-lactâmico permite classificar essas moléculas em: penicilinas, cefalosporinas, carbapens e compostos β-lactâmicos monocíclicos (TAHLAN; JENSEN, 2013). O mecanismo de ação dessas moléculas é pela inibição das transpeptidases, enzimas responsáveis pela síntese das ligações transversais entre cadeias de peptideoglicano. A construção da parede celular pode ser comprometida, tornando a membrana celular frágil, e pode ocorrer a lise (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
A penicilina G (Figura 3 (1)), isolada inicialmente a partir do fungo Penicillium
notatum, foi o primeiro antibiótico β-lactâmico introduzido no mercado no ano de 1940. Dez
anos mais tarde, outro antibiótico deste grupo foi isolado, a cefalosporina C (Figura 3 (2)), produzida pelo fungo Cephalosporium acremonium. Atualmente, P. chrysogenum e
Acremonium chrysogenum são as espécies utilizadas para a produção destes antibióticos,
respectivamente. O maior problema enfrentado pelos β-lactâmicos neste momento é o desenvolvimento de bactérias resistentes a estes compostos, devido à produção de enzimas que hidrolisam esses antibióticos (β-lactamases) (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011).
1.3.4.2 Griseofulvina
Um dos primeiros antifúngicos naturais, a griseofulvina (Figura 3 (3)), é pertencente ao grupo dos policetídeos e é produzida pelo fungo P. griseofulvum. Possui efeito fungiostático e é utilizada no tratamento de infecções da pele, cabelo e unhas causadas por
Epidermophyton floccosum e espécies de Microsporum e Trichophyton. O mecanismo de ação
deste antifúngico é através da ligação com tubulinas, proteínas que formam os microtubos, interferindo na função destas estruturas e impedindo a mitose (ALY; DEBBAB; PROKSCH, 2011; CHADEGANIPOUR; NILIPOUR; HAVAEI, 2004; CORVIS et al., 2006).
Além do fungo P. griseofulvum, outras espécies já foram descritas como produtoras de griseofulvina, P. patulum, P. urticae, P. nigricans, P. sclerotigenum e Aspergillus versicolor são algumas delas. Os fungos produtores deste composto já foram isolados em diversos ecossistemas. Como exemplo, a espécie P.waksmanii, isolada do ambiente marinho (PETIT et
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al., 2004) e a cepa Xylaria sp. strain F0010, fungo endofítico isolado de Abies holophylla (PARK et al., 2005).
1.3.4.3 Ácido Fusídico
O ácido fusídico (Figura 3 (4)), isolado da fermentação de Fusidium coccineum, é um antibiótico de espectro reduzido, capaz de inibir bactérias Gram-positivas (COLLIGNON; TURNIDGE, 1999; FALAGAS; GRAMMATIKOS; MICHALOPOULOS, 2008). É utilizado no tratamento de infecções causadas por S. aureus e o seu mecanismo de ação é através da inibição da síntese protéica (MUSMADE et al., 2013). É classificado quanto a sua estrutura química como um antibacteriano esteróide (ANDERSON, 1980). Estudos in vitro demonstraram esse composto sendo mais eficaz que outros antibióticos, no tratamento de infecções causadas por S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) (GUENTHNER; WENZEL, 1984).
1.3.4.4 Equinocandinas
As equinocandinas representam a mais nova classe de drogas aprovadas, utilizadas no tratamento de infecções fúngicas (BAUER; BRÖNSTRUP, 2014). A equinocandina B (Figura 3 (5)), produzida pelos fungos A. nidulans var. echinolatus, A. nidulans var. roseus e A.
rugulosus, foi o primeiro tipo de equinocandina natural isolada. O mecanismo de ação destes
compostos é através da inibição não competitiva da enzima β- l, 3-glucano-sintetase, a qual impede a formação de β-glucanos, componente essencial da parede celular de alguns fungos, resultando em instabilidade osmótica e lise celular. O modo de ação nas paredes celulares de fungos torna esses antifúngicos pouco tóxicos às células humanas (KATHIRAVAN et al., 2012). Em geral, a estrutura química dos compostos pertencentes a este grupo baseia-se em hexapeptídeos cíclicos ligados a uma cadeia lateral alifática de diferentes comprimentos (CHEN et al., 2013). As equinocandinas são fungicidas contra Candida sp., e fungistática contra algumas espécies de Aspergillus e Pneumocystis carynii, não sendo ativas contra
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(EMRI et al., 2013). Outras equinocandinas naturais são conhecidas, entre elas a Pneumocandina B0, produzida pelo fungo Glarea lozoyensisc, a qual juntamente com a equinocandina B, deram origem a alguns antibióticos semi-sintéticos: Caspofungina, primeira equinocandina semi-sintética aprovada, Anidulafungina e Micafungina (ALY; DEBBAD; PROKSCH, 2011).
1.3.4.5 Sordarinas
As sordarinas (Figura 3 (6)) representam uma classe de compostos antifúngicos, os quais inibem a síntese protéica de fungos (VICENTE et al., 2009). São glicosídeos diterpênicos tetracíclicos, primeiramente isolados da fermentação por Sordaria araneosa, efetivos contra cepas de C. albicans, C. tropicalis, C. kefir e Cryptococcus neoformans, e algumas cepas de fungos filamentosos, como Aspergillus spp., Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis e Coccidioides immitis (MISIEK;
HOFFMEISTER, 2007).
1.3.4.6 Esclerotiorina
Os policetídeos representam uma classe de metabólitos secundários produzidos por diversos organismos, inclusive pelos fungos. Apresentam uma das maiores diversidades estruturais entre os produtos naturais, incluindo polifenóis, polienos e macrolídeos (SIMPSON; COX, 2012). A maioria destes compostos está relacionada a alguma atividade biológica, entre elas, atividade antibacteriana e antifúngica (PASTRE et al., 2007).
A esclerotiorina (Figura 3 (7)) é um policetídeo pertencente à classe das azafilonas e é relatada na literatura por possuir várias propriedades biológicas (CHIDANANDA; SATTUR, 2007). É produzida por diferentes espécies de fungo, como por exemplo, pelas cepas de P.
frequentans e P. sclerotiorum. No estudo da esclerotiorina produzida por P. frequentans essa
molécula demonstrou boa atividade antibacteriana e potente inibição da aldose redutase, enzima envolvida em sérias complicações do diabetes (CHIDANANDA; RAO; SATTUR, 2006). Com relação à espécie P. sclerotiorum, nos estudos de Lucas, Castro e Takahashi
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(2007) e Takahashi et al. (2008) que mostram a atividade antimicrobiana de fungos isolados do solo do Cerrado brasileiro, a espécie P. sclerotiorum apresentou uma das melhores atividades, sendo capaz de inibir as cepas de E. coli, S. aureus, Salmonella typhimurium,
Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes e C. albicans. A bioatividade foi relacionada
a alguns metabólitos isolados, entre eles a esclerotiorina (LUCAS; CASTRO; TAKAHASHI, 2007; TAKAHASHI et al., 2008). Este composto possui efeito bacteriostático sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas e atividade antifúngica (BAO et al., 2010), o que sugere que esta molécula possua amplo espectro de atividade.
1.3.4.7 Peptídeos com ação antibiótica
Os peptídeos-antibióticos são metabólitos secundários bioativos produzidos exclusivamente por fungos filamentosos, sendo estes na maioria dos casos pertencentes aos gêneros Trichoderma, Acremonium, Paecilomyces e Emericellopsis (DEGENKOLB et al., 2003; MARIK, et al., 2013). Essas moléculas são definidas como peptídeos lineares, com massa molecular entre 500 e 2 200 Da (entre 5 e 21 resíduos de aminoácidos), contendo aminoácidos incomuns, como ácido α-aminobutírico e isovalina, devido a biossíntese destes peptídeos ser não ribossomal (DEGENKOLB; KIRSCHBAUM; BRÜCKNER, 2007). O interesse nestas moléculas é devido à necessidade de novos antibióticos e da capacidade delas possuírem também outras atividades biológicas (CARROUX et al., 2013). Segundo estudos, os peptídeos antibióticos são capazes de formar poros na bicamada lipídica das membranas, podendo possuir atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral e antiparasitária (DEGENKOLB et al., 2003; SHI et al., 2012).
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Figura 3. Estrutura química dos antibióticos penicilina G (1), cefalosporina C (2), griseofulvina (3), ácido fusídico (4), equinocandina B (5), sordarina (6), esclerotiorina (7) e ácido kójico (8).
