UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
GABRIELA BORTOLANÇA CHIAROTTO
EMPREGO DE RILUZOL, TEMPOL E CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS NO TRATAMENTO DA ESCLEROSE
LATERAL AMIOTRÓFICA EM CAMUNDONGOS SOD1
G93ACAMPINAS 2018
GABRIELA BORTOLANÇA CHIAROTTO
EMPREGO DE RILUZOL, TEMPOL E CÉLULAS-TRONCO
MESENQUIMAIS NO TRATAMENTO DA ESCLEROSE
LATERAL AMIOTRÓFICA EM CAMUNDONGOS SOD1
G93ATese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural na Área de Anatomia.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira
CAMPINAS 2018
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA GABRIELA BORTOLANÇA CHIAROTTO E ORIENTADA PELO PROF DR ALEXANDRE LEIE RODRIGUES DE OLIVEIRA
Campinas, 26 de janeiro de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira
Profa. Dra. Rosalia Mendez-Otero
Prof. Dr. Rui Seabra Ferreira Junior
Prof. Dr. Marcondes Cavalcante França Junior
Profa. Dra. Claudia Vianna Maurer Morelli
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
“Ao meu pai José Mário Chiarotto, aquele que não me deixou desistir
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por colocar em meu caminho pessoas do bem que sempre tem algo a somar em minha vida pessoal e profissional.
Aos meus pais José Mario e Eva, minha irmã Marcela e meu sobrinho e amor da minha vida José Victor por serem minha base e sustento, fazendo o possível e o impossível para que eu pudesse estar aqui hoje. Mesmo sem entender muito sobre o que faço, obrigada por me apoiarem e me incentivarem sempre e com esse amor incondicional.
Ao meu orientador Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira por ser esse ser humano ímpar em minha vida. Gratidão por todo conhecimento, ensinamento, “puxões de orelha”, amizade e acima de tudo por confiar e acreditar na minha capacidade. Muito mais que meu orientador, meu “pai científico”, ao lado do qual pretendo caminhar sempre. Obrigada pelo privilégio e honra de ser sua orientanda e poder ter além de um excelente pesquisador e profissional, um exemplo de ser humano para minha vida.
Gratidão especial aos meus amigos/irmãos Luciana e Matheus pela amizade, risadas e companheirismo dentro e fora do laboratório todos esses anos. Agradeço imensamente por terem cuidado e realizado meus experimentos durante o estágio BEPE com carinho e dedicação. Com toda certeza, sem vocês, hoje seria impossível estar aqui! Sei que sou “trabalhosa”, mas agradeço sempre por todo apoio e suporte perante os problemas pessoais que passei. Amo vocês.
Gratidão especial também a Natália e Mateusinho pela amizade, carinho, comilanças, parceria nas madrugadas de trabalho e, principalmente pela colaboração nos experimentos árduos de microscopia eletrônica. Vocês somaram muito nesse trabalho.
A Aline Spejo minha amiga/irmã e parceira de experimentos no PCR. Obrigada por todo carinho, amizade e colaborações durante todos esses anos. Amo você.
Obrigada a Danielle, pela amizade, conselhos, troca de experiências e pelas discussões de resultados e auxílio com as estatísticas.
As minhas queridas Profa. Dra. Fernanda S. Mendonça, Profa. Dra. Glaucia M. T. dos Santos, e Lia Mara Neves
por acompanharem minha carreira acadêmica desde a graduação, sempre me apoiando, incentivado e torcendo pelo meu sucesso. Gratidão pela amizade e carinho de sempre. Se hoje estou aqui, com toda certeza minhas inspirações foram vocês.Amo vocês!
As minhas amigas Ana Laura, Marcella, Mayara, Joyce e Juliana, e meus familiares que sempre me apoiaram e torceram pelo meu sucesso. Gratidão por me fazerem rir nos momentos de descontração e enxugarem minhas
lágrimas quando necessário. Mesmo nos bastidores vocês foram essências para que tudo isso fosse realizado Amo vocês.
As minhas “irmãs” da vida que moram ou moraram comigo na república durante esses sete anos de Campinas, obrigada pelo companheirismo, risos e suporte em tudo sempre. Em especial a Petra, minha mãe/irmã/amiga por tudo que fez e faz por mim, pelo amor e amizade verdadeiros. A Ellen e Vanessa por rirem e chorarem comigo e por me aguentarem e me fornecerem todo apoio e suporte nessa etapa de final de tese.
A todos os alunos que passaram pelo laboratório de regeneração nervosa durante todos esses anos pelo convívio, troca de experiências e momentos de descontração. Em especial a Suzana e Patrícia.
Aos membros da minha banca pelo aceite do convite e pelo enriquecimento da minha tese. Em especial a Profa Dra. Rosália pela colaboração e suporte com a linhagem animal utilizada nesse projeto, ao professor Dr. Marcondes pela colaboração e auxílio no fornecimento do riluzol e a Profa Dra Ângela Cristina Malheiros Luzo pela doação das células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo, utilizadas no projeto. Gratidão!
A minha “família italiana” Dra. Caterina Bendotti, Giovanni, Chiara, Massimo, Giulia, Roberta, Francesca, Alessandro e António pelos seis meses de aprendizado científico, pelo carinho e reconhecimento, pela felicidade de trabalhar e conviver com vocês e por terem feito parte do meu crescimento científico e pessoal. Obrigada a todos os amigos e funcionários do Instituto Mário Negri (Milão) pela hospitalidade e carinho durante meu estágio.
A equipe de suporte técnico da Life Technologies e a Fernanda da Agilent por todo suporte científico e atenção com os experimentos e técnica RT-qPCR.
A todos os professores, funcionários e alunos do departamento de Biologia Celular e Estrutural pela amizade, convivência e conhecimentos adquiridos durante todos esses anos.
A Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Biologia Celular e Estrutural pela oportunidade de desenvolver minha pesquisa.
A FAPESP pela bolsa concedida durante o doutorado (processo número: 2013/16168-8) e estágio BEPE (processo número: 2017/02895-6, e auxílio financeiro para realização do projeto bem como os recursos utilizados para apresentação deste trabalho em congressos.
RESUMO
A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda seletiva e progressiva de neurônios motores na medula espinal, tronco encefálico e córtex motor. Resulta em progressiva atrofia e consequente paralisia muscular, levando o paciente a óbito, geralmente entre 2 a 5 anos após o início dos sintomas. Apesar de sua etiologia ser complexa e pouco conhecida, acredita-se que, a exemplo do que ocorre em outras doenças neurodegenerativas, o mecanismo patológico subjacente da ELA seja um conjunto de alterações celulares e bioquímicas que acabam por desencadear a degeneração dos motoneurônios. Apesar do resultado final da doença ser a morte neuronal, sabe-se hoje que a ELA é uma doença não autônoma com participação ativa de astrócitos, micróglia e células T como protagonistas da neuroinflamação, um dos principais e mais evidentes mecanismos patogênicos envolvidos na doença. O tratamento farmacológico com riluzol não é curativo e exerce pouco efeito na prorrogação da sobrevida dos pacientes. Assim, é de máxima importância o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas visando promover melhor qualidade de vida aos pacientes. Como alternativa, existe a perspectiva do uso de nitróxidos cíclicos como o tempol, uma vez que são antioxidantes multifuncionais que apresentam baixa toxicidade em animais experimentais. Além de terapias farmacológicas, ouso de células-tronco vêm sendo fortemente investigado, buscando efeitos imunomodulatórios e neuroprotetores. O objetivo deste estudo foi verificar se a interação entre riluzol, tempol e células-tronco mesenquimais apresenta potencial terapêutico em camundongos transgênicos SOD1G93A. Os tratamentos tiveram início na fase assintomática da doença (10a semana). O tratamento com riluzol (8mg/kg) e tempol (50mg/kg) foi realizado em dias alternados até a 14° semana e, a partir daí, até o estágio final da doença, duas vezes por semana. Já a aplicação sistêmica (1x105) de células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) derivadas de tecido adiposo, ocorreu uma única vez. Os animais foram eutanasiados na 14a semana (estágio inicial dos sintomas - EIS) e no estágio final (EF) da doença para a coleta das amostras e análise dos dados. A medula lombar dos animais foi dissecada e processada para as seguintes técnicas: coloração de Nissl para avaliação da sobrevivência neuronal, imunoistoquímica para avaliar astrogliose, microgliose e alterações sinápticas (EIS e EF); qRT-PCR para avaliação da expressão de fatores neurotróficos e citocinas pró e anti-inflamatórias (EIS) e, microscopia eletrônica de transmissão para avaliação ultraestrutural dos motnoneurônios alfa (EF). As análises comportamentais considerando-se o início da doença, progressão e sobrevida dos animais, através da avaliação do score neurológico, monitoramento do peso corporal e teste de desempenho motor Rotarod, tiveram início na 10a semana e foram realizados a cada 3 dias até o estágio final da doença. Os resultados
revelaram que o tratamento com tempol e hMSC promoveu maior sobrevivência neuronal (23% e 44% respectivamente) no EIS da doença, quando comparados aos animais do grupo veículo. No entanto, esse efeito só foi evidenciado no EF da doença no grupo tratado com tempol. A maior sobrevivência neuronal observada no EIS foi acompanhada por uma maior preservação de circuitos sinápticos no corno ventral da medula desses animais. Porém, no estágio final houve perda de ~80% das sinapses em todos os grupos experimentais, quando comparados aos animais não transgênicos (NTG; p<0,0001). A intensa reatividade de astrócitos e micróglia observada nos animais veículo, quando comparados aos NTG, foi reduzida na medula lombar dos animais tratados com tempol, hMSC e hMSC+tempol, sendo evidenciada no grupo hMSC quando comprado ao tempol. O efeito neurprotetor dos tratamentos com tempol e hMSC sob a inflamação foram contínuos, até o EF da doença. Além da menor reatividade das células gliais, os grupos tratados com tempol e hMSC reduziram em ~8× a expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL1β e TNFα) e ~3× a expressão de TGFβ (anti-inflamatória) no EIS, quando comparados com o grupo veículo. Todos esses efeitos somados resultaram em atraso no déficit motor e reduziram a perda de peso desses animais quando comparados aos animais veículo. Adicionalmente, os grupos que receberam a terapia celular sozinha ou associada ao tempol, retardaram a evolução da doença o que refletiu significativamente em um aumento de 18 dias na sobrevida dos animais. Em conjunto, nossos resultados indicaram que o tratamento com tempol, bem como a terapia celular com hMSC, apresentam efeitos benéficos, aumentando a sobrevivência neuronal, preservando sinapses e diminuindo a reatividade das células gliais durante a progressão da ELA, além de reduzir os níveis de citocinas pró-inflamatórias na medula, podendo ser considerados promissoras terapias para promover maior qualidade de vida aos pacientes e/ou prorrogar o tempo de sobrevida dos mesmos.
ABSTRACT
Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disease characterized by the selective and progressive loss of motor neurons in the spinal cord, brain stem, and motor cortex. It results in progressive atrophy and consequent muscular paralysis, leading the patient to death, usually between 2 and 5 years after the onset of symptoms. Although its etiology is complex and little known, it is believed that, as in other neurodegenerative diseases, the underlying pathological mechanism of ALS is a set of cellular and biochemical alterations that end up triggering the degeneration of the motoneurons. Although the end result of the disease is neuronal death, it is known today that ALS is a non-autonomous disease with the active participation of astrocytes, microglia and T cells as protagonists of neuroinflammation, one of the main and most evident pathogenic mechanisms involved in the disease. Pharmacological treatment with riluzole is not curative and has little effect on the prolongation of patient survival. Thus, the development of new therapeutic strategies aimed at promoting a better quality of life for patients is of utmost importance. As an alternative, there is the prospect of the use of cyclic nitroxides such as tempol, since they are multifunctional antioxidants that present low toxicity in experimental animals. In addition to pharmacological therapies, the use of stem cells has been heavily investigated, seeking immunomodulatory and neuroprotective effects. The objective of this study was to verify if the interaction between riluzole, tempol and mesenchymal stem cells presents therapeutic potential in SOD1G93A transgenic mice. The treatments started in the asymptomatic phase of the disease (10th week). Treatment with riluzole (8mg/kg) and tempol (50mg/kg) was performed on alternate days until the 14th week and from there to the final stage of the disease, twice a week. On the other hand, the systemic application (1x105) of human mesenchymal stem cells (hMSC) derived from adipose tissue occurred only once. The animals were sacrificed at the 14th week (initial stage of symptoms - ISS) and at the end stage (ES) of the disease for sample collection and data analysis. The lumbar spinal cord of the animals was dissected and processed for the following techniques: Nissl staining for evaluation of neuronal survival, immunohistochemistry to evaluate astrogliosis, microgliosis and synaptic changes (ISS and ES); qRT-PCR to evaluate the expression of neurotrophic factors and pro-inflammatory cytokines (ISS) and transmission electron microscopy for the ultrastructural evaluation of the alpha motoneurons (ES). Behavioral analyzes considering the onset of disease, progression and survival of the animals through evaluation of the neurological score, body weight monitoring and Rotarod motor performance test, started on the 10th week and were performed every 3 days until the stage end of the disease. The results revealed that treatment with tempol and hMSC promoted greater neuronal survival
(23% and 44%, respectively) in the disease ISS when compared to animals in the vehicle group. However, this effect was only evidenced in the ES of the disease in the group treated with tempol. The higher neuronal survival observed in the ISS was accompanied by a greater preservation of synaptic circuits in the ventral horn of the spinal cord of these animals. However, in the final stage, there was ~ 80% loss of synapses in all experimental groups when compared to non-transgenic animals (NTG; p <0.0001). The intense reactivity of astrocytes and microglia observed in vehicle animals, when compared to NTG, was reduced in the lumbar spinal cord of the animals treated with tempol, hMSC and hMSC + tempol, being evidenced in the hMSC group when purchased at the tempol. The neuroprotective effect of the treatments with tempol and hMSC under the inflammation were continuous, until the ES of the disease. In addition to the lower reactivity of glial cells, the groups treated with tempol and hMSC reduced the expression of proinflammatory cytokines (IL1β and TNFα) and ~ 3x the expression of TGFβ (anti-inflammatory) in the ISS, when compared with the vehicle group. All these added effects resulted in delayed motor deficit and reduced the weight loss of these animals when compared to vehicle animals. In addition, groups receiving cell therapy alone or in combination with tempol delayed the course of the disease, which significantly reflected an 18-day increase in survival of the animals. Together, our results indicate that treatment with tempol as well as cell therapy with hMSC have beneficial effects, enhancing neuronal survival, preserving synapses and decreasing glial cell reactivity during ALS progression, and reducing levels of proinflammatory cytokines in the spinal cord, and may be considered promising therapies to promote patients' quality of life and / or to extend their survival time.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição absoluta de casos de esclerose lateral amiotrófica e sua correlação com a proporção de raças em cada estado brasileiro. Período: 2004-2013. Fontes: 2010 IBGE Census and Mortality Information System (SIM). Retirado de (Moura, Casulari et al. 2016).
Figura 2: Principais mecanismos envolvidos na patogênese da ELA. Modificado de (Vucic, Rothstein et al. 2014).
Figura 3: Representação esquemática da seleção dos cortes da medula lombar para a contagem dos motoneurônios, através da coloração de Nissl. Os cortes utilizados estão destacados pelo círculo vermelho.
Figura 4: Representação esquemática ilustrando o método de quantificação em cada região da medula de acordo com os anticorpos utilizados. A: corno ventral (área total da imagem quantificada para todos os anticorpos). B: região intermédia da medula (área total da imagem quantificada para GFAP e Iba1). C: corno dorsal (lâminas I, II e III para GFAP e Iba1). Na região dorsal, foram capturadas três áreas de mesmo tamanho e empregou-se a média nas análises estatísticas.
Figura 5: Bandas de RNAr 28S e 18S bem delimitadas. É possível observar que a banda 28S é o dobro da 18S, indicando que o RNA tem boa integridade.
Figura 6: Gel de agarose 1,5% com amostras de DNA genômico utilizados para genotipagem dos animais
SOD1G93A através da técnica de PCR convencional.
Figura 7: Gráfico representativo do controle do número de cópias do gene humano SOD1 mutante em
camundongos SOD1G93A. A média de expressão relativa entre os animais foi 6×. Foram considerados para o estudo
animais com expressão relativa entre 4.5 e 6.5×.
Figura 8: Sinais clínicos característicos da ELA em roedores. A. Radiografia de animais NTG (superior) e G93A (inferior) no estágio final da doença evidenciando o aumento das curvaturas primária e secundária B. Evolução dos sinais clínicos de reflexo de extensão e paralisia dos membros posteriores em animais G93A durante a progressão da ELA.
Figura 9: Peso corporal (%) de animais transgênicos SOD1G93A comparados com animais não transgênicos (NTG).
Two-way-ANOVA e post hoc Bonferroni *p<0,05; **p<0,001 e ***p<0,0001.
Figura 10: Teste de desempenho motor Rotarod em animais transgênicos SOD1G93A comparados com animais
não transgênicos (NTG). Two-way-ANOVA e post hoc Bonferroni *p<0,05; **p<0,001 e ***p<0,0001.
Figura 11: Linha do tempo ilustrativa do início da doença, início dos sintomas e sobrevida em camundongos SOD1G93A utilizados nesse projeto.
Figura 12: Micrografia de contraste de fase, evidenciando o aspecto morfológico da cultura de células-tronco hMSC derivadas de tecido adiposo na 8ª passagem, mostrando a homogeneidade da cultura e morfologia fusiforme.
Figura 13: Análise fenotípica das hMSC por citometria de fluxo para caracterização da cultura de hMSC utilizadas nos experimentos.
Figura 14: Imunoistoquímica em hMSC evidenciando a imunomarcação positiva para BDNF (A, B e C) e negativa para GDNF (D, E e F). Barra de escala = 50μm.
Figura 15: Morte neuronal durante a progressão da ELA em camundongos SOD1G93A, comparados com animais
NTG. Teste T e post-hoc Mann-Whitney ***p<0,0001.
Figura 16: Secções transversais do corno ventral da medula lombar submetidas à coloração de Nissl, no estágio inicial dos sintomas. Os grupos com ELA apresentaram redução significativa na sobrevivência neuronal, quando comparados com o grupo NTG (***p<0,0001). No entanto, o grupo tempol apresentou maior sobrevivência
neuronal, quando comparado ao grupo veículo. #p<0,05; ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de
escala = 50μm.
Figura 17: Secções transversais do corno ventral da medula lombar submetidas à coloração de Nissl no estágio final da doença. Os grupos com ELA apresentaram redução significativa na sobrevivência neuronal, quando comparados com o grupo NTG (***p<0,0001). No entanto, o grupo tempol apresentou maior sobrevivência
neuronal, quando comparado com o grupo veículo. #p<0,05; ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de
escala =50μm.
Figura 18: Secções transversais do corno ventral da medula lombar submetidas à coloração de Nissl no estágio inicial dos sintomas. Os grupos com ELA apresentaram redução significativa na sobrevivência neuronal, quando comparados com o grupo NTG (***p<0,0001). No entanto, o grupo tempol, hMSC e hMSC+tempol apresentaram
maior sobrevivência neuronal, quando comparados com o grupo veículo. #p<0,05 e ### p<0,0001 respectivamente.
ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 19: Secções transversais do corno ventral da medula lombar submetidas à coloração de Nissl no estágio final da doença. Os grupos com ELA apresentaram redução significativa na sobrevivência neuronal, quando comparados com o grupo NTG (***p<0,0001). Nesse estágio, somete o grupo tempol apresentou maior
sobrevivência neuronal, quando comparado com o grupo veículo. #p<0,05; ANOVA de uma via e post hoc
Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 20: Análise qualitativa de cortes semi-finos do corno ventral da medula espinal no estágio final da ELA. A. Esquema representativo da região do corno ventral onde estão localizados os motoneurônios analisados. B. NTG, C. veículo, D. riluzol, E. tempol, F. R+T, G. hMSC e H. hMSC+tempol. Observa-se maior preservação tecidual dos grupos tratados com a terapia celular. Aumento: 40x. Barra de escala = 50μm.
Figura 21: Análise qualitativa de cortes ultrafinos do corno ventral da medula espinal no estágio final da ELA. A. Motoneurônio alfa medular remanescente. Observar a integridade, forma e tamanho do neurônio, posição central do núcleo, eletrolucidez citoplasmática e nuclear. B. Motoneurônio alfa medular em degeneração. Observar as primeiras alterações cromatolíticas, identificadas pelo citoplasma do neurônio mais eletrodenso (devido à
dissolução dos corpúsculos de Nissl e acúmulo de grânulos intracelulares, provavelmente
lipofuscina). C. Motoneurônio alfa medular atrófico. Observar redução do volume celular, nuclear e citoplasmático, picnose do núcleo e perda dos corpúsculos de Nissl. D. Processo de vacuolização observado no microambiente medular. A formação de vacúolos (setas) se estendeu por todo o microambiente observado. E. Micróglia fagocítica observada na proximidade do corpo celular, envolvida na remoção e eliminação de detritos neuronais. Observar debris (setas) dentro da micróglia. Também é possível observar um
vaso sanguíneo edemaciado (seta), indicando um possível comprometimento da barreira
hematoencefálica. F. Astrócitos protoplasmásticos (setas) observados na proximidade da membrana neuronal. Projeções dessas células foram observadas preenchendo o espaço entre os terminais pré-sinápticos e a membrana pós-sináptica. G e H. Mitocôndrias (setas) inchadas, apresentando espaços vazios, e membranas internas rompidas, característicos de disfunção mitocondrial. I. Terminal pré-sináptico colinérgico (Tipo C) (seta), necessário para identificação dos α-motoneurônios. Aumento: A-D 890x, Barra de escala = 500μm; E-F 2900x, Barra de escala = 2μm; G-H 11000x, Barra de escala = 500nm; I 18500x, Barra de escala = 500nm.
Figura 22: Imunomarcação para proteína sinaptofisina, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas da ELA. Nota-se intensa perda de imunomarcação nos grupos veículo e riluzol e R+T quando comparados ao grupo NTG (***p<0,001). Observou-se maior preservação no grupo tratado com tempol quando
comparado ao grupo veículo (#p<0,05); ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 23: Imunomarcação para proteína sinaptofisina, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio final da doença. Observa-se que o padrão de perda da inumomarcação entre os grupos com a doença são similares, enquanto o grupo NTG apresenta uma imunomarcação mais intensa (***p<0,0001). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 24: Imunomarcação para proteína sinaptofisina, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas. Nota-se uma perda de imunomarcação no grupo veículo e demais grupos quando comparados ao grupo NTG (***p<0,001). Nos grupos tempol, hMSC e hMSC+tempol, observa-se maior preservação da
imunmarcação quando comparados ao grupo veículo, ##p<0,001 e ###p<0,0001 respectivamente. A terapia celular
mostrou-se ainda mais eficiente quando comparada ao tratamento somente com tempol $p<0,05 (hMSC) e
$$p<0,001 (hMSC+tempol). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 25: Imunomarcação para proteína sinaptofisina, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio final da doença. Observa-se que o padrão de inumomarcação entre os grupos com a doença são similares, enquanto o grupo NTG apresenta uma imunomarcação mais intensa (p<0,0001***). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 26: Imunomarcação para proteína GFAP no corno ventral da medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas. Nota-se uma intensa imunomarcação nos grupos veículo, riluzol e R+T quando comparados ao grupo NTG (***p<0,001) e uma menor reatividade dos astrócitos no grupo tratado com tempol, quando comparado ao
grupo veículo (###p<0,001); riluzol (&&p<0,001) e R+T (@p<0,05). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni.
Barra de escala = 50μm.
Figura 27: Imunomarcação para proteína GFAP, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio final da doença. Nota-se uma intensa imunomarcação nos grupos de animais doentes quando comparados ao grupo NTG (***p<0,0001) nas três regiões da medula analisadas: A, D, G, J e M (corno ventral); B, E, H, K e N (região intermédia) e C, F, I, L e O (região dorsal). P, Q e R: Representação gráfica da quantificação da imunomarcação
no corno ventral (***p<0,0001 e &p<0,05), região intermédia (***p<0,0001) e dorsal (***p<0,0001). ANOVA de
uma via e post hoc Bonferroni. cc: canal central. Barra de escala = 50μm.
Figura 28: Imunomarcação para proteína GFAP, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas. Nota-se uma intensa imunomarcação nos grupos veículo quando comparado ao grupo NTG (***p<0,001) e uma menor reatividade dos astrócitos nos grupos tratados com tempol, hMSC e hMSC+tempol
quando comparados ao grupo veículo (###p<0,0001). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala
= 50μm.
Figura 29: Imunomarcação para proteína GFAP, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio final da doença. Nota-se uma intensa imunomarcação nos grupos de animais doentes quando comparados ao grupo NTG (***p<0,0001) e um efeito neuroprotetor da terapia celular observada nas três regiões da medula analisadas quando comparada aos grupos veículo e tempol. A, D, G, J e M (corno ventral); B, E, H, K e N (região intermédia) e C, F, I, L e O (região dorsal). P, Q e R: Representação gráfica da quantificação da imunomarcação no corno ventral
(***p<0,0001, ###p<0,0001 e $$$p<0,0001), região intermédia (***p<0,0001, ###p<0,0001 e $$$p<0,0001) e dorsal
(***p<0,0001 e #p<0,05). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. cc: canal central. Barra de escala = 50μm.
Figura 30: Imunomarcação para proteína Iba1, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas. Nota-se intensa imunomarcação nos grupos com a doença quando comparados ao grupo NTG (***p<0,001) e redução da microgliose nos grupos tratados com riluzol e tempol quando comparados ao grupo
veículo (#p<0,05 e ###p<0,0001 respectivamente). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. Barra de escala =
50μm.
Figura 31: Imunomarcação para proteína Iba1, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio final da doença. Nota-se intensa imunomarcação nos grupos de animais doente quando comparados ao grupo NTG (***p<0,0001) nas três regiões da medula analisadas: A, D, G, J e M (corno ventral); B, E, H, K e N (região intermédia) e C, F, I, L e O (região dorsal). P, Q e R: Representação gráfica da quantificação da imunomarcação
no corno ventral (***p<0,0001 e ##p<0,001), região intermédia (***p<0,0001, ###p<0,0001 e ##p<0,001) e dorsal
(***p<0,0001, ###p<0,001, &&p<0,001, @@p<0,001). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. cc: canal central.
Figura 32: Imunomarcação para proteína Iba1, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas. Nota-se intensa imunomarcação nos grupos com a doença quando comparados ao grupo NTG (***p<0,001) e redução da microgliose nos grupos tratados com tempol, hMSC e hMSC+tempol quando
comparados ao grupo veículo (###p<0,000) e hMSC quando comparado com tempol ($$p<0,001). ANOVA de uma
via e post hoc Bonferroni. Barra de escala = 50μm.
Figura 33: Imunomarcação para proteína Iba1, no corno ventral da medula lombar de animais no estágio final da doença. Nota-se intensa imunomarcação nos grupos de animais doente quando comparados ao grupo NTG (***p<0,0001) nas três regiões da medula analisadas: A, D, G, J e M (corno ventral); B, E, H, K e N (região intermédia) e C, F, I, L e O (região dorsal). P, Q e R: Representação gráfica da quantificação da imunomarcação
no corno ventral (***p<0,0001, ##p<0,001, ###p<0,0001 e $p<0,05), região intermédia (***p<0,0001, ###p<0,0001 e
$$$p<0,0001) e dorsal (***p<0,0001, ###p<0,0001 e &p<0,05). ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni. cc: canal
central. Barra de escala = 50μm.
Figura 34: Gel de agarose 1% com amostras de RNA dos animais utilizados para a técnica RT-qPCR.
Figura 35: Seleção do gene de referência para validação dos dados de RT-qPCR pelo software Best Keeper.
Figura 36: Quantificação relativa da expressão gênica de fatores neurotróficos na medula lombar no estágio inicial dos sintomas da ELA. A e B: BDNF; C e D: GDNF. ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni.
Figura 37: Quantificação relativa da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias na medula lombar no estágio inicial dos sintomas da ELA. A e B IL1β: C e D: TNFα; E e F: INFγ e G e H: iNOS. ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni.
Figura 38: Quantificação relativa da expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias na medula lombar no estágio inicial dos sintomas da ELA. A e B TGFβ: C e D: IL10. ANOVA de uma via e post hoc Bonferroni.
Figura 39: Teste de desempenho motor Rotarod. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, avaliados a partir da 10ª semana (assintomático) até 16.5 semanas (sintomáticos). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) riluzol; (C) tempol e (D) R+T. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.
Figura 40: Teste de desempenho motor Rotarod. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, avaliados da 10ª semana (assintomático) até 16.5 semanas (sintomáticos). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) tempol; (C) hMSC e (D) hMSC+tempol. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.
Figura 41: Monitoramento do peso corporal em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até a 17ª semana (sintomático). As análises estatísticas
foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) riluzol; (C) tempol e (D) R+T. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.
Figura 42: Representação gráfica da perda de peso corporal em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até a 17ª semanas (sintomático). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) tempol; (C) hMSC e (D) hMSC+tempol. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.
Figura 43: Representação gráfica da perda de peso corporal durante a progressão da ELA (20 semanas).
Figura 44: Representação gráfica da evolução dos sinais clínicos da ELA em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até 17ª semanas (sintomáticos). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) riluzol; (C) tempol e (D) R+T. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.
Figura 45: Representação gráfica da evolução dos sinais clínicos da ELA em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até 17ª semana (sintomático). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) tempol; (C) hMSC e (D) hMSC+tempol. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.
Figura 46: Representação gráfica da evolução dos sinais clínicos (sintomas) durante a progressão da ELA (20 semanas).
Figura 47: Representação gráfica da probabilidade de início da ELA (A) e duração da doença (B) entre os grupos experimentais. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos. ANOVA de uma via e post hoc Newman-Keuls.
Figura 48: Curvas de sobrevivência Kaplan-Meier (A-F) em animais transgênicos SOD1G93A. Log-rank
(Mantel-Cox test) e post hoc Gehan-Breslow-Wilcoxan test.
Figura 49: Representação esquemática da transposição do tratamento experimental para clínica, iniciando a intervenção após aparecimento dos sintomas. A. Esquema representativo dos resultados encontrados no presente estudo. B. Perspectiva de eficiência para um novo tratamento, empregando-se múltiplas aplicações de células-tronco mesenquimais adultas.
LISTA DE TABELA
Tabela 1: Descrição dos primers utilizados na genotipagem dos animais (PCR convencional)
Tabela 2: Descrição dos primers utilizados para verificação do número de cópias do gene hSOD1 (RT-qPCR).
Tabela 3: Divisão dos grupos experimentais.
Tabela 4: Informações dos anticorpos utilizados para imunoistoquímica
Tabela 5: Ensaios Taqman utilizados no RT-qPCR
Tabela 6: Condições de termociclagem das reações de RT-qPCR
Tabela 7: Legendas das diferenças estatísticas entre os grupos experimentais
Tabela 8: Valores da leitura das amostras de RNA em nanofotômetro para validação da pureza e qualidade das amostras de RNA.
SUMÁRIO RESUMO ... 8 ABSTRACT ...10 LISTA DE FIGURAS ...12 LISTA DE TABELAS ...18 SUMÁRIO ...19 1.INTRODUÇÃO ...21
1.1ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA (ELA) ... 21
1.2CÉLULAS NÃO NEURONAIS NA ELA ... 23
1.3ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS ... 26 2.JUSTIFICATIVA ...30 3.OBJETIVOS ...32 3.1OBJETIVO GERAL: ... 32 3.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ... 32 4.METODOLOGIA ...33 4.1ANIMAIS ... 33 4.2GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 34 4.3TRATAMENTOS ... 34
4.3.1 Preparação e aplicação do tempol e riluzol ... 34
4.3.2 Tratamento com células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) adultas derivadas de tecido adiposo ... 34
4.4AVALIAÇÃO DA SOBREVIDA DOS ANIMAIS ... 35
4.4.1 Avaliação do início dos sintomas da ELA e progressão da doença nos camundongos SOD1G93A ... 35
4.5EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E PROCESSAMENTO DOS ESPÉCIMES PARA COLORAÇÃO DE NISSL E IMUNOISTOQUÍMICA ... 37
4.6MICROSCOPIA DE LUZ PARA AVALIAÇÃO DA SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ... 37
4.7IMUNOISTOQUÍMICA ... 38
4.7.1 Análise quantitativa da imunoistoquímica ... 39
4.8EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E PROCESSAMENTO DOS ESPÉCIMES PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO ... 40
4.8.1 Análises das Secções Ultrafinas ... 40
4.9RT-QPCR(PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL) ... 40
4.9.1 Extração do RNA total ... 40
4.9.3 Síntese do DNA complementar (cDNA) ... 42
4.9.4 Reação da Polimerase em Cadeia em Tempo Real ... 42
4.9.5 Escolha do gene de referência ... 44
4.9.6 Análise dos dados ... 44
4.10ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 44
5 RESULTADOS ...45
5.1CARACTERIZAÇÃO DA LINHAGEM TRANSGÊNICA SOD1G93A ... 45
5.2CARACTERIZAÇÃO E FENOTIPAGEM DAS CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS (HMSC) EXTRAÍDAS DE TECIDO ADIPOSO ... 48
5.3AVALIAÇÃO DA SOBREVIVÊNCIA NEURONAL DURANTE A PROGRESSÃO DA ELA E POSSÍVEL EFEITO DOS TRATAMENTOS COM RILUZOL, TEMPOL E HMSC. ... 52
5.4ANÁLISE ULTRA-ESTRUTURAL DOS MOTONEURÔNIOS E MICROAMBIENTE MEDULAR NO ESTÁGIO FINAL DA DOENÇA. ... 56
5.5EFEITO DOS TRATAMENTOS COM RILUZOL, TEMPOL E HMSC NAS ALTERAÇÕES SINÁPTICAS DURANTE A PROGRESSÃO DA ELA ... 60
5.6EFEITO DOS TRATAMENTOS COM RILUZOL, TEMPOL E HMSC NA REATIVIDADE DOS ASTRÓCTIOS DURANTE A PROGRESSÃO DA ELA ... 63
5.7EFEITO DOS TRATAMENTOS COM RILUZOL, TEMPOL E HMSC NA ATIVAÇÃO DA MICRÓGLIA DURANTE A PROGRESSÃO DA ELA ... 70
5.8ANALISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DE FATORES NEUROTRÓFICOS E CITOCINAS PRÓ E ANTI -INFLAMATÓRIAS NO ESTÁGIO INICIAL DOS SINTOMAS DA ELA, ATRAVÉS DA TÉCNICA RT-QPCR ... 75
5.8.1 Análise da qualidade e integridade do RNA extraído como amostra ... 75
5.8.2 Escolha do gene de referência (endógeno) pelo software Best Keeper ... 76
5.8.3 Expressão gênica de fatores neurotróficos na medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas da ELA ... 77
5.8.4 Expressão gênica de citocinas pró e anti-inflamatórias na medula lombar de animais no estágio inicial dos sintomas da ELA ... 78
5.9ANÁLISES COMPORTAMENTAIS ... 81
5.9.1 Teste de desempenho motor - Rotarod ... 81
5.9.2 Início e progressão da ELA ... 84
6.DISCUSSÃO ...93
7.CONCLUSÕES ... 100
8.REFERÊNCIAS ... 101
1. INTRODUÇÃO
1.1 Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), primeiro descrita pelo neurologista francês Jean-Martin Charcot em 1869, é uma doença neurodegenerativa rara de início adulto, caracterizada pela degeneração seletiva e progressiva dos neurônios motores superiores, localizados no córtex cerebral e inferiores, localizados no tronco encefálico e corno ventral da medula espinal (Fischer, Culver et al. 2004, Hardiman, van den Berg et al. 2011, Chio, Logroscino et al. 2013). Os sinais emergem quando se inicia a perda axonal decorrente da degeneração neuronal, gerando desnervação e fraqueza muscular. Inicialmente, tal degeneração parcial é compensada por neurônios sobreviventes que, através do brotamento axonal, reinervam fibras musculares, aumentando o tamanho das unidades motoras. Contudo, este mecanismo falha eventualmente, e os corpos celulares dos motoneurônios tornam-se visivelmente anormais e degeneram completamente (Robberecht and Philips 2013). A progressão da doença é rápida, com 50% dos pacientes morrendo devido a complicações respiratórias dentro de 2 a 5 anos após o início dos sintomas (Kiernan, Vucic et al. 2011).
A ELA pode se apresentar de duas formas praticamente indistinguíveis: a familiar com um padrão de herança dominante, responsável por 10% dos casos e a esporádica, na qual na maioria dos casos é impossível a identificação de um único agente causador, representando 90% dos afetados (Coatti, Beccari et al. 2015). Dentre as mutações mais frequentes na ELA familiar encontram-se mutações relacionadas aos genes que codificam as seguintes proteínas:
C9orf72 (33% dos casos), seguida por Cu Zn superóxido dismutase (SOD1) que representam
20% dos casos e TDP43, sendo observada em 5% dos casos (Peters, Ghasemi et al. 2015). Atualmente a ELA é considerada a quarta causa de morte mais comum por doença neurodegenerativa após Alzheimer, Parkinson e Huntington, com prevalência mundial de 4-8 casos por 100.000 indivíduos (Fischer, Culver et al. 2004, Hardiman, van den Berg et al. 2011, Chio, Logroscino et al. 2013).
No Brasil, devido à escassez de estudos epidemiológicos da doença, fica difícil estimar sua prevalência. De acordo com um estudo epidemiológico realizado por (Moura, Casulari et al. 2016), a incidência da ELA no país, determinada por dados de mortalidade, é de 2,3 casos por 100.000 pessoas/ano, sendo 73,4% dos afetados da raça branca e idade média de 62,7 anos. A Figura 1 ilustra a correlação da distribuição geográfica e racial no Brasil mostrando que, a maior concentração de casos de ELA, ocorre em áreas com alta população, afetando em maior proporção pessoas da raça branca.
Figura 1: Distribuição absoluta de casos de esclerose lateral amiotrófica e sua correlação com a proporção de raças em cada estado brasileiro. Período: 2004-2013. Fontes: 2010 IBGE Census and Mortality Information System (SIM). Retirado de (Moura, Casulari et al. 2016).
Clinicamente, os pacientes com ELA apresentam a combinação de sinais de comprometimento dos 1º e 2º neurônios motores, ou seja, envolvimento do trato corticoespinal e de neurônios motores do corno ventral da medula espinal e núcleos motores de nervos cranianos bulbares. De maneira geral, os sintomas clínicos predominantes são: fraqueza e atrofia muscular, fasciculações e espasticidade (Mulder, Kurland et al. 1986, Rowland and Shneider 2001). Na maioria dos pacientes, são acometidos primeiro os neurônios motores inferiores da medula espinal, enquanto que em um para cada quatro ou cinco pacientes, o início é bulbar (Mitchell and Borasio 2007).
A maioria dos casos é caracterizada por início dos sintomas geralmente na quarta década de vida (Coatti, Beccari et al. 2015). O diagnóstico da ELA é feito com base na presença de sinais clínicos que indicam comprometimento de neurônios motores superiores e inferiores. Além disso, é necessária uma evolução progressiva dos sinais ou sintomas em uma região ou para outras regiões do corpo, que não possam ser explicados por nenhum outro processo
patológico (evidentes em estudos eletrofisiológicos, de imagem, sorológico e do líquido cefalorraquidiano) (Wijesekera and Leigh 2009). Apesar dos avanços na área médica, a ELA em seus estágios iniciais está relacionada com uma grande variedade de sinais e sintomas, dificultando o diagnóstico, que pode levar até 12 meses para ser confirmado (Shook and Pioro 2009).
Uma importante descoberta foi a identificação de mutações no gene que codifica a proteína Cu Zn superóxido dismutase 1 (SOD1), como causa de aproximadamente 20% dos casos de ELA familiar. A SOD1 é uma enzima amplamente presente no organismo, que contém 153 aminoácidos por subunidade e a cada uma delas está ligado um átomo de zinco e um átomo de cobre. A SOD1 catalisa a reação de dismutação que converte ânions superóxido, originários de erros da fosforilação oxidativa na mitocôndria, em peróxido de hidrogênio que pode então, ser transformado em água e oxigênio (Roberts, Tainer et al. 2007). Já foram encontradas mais de 125 mutações da SOD1 que, com poucas exceções, são herdadas dominantemente (Pasinelli and Brown 2006). Embora os primeiros estudos indicassem perda de atividade enzimática nos pacientes com mutações da SOD1, animais transgênicos expressando inúmeras mutações da SOD1 relacionadas com a ELA, entre elas a mutação SOD1G93A (glicina substituída por alanina na posição 93), desenvolveram os sintomas fenotípicos característicos da doença, mas mantiveram níveis elevados de atividade da enzima (Gurney, Pu et al. 1994). Por outro lado, animais com a deleção da SOD1 não desenvolveram sintomas da doença, nem tiveram comprometimento da sobrevida indicando que a natureza patogênica da SOD1 mutante ocorre através de um ganho de função e não pela perda de atividade (Reaume, Elliott et al. 1996, Ilieva, Polymenidou et al. 2009). Entretanto, o mecanismo molecular que leva ao ganho de toxicidade da SOD1 mutante é multifatorial e de natureza desconhecida.
1.2 Células não neuronais na ELA
Apesar da mutação no gene SOD1 não ser a mais frequente entre os pacientes com ELA, foi a primeira a ser identificada e responsável pelo desenvolvimento de modelos animais da doença. A superexpressão do gene SOD1 humano mutante em roedores resulta em uma severa e progressiva degeneração dos motoneurônios levando à fraqueza e paralisia muscular e morte (Bendotti and Carri 2004). Esses animais apresentam vários aspectos do perfil clínico observados em pacientes com a doença, representando um excelente modelo para o estudo dos mecanismos patológicos da ELA (Philips and Rothstein 2014). Apesar do mecanismo patológico responsável por desencadear a ELA ainda não ter sido claramente identificado, a fisiopatologia da doença parece ser multifatorial, incluindo estresse oxidativo, excitotoxicidade
pelo glutamato, disfunção mitocondrial, desregulação no metabolismo de RNA, formação de agregados intracelulares, estresse de retículo e distúrbios no transporte axonal que resultam na degeneração especificamente dos motoneurônios (Figura 2).
Figura 2: Principais mecanismos envolvidos na patogênese da ELA. Modificado de (Vucic, Rothstein et al. 2014).
Inicialmente, pesquisadores concentraram-se na busca por mecanismos patogênicos diretamente em neurônios motores. No entanto, crescentes evidências indicam que outros tipos celulares presentes no sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) tais como astrócitos, micróglia, oligodendrócitos e células T participam ativamente do processo degenerativo dos motoneurônios (Ilieva, Polymenidou et al. 2009).
Sabe-se que a mutação SOD1 especificamente em neurônios, não é suficiente para promover degeneração em modelos animais (Pramatarova, Laganiere et al. 2001, Lino, Schneider et al. 2002). Por outro lado, quando neurônios normais (wild-type) são cultivados com astrócitos, micróglia e oligodendrócitos expressando a mutação SOD1, o processo degenerativo é evidenciado, causando morte neuronal (Clement, Nguyen et al. 2003, Yamanaka, Boillee et al. 2008, Yamanaka, Chun et al. 2008, Song, Miranda et al. 2016). Ao contrário, quando neurônios expressando tal mutação são cultivados com células gliais normais, observa-se aumento na duração da doença e sobrevida dos animais, modelando o conceito de
degeneração celular não autônoma na patogênese da ELA (Beers, Henkel et al. 2006, Lepore, Rauck et al. 2008, Appel, Zhao et al. 2011).
A neuroinflamção é um mecanismo patológico padrão envolvido em várias doenças neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson e ELA e caracteriza-se pela ativação de células da glia e acúmulo de infiltrados de linfócitos T nos locais de injúria e subsequente superexpressão de citocinas pró-inflamatórias e outras moléculas neurotóxicas ou neuroprotetoras (Engelhardt, Tajti et al. 1993, Lewis, Manning et al. 2012, Endo, Komine et al. 2015).
A micróglia atua como primeira linha de defesa no sistema nervoso central. Em seu estado quiescente, são células altamente dinâmicas que fazem a vigilância do microambiente do SNC. Entretanto, quando ativadas, essas células podem liberar substâncias que exercem efeitos benéficos ou prejudiciais aos neurônios ao seu redor (Lewis, Manning et al. 2012). Classicamente a ativação de subpopulações (M1) apresentam um fenótipo pró-inflamatório, caracterizado pela produção de fator de necrose tumoral (TNFα) e interleucina 1β (IL1β) e aumento da liberação de espécies reativas do oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO), através da regulação positiva de NADPH oxidase e óxido nítrico sintase induzível (iNOS), respectivamente (Lewis, Manning et al. 2012). Ao contrário, a ativação de subpopulações (M2), promove liberação de citocinas anti-inflamatórias, tais como: interleucinas IL-4, IL-10 e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1). Estes atuam no processo de reparo e promovem a restauração da homeostase (Philips and Rothstein 2014). Recentemente, foi sugerido que a microglia pode estar implicada no início da ELA (Gerber, Sabourin et al. 2012), após perda de sua capacidade de vigilância, passando com a progressão da doença, de um fenótipo neuroprotetor para um fenótipo neurodegenerativo (Weydt, Yuen et al. 2004, Dibaj, Steffens et al. 2011).
Os astrócitos desempenham funções homeostáticas e de suporte no sistema nervoso. Uma de suas funções mais importantes é controlar e reduzir as concentrações extracelulares de glutamato, principal neurotransmissor excitatório do SNC, através do receptor de glutamato EAAT2 (Sofroniew and Vinters 2010). Evidências sugerem que falhas na recaptação do glutamato pelos astrócitos são devido à perda de funcionalidade do transportador EAAT2, como relatado em casos de ELA familiar e esporádica e modelos animais superexpressando mutações SOD1 (Bruijn, Becher et al. 1997, Howland, Liu et al. 2002, Pardo, Wong et al. 2006). Astrócitos expressando a mutação SOD1, perdem a capacidade de controlar a expressão da subunidade GluR2 de receptores de glutamato do tipo AMPA nos neurônios motores, levando a um fluxo elevado de cálcio e à sua degeneração (Van Damme, Bogaert et al. 2007).
Ressalte-se que a proliferação e ativação dos astrócitos são características histológicas marcantes encontradas na medula espinal e córtex motor de pacientes com ELA e modelos animais durante a progressão da doença (Turner, Cagnin et al. 2004, Mantovani, Garbelli et al. 2009). Além disso, recentes estudos sugerem que assim como a micróglia, os astrócitos também podem apresentar um fenótipo diferente (A1 e A2) dependendo do insulto agressor inicial. Evidências indicam que astrócitos A1 são neurotóxicos e são encontrados abundantemente em vários modelos de doneças neurodegenerativas incluindo Alzheimer, Huntington, Parkinson e ELA (Chung, Welsh et al. 2015, Liddelow, Guttenplan et al. 2017). Astrócitos com fenótipo aberrante A1, poderiam contribuir com a neurodegeneração, bem como comprometer diversas funções neuronais e sinápticas. No entanto, os mecanismos pelos quais os astrócitos geram toxicidade aos neurônios, permanecem sob alvo de estudos.
As células T também são componentes chaves da neuroinflamação. Sub-populações de células T, que infiltram no sistema nervoso modulam a reação neuroinflamatória diferentemente, dependendo do estágio de progressão da doença (Beers, Henkel et al. 2008, Chiu, Chen et al. 2008). Notavelmente, foram reportados monócitos circulantes (CD16+) aumentados no sangue periférico (Zhang, Gascon et al. 2006) de pacientes com ELA esporádica, os quais foram correlacionados com aumento nos níveis plasmáticos de LPS (Zhang, Miller et al. 2009), um potente indutor da ativação de macrófagos M1. Esses e outros resultados confirmam que a resposta inflamatória associada com a ELA não é limitada ao SNC, com ativação sistêmica do sistema imune, influenciando potencialmente a progressão da doença (Nardo, Iennaco et al. 2013, Nardo, Trolese et al. 2016, Chiarotto, Nardo et al. 2017). Apesar do claro envolvimento de outros tipos celulares na patogênese da ELA, os mecanismos envolvidos na ativação dessas células durante o curso da doença ainda são alvo de pesquisas.
1.3 Estratégias terapêuticas
Devido à complexidade dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na ELA, faz-se necessário a busca por terapias multifatoriais que possam exercem diversos efeitos frente aos alvos acima mencionados. Apesar dos avanços na área médica e dos inúmeros estudos científicos e clínicos da doença, o Riluzol, que foi aprovado há mais de 15 anos atrás pela FDA (Food and Drug Administration - U.S.A) permanece até o momento, como único fármaco aprovado para o tratamento da ELA, exercendo um modesto efeito na prorrogação da sobrevida de 3 a 6 meses, em pacientes e cerca de 10 dias em modelos animais da doença (Sironi, Vallarola et al. 2017).
O riluzol (2-amino-6-trifluorometoxy benzotiazole, comercialmente chamado Rilutek), é membro da classe do benzotiazole, que foi originalmente desenvolvido em 1950, como relaxante muscular e, mais tarde, como agente anti-convulsivo e neuroprotetor U.S.A Food and Drug Administration (Rowland and Shneider 2001). No Brasil, também é o único medicamento aprovado pela ANVISA e disponível para o tratamento da doença. Desde sua aprovação para o tratamento da ELA, os estudos científicos em modelos animais continuam a ser realizados, uma vez que, os mecanismos de ação, as propriedades e metabolismo do riluzol, não foram completamente esclarecidos.
Enquanto vários experimentos em modelos animais têm replicado o efeito terapêutico observado com o riluzol em pacientes com ELA (Gurney, Fleck et al. 1998, Bruijn, Miller et al. 2004), houve também uma série de ensaios demonstrando um efeito terapêutico mais eficaz através da combinação de uma ou mais terapias (Kriz, Gowing et al. 2003, Waibel, Reuter et al. 2004, Fumagalli, Bigini et al. 2006).
Uma alternativa a ser explorada são os nitróxidos cíclicos, uma vez que são antioxidantes multifuncionais e apresentam baixa toxicidade in vitro e in vivo (Thiemermann 2003, Soule, Hyodo et al. 2007, Augusto, Trindade et al. 2008). Dentre os vários compostos, o tempol (4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl), considerado uma molécula de baixo peso molecular e apresentando excelente permeabilidade celular e atividade in vitro e in vivo, é uma promissora terapia a ser explorada. Isto, pois vem demonstrando excelentes efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e anti-apoptóticos em vários modelos de injúrias e doenças que acometem o sistema nervoso (Ghosh, Tong et al. 2008, Chiarotto, Drummond et al. 2014, Sunkaria, Sharma et al. 2014, Ali, Abo-Youssef et al. 2016, Neil, Huh et al. 2017).
Recentemente, a terapia com células-tronco emergiu como uma abordagem promissora para vários tratamentos de doenças neurológicas, incluindo ELA (Adami, Scesa et al. 2014). Estas têm o potencial para se diferenciar em diversos tipos celulares durante o início da vida e crescimento. As células-tronco representam uma unidade natural do desenvolvimento embrionário e da reparação tecidual. Elas apresentam a capacidade tanto de se autorregenerar, ou seja, dividir-se e criar outras células-tronco, quanto de se diferenciar e originar diferentes linhagens celulares. As células-tronco são em geral, classificadas segundo sua origem em: células-tronco embrionárias e células-tronco adultas ou somáticas. As células-tronco embrionárias são derivadas do blastocisto e são totipotentes, isto é, têm a capacidade de se diferenciar em células derivadas do endoderma, mesoderma e ectoderma. As células-tronco adultas ou somáticas são células indiferenciadas que se encontram em tecidos diferenciados ou especializados (Morrison, Shah et al. 1997, Kaji and Leiden 2001)
Mais do que estudar somente a reposição seletiva de neurônios ou de células gliais que tenham sido perdidas no curso de uma determinada doença ou em decorrência de uma lesão, pesquisadores têm se debruçado sobre os efeitos da terapia celular na neurogênese endógena. Esta poderia ser induzida ou aumentada através da administração de células-tronco. As células seriam responsáveis por liberação de fatores tróficos ou, ainda, pela modulação dos processos inflamatórios capazes de promover tais modificações ou ainda promover neuroproteção ao tecido (Lindvall and Kokaia 2006, Lindvall and Kokaia 2010).
Assim, há pelo menos duas estratégias principais no uso de células-tronco para o tratamento da ELA. A primeira seria produzir novos motoneurônios para repor aqueles perdidos em decorrência do processo degenerativo inerente à doença. A segunda seria produzir células de suporte que protegeriam os motoneurônios sobreviventes de sofrer subsequente degeneração (Suzuki and Svendsen 2008). Essas células poderiam alterar o curso da doença através da reposição de motoneurônios degenerados e astrócitos disfuncionais que ajudam a promover a morte neuronal ou ainda, estimular a proliferação de progenitores endógenos, liberação de fatores tróficos e modular a inflamação (Silani, Cova et al. 2004, Garbuzova-Davis and Sanberg 2009, Lindvall and Kokaia 2010).
A promissora terapia com células-tronco para reposição neuronal e regeneração do sistema nervoso, bem como para outros tecidos, tem sido uma alternativa esperançosa para pacientes com ELA (Maragakis 2010). Entre os muitos tipos de células-tronco submetidos a ensaios para tratamentos de desordens neurológicas, as mais comuns são as células-tronco neuronais fetais e adultas, as células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC), e as células-tronco mesenquimais (MSCs) (Mattis and Svendsen 2011).
As células mesenquimais podem ser obtidas facilmente a partir de uma variedade de fontes tais como: medula óssea (Prockop 1997), cordão umbilical (Secco, Zucconi et al. 2008)e tecido adiposo (Orbay, Tobita et al. 2012). Uma vez que essas células são obtidas a partir de fontes de tecido adulto, a aplicação de MSCs não envolve problemas éticos significativos (Pflegerl, Keller et al. 2008, Liras 2010). Além disso, como a ELA não afeta o potencial de expansão e diferenciação das MSC (Ferrero, Mazzini et al. 2008), as células podem ser obtidas do próprio paciente, evitando assim, riscos de rejeição.
Diferentes estudos têm demonstrado a eficácia das MSCs, principalmente provenientes da medula óssea ou do tecido adiposo, em retardar o aparecimento da doença e proteger os neurônios motores em camundongos SOD1G93A, mesmo com certa variabilidade em relação à quantidade aplicada e via de administração (Lewis and Suzuki 2014, Yao, Zhijuan et al. 2015).
A terapia celular na ELA já está em fase de testes clínicos. Segundo informações da ABRELA (Associação Brasileira de Esclerose Lateral Amiotrófica), estudos realizados na Itália e nos EUA estão verificando a segurança e eficácia da aplicação de células-tronco adultas em pacientes com ELA.
Portanto, a busca por tratamentos mais complexos que visem ações que abranjam as hipóteses envolvidas na patogênese da ELA são de extrema urgência, com o intuito de promover melhor qualidade de vida aos pacientes e prolongar sua sobrevivência.
2. JUSTIFICATIVA
A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa que se inicia na fase adulta e promove a degeneração dos motoneurônios superiores e inferiores, causando progressiva atrofia e paralisia, levando o paciente a óbito entre 2 a 5 anos após início dos sintomas, geralmente por comprometimento respiratório. O único fármaco disponível para o tratamento da doença é o riluzol, um membro da classe do benzotiazole, que atua principalmente na inibição da liberação do glutamato. O tratamento com riluzol não é curativo, apresentando somente um modesto efeito na progressão da doença, prolongando a vida do paciente por aproximadamente 3 meses. Apesar de ser o único fármaco empregado como tratamento da ELA, os mecanismos pelos quais o riluzol exerce seus efeitos continua alvo de investigações nos estudos científicos.
Acredita-se que, assim como ocorre em outras doenças neurodegenerativas, o mecanismo patológico subjacente a ELA seja um conjunto de alterações celulares e bioquímicas que acabam por desencadear a degeneração dos motoneurônios.
Muitas hipóteses, atualmente aceitas para explicar a etiologia da ELA, foram propostas a partir de estudos com animais expressando diferentes mutações da SOD1. Estas incluem: danos oxidativos, acúmulo de agregados celulares, disfunção mitocondrial, falhas no transporte axonal, deficiência de fatores tróficos, inflamação, efeitos da astrogliose e excitotoxicidade promovida por glutamato. Apesar da ELA ser caracterizada primeiramente por seletiva degeneração dos motoneurônios, tem sido cada vez mais considerada uma doença multifatorial complexa, envolvendo desregulação de processos celulares, afetando ambos, neurônios e células da glia. Dada à natureza multifatorial da patogênese da ELA, a combinação de terapias que apresentem múltiplos caminhos de atuação é uma promessa para alcançar efeito terapêutico maximizado. Com esse intuito, destaca-se o tempol, caracterizado como uma molécula de baixo peso molecular, estável, metal-independente, com excelente permeabilidade celular, ativa tanto in vitro quanto in vivo. Outro alvo das pesquisas em busca de novas terapias para a ELA são as células-tronco, que apresentam a capacidade tanto de se autorregenerar, ou seja, dividir-se e gerar outras células-tronco, quanto de se diferenciar e originar diferentes linhagens celulares. A hipótese se baseia na ideia de que, uma vez introduzidas no sistema nervoso central (SNC), essas células possam promover a reposição das células perdidas durante o curso da doença ou ainda modular a regeneração endógena e/ou cascatas inflamatórias. Pesquisadores têm investigado os efeitos da terapia celular na neurogênese endógena, que poderia ser induzida ou aumentada através da administração de células-tronco. Essas seriam
responsáveis por liberação de fatores tróficos ou, ainda, pela modulação dos processos inflamatórios.
Tendo-se tal panorama em vista, o objetivo do nosso trabalho foi investigar o potencial terapêutico do riluzol, tempol e células-tronco mesenquimais no tratamento da ELA, em camundongos superexpressando a mutação SOD1G93A. Acreditamos que nosso estudo
contribui para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que possam promover benefício e qualidade de vida aos pacientes com ELA.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
Verificar se a associação dos tratamentos com riluzol, tempol e células-tronco mesenquimais apresentam potencial terapêutico em camundongos transgênicos SOD1G93A.
3.2 Objetivos Específicos:
✓ Caracterizar fenotipicamente as células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo que foram transplantadas;
✓ Avaliar a sobrevida, função neuromotora (Rotarod) e a perda de peso associada a progressão da ELA em camundongos transgênicos SOD1G93A tratados e comparar com grupo veículo;
✓ Avaliar a sobrevivência neuronal, através da contagem de motoneurônios no corno anterior da medula lombar, por coloração de Nissl;
✓ Avaliar qualitativamente alterações ultraestruturais decorrentes da ELA através da MET;
✓ Avaliar por imunoistoquímica a cobertura sináptica (sinaptofisina) e a reatividade glial dos astrócitos (GFAP) e micróglia (Iba1);
✓ Avaliar por RT-qPCR a expressão dos transcritos para os fatores neurotróficos (BDNF e GDNF), citocinas pró-inflamatórias (TNFα, INFγ, IL1β e iNOS) e anti-inflamatórias (IL10 e TGFβ) na medula lombar;
4. METODOLOGIA
4.1 Animais
Durante este estudo foram utilizados 118 camundongos transgênicos, da linhagem SOD1G93A (B6SJL), que superexpressam o gene humano SOD1 com a mutação Gly93→Ala (Gurney, Pu et al. 1994). Os casais reprodutores foram doados pela ALS Foundation através do Dr. R Brown (Universidade de Massachusetts, Worcester, EUA) e posteriormente à nós doados pela Profa. Dra. Rosália Mendez-Otero (Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – UFRJ). A colônia está sendo mantida no biotério do Laboratório de Regeneração Nervosa. Os animais foram genotipados pela técnica de PCR a partir do DNA obtido da orelha do animal e o número de cópias do gene SOD1 humano mutante verificado, seguindo-se as normas do fabricante (http://jaxmice.jax.org/neurobiology/als.html). Os primers utilizados para genotipagem e controle do número de cópias SOD1 mutantes estão descritos nas Tabelas 1 e 2 respectivamente. Os fragmentos resultantes foram visualizados em gel de agarose. Todos os experimentos foram conduzidos seguindo-se as normas de ética na experimentação animal (CEUA protocolos números: 3307-1 e 4501/2017). Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Regeneração Nervosa do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional – área de Anatomia (Instituto de Biologia - UNICAMP), sob condições de luz (ciclo de 12 horas de claro/escuro) e temperatura (23°C) controladas. Todos os animais tiveram livre acesso à comida e água, sendo adicionada ração dentro da gaiola dos camundongos transgênicos SOD1G93A, a partir da 15ª semana de vida devido a progressão da doença.
Tabela 1: Descrição dos primers utilizados na genotipagem dos animais (PCR convencional)
Primers Seqüência
Human SOD foward 5’ CAT CAG CCC TAA TCC ATC TGA3’
Human SOD reverse 3’ TCT TAG AAA CCG CGA CTA ACA ATC 5’
Mouse SOD forward 5’ GCA ATC CCA ATC ACT CCA CAG 3’
Mouse SOD reverse 3’ GTC CAT GAG AAA CAA GAT GAC 5’
Tabela 2: Descrição dos primers utilizados para verificação do número de cópias do gene hSOD1 (RT-qPCR).
Primers Seqüência
IMR1544 CAC GTG GGC TCC AGC ATT
IMR3580 TCA CCA GTC ATT TCT GCC TTT G
IMR9655 GGG AAG CTG TTG TCC CAA G
4.2 Grupos Experimentais
Nestes experimentos foram utilizados animais machos e fêmeas, divididos nos seguintes grupos experimentais.
Tabela 3: Divisão dos grupos experimentais.
GRUPOS n° Imunoistoquímica e Nissl (EIS)* n° Imunoistoquímica e Nissl (EF)* n° qRT-PCR (EIS) n° MET (EF) NTG (não transgênicos) 6 6 4 3 ELA – veículo 6 6 4 3 ELA – riluzol 6 6 4 3 ELA - tempol 6 3 4 3 ELA –R+T* 6 3 4 2 ELA - hMSC 6 3 4 2 ELA – hMSC+tempol 6 3 4 2 *R+T: riluzol+ tempol
*EIS: estágio inicial dos sintomas *EF: estágio final
4.3 Tratamentos
4.3.1 Preparação e aplicação do tempol e riluzol
Tanto tempol quanto riluzol foram diluídos em água e, em seguida, administrados por via oral (gavagem) na concentração de 50mg/kg (Chiarotto, Drummond et al. 2014) e 8mg/kg de animal (Kennel, Revah et al. 2000), respectivamente. Os animais do grupo veículo receberam o mesmo veículo de diluição do tempol e riluzol. O peso dos animais foi monitorado dia a dia para o ajuste da dose. O tratamento teve início na fase assintomática da doença (10a semana) e foi realizado em dias alternados até a 14a semana, considerado o
estágio inicial dos sintomas (EIS). Após a 14a semana, o tratamento ocorreu duas vezes por
semana até o estágio final (EF) da doença, considerado o momento em que o animal se mostrou incapaz de retornar à posição normal dentro de 30 segundos após ter sido posicionado em decúbito dorsal.
4.3.2 Tratamento com células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) adultas derivadas de tecido adiposo
As células-tronco mesenquimais humanas derivadas de tecido adiposo foram obtidas de material lipoaspirado, sob consentimento dos doadores e aprovação do uso das células (CAAE: 1162.0.146.000-11). Os experimentos envolvendo a obtenção, extração e cultivo das células, bem como, a citometria de fluxo, foram realizados no laboratório de
