Início e progressão da ELA

Para verificar se os tratamentos empregados neste estudo teriam efeito sobre o início da doença, evolução dos sintomas, progressão e sobrevida dos animais com ELA, foi realizado o monitoramento da massa corporal dos animais (Figura 41) e score neurológico (Figura 42). O acompanhamento do peso dos animais foi utilizado para detectar o início da ELA, assim como acompanhar a progressão para o estágio sintomático. Os critérios utilizados para estabelecer cada uma dessas etapas foram mencionados no item 4.4 da metodologia.

A perda do peso corporal em camundongos SOD1G93A _{foi observada a partir da 13ª}

semana de idade e ocorreu de maneira progressiva até o estágio final da doença, quando comparados a animais NTG (Figura 9). De modo geral, os tratamentos empregados não tiveram influência sobre o padrão de perda de peso decorrente da ELA (Figuras 41 e 42). Diferenças estatísticas foram observadas na associação da terapia com hMSC+tempol, onde observou-se, a partir da 16.5 semana, menor perda de peso quando comparada aos animais veículo (#p<0,05) (Figura 42: D).

Figura 41: Monitoramento do peso corporal em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até a 17ª semana (sintomático). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) riluzol; (C) tempol e (D) R+T. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.

Figura 42: Representação gráfica da perda de peso corporal em animais trangêncios. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até a 17ª semanas (sintomático). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) tempol; (C) hMSC e (D) hMSC+tempol. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.

Para melhor visualizar a tendência dos tratamentos com tempol e hMSC, em reduzir a perda de peso observada até a 17ª semana e verificar se essa tendência era contínua mesmo com a progressão da ELA, foi confeccionado um gráfico ilustrativo com o número de animais que sobreviveram o máximo de tempo entre os grupos (20 semanas) (Figura 43). Como ilustrado, os tratamentos tendem a reduzir a perda de peso, mesmo nos estágios mais avançados da doença. Apesar de não terem sido realizados testes estatísticos, devido ao n=2 para alguns grupos, é notável que os tratamentos com tempol e hMSC exercem efeitos em reduzir a perda de peso em estágios mais avançados da doença (a partir da 17° semana), sendo estes, claramente evidentes no grupo tratado com tempol.

Figura 43: Representação gráfica da perda de peso corporal durante a progressão da ELA (20 semanas).

A evolução dos sintomas foi acompanhada pela avaliação clínica conforme sugerido no manual da linhagem, através do score neurológico. Os tratamentos com riluzol, tempol e R+T, apresentaram uma evolução dos sintomas similar aos animais do grupo veículo (Figura 44: A-D). No entanto, o grupo tratado com hMSC apresentou retardo significativo na evolução do score neurológico desde a 15ª semana, com diferenças estatísticas nas 16ª, 16.5ª e 17ª semanas, quando comparado ao grupo veículo (Figura 45: C). Do mesmo modo, como descrito na análise do peso corporal, foi verificado se esse efeito poderia ser prolongado mesmo com a evolução da doença. Como ilustrado na Figura 46, a terapia com hMSC mostrou-se capaz de retardar a evolução dos sintomas durante a progressão da doença, sendo que na 20ª semana, estágio avançado da doença, os animais ainda estavam no score 2, enquanto animais dos demais grupos experimentais já haviam atingido o score 4, no mesmo período analisado.

Figura 44: Representação gráfica da evolução dos sinais clínicos da ELA em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até 17ª semanas (sintomáticos). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) riluzol; (C) tempol e (D) R+T. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.

Figura 45: Representação gráfica da evolução dos sinais clínicos da ELA em animais transgênicos. (A) animais NTG e com ELA, com e sem tratamento, acompanhados da 10ª semana (assintomático) até 17ª semana (sintomático). As análises estatísticas foram feitas isoladamente para cada tratamento comparando-os com animais NTG e veículo: (B) tempol; (C) hMSC e (D) hMSC+tempol. ANOVA de duas vias e post hoc Bonferroni.

Figura 46: Representação gráfica da evolução dos sinais clínicos (sintomas) durante a progressão da ELA (20 semanas).

A probabilidade de início da doença (Figura 47: A) nos animais transgênicos SOD1G93A foi calculada conforme descrito no item 4.4 da metodologia, considerando-se a idade em que o animal apresentou seu peso corporal máximo. Não houve diferenças de probabilidade de início da ELA entre os grupos experimentais, sendo a média de início da doença na 13ª semana. A duração da doença foi calculada considerando-se a subtração da semana de morte e a semana de início da doença, em cada animal. O tempo de duração da doença (semanas) entre os grupos experimentais foi similar, sendo em média de 5.5 semanas (Figura 47: B).

Figura 47: Representação gráfica da probabilidade de início da ELA (A) e duração da doença (B) entre os grupos experimentais. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos. ANOVA de uma via e post hoc Newman-Keuls.

A análise da sobrevida dos animais (Figura 48: A-F) foi realizada de maneira retrospectiva, considerando a data de eutanásia e a data de nascimento dos animais. Os resultados mostraram uma tendência dos tratamentos com tempol (Figura 48: C) e hMSC (Figura 48: F) em aumentar a sobrevida dos animais, quando comparados ao grupo veículo. No entanto não foram observadas diferenças estatísticas entre esses grupos sendo a média de sobrevivência de: 129 dias no grupo veículo (n=15), 123 dias no grupo riluzol (n=11), 133 dias no grupo tempol (n=9) e 140 dias no grupo hMSC (n=7). Os grupos tratados com R+T e

hMSC+tempol apresentaram média de sobrevivência de 143 dias (n=9) e 147 dias (n=9) (Figura 48: D e F), respectivamente, promovendo um aumento de sobrevida de 14 dias no grupo R+T (##p<0,0094) e 18 dias no grupo hMSC+tempol (##p<0,0086), quando comparados ao grupo veículo.

Figura 48: Curvas de sobrevivência Kaplan-Meier (A-F) em animais transgênicos SOD1G93A_{. Log-rank (Mantel-}