UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
CAROLINE GOMES RAVAZZI
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ADULTERANTES EM WHEY
PROTEIN CONCENTRADO EMPREGANDO ESPECTROSCOPIA NO
INFRAVERMELHO PRÓXIMO E RESOLUÇÃO MULTIVARIADA DE
CURVAS
CAMPINAS 2019
IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ADULTERANTES EM WHEY
PROTEIN CONCENTRADO EMPREGANDO ESPECTROSCOPIA NO
INFRAVERMELHO PRÓXIMO E RESOLUÇÃO MULTIVARIADA DE
CURVAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Química na área de Química Analítica.
Orientador: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi
O arquivo digital corresponde à versão final da Dissertação defendida pela aluna Caroline Gomes Ravazzi e orientada pelo Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi.
CAMPINAS 2019
Camila Barleta Fullin - CRB 8462
Ravazzi, Caroline Gomes,
R195i RavIdentificação e quantificação de adulterantes em whey protein concentrado empregando espectroscopia no infravermelho próximo e resolução multivariada de curvas / Caroline Gomes Ravazzi. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
RavOrientador: Ronei Jesus Poppi.
RavDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Rav1. Proteínas do soro do leite. 2. Alimentos - Adulteração e inspeção. 3. Espectroscopia de infravermelho próximo. 4. Resolução multivariada de curvas. I. Poppi, Ronei Jesus, 1961-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Identification and quantification of adulterants in whey protein
concentrate using near infrared spectroscopy and multivariate curve resolution
Palavras-chave em inglês:
Whey protein
Food adulteration and inspection Near infrared spectroscopy Multivariate curve resolution
Área de concentração: Química Analítica
Titulação: Mestra em Química na área de Química Analítica Banca examinadora:
Ronei Jesus Poppi [Orientador] Juliana Azevedo Lima Pallone Marcia Cristina Breitkreitz
Data de defesa: 30-01-2019
Programa de Pós-Graduação: Química
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-6780-0318
- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/9119281368514563
Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi (Orientador)
Profa. Dra. Juliana Azevedo Lima Pallone (FEA / UNICAMP)
Profa. Dra. Marcia Cristina Breitkreitz (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pela aluna CAROLINE GOMES RAVAZZI, aprovada pela Comissão Julgadora em 30 de janeiro de 2019.
Dedico este trabalho à minha maravilhosa família.
Em especial ao meu pai, ADILSON, à minha mãe, MARISA, e à minha irmã, LORENA, por serem meus exemplos de amor incodicional e meu porto seguro.
Em primeiro lugar, agradeço aos meus pais e heróis, Adilson e Marisa, pelo apoio incondicional, pelos conselhos e ensinamentos, pelas palavras encorajadoras e por todo amor demostrado em cada instante da minha vida. Sem vocês nada disso seria possível. À minha irmã, Lorena, por sempre estar disponível a me ajudar em horas que tanto precisei. À minha amável e amada tia, Dalva, por todo carinho e à minha querida avó, Mafalda, que hoje não está mais conosco, mas que por muitos anos se fez presente em minha vida, me colocando em suas orações e torcendo pelo meu sucesso.
Aos meus amigos de longa data: Felipe, Tulio, Nat e Fernando que mesmo de longe continuam comigo, dividindo aflições e conquistas. E, em especial, ao Juninho, por ter me incentivado a fazer a prova para esse programa de mestrado, pelo ombro sempre amigo e pelo aprendizado compartilhado.
Às pessoas maravilhosas que Campinas me deu a oportunidade de conhecer, em especial os amigos do LAQQA: Javier, Luciana Terra, Willian, Marina, Hery, Felipe, Carlos, Guto, Débora, Victor Kelis e Victor. Obrigada por tantos momentos de colaboração, descontração e interação.
Um agradecimento especial ao Humberto por ser sempre muito prestativo e amigável e ao Prof. Dr. Ronei por me acolher em seu grupo, me dar a oportunidade de crescimento acadêmico e me conceder todo apoio para desenvolver esse trabalho, que com certeza abrirá muitas portas para meu futuro profissional.
Agradeço também à Profa. Dra. Márcia Breitkreitz, que acompanhou minhas atividades durante o PED e me proporcionou muitos ensinamentos e inspiração profissional.
Ao Instituto de Química da UNICAMP, pela excelência em infraestrutura, ensino e pesquisa e aos órgãos de fomento.
À FUNCAMP pelo apoio financeiro.
Por fim, agradeço a todos que, de alguma forma, marcaram minha passagem pela UNICAMP.
Dentre os suplementos alimentares mais populares e consumidos no mundo está o whey
protein, que corresponde a uma mistura complexa de proteínas globulares extraídas do
soro do leite. Nesta dissertação, as técnicas de espectroscopia pontual (NIRS, Near
Infrared Spectroscopy) e espectroscopia de imagem (NIR-CI, Near Infrared Chemical Imaging) na região do infravermelho próximo foram avaliadas como estratégias para
identificação e quantificação de adulterantes em amostras de whey protein concentrado (WPC). Modelos empíricos multivariados para quantificação foram construídos utilizando o método de resolução multivariada de curvas (MCR-ALS). Inicialmente, as adulterações foram realizadas a partir da adição individual de amido, trigo, soja, milho, arroz e ureia em faixas de concentração de 1 a 30% (m/m). Espectros de reflectância dessas amostras foram obtidos empregando dois instrumentos pontuais distintos: um espectrômetro de bancada (Spectrum 100N FT– NIR Perkin Elmer) e um instrumento miniaturizado e portátil (DLP NIRscan Nano Texas Instruments). Posteriormente, a adulteração por adição de cafeína foi estudada na faixa de concentração de 0,1 a 10% (m/m), empregando um sistema de imagem (Spotlight 400N FT-NIR Imaging System, Perkin-Elmer). Os resultados dos modelos MCR-ALS para quantificação apresentaram erros absolutos inferiores a 6% e todos os espectros recuperados apresentaram alta correlação com os espectros de referência dos adulterantes avaliados. Testes de aleatorização foram empregados para comparar estatisticamente a performance dos modelos Bancada e MCR-NIRS-Portátil. Apesar de o instrumento portátil possuir resolução reduzida e faixa espectral mais estreita, seus dados geraram modelos com capacidade preditiva equivalente aos modelos do instrumento de bancada para a maioria dos adulterantes. A espectroscopia de imagem (NIR-CI) se mostrou como um método analítico eficiente para a análise de amostras em faixas de concentração mais baixas (1-10% m/m), uma vez que não foi possível quantificar a adulteração com cafeína dessas amostras utilizando a técnica pontual (NIRS). Além disso, usando NIR-CI foi possível alcançar menores limites de detecção quando comparado a NIRS, sendo que os mapas de distribuição obtidos identificam a presença de cafeína em níveis de 0,5%.
Whey protein is one of the most popular dietary supplements worldwide. It corresponds to a complex mixture of globular proteins extracted from raw milk during cheese manufacturing. In this dissertation, Near Infrared Spectroscopy (NIRS) and Near Infrared Chemical Imaging (NIR-CI) techniques were evaluated as strategies to identify and to quantify adulterants in whey protein concentrate (WPC) samples. Empirical models for quantification were constructed using Multivariate Curve Resolution (MCR-ALS) method. Adulterations were carried out through the individual addition of starch, wheat, soybean, corn, rice and urea to WPC in the concentration range of 1 to 30% (w/w). Reflectance spectra of adulterated samples were obtained using two instruments: a benchtop spectrometer (Spectrum 100N FT-NIR Perkin Elmer) and a miniaturized portable instrument (DLP NIRscan Nano Texas Instruments). WPC samples were also adulterated trough the addition of caffeine in the concentration range of 0.1 to 10% (w/w) and analyzed using an imaging system (Spotlight 400N FT-NIR Imaging System, Perkin-Elmer). MCR-ALS models for quantification presented absolute errors lower than 6% for all adulterants evaluated and recovered spectra showed high correlation with reference spectra. Randomization tests were applied to compare the performance between Benchtop and MCR-NIRS-Portable models. Despite of the reduced resolution and narrower spectral range, the data from portable instrument generated models with predictive capacity equivalent to the benchtop instrument models. In addition, NIR-CI proved to be more efficient than NIRS for analyzing samples at lower concentration ranges (1-10% w/w), making it possible to identify the presence of caffeine at concentration levels of 0.5%.
deve estar contida no rótulo do produto. ... 20 Figura 2. Faturamento da indústria de Sports Nutrition no Brasil nos últimos anos. Adaptado de Brasnutri (2016)[29]. ... 21 Figura 3. Composição média do leite bovino. ... 22 Figura 4. Processo de Spray Drying utilizado para secagem do concentrado proteico. Adaptado de Rosa, Tsukada e Freitas (2006)[43]. ... 25 Figura 5. Região do infravermelho próximo destacada no espectro eletromagnético. .... 28 Figura 6. Modos vibracionais: estiramentos e deformações moleculares. ... 29 Figura 7. Arranjo de dados gerados por espectroscopia de imagem: (A) representação de um hipercubo espectral e (B) de uma matriz desdobrada com dimensões (X*Y, 𝜆) à direita. ... 31 Figura 8. Representação do modelo bilinear do MCR. ... 32 Figura 9. Esquema de implementação da restrição de correlação na otimização via MCR-ALS.Adaptado de Debus et al (2017)[65]. ... 36 Figura 10. (A) Estrutura óptica interna do instrumento portátil e (B) tecnologia de micro-espelhos (DMD) utilizada para seleção de comprimento de onda. Adaptado de User’s Guide,Texas Instruments (2017)[68]. ... 37 Figura 11. Exemplo do efeito do algoritmo MSC no pré-tratamento de dados espectrais (A) Espectros originais obtidos a partir do desdobramento das imagens hiperespectrais (B) Espectros corrigidos. ... 39 Figura 12. Teste qualitativo para identificar a presença de iodo no WPC usado como padrão par efetuar as adulterações. (A) Solução de amido com 3 gotas de iodo 2%, (B) WPC com excesso de iodo 2%, (C) WPC sem iodo. ... 44 Figura 13. Instrumento portátil com suas respectivas dimensões em contraste com o instrumento de bancada. ... 45 Figura 14. Espectros puros dos adulterantes estudados (A) obtidos através do instrumento portátil e (B) obtidos através do instrumento de bancada. A janela destacada na cor preta indica o limite da faixa espectral do instrumento portátil. ... 46
espectros adquiridos no instrumento pontual portátil. ... 50 Figura 17. Curvas de concentração conhecida versus prevista obtidas a partir dos espectros adquiridos no instrumento pontual de bancada. ... 51 Figura 18. Representação dos vetores de resíduos utilizados no teste de aleatorização. ... 52 Figura 19. Histogramas da distribuição das diferenças médias das permutações. A linha vermelha indica o valor da média quadrática real dos resíduos(d ̅^*). A esquerda da linha estão as médias menores que d ̅^* e a direita da linha, as maiores que d ̅^*. ... 54 Figura 20. Estrutura da cafeína (1,3,5- trimetilxantina). ... 56 Figura 21. Sistema de Imagem Spotlight 400N FT-NIR Imaging System. ... 57 Figura 22. (A) Mapa de distribuição de 16mm2 de amostra adulterada com cafeína a 1% seccionado em 4 partes de 4 mm2. (B) Elementos de área de 4mm2 (usado inicialmente) e 16 mm2, respectivamente, delimitados sobre a superfície de uma pastilha. ... 59 Figura 23. Esquema ilustrando a organização dos dados experimentais. A Matriz de Dados dispõe os espectros médios nas primeiras linhas seguidos dos 6400 espectros obtidos em cada pixel da amostra X%, sendo que X varia de 1 a 10%. ... 60 Figura 24. Informações obtidas a partir do modelo MCR-ALS: Espectros Recuperados, mapas de distribuição e perfis de concentração. ... 61 Figura 25. Espectros recuperados das amostras de 1 a 10 em cinza em contraste com o espectro de referência de cafeína pura em preto. ... 62 Figura 26. Mapas de distribuição de cafeína em amostras de whey adulterado. Três imagens distintas foram coletas para cada amostra, sendo que este corresponde ao primeiro conjunto e por isso foi denominado Imagem (1). ... 63 Figura 27. Mapas de distribuição de cafeína para o conjunto Imagem (2). ... 64 Figura 28. Mapas de distribuição de cafeína para o conjunto Imagem (3). ... 64 Figura 29. Resultados de quantificação obtidos em três imagens distintas para amostra de 0,5% (m/m). O valor médio de concentração encontrado pelo modelo foi igual a (0,7 ± 0,2)%. ... 67
Tabela 2. Regiões espectrais do infravermelho em unidades de cm-1 e nm. ... 28 Tabela 3. Comparação entre as condições de operação do instrumento portátil e do instrumento de bancada. ... 45 Tabela 4. Parâmetros obtidos pelo MCR para cinco adulterantes considerando o instrumento portátil e o de bancada. ... 49 Tabela 5. p-valores obtidos através do teste de aleatorização. ... 53 Tabela 6. Condições de operação do sistema de imagem. ... 57 Tabela 7. Valores dos coeficientes de correlação entre os espectros recuperados pelo modelo e o espectro de cafeína de referência. ... 62 Tabela 8. Resultados de previsão do modelo MCR-ALS. ... 65 Tabela 9. Resultados de quantificação para cafeína com dados experimentais oriundos do instrumento de pontual de bancada. ... 68
1.1 Fraudes em Alimentos ... 17
1.2 Adulteração em Alimentos e PrincipaisTécnicas Analíticas ... 18
1.3 Suplementos Alimentares ... 19
1.4 Whey Protein ... 21
1.5 As Proteínas do Soro do Leite ... 22
1.6 Processo de Fabricação de Whey Protein ... 24
1.7 Adulteração de Whey Protein ... 26
1.8 Fundamentos Teóricos ... 27
Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIRS) ... 27
Espectroscopia de Imagem no Infravermelho Próximo (NIR-CI) ... 30
Resolução Multivariada de Curvas ... 31
Restrição de Correlação ... 35
Espectrômetro DLP NIRscan Nano ... 36
Tratamento dos Dados ... 37
Detecção de Amostras Anômalas ... 38
2 Objetivos ... 40
2.1 Gerais ... 41
2.2 Específicos ... 41
3 Estudo de Adulteração de WPC por Adição de Amido, Arroz, Milho, Soja, Trigo e Ureia Empregando NIRS ... 42
3.1 Considerações Gerais ... 43
3.2 Experimental ... 43
Preparo das Amostras ... 43
Condições Operacionais e Aquisição de Espectros ... 45
3.3 Resultados e Discussão ... 46
4 Estudo de Adulteração de WPC por Adição de Cafeína Empregando NIR-CI .. 55
4.1 Considerações Gerais ... 56
4.3 Resultados e Discussão ... 58 5 Considerações Finais ... 69 6 Referências ... 71
Capítulo 1
1 Introdução
1.1 Fraudes em Alimentos
As fraudes em produtos alimentícios são economicamente motivadas pelo objetivo de obter lucratividade ilícita e apresentam uma grande ameaça à segurança de alimentos. Inúmeros casos ganharam notoriedade na mídia e abalaram a opinião pública, evidenciando o quão vulneráveis estão os consumidores à esse tipo de prática ilegal. No Brasil, duas investigações recentes tomaram grandes proporções e chamaram a atenção do público: a operação Carne Fraca e a operação Leite Compen$ado.
Deflagrada pela Polícia Federal em março de 2017, a operação Carne Fraca desvendou um esquema de corrupção entre fiscais e frigoríficos que burlava parâmetros de controle sanitário[1]. Na ocasião, 30 empresas do ramo foram acusadas de comercializar carne estragada, mudando a data de vencimento e maquiando o mau aspecto com produtos químicos supostamente carcinogênicos. Já a Operação Leite Compen$ado foi uma força tarefa iniciada em meados de 2012 com o objetivo de desmarcarar um esquema de fraudes em leite no sul do Brasil. Análises fisico-químicas de várias amostras de leite cru identificaram a presença de ureia, água contaminada com coliformes fecais, álcool etílico e até mesmo formol[2].
E a lista de escândalos é vasta: diversos incidentes foram relatados em muitos outros países, provocando problemas de saúde aos cosumidores e até mortes. Na Noruega, em 2002, uma adulteração de bebidas alcoólicas com metanol levou nove pessoas a óbito e 51 pessoas foram internadas por intoxicação. O licor responsável por esses casos continha 20% de metanol e 80% de etanol[3]. Na China, em 2008, melamina foi usada para adulterar os níveis de proteína em leite em pó e em formulações infantis. A adulteração resultou na contaminação de 294 mil indivíduos, com mais de 50 mil deles hospitalizados com problemas urinários e renais, e seis mortes[4,5]. Na Europa, em 2013, vários países da UE encontraram carne de cavalo em produtos fraudulentamente rotulados como carne bovina[6]. Em 2014, 500 mil garrafas de água dos mercados da Grã Bretanha foram recolhidas depois da identificação de brometo em níveis superiores aos permitidos pela legislação. Apesar de comercializada como água mineral, a água contida nas garrafas vinha da torneira, e não de fontes naturais[7].
1.2 Adulteração em Alimentos e PrincipaisTécnicas Analíticas
De uma maneira geral, as fraudes em alimentos podem ser classificadas como: alteração, adulteração, falsificação e sofisticação[8]. Em particular, a fraude por adulteração caracteriza-se como uma fraude intencional e geralmente está associada a prejuízos nutricionais e econômicos para o consumidor. Por afetar pouco as características sensoriais dos alimentos, a fraude por adulteração se torna difícil para o consumidor identificar, sendo geralmente necessárias análises específicas para sua detecção. A adulteração pode ocorrer por diversos processos: por adição de substâncias inferiores ao produto; por adição de elementos não permitidos, por subtração de constituintes dos alimentos, por substituição de matéria prima anunciada no rótulo por outra de menor valor e por omissão de constituintes da fórmula de registro de fabricação[9].
Atualmente há uma grande preocupação na aplicação de técnicas de análise química no controle de qualidade de alimentos[10,11]. Do mesmo modo que os esquemas fraudulentos evoluem, os métodos de detecção dos mesmos precisam também estar em processo de aperfeiçoamento constante. A maioria das adulterações não é trivialmente perceptível pelo consumidor e por isso cabe a entidades responsáveis pelo controle da qualidade realizar a supervisão desses produtos. Também há interesse por parte dos produtores de alimentos de garantir a autenticidade de suas materias-primas e também evitar a competição injusta de falsificadores, que muitas vezes ganham vantagem econômica no mercado através da comercialização de produtos fraudulentos a preços mais atraentes. Daí surge a importância de estudar e desenvolver metodologias que permitam garantir a autenticidade e assim dar respaldo legal ao consumidor e ao produtor que forem prejudicados por ações inescrupulosas e ilícitas.
Técnicas espectroscópicas como ultravioleta (UV), infravermelho próximo (NIR), infravermelho médio (MIR), Raman e ressonância magnética nuclear (NMR) tem sido amplamente empregadas no controle de qualidade de processos industriais, na discriminação de amostras e também na identificação de fraudes e autenticidade de alimentos[10,12–14]. Estas técnicas são não-destrutivas, rápidas, podem ser aplicadas a uma ampla variedade de amostras e ainda possuem custo reduzido quando comparadas
a outras técnicas analíticas como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a cromatografia gasosa (GC) e a espectroscopia de massas (MS).
Particularmente, o desenvolvimento de métodos quimiométricos em concomitante com a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) tem atraído considerável atenção dos pesquisadores e da indústria de alimentos[15,16]. Na última década, vários estudos sobre a detecção de adulterações em alimentos reportam o emprego da espectroscopia NIR[17]. A técnica foi implementada com sucesso por diversos pesquisadores para identificar adulterantes em amostras de mel[18,19], leite em pó[20], café[21], farelo de soja[22], iogurte, hambúrguer[23], páprica[24], água de coco[25], cacau em pó[26], azeite de oliva[27], dentre outras.
1.3 Suplementos Alimentares
Suplemento alimentar é a denominação popular usada para fazer referência a produtos que tem a finalidade de complementar a dieta de uma pessoa saudável. O principal órgão responsável pelo controle efetivo, normatização, aperfeiçoamento e fixação de identidade desses produtos é a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Segundo definição da ANVISA, os produtos que complementam a dieta com nutrientes ou outras substâncias podem ser classificados em duas categorias específicas: os Suplementos Vitamínicos e Minerais e os Alimentos para Atletas, cujo regulamento técnico (ou seja, descrição da finalidade, composição e rotulagem) foi definido em abril de 2010 (RDC n.18/2010)[28] (Figura 1). Ainda segundo a ANVISA, produtos importados de outros países com a denominação de dietary supplements não podem ser comercializados como alimento para atletas no Brasil se contiverem substâncias terapêuticas ou medicamentosas em sua formulação, pois essas substâncias não são admitidas em produtos alimentícios de acordo com o artigo 56 do Decreto-Lei n. 986/69.
Os alimentos para atletas são especialmente formulados para atender necessidades nutricionais específicas e auxiliar no desempenho esportivo de atletas, ou seja, profissionais praticantes de exercícios físicos que requerem esforço muscular intenso. Esses produtos não podem apresentar estimulantes, hormônios ou outras substâncias consideradas como doping pela Agência Mundial Antidoping (WADA – World
Antidoping Agency) nem substâncias com propriedades terapêuticas, como extratos
hidroeletrolítico, energético, proteico, para substituição parcial de refeições, de creatina e de cafeína, sendo que essa denominação deve constar na rotulagem mesmo no caso de produto importado[28].
Figura 1. Categorias de suplementos alimentares segundo a ANVISA. Essa identificação deve estar contida no rótulo do produto.
No Brasil, suplementos vitamínicos e minerais e alimento para atletas possuem livre comércio, ou seja, não é necessário prescrição médica para adquiri-los[28]. Devido a essa facilidade de acesso, o consumo desses produtos tem se tornado uma tendência entre praticantes de atividades físicas, sejam eles profissionais ou amadores, e vem ganhando espaço na vida dos brasileiros. O setor registrou um faturamento de R$1,49 bilhão em 2016 segundo a Associação Brasileira dos Fabricantes de Suplementos Nutricionais e Alimentos para Fins Especiais (BrasNutri)[29]. A ascensão constante entre os anos 2010 a 2016 ilustrada na Figura 2 revela o pleno potencial de crescimento e lucratividade desse segmento no Brasil.
Um grande problema frequentemente discutido sobre esse mercado bilionário é a falta de fiscalização periódica para garantir que os produtos de fato atendam às normas de segurança e qualidade.
Figura 2. Faturamento da indústria de Sports Nutrition no Brasil nos últimos anos. Adaptado de Brasnutri (2016)[29].
1.4 Whey Protein
O whey protein (WP) está entre os suplementos mais populares e mais consumidos no mundo. Ele consiste em um concentrado protéico produzido a partir do soro do leite[30,31]. Estima-se que no Brasil, a cada 10 suplementos vendidos, 6 sejam WP[32]. Nos últimos anos, numerosas pesquisas vêm demonstrando a qualidade nutricional das proteínas solúveis do soro do leite[33–35]. Há algumas décadas atrás o soro era descartado pela indústria de alimentos durante o processo de fabricação de queijos; foi somente a partir dos anos 70 que pesquisadores passaram a estudar as propriedades de suas proteínas[31,36].
Estudos afirmam que as necessidades proteicas de indivíduos envolvidos em treinos de força podem ser até duas vezes maiores do que indivíduos sedentários[37]. Isso porque exercícios intensos induzem a diminuição da síntese proteica nos músculos e aumentam a degradação de aminoácidos, resultando em um balanço proteico negativo. Sendo assim, a ingestão de proteínas favorece a recuperação e a síntese protéica muscular[37].
O WP possui um excelente perfil de aminoácidos essenciais, é facilmente digerido e absorvido; estimula o crescimento muscular, promove redução de gordura corporal e aumenta o desempenho esportivo[34]. Além disso, alguns ensaios clínicos sugerem que
a proteína do soro pode possuir propriedades anti-inflamatórias, anti-tumorais e também prevenir doenças cardiovasculares[30,38].
O WP encontra-se comercialmente disponível nas categorias concentrado, isolado e hidrolisado, diferindo quanto a forma e quantidade de proteína por porção[30]. O whey protein concentrado (WCP) contém de 25% a 89% de proteína intacta e quantidades apreciáveis de gordura, lactose e minerais. O whey protein isolado (WPI) contém de 90% a 95% de proteína intacta com gordura e lactose em quantidades mínimas ou mesmo ausentes[30]. Já o whey protein hidrolisado (WPH) contém uma fração concentrada e isolada, porém suas proteínas sofrem hidrólise por enzimas proteolíticas e são quebradas em peptídeos menores com alto valor nutricional, resultando em maior velocidade de absorção e baixa alergenicidade[30].
1.5 As Proteínas do Soro do Leite
O leite é um fluido complexo composto, basicamente, por 13% de elementos sólidos (gordura, carboidratos, proteínas, sais minerais e vitaminas) e 87% de água[39]. As proporções dos constituintes do leite estão ilustradas na Figura 3. Essa composição pode variar de acordo com a raça das vacas, alimentação (plano de nutrição e forma física da ração), estágio de lactação, forma de manejo e intervalo entre as ordenhas[39].
O principal carboidrato encontrado no leite é a lactose, seguido de glicose e galactose em pequenas quantidades. A gordura está presente na forma de pequenos glóbulos, suspensos na fase aquosa. O leite é uma importante fonte de vitaminas (como A, C, D, E, K, complexo B) e sais minerais (como o cálcio e o fósforo). A parte proteica é constituída por 2 grupos de proteínas: caseínas (80%) e proteínas do soro (20%)[34].
O soro do leite é rico em proteínas de alto valor biológico, também chamadas de proteínas completas[31]. As proteínas completas são aquelas que provém de fontes animais e podem ser encontradas no ovo, leite, carne, peixe e aves. Já a maioria das proteínas vegetais (lentilhas, feijões, ervilhas, soja) é considerada incompleta e possui um valor biológico relativamente menor. Proteínas de alto valor biológico contém todos os aminoácidos essenciais em quantidades e proporções ideais para atender às necessidades humanas. Dentre os 21 aminoácidos que são metabolizados pelo organismo humano, oito são chamados essencias: leucina, isoleucina, valina, triptofano, metionina, fenilalanina, treonina e lisina. Esses aminoácidos não são sintetizados pelo organismo e por isso devem ser fornecidos através da alimentação.
As proteínas do soro apresentam estrutura globular contendo algumas pontes de dissulfeto, que conferem um certo grau de estabilidade estrutural. As proteínas (frações peptídicas) contidas no soro são: beta-lactoglobulina (BLG), alfa-lactoalbumina (ALA), albumina do soro bovino (BSA), imunoglobulinas (Ig‘s), glicomacropeptídeos (GMP), lactoferrina (Lf) e lactoperoxidase(Lp), além de outras frações menores que vão depender do método utilizado para separação e obtenção do soro[34] (Tabela 1). A BLG, por exemplo, representa até 55% das proteínas do soro, é composta por 162 aminoácidos e possui em sua estrutura um grupo tiol livre, podendo associar-se a outras proteínas hidrofóbicas.
A separação do soro pode ser realizada por três processos principais: coagulação enzimática das caseínas obtendo-se o soro doce (produção de queijos tipo Cheddar, Suíço e Mussarela), precipitação ácida no pH isoelétrico obtendo-se caseinatos e soro ácido (produção de queijos tipo Cottage e Ricota) e separação física das micelas de caseína por ultrafiltração (obtenção de concentrados ou isolados proteicos).
Tabela 1. Frações peptídicas constituíntes do soro do leite bovino.
Proteínas do Soro Concentração no Leite Bovino BLG 50% a 55% ALA 20% a 25% BSA 5% a 10% Ig’s 10% a 15% GMP 10% a 15% Lf 1% a 2% Lp 0,50%
Quando está na forma líquida o soro apresenta uma proporção de 93% de água para 0,6% de proteínas. Os produtos que podem ser obtidos a partir do soro líquido são designados em: soro em pó, soro em pó parcialmente deslactosado, soro em pó parcialmente desmineralizado, concentrados proteicos (>25% proteína seca) e isolados proteicos (> 90% proteína seca)[40], sendo que o produto concentrado pode ter um valor comercial de 3 a 10 vezes maior que o soro em pó.
1.6 Processo de Fabricação de Whey Protein
O sucesso comercial do WP tem colaborado como o desenvolvimento e emprego de novas tecnologias para aumentar a eficiência da concentração das proteínas a partir do soro do leite. Há um cuidado especial para preservar a estrutura e a atividade biológica das proteínas no produto acabado. Por isso, o processamento acontece sob baixas temperaturas e sem alterações de pH, a fim de evitar a desnaturação das estruturas.
O método mais utilizado para obtenção de concentrados proteicos é a ultrafiltração. Esse processo permite a separação seletiva da água e de alguns solutos através da passagem do soro por uma membrana semipermeável[41]. A técnica possibilita a purificação e concentração por meio da segregação entre componentes de alta massa
molecular em solução (proteínas) e componentes de baixa massa molecular (lactose,
minerais, nitrogênio não proteico e vitaminas)[42].
Por meio da ultrafiltração (e dependendo do tipo de membrana utilizado) obtem-se um concentrado proteico contendo de 25 a 89% de proteínas, ou isolado proteico,
contendo mais de 90% de proteínas. O processo de ultrafiltração pode ser projetado para operar em batelada ou em processo contínuo, sendo a operação contínua a mais adequada para processos em larga escala[41].
Após a ultrafiltração, o concentrado proteico passa por um processo de secagem. A técnica mais utilizada atualmente é o Spray Drying (ou secagem por atomização), que tem sido aplicada em indústrias alimentícias e farmacêuticas para secagem de materiais que apresentam sensilidade ao calor (Figura 4). Nesse processo, o concentrado proteico é inicialmente disperso em pequenas gotas por meio de um atomizador, a fim de aumentar a área de superfície do líquido. Em seguida, uma corrente de ar quente é aplicada sobre as gotículas, possibilitando a tranferência de calor e a rápida evaporação formando assim partículas sólidas[43].
Figura 4. Processo de Spray Drying utilizado para secagem do concentrado proteico. Adaptado de Rosa, Tsukada e Freitas (2006)[43].
Uma outra técnica de secagem é a liofilização, ou secagem por congelamento. Nesse processo o concentrado proteico é congelado a -40ºC sob condições de alto vácuo e a água é posteriormnete retirada por sublimação, passando diretamente do estado
sólido para o gasoso. A liofilização permite a desidratação sem exposição a altas temperaturas, mantendo assim o valor nutricional do produto[44]. Porém, essa técnica exige maiores investimentos operacionais quando comparada ao Spray Drying.
1.7 Adulteração de Whey Protein
Devido a imensa popularidade e o alto valor de mercado, casos envolvendo adulteração de WP foram relatados recentemente tanto no Brasil quanto em outros países, o que compromete a qualidade dos produtos e indica prática desleal de comércio. Nos casos mais comuns, a adulteração ocorre através da adição de proteínas de baixo valor biológico ou de compostos com elevado teor de nitrogênio, que quando misturados ao WP podem maquiar o conteúdo proteico. Isso porque o método Kjeldahl, que é tradicionalmente usado para determinação do teor de proteína em alimentos, determina apenas a quantidade total de nitrogênio e não distingue a origem desse conteúdo nitrogenado.
Nos EUA diversas lojas suspenderam a venda de mais de 20 marcas de WP após análises realizadas pela agência de regulamentação FDA (Food and Drugs
Administration) indicarem fraude na composição. Os produtos não continham o
ingrediente ativo exibido no rótulo ou estavam contaminados com arroz, feijão e até areia[45]. Em 2014 a ANVISA retirou do mercado brasileiro 20 lotes após laboratórios públicos constatarem disparidades entre as informações dos rótulos e o real teor encontrado no produto. Os testes revelaram que 11 deles apresentavam em sua composição ingredientes não declarados, como amido, milho e soja. Ainda em 2014 o Inmetro avaliou diversos parâmetros de qualidade em 15 marcas de WP. Dentre dentre elas, 14 foram consideradas “Não Conformes”, sendo que um dos produtos foi reprovado por apresentar proteína de origem diferente daquela declarada.
Apesar de vários escândalos envolvendo adulteração de WP terem sido reportados na mídia, ainda são poucos e muito recentes os estudos dedicados a identificação de adulteração em suplementos proteicos como o WP. A primeira publicação na literatura é datada de setembro de 2016 onde Garrido et al[31] usaram uma abordagem proteômica para investigar WP adulterado pela adição de proteínas de baixo valor biológico. O estudo
emprega proteômica shotgun, que inclui separação por cromatografia líquida dos
análise por espectrometria de massas. Em 6 das 16 amostras de WP comercial analisadas, além das proteínas de soro de leite bovino, várias outras fontes de proteína foram encontradas em altas concentrações, principalmente soja, trigo e arroz.
Em 2018, Pereira et al[46] publicaram um trabalho onde utilizaram as técnicas espectroscópicas de fluorescência estacionária e resolvida no tempo para detectar adulteração em WPC com cafeína, creatina e lactose em níveis de concentração de 10%, 20% e 30% (m/m). As amostras foram submetidas ao comprimento de onda de excitação de 275 nm e a fluorescência resolvida no tempo revelou que as adulterações mudaram o tempo de vida das curvas de decaimento tri-exponencial obtidas em 335 nm. Entre os adulterantes estudados, a cafeína mostrou diferenças visuais e estatisticas mais significativas.
Em 2018, Lukacs et al[47] estudaram adulterações de WP pela adição de ingredientes nitrogenados. Ferramentas quimiométricas foram combinadas com a técnica de espectroscopia NIR. Os modelos PLSR predizeram as concentrações de adulterantes com valores de RMSEP de 0,16%, 0,41%, 0,23% para uréia, taurina e histidina, respectivamente.
Em 2019, Andrade et al[48] usaram espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourie e reflexão total atenuada (FTIR-ATR) através de uma abordagem multivariada para caracterizar e detectar adulteração de WCP com adição de soro do leite em pó. Análise de Componentes Principais (PCA) e. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS) foram aplicadas para caracterizar os espectros e predizer o teor de proteina e a massa de adulterante adicionada nas amostras. Os modelos apresentaram baixos erros de predição, alta precisão e coeficientes de determinação acima de 0,99.
1.8 Fundamentos Teóricos
Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIRS)
A espectroscopia no infravermelho próximo (do inglês, Near Infrared Spectroscopy, NIRS) é uma técnica analítica frequentemente empregada para identificar adulterações, podendo ser usada para diferentes tipos de amostras, como por exemplo produtos alimentícios[17,21,23,27], fármacêuticos[49,50] e combustíveis[51].
O infravermelho compreende a região espectral em que o número de onda está entre 12800 cm-1 e 10 cm-1 (Figura 5). Essa região pode ser dividida em três subregiões, que são denominadas de infravermelho próximo (Near Infrared, NIR), médio (Middle
Infrared, MIR) e distante (Far Infrared, FIR). A Tabela 2 correlaciona as regiões espectrais
do infravermelho a seus respectivos números de onda e comprimento de onda.
Tabela 2. Regiões espectrais do infravermelho em unidades de cm-1 e nm.
Região Número de onda (cm-1) Comprimento de onda (nm) Próximo (NIR) 12.800 a 4.000 780 a 2.500 Médio (MIR) 4.000 a 200 2.500 a 50.000 Distante (FIR) 200 a 10 50.000 a 1.000.000
Figura 5. Região do infravermelho próximo destacada no espectro eletromagnético.
A espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética com a matéria e os métodos espectroscópicos de análise são amplamente empregados na elucidação de estruturas moleculares, bem como na determinação qualitativa e quantitativa de compostos orgânicos e inorgânicos.
A ligação entre dois átomos envolve diferentes tipos de energia: energia translacional, vibracional e eletrônica. A radiação infravermelha geralmente não possui energia suficiente para causar transições eletrônicas porém, pode induzir transições nos estados vibracionais e rotacionais associados com o estado eletrônico fundamental de uma molécula[52,53]. Os espectros de rotação das moléculas e os espectros de vibração molecular são estudados no infravermelho distante e médio, os harmônicos das vibrações moleculares são estudados no infravermelho próximo[52].
As vibrações moleculares podem ser classificadas em dois tipos: estiramento (stretching), e deformação (bending), conforme ilustrado na Figura 6.
Os espectros observados na região do infravermelho próximo são atribuídos a sobretons de estiramentos C–H, N–H, S–H e O–H, combinações de estiramentos e deformações angulares[17,53]. A região entre 700 e 1600 nm é tipicamente atribuída a sobretons e a região entre 1600 e 2500 nm a bandas de combinação. Sobretons ocorrem quando a transição entre modos vibracionais ocorre de v=0 para v=2, chamado primeiro sobretom, ou v=0 para v=3, chamado segundo sobretom, e assim por diante. As transições fundamentais (observadas no infravermelho médio) são as ocorrências mais comuns e probabilidade de ocorrência de sobretons diminui à medida que o número de níveis vibracionais da molécula aumenta. Já as bandas de combinação são observadas quando duas ou mais frequências fundamentais são excitadas simultaneamente.
A espectroscopia no infravermelho próximo baseia-se nas correlações espectro-estrutura existentes entre as respostas instrumentais e os harmônicos das vibrações fundamentais. Essas vibrações harmônicas ocorrem em frequências únicas e dependem da quantidade de analito, do tipo de moléculas presentes na amostra e da espessura da amostra[53]. Métodos quantitativos são possíveis quando mudanças na resposta instrumental são proporcionais às mudanças na concentração de componentes químicos ou nas características físicas de amostras submetidas à análise. Porém, esta região espectral traz apenas informações com respeito aos sobretons das vibrações moleculares Figura 6. Modos vibracionais: estiramentos e deformações moleculares.
através de sinais extremamente parecidos, pouco intensos e, aparentemente, pouco informativos já que não é possível atribuir bandas para grupos funcionais específicos[54]. Dessa forma faz-se necessária a aplicação de metodologias quimiométricas para extrair informação destes dados.
Espectroscopia de Imagem no Infravermelho Próximo (NIR-CI)
A espectroscopia de imagem (Near Infrared Chemical Imaging, NIR-CI) é uma técnica analítica na qual a espectroscopia NIRS convencional (ou pontual) é acoplada a um sistema de captura de imagem a fim de proceder o mapeamento de uma determinada região de interesse sob a superfície da amostra. Nessa técnica, uma área de varredura é selecionada e subdividida em regiões menores de dimensões pré-definidas, denominadas
pixels[55,56].
Sobre cada um dos pixels é obtido um espectro completo na região do infravermelho próximo e o conjunto de dados gerados pode ser visualizado como um arranjo tridimensional (X x Y x 𝜆), chamado de hipercubo espectral[56]. Nesse arranjo, X e Y definem as coordenadas espaciais ao longo da área mapeada e o eixo 𝜆 contém as variáveis espectrais, ou seja, os comprimentos de onda (Figura 7). Consequentemente, é possível adquirir tanto informações químicas quanto compreensão espacial sobre a localização das espécies que ocupam a superfície da amostra[56].
A espectroscopia de imagem gera um elevado volume de dados altamente correlacionados que precisam ser processados. A extração de informações é possível a partir do tratamento quimiométrico e, para isso, o arranjo tridimensional deve ser primeiramente convertido em uma matriz de duas dimensões, de modo que ao longo das linhas estejam contidos os espectros relacionados aos diferentes pixels da imagem, conforme ilustrado na Figura 7.
Figura 7. Arranjo de dados gerados por espectroscopia de imagem: (A) representação de um hipercubo espectral e (B) de uma matriz desdobrada com dimensões (X*Y, 𝜆) à direita.
Sendo assim, NIR-CI é uma técnica essencial para explorar superfícies em que é necessário mais detalhes do que o fornecido pela espectroscopia pontual e fornecer informações químicas e espaciais robustas e confiáveis[56]. Muitos dispositivos para aquisição de imagens vêm sendo disponibilizados no mercado e há um interesse crescente em aprimorar as técnicas de análise de dados aplicadas a esses conjuntos de dados complexos.
Resolução Multivariada de Curvas
A Resolução Multivariada de Curvas (Multivariate Curve Resolution, MCR) é um método quimiométrico que permite obter informações sobre componentes puros que constituem misturas complexas[57–60]. Em outras palavras, é um método de processamento de sinais analíticos que têm o intuito de resolver misturas de sinais.
A Resolução Multivariada de Curvas está incluída na família de técnicas de análise de fatores (Factor Analysis, FA)[59]. Vários algoritmos para o MCR já foram desenvolvidos e, em geral, eles podem ser classificados em dois grupos: não-iterativos e iterativos. O processo iterativo baseia-se em gerar uma sequência de soluções aproximadas que se modificam conforme os ciclos de iteração são executados.
O MCR-ALS é um tipo de MCR iterativo que utiliza como processo de otimização os mínimos quadrados alternantes (Alternating Least Squares, ALS) para decompor a matriz de dados experimentais X em três conjuntos de dados: o perfil de concentração C, o perfil espectral S e a matriz de erro experimental E. A solução final é encontrada de
acordo com o critério de convergência escolhido, podendo ser um número pré-definido de iterações ou um valor limite no ajuste entre cada iteração[61].
O modelo geral do MCR pode representado pela Equação 1mostrada abaixo e é baseando no pressuposto de que a matriz de dados é bilinear e pode ser decomposta no produto de duas outras matrizes C e S, conforme ilustrado na Figura 8[59].
𝐗 = 𝐂𝐒𝐓+ 𝐄 (1)
Figura 8. Representação do modelo bilinear do MCR.
O passo inicial para otimização via MCR-ALS é estimar o posto da matriz de dados, que corresponde ao número de espécies presentes na mistura e que produzem o sinal analítico[59,62]. No caso de dados matriciais, o posto corresponde ao número de linhas linearmente independentes que compõem a matriz de dados. Se há conhecimento prévio do sistema, essa informação pode ser diretamente fornecida ao algoritmo e corresponderá ao número de componentes da amostra. Caso contrário, estimativas podem ser realizadas através do algoritmo SVD (Singular Value Decomposition) que opera a partir da decomposição da matriz de dados em valores singulares. A determinação do número de componentes independentes envolvidos no sistema é uma etapa fundamental, pois a a escolha incorreta desse parâmetro irá fornecer modelos subajustados ou sobreajustados, que comprometem o desempenho e a capacidade preditiva dos modelos. Um modelo subajustado não irá considerar todas as informações presentes nos dados originais pois nesse caso o número de componentes selecionados é inferior ao número de compenentes independentes presentes de fato na amostra. Já
um modelo superajustado irá considerar atributos que não deveriam ser incluidos como erros e ruídos dos dados originais.
O SVD é muito similar a PCA (Principal Component Analysis) e decompõe a matriz de dados X conforme descrito na Equação 2. U e V são matrizes quadradas e ortogonais. A matriz V é a matriz dos loadings, U*S corresponde à matriz dos scores e S é uma matriz diagonal, cujos elementos diagonais representam os valores singulares e contêm informação sobre a quantidade de variância que cada componente principal descreve[59].
𝐗 = 𝐔𝐒𝐕𝐭 (2)
Assim, a matriz S é usada na determinação da dimensionalidade da matriz de dados X (ou seja, o posto de X) e o número de componentes é definido a partir dos valores significativos de S.
O próximo passo diz respeito ao conhecimento inicial dos sinais ou concentrações dos componentes puros presentes na mistura. Esses parâmetros também podem ser fornecidos ou então estimados por métodos como a Análise de Fatores Evolucionários (Evoluing Factor Analysis, EFA) e a aproximação da variável mais pura (Pure Variable
Detection, PURE)[63].
Há ainda a possibilidade de aplicar as chamadas ‘restrições’, que são condições matemáticas impostas ao algoritmo para tentar diminuir ou até mesmo suprimir problemas de ambiguidade – de permutação, de intensidade ou rotacional.
A ambiguidade rotacional, em particular, é considerada como a principal causa de soluções incorretas obtidas por MCR-ALS e está relacionada com a solução do produto CST (Equação 1), que em alguns casos pode não ser única. Isso significa que uma mesma
solução otimizada que descreva o conjunto de dados (X) pode ser obtida usando um perfil espectral e um perfil de concentração (C e S) diferentes dos verdadeiros C e S[60][59]. Assim, o modelo pode produzir soluções que, apesar de possuírem sentido matemático, não possuem sentido no ponto de vista químico.
Desta maneira, restrições de não-negatividade, unimodalidde, balanço de massa e correlação podem ser aplicadas e auxiliam o algoritmo ALS a encontrar uma solução matemática que tenha algum sentido físico e facilite a interpretação química do problema[64]. Essas restrições seguem descritas:
i) Não-Negatividade: pode ser aplicada tanto nas concentrações quanto no sinal analítico e estabelece que esses perfis devem assumir sempre valores positivos[61];
ii) Unimodalidade: essa restrição é aplicada ao sinal analítico para impor que este apresente apenas um único ponto de máximo[61];
iii) Balanço de Massa: restrição que estabelece que o somatório das concentrações relativas permaceça constante durante o processo de otimização[61];
iv) Correlação: pode ser usada para fins de quantificação e relaciona os escores do MCR às concentrações de referência dos analitos[64].
Uma vez que as informações e restrições necessárias são inseridas, a etapa de otimização é inicializada. Através do algoritmo ALS e de iterações consecutivas a Equação 1 é resolvida fazendo-se:
𝐂 = 𝐃(𝐒𝐓)+ (3)
𝐒𝐓 = 𝐂+𝐃 (4)
onde (+) indica as pseudoinversas das matrizes. O processo de otimização ALS termina de acordo com um certo critério de convergência. Esse critério é atingido quando a diferença relativa entre a raiz quadrada do erro quadrático médio da matriz residual E entre interações consecutivas alcança um valor limite pré-estabelecido, ou quando um certo número de iterações é excedido[59].
Em espectroscopia de imagem, métodos baseados em MCR são geralmente utilizados para construção de imagens químicas. Nesse caso, busca-se a resolução dos perfis de concentração dos componentes em cada pixel, de forma que a distribuição espacial das espécies de interesse na área de varredura seja obtida. Outra característica importante na espectroscopia de imagem é a possibilidade de detecção de compostos em baixas concentrações (muito menores que em espectroscopia pontual), uma vez que se determina a concentração em cada pixel[56]. Assim, a concentração de uma espécie
pode ser baixa analisando-se a amostra como um todo, mas pode estar concentrada em certos pixels.
Restrição de Correlação
A restrição de correlação, utilizada nesta dissertação para obter informação quantitativa sobre as adulterações, baseia-se na construção de um modelo interno de calibração univariada entre os valores de concentração calculados pelo MCR-ALS (que possuem unidades arbitrárias), e os valores de concentração de referência das amostras de calibração[65]. O modelo é então utilizado para fazer a previsão das concentrações das amostras de validação e permite que os perfis de concentração sejam expressos em unidades reais, minimizando assim o efeito de ambiguidade rotacional. Além disso, o método permite o desenvolvimento de calibração multiprodutos, uma vez que é criado um modelo de calibração único para cada analito presente na amostra.
Em cada iteração os valores de concentração obtidos pelo MCR-ALS para as amostras de calibração(𝐜𝐜𝐚𝐥𝐀𝐋𝐒) são regredidos contra os valores de referência do adulterante presente na amostra (𝐜𝐜𝐚𝐥𝐫𝐞𝐟). A regressão ocorre a partir da Equação 5, onde a é o coeficiente angular e b o coeficiente linear que são obtidos pelo ajuste linear do modelo de regressão de mínimos quadrados entre 𝐜𝐜𝐚𝐥𝐀𝐋𝐒 e 𝐜𝐜𝐚𝐥𝐫𝐞𝐟.
𝐜𝐜𝐚𝐥𝐀𝐋𝐒= 𝐚𝐜𝐜𝐚𝐥𝐫𝐞𝐟+ 𝐛 (5) Os coeficientes a e b estimados pela regressão são então usados para calcular os valores de concentração das amostras nos conjuntos de calibração e de validação pelas Equações 6 e 7. Os valores previstos 𝒄̂𝒄𝒂𝒍 e 𝒄̂𝒗𝒂𝒍 compõem um novo vetor de concentração
que é enviado de volta ao loop do ALS para otimização adicional[57,65]. Este procedimento é repetido até que o critério de convergência seja atingido, resultando em um perfil de concentração único para o adulterante avaliado.
𝒄̂𝒄𝒂𝒍= 𝐜𝐜𝐚𝐥 𝐀𝐋𝐒− 𝐛 𝐚 (6) 𝒄̂ = 𝒗𝒂𝒍 𝐜𝐯𝐚𝐥 𝐀𝐋𝐒− 𝐛 𝐚 (7)
O processo de otimização pelo ALS utilizando a restrição de correlação é ilustrado no esquema da Figura 9.
Figura 9. Esquema de implementação da restrição de correlação na otimização via MCR-ALS.Adaptado de Debus et al (2017)[65].
Espectrômetro DLP NIRscan Nano
A miniaturização de instrumentos analíticos é uma das grandes tendências atuais, uma vez que as novas tecnologias possibilitam a fabricação de microestruturas com excelente definição e resolução. A praticidade de manipulação associada ao custo reduzido são fatores que alavancam cada vez o desenvolvimento desses sistemas. Além disso, a miniaturização influencia fortemente outra clara tendência da química analítica moderna, que é o desenvolvimento de metodologias verdes e procedimentos que contribuam para reduzir o uso de reagentes e a quantidade de resíduos gerados, bem como a redução do uso de energia.
O DLP NIRscan Nano da Texas Instruments é um instrumento portátil e compacto usado para efetuar medidas na região do infravermelho próximo, otimizado para faixa espectral entre 900 nm e 1700 nm e resolução espectral de 10 nm. Com um dispositivo de microfibra digital, o NIRscan Nano suporta conexões Bluetooth 4.0, o que proporciona mobilidade e permite medições in situ.
A arquitetura pós-dispersiva do instrumento incorpora uma grade de difração e um fotodetector de ponto único InGaAs. Um dispositivo digital de microespelhos (Digital Micromirror Device, DMD) atua como um modulador da radiação para incidir diferentes comprimentos de onda no detector com alta velocidade, precisão e eficiência (Figura 10).
Figura 10. (A) Estrutura óptica interna do instrumento portátil e (B) tecnologia de micro-espelhos (DMD) utilizada para seleção de comprimento de onda. Adaptado de User’s Guide, Texas Instruments (2017)[66].
A fonte de radiação consiste em duas lâmpadas de filamento de tungstênio de amplo espectro. A amostra, disposta na janela frontal de safira, absorve radiação NIR e reflete difusamente a radiação não absorvida. Essa radiação é coletada pelo sistema óptico através da fenda de entrada e então é colimada pelo primeiro conjunto de lentes passando por um filtro, que bloqueia comprimentos de onda menores que 900 nm, até atingir a grade de difração. Após a radiação ser decomposta em vários comprimentos de onda através da grade de difração, ela passa por um conjunto de lentes focalizadoras e atinge o dispositivo digital de microespelhos (DMD). Os microespelhos são arranjados de forma a refletir um comprimento de onda de cada vez para o condensador, que direciona essa radiação até o detector de ponto único InGaAs.
Tratamento dos Dados
O pré-processamento de dados espectrais é a primeira etapa do tratamento quimiométrico de espectros no infravermelho. Essa etapa envolve a aplicação de métodos
corretivos para minimizar variação nos espectros e tem o intuito de maximizar a extração de informação útil dos dados[54]. Modelos quantitativos e de classificação desenvolvidos com base em dados pré-processados geralmente apresentam melhores resultados do que modelos que usam apenas dados brutos. Distorções nos dados espectrais podem ocorrer devido ao aspecto físico das amostras, como por exemplo diferenças de tamanho das partículas ou brilho na superfície.
Existem vários tipos de pré-processamentos que produzem diferentes transformações nos dados. Entre eles, destacam-se a Centralização na Média (ou Mean
Centering), Autoescalamento (ou Autoscale), os Filtros Digitais (como de Savitzky-Golay),
a Correção Multiplicativa de Sinal (ou Multiplicative Scatter Correction, MSC) e a Variação de Padrão Normal (ou Standard Normal Variate Method, SNV).
A correção matemática que o MSC promove pode ser descrita pela Equação 8, onde X corresponde a matriz que contém os valores de absorbância antes e depois da correção em k comprimentos de onda. As constantes ai e bi correspondem,
respectivamente, ao efeito estimado da reflexão especular na amostra e as interferências de dispersão. Essas constantes são obtidas a partir da regressão simples de mínimos quadrados do espectro a ser corrigido em relação a um espectro tomado como referência, como o espectro médio por exemplo.
𝐗𝐢𝐤 𝐟𝐢𝐧𝐚𝐥 = (𝐗𝐢𝐤 𝐢𝐧𝐢𝐜𝐢𝐚𝐥− 𝐚𝐢)
𝐛𝐢 (8)
Detecção de Amostras Anômalas
Outliers são amostras anômalas que apresentam um comportamento diferente das
demais amostras que integram o conjunto dados. Essas amostras não são estatisticamente representativas e geralmente são fruto de algum erro de medida. A detecção e remoção de outliers consiste em uma etapa importante no processo de desenvolvimento de modelos multivariados pois nela verifica-se a qualidade do conjunto de amostras. A presença de outliers no conjunto de calibração pode prejudicar a capacidade de preditiva e influenciar significativamente os resultados, gerando modelos que produzem altos valores de erro.
Os diversos métodos sugeridos para identificação de amostras anômalas envolvem, de uma forma geral, a observação dos dados com alta influência (do inglês,
leverage) e resíduos não modelados, com utilização de um certo nível de confiança. Nesta
dissertação a identificação de outliers nos dados de espectroscopia de imagem se deu através da observação e análise dos resíduos espectrais (Q) versus leverage (T2 de Hotelling). O pre-processamento foi realizado utilizando o algoritmo MSC, conforme descrito no capítulo anterior (Seção 3.3). Na Figura 11 é possível notar a correção da linha de base após a aplicação do MSC nos dados desdobrados.
Figura 11. Exemplo do efeito do algoritmo MSC no pré-tratamento de dados espectrais (A) Espectros originais obtidos a partir do desdobramento das imagens hiperespectrais (B) Espectros corrigidos.
Capítulo 2
2 Objetivos 2.1 Gerais
Esta dissertação tem por objetivo avaliar a utilização das técnicas de espectroscopia pontual (NIRS) e espectroscopia de imagem (NIR-CI) na região do infravermelho próximo aliadas a ferramenta quimiométrica de resolução multivariada de curvas (MCR-ALS) para identificar e quantificar adulterantes em amostras de WPC.
2.2 Específicos
Determinar qualitativa e quantitativamente adulterações por amido, arroz, milho, soja, trigo, ureia e cafeína através do tratamento quimiométrico por MCR- ALS dos dados gerados por NIRS;
Comparar a exatidão entre os modelos gerados pelo instrumento pontual de bancada Bancada) e os modelos do instrumento pontual portátil (MCR-NIRS-Portátil);
Avaliar a área de varredura ideal para ser empregada na quantificação de cafeína por NIR-CI;
Estudar o limite de quantificação para cafeína, analisada pela espectroscopia NIR-CI; Comparar a capacidade preditiva dos modelos MCR-NIR-Pontual e MCR-NIR-Imagem
Capítulo 3
ESTUDO DE ADULTERAÇÃO DE WPC POR
ADIÇÃO INDIVIDUAL DE AMIDO, ARROZ, MILHO,
3 Estudo de Adulteração de WPC por Adição de Amido, Arroz, Milho, Soja, Trigo e Ureia Empregando NIRS
3.1 Considerações Gerais
Baseando-se nas informações divulgadas pela ANVISA a respeito do conteúdo de alguns lotes irregulares de WP apreendidos em 2014[67], decidiu-se por estudar amido de milho, arroz, milho, soja e trigo como prováveis insumos de adulteração. Esses ingredientes são supostamente adicionados na tentativa de manter o conteúdo proteico total no produto comercial, mas substituindo as proteínas de alto valor biológico oriundas do soro do leite por fontes proteicas baratas e de baixo valor biológico. A adulteração por ureia também foi avaliada.
A presença desses adulterantes citados acima em WP comercial não é identificada através do método Kjeldahl em uma eventual análise para controle de qualidade. O método Kjeldahl é tradicionalmente utilizado para determinação de proteínas em alimentos e ele quantifica indiretamente o teor total de proteínas a partir do nitrogênio presente na amostra. O processo envolve três etapas: digestão, destilação e titulação. A amostra é inicialmente digerida em ácido sulfúrico na presença de um catalisador para converter quantitativamente o nitrogênio das proteínas ao sulfato de amônio. A solução é então destilada na presença de excesso de hidróxido de sódio e a amônia liberada é absorvida em um ácido, que é titulado para quantificar a amônia[68]. O método é demorado e requer grandes quantidades de amostra e inclui o uso de reagentes químicos em grandes quantidades. Além dessas desvantagens, esse método não é capaz de distingir a origem do conteúdo nitrogenado, ou seja, não é capaz de diferenciar se o nitrogênio mensurado é, de fato, proveniente de uma fonte proteica ou se a proteína é de origem animal ou vegetal.
3.2 Experimental
Preparo das Amostras
O WP é comercialmente apresentado na forma de um pó uniforme, sem grumos, com variações de coloração e odor que dependem do tipo de flavorizantes e corantes adicionados na formulação. Nesta dissertação foi usado WPC, sabor morango, tanto de
procedência internacional (Midway®) quanto nacional (Probiótica®). As amostras adulteradas consistiram em misturas binárias, ou seja, preparadas de forma a conter WPC acrescido de apenas um adulterante por vez.
Os WPC tomados como padrão neste trabalho foram testados através de um ensaio rápido e qualitativo para avaliar a presença de amido. Para isso foram adicionadas algumas gotas de solução de iodo comercial 2% (FARMAX). O amido é um polissacarídeo constituído basicamente por amilose e amilopectina, sendo que a amilose na presença de iodo forma um complexo de coloração azul intensa. Na Figura 12 abaixo é possível ver o resultado do teste, indicando que o WPC usado estava livre de adulteração prévia por amido.
Figura 12. Teste qualitativo para identificar a presença de iodo no WPC usado como padrão par efetuar as adulterações. (A) Solução de amido com 3 gotas de iodo 2%, (B) WPC com excesso de iodo 2%, (C) WPC sem iodo.
Amostras de WPC foram adulteradas adicionando-se individualmente farinha de arroz, de milho e de trigo, além de farelo de soja, amido de milho e ureia na faixa de concentração de 1 a 30% (m/m) - em intervalos de 1% - totalizando um conjunto de 180 misturas. O conteúdo de cada uma delas foi homogeneizado em vórtex por aproximadamente um minuto e disposto em placas Petri Duroplan de borossilicato com dimensões 40 mm x 12 mm para aquisição dos espectros no instrumento portátil (DLP NIRscan Nano, Texas Instruments) e também no instrumento de bancada (Spectrum 100N FT– NIR, Perkin Elmer).
Condições Operacionais e Aquisição de Espectros
Os espectros foram adquiridos através de dois instrumentos distintos, sendo um portátil e outro de bancada: DLP NIRscan Nano da Texas Instruments e Spectrum e 100N FT– NIR da fabricante Perkin Elmer. Ambos estão apresentados na Figura 13 com suas respectivas dimensões reais. As condições operacionais empregadas em cada um deles estão listadas na Tabela 3 abaixo.
Figura 13. Instrumento portátil com suas respectivas dimensões em contraste com o instrumento de bancada.
A função logarítmica (log 1/R) foi utilizada para converter os espectros obtidos em modo reflectância (R) para absorbância (A). Posteriormente, o MSC foi usado para corrigir os efeitos multiplicativos e aditivos da dispersão da luz
Tabela 3. Comparação entre as condições de operação do instrumento portátil e do instrumento de bancada. NIR Portátil DLP® NIRscan™ Nano NIR Bancada Spectrum™ 100N FT– NIR Faixa Espectral 900 – 1700 nm 10000 – 4000 cm-1 Resolução 10 nm 16 cm-1 Número de Scans 32 32
Modo de Leitura Absorbância % de Reflectância
Todo tratamento dos dados foi realizado em ambiente Matlab R2016b. O pré-processamento foi executado através do PLS Toolbox 8.1.1 e os modelos de resolução multivariada de curvas foram obtidos usando o MCR-ALS GUI 2.0.
3.3 Resultados e Discussão
A Figura 14 mostra os espectros dos adulterantes puros obtidos por ambos espectrômetros utilizados. É possível observar no eixo das abcissas que a faixa espectral do instrumento portátil é reduzida em relação ao instrumento de bancada, e portanto na Figura 14(A) tem-se apenas uma parte do espectro que consta na Figura 14(B).
Figura 14. Espectros puros dos adulterantes estudados (A) obtidos através do instrumento portátil e (B) obtidos através do instrumento de bancada. A janela destacada na cor preta indica o limite da faixa espectral do instrumento portátil.
(A)
Modelos MCR-ALS foram desenvolvidos separadamente para cada um dos adulterantes, sendo que, para cada modelo uma seleção aleatória destinou 8 amostras de um total de 30 para serem usadas na calibração e as 22 restantes integraram o conjunto de validação.
Foram usadas simultaneamente as restrições de correlação e de não-negatividade nas concentrações e nos espectros. O número de componentes das misturas foi obtido através do algoritmo SVD (do ingles, Singular Value Decomposition), sendo que a escolha foi feita a partir da convergência nos valores de variância. Na Figura 15 tem-se um exemplo de como foi definido o número de componentes. É possível notar que a partir do segundo termo os valores convergem para zero e por isso foram escolhidos 2 fatores. O mesmo procedimento foi realizado com todos os conjuntos de amostras de todos os adulterantes avaliados. Matrizes contendo os perfiis espectrais puros dos dois fatores (whey e adulterante) foram usadas como estimativa inicial para inicialização dos algoritmos.
Figura 15. SVD para determinação do número de componentes do sistema.
O MCR-ALS foi capaz de recuperar satisfatoriamente o perfil espectral de todos os adulterantes puros estudados. Essa informação é valiosa quando se trata de adulterações porque é através dela que se torna possível confirmar as espécies presentes nas amostras. A similaridade entre o espectro de referência do adulterante puro e o espectro recuperado pelo modelo MCR-ALS pode ser numericamente expressa através dos coeficientes de correlação (corr), que estão dispostos na Tabela 4 e cujos valores são
