A cafeína é um alcaloide, identificado como 1,3,7-trimetilxantina (Figura 20), que apresenta ampla atividade biológica e pode induzir alterações no sistema cardiovascular e no sistema nervoso central[70]. Caracteriza-se como um pó branco, cristalino, sem cheiro e com aspecto brilhante, que pode ser facilmente incorporado ao conteúdo de WP sem que seja visualmente perceptível.
Figura 20. Estrutura da cafeína (1,3,5- trimetilxantina).
Em 2014 o Inmetro, através do seu Programa de Análise de Produtos, testou 15 diferentes marcas de WP disponíveis no mercado brasileiro, sendo que um dos aspectos avaliados foi a presença de substâncias não declaradas, como a cafeína. A Anvisa determina, por meio da RDC 18, que suplementos proteicos para atletas não podem ser adicionados de não nutrientes, de forma que a presença de cafeína leva a não conformidade do produto.
Estudos indicam que a ingestão de 200 mg de cafeína por quilograma de massa corporal pode ser letal, sendo que 20 mg/kg já pode ser considerada como uma dose capaz de causar efeitos colaterais29. Sendo assim, optou-se por estudar uma faixa de
concentração mais baixa para esse adulterante, entre 0,1 e 10% (m/m). 4.2 Experimental
Preparo de Amostras
Um total de 12 misturas de WPC com cafeína foram preparadas nas concentrações de 0,1%, 0,5%, 1% a 10% (m/m). Após o processo de maceração e homogeneização em vórtex por três minutos, foram confeccionadas pastilhas de aproximadamente 300 mg e
1,40 cm de diâmetro utilizando uma prensa hidráulica e trabalhando com 7 toneladas de pressão durante cinco segundos, a fim de obter uma superfície plana e regular e, consequentemente, espectros menos ruidosos.
Condições Operacionais e Aquisição de Imagens Hiperespectrais
As imagens hiperespectrais das pastilhas foram adquiridas através do sistema de imagem Spotlight 400N FT-NIR Imaging System da fabricante Perkin Elmer, representado na Figura 21 e as condições operacionais empregadas estão listadas na Tabela 6. Tabela 6. Condições de operação do sistema de imagem.
NIR Imagem
Spotlight 400N FT-NIR Imaging System
FaixaEspectral 7800 – 2000 cm-1
Resolução 16 cm-1
Número de Scans 16
Modo de Leitura % de Reflectância
Tempo de Leitura 43,5 min
Área Monitorada 16 mm2
Tamanho do Pixel 50µm
4.3 Resultados e Discussão
Na espectroscopia de imagem um parâmetro fundamental para ser avaliado antes de iniciar o procedimento experimental é a escolha da área da amostra a ser monitorada. O tamanho selecionado pode variar de acordo com os objetivos do trabalho, mas as dimensões devem ser representativas e assegurar reprodutibilidade aos resultados. Inicialmente, todos os espectros foram adquiridos utilizando pixels de 25 µm para varrer
uma superfície de 2000 µm x 2000 µm (ou 4 mm2) com resolução espectral de 32 cm-1,
gerando assim um total de 6400 espectros por amostra. Esses parâmetros foram empregados baseando-se em trabalhos existentes na literatura, porém eles não forneceram resultados satisfatórios para previsão da concentração de cafeína.
Apesar de todos os esforços empregados na homogeneização das misturas, foi observado distribuição não uniforme de cafeína na superfície das pastilhas: em alguns pontos o acúmulo de grânulos de cafeína era maior que em outros e dependendo da região de varredura selecionada, resultados muito divergentes do esperado eram obtidos, principalmente para amostras em níveis de concentração mais baixos. A seleção de uma área inadequada, portanto, poderia comprometer a exatidão e a reprodutibilidade do método e por isso foi decidido selecionar uma área de varredura quatro vezes maior – o equivalente a 16mm2 – utilizando pixels de 50 µm para aquisição de 6400 (80x80)
espectros por amostra. Além disso, para garantir confiabilidade aos resultados, cada amostra foi submetida a três varreduras distintas, em regiões aleatoriamente selecionadas e o resultado de previsão de concentração foi expresso em função da média e do desvio padrão dessas três medidas.
Para exemplificar a importância da seleção de uma área adequada, um plano cartesiano foi posicionado no centro de uma imagem de 16 mm2, seccionando-a em
quatro quadrantes de 4 mm2 (Figura 22).
É possível notar que se fosse usada a área de 4 mm2 para a varredura, haveria
50% de chance de não encontrar cafeína nessa amostra, uma vez que apenas os quadrantes inferiores apresentam pixels onde cafeína foi identificada. Essa ocorrência foi observada, principalmente, em amostras de baixas concentrações. Também na Figura 22 foram representados elementos de área de 4mm2 e 16 mm2 sob a superfície das pastilhas
Para aplicar o MCR-ALS foi necessário desdobrar os dados tridimensionais (80 x 80 x 501) em uma matriz bidimensional (6400 x 501). A faixa espectral de 3800 – 2000 cm-1 foi excluída do conjunto de dados por apresentar excesso de ruídos e ausência de
informação química relevante. A determinação da concentração de cafeína nas amostras de whey adulteradas foi realizada organizando os espectros médios das amostras 1 – 10% nas primeiras linhas de uma matriz, seguidos dos espectros de cada pixel da imagem de uma amostra tomada para validação (Figura 23). Sendo assim, as amostras de 1 a 10 foram validadas individualmente, ou seja, construindo-se uma matriz de dados para cada amostra, sempre usando como referência para calibração os espectros médios de todas as amostras. A Figura 23 ilustra esse procedimento. Através dessa estratégia de estruturação dos dados é possível evitar a concatenação de várias matrizes, o que gera conjuntos de dados imensos e que requer tempo e configurações de hardware sofisticadas para realizar os cálculos.
(B) (A)
Figura 22. (A) Mapa de distribuição de 16mm2 de amostra adulterada com cafeína a 1% seccionado em 4 partes de 4 mm2. (B) Elementos de área de 4mm2 (usado inicialmente) e 16
Figura 23. Esquema ilustrando a organização dos dados experimentais. A Matriz de Dados dispõe os espectros médios nas primeiras linhas seguidos dos 6400 espectros obtidos em cada pixel da amostra X%, sendo que X varia de 1 a 10%.
Para a escolha do número de componentes do sistema utilizou-se o algoritmo SVD, que estima o posto da matriz por meio da porcentagem de variância explicada, e as estimativas iniciais dos perfis espectrais foram gerados pelo algoritmo PURE (do inglês, Pure Variable Detection). Correlação e Não-Negatividade foram as restrições aplicadas nas concentrações e nos espectros. Adotou-se o critério de convergência menor ou igual a 0,1% entre duas sucessivas iterações para a finalização do processo ALS.
Conforme esquematizado na Figura 24, após a convergência do MCR-ALS foram obtidos: os espectros recuperados das espécies, os mapas de distribuição o valor médio de concentração de cafeína nas amostras. Três imagens distintas foram coletas para cada umas das 10 amostras. Sendo assim, a apresentação dos resultados foi organizada em Imagem (1), Imagem (2) e Imagem (3). Imagem (1) corresponde ao primeiro conjunto de imagens coletadas para as amostras 1 a 10%.
A recuperação dos espectros é uma ferramenta que proporciona significado e interpretação química dos resultados. Isso é possível mesmo quando a estimativa inicial dos espectros puros é gerada pelo SIMPLISMA e não há conhecimento prévio do tipo de adulterante. Assim, além da quantificação é possível a identificação do adulterante através do espectro recuperado, o que não pode ser realizado utilizando outras técnicas quimiométricas como, por exemplo, PLS ou CLS.
De forma geral, os espectros de cafeína recuperados por todos os modelos (Figura 25) apresentaram excelente concordância com o espectro de referência da cafeína, e essa semelhança visual pode ser numericamente representada pelos coeficientes de correlação, que estão dispostos na Tabela 7.
Figura 24. Informações obtidas a partir do modelo MCR-ALS: Espectros Recuperados, mapas de distribuição e perfis de concentração.
Tabela 7. Valores dos coeficientes de correlação entre os espectros recuperados pelo modelo e o espectro de cafeína de referência.
Concentração Coeficientes de Correlação
Amostra (%) Imagem (1) Imagem (2) Imagem (3)
1 0,9845 0,9791 0,9675 2 0,9762 0,9757 0,9862 3 0,9908 0,9868 0,9794 4 0,9883 0,9838 0,9843 5 0,9837 0,9950 0,9818 6 0,9887 0,9863 0,9595 7 0,9828 0,9908 0,9903 8 0,9862 0,9892 0,9791 9 0,9867 0,9915 0,9782 10 0,9889 0,9932 0,9794
Figura 25. Espectros recuperados das amostras de 1 a 10 em cinza em contraste com o espectro de referência de cafeína pura em preto.
Os mapas de distribuição são importantes ferramentas para verificar a posição espacial das espécies na mistura, podendo apontar quais são os pixels que possuem maiores concentrações de determinado componente. As Figuras 26, 27 e 28 apresentam os mapas de distribuição de cafeína em amostras de whey adulterado nas concentrações de 1 a 10%. As regiões que possuem maiores concentrações de cafeína são representadas pelos pixels em vermelho intenso e regiões com ausência de cafeína são representadas em azul.
As concentrações das amostras adulteradas previstas pelo modelo MCR-ALS estão dispostas na Tabela 8, onde são apresentados os valores médios e o desvio padrão associado às medidas. O erro absoluto das medidas não ultrapassou 1,7%, o que mostra que o modelo tem capacidade preditiva satisfatória para quantificar cafeína em amostras de WPC na faixa de concentração de 1% a 10% (m/m).
Além disso, em todos os casos as previsões de concentração foram semelhantes nas três imagens obtidas para uma mesma amostra, o que revela que a área selecionada para varredura foi, de fato, adequada.
Figura 26. Mapas de distribuição de cafeína em amostras de whey adulterado. Três imagens distintas foram coletas para cada amostra, sendo que este corresponde ao primeiro conjunto e por isso foi denominado Imagem (1).
Figura 28. Mapas de distribuição de cafeína para o conjunto Imagem (2).
Tabela 8. Resultados de previsão do modelo MCR-ALS. Concentração Prevista Conhecida (%) Imagem (1) (%) Imagem (2) (%) Imagem (3) (%) Média (%) Erro Absoluto (%) 1,1 1,1 1,7 2,2 1,7 ± 0,6 0,6 2,2 2,6 2,2 2,0 2,3 ± 0,3 0,1 3,3 5,3 4,0 5,7 5,0 ± 0,9 1,7 4,3 5,7 4,2 5,9 5,3 ± 0,9 1,0 5,2 4,9 6,9 4,8 5,5 ± 1,2 0,3 6,0 6,8 5,5 5,1 5,8 ± 0,9 0,2 7,2 7,6 8,2 8,4 8,1 ± 0,4 0,8 8,0 8,2 8,4 8,5 8,4 ± 0,2 0,4 9,1 10,9 10,3 9,4 10,2 ± 0,8 1,1 10,2 9,5 9,6 11,0 10,1 ± 0,8 0,1
Com o intuito de determinar o limite de quantificação do método proposto foram avaliadas amostras de whey adulteradas com cafeína em níveis inferiores a 1%. Primeiramente foi avaliada a concentração 0,5% (m/m), sendo que três imagens distintas foram obtidas para a amostra nessa concentração. A matriz de dados foi organizada de modo similar aquele descrito anteriormente, mas agora acrescentando-se o ponto 0% no conjunto de calibração através da adição do espectro médio de whey puro de modo a evitar a extrapolação do modelo. Analisando a Figura 29, onde estão dispostos os espectros recuperados, os mapas de distribuição e as curvas de calibração apresentadas conclui-se que é possível identificar a presença de cafeína nessa amostra além de ser possível quantificá-la de maneira satisfatória. O valor médio de concentração encontrado pelo modelo na amostra de 0,5% foi igual a (0,7 ± 0,2)%. Foi realizada ainda a tentativa de detectar cafeína em concentração 0,1% (m/m) mas, nas condições experimentais empregadas, não foi possível identificar a adulteração nesse nível, uma vez que os espectros recuperados não correspondiam mais a cafeína.
Por fim, espectros das misturas de whey e cafeína foram coletados através do instrumento de bancada com o intuito de comparar os resultados de espectroscopia de imagem e espectroscopia pontual. O procedimento empregado para aquisição, pré- processamento e organização dos dados, bem como os parâmetros usados para aplicar o MCR-ALS, foram exatamente os mesmos que foram discutidos anteriormente. Do total de 10 amostras estudadas, 9 delas foram destinadas para calibração e uma para previsão e esse procedimento foi repetido até que todas as amostras de calibração fossem utilizadas para validação.
A otimização no MCR-ALS, porém, não pôde ser concluída uma vez que o algoritmo detectou deficiência de posto (do inglês, rank) na matriz de dados. Na prática, o posto de uma matriz corresponde ao número de espécies químicas presentes na amostra. Em uma matriz de espectros esse número correspondente ao número de linhas e colunas linearmente independentes, ou seja, o número de vetores que não podem ser escritos como uma combinação linear dos outros. Uma matriz é considerada de posto completo se o posto estimado for igual ao número de componentes químicos presentes na amostra. No caso de deficiência de posto, isso significa que o posto previamente estimado – nesse caso igual a 2, referente ao conteúdo da mistura de whey com cafeína – é diferente do número de espécies químicas que o algoritmo conseguiu identificar.
Na tentativa de quebrar a deficiência de posto, foi acrescentado à matriz de interesse os espectros puros de whey e cafeína para representar amostras de concentração 0% e 100%, respectivamente, além de ser fornecido os perfis espectrais ao invés de usar as estimativas do PURE. Através dessa estratégia foi possível realizar a otimização, porém o modelo não conseguiu um ajuste linear similar (Figura 30) ao obtido a partir das imagens hiperespectrais e os resultados de previsão apresentaram erros bem maiores, na ordem de 4% (Tabela 9). Isso nos leva a concluir que, nessa faixa de concentração, a espectroscopia de imagem é de fato uma opção mais adequada, uma vez que pode fornecer resultados evidentemente mais exatos do que aqueles obtidos pela espectroscopia pontual.
Figura 29. Resultados de quantificação obtidos em três imagens distintas para amostra de 0,5% (m/m). O valor médio de concentração encontrado pelo modelo foi igual a (0,7 ± 0,2)%.
Tabela 9. Resultados de quantificação para cafeína com dados experimentais oriundos do instrumento de pontual de bancada.
Referência % (m/m) Previsão %(m/m) Erro Absoluto % (m/m) 1,1 1,9 0,8 2,1 3,2 1,1 3,2 3,7 0,5 4,3 8,9 4,6 5,2 4,0 1,2 6,0 9,6 3,6 7,2 5,2 2,0 8,0 7,0 1,0 9,0 5,5 3,5 10,2 6,9 3,3
Figura 30. Tentativa de ajuste linear com dados experimentais oriundos do instrumento de pontual de bancada.
Capítulo 5
5 Considerações Finais
Este trabalho demonstra que as técnicas de espectroscopia NIRS e NIR-CI aliadas ao método de resolução multivariada de curvas possuem pleno potencial para serem usadas no desenvolvimento de metodologias analíticas para identificação de adulteração e para quantificação de adulterantes em amostras de whey protein concentrado (WPC). O MCR-ALS apresentou excelente performance na recuperação dos perfis espectrais dos diferentes adulterantes avaliados (amido, arroz, milho, soja, trigo, ureia e cafeína). Porém, na faixa espectral utilizada, os espectros de amido de milho, arroz, milho e trigo são muito similares e no caso de análises de amostras desconhecidas se tornaria difícil distingui-los através do perfil espectral. Em todo caso, apesar de não identificar precisamente o ingrediente fraudulento, o método permite detectar a adição desses adulterantes e quantificá-los. Também foi constatado que apesar de possuir resolução e faixa espectral reduzidas, o equipamento portátil apresentou resultados bastante satisfatórios indicando que pode ser utilizado para esse tipo de aplicação. A maior vantagem da aplicação de NIR-CI em comparação com a análise pontual convencional NIRS está na obtenção de resultados de quantificação mais exatos para uma faixa de concentração de adulterante mais baixa (0,5-10% m/m) além da aquisição de informação espacial sobre o conteúdo da amostra. Porém, é necessário ajustar o tamanho do pixel e a área de varredura adequadamente para garantir a reprodutibilidade do método, uma vez que amostras sólidas podem apresentar distribuição não uniforme dos componentes em sua superfície e a seleção de área de varredura muito reduzida pode comprometer os resultados.
6 Referências
[1] BBC Brasil, Carne vencida e mascarada com “produtos cancerígenos”: o escândalo que atinge as maiores empresas do Brasil, (2017). Disponível em: <https://www.bbc.com/portuguese/brasil-39313589>
[2] BBC Brasil, Não é só com carne : leite com ureia e óleo em vez de azeite estão entre fraudes de alimentos no Brasil, (2017). Disponível em <https://www.bbc.com/portuguese/brasil-39325884>
[3] K.E. Hovda, O.H. Hunderi, A.B. Tafjord, O. Dunlop, N. Rudberg, D. Jacobsen, Methanol outbreak in Norway 2002-2004: Epidemiology, clinical features and prognostic signs, J. Intern. Med. 258 (2005) 181–190.
[4] R. Yang, W. Huang, L. Zhang, M. Thomas, X. Pei, Milk adulteration with melamine in China: Crisis and response, Qual. Assur. Saf. Crop. Foods. 1 (2009) 111–116. [5] K. Sharma, M. Paradakar, The melamine adulteration scandal, Food Secur. 2 (2010)
97–107.
[6] I.H. Boyaci, H.T. Temiz, R.S. Uysal, H.M. Velioglu, R.J. Yadegari, M.M. Rishkan, A novel method for discrimination of beef and horsemeat using Raman spectroscopy, Food Chem. 148 (2014) 37–41.
[7] M. Christopher, B. Gaudenzi, Exploiting knowledge across networks through reputation management, Ind. Mark. Manag. 38 (2009) 191–197.
[8] M.B. Kolicheski, Fraudes em Alimentos. Boletim do Centro de Pesquisa de Processamento de Alimentos 12 (1994) 65–77.
[9] J. Evangelista, Tecnologia de Alimentos, Atheneu (1989) 577-584.
[10] D.I. Ellis, V.L. Brewster, W.B. Dunn, J.W. Allwood, A.P. Golovanov, R. Goodacre, Fingerprinting food: Current technologies for the detection of food adulteration and contamination, Chem. Soc. Rev. 41 (2012) 5706–5727.
[11] R. Consonni, K. Astraka, L.R. Cagliani, N. Nenadis, E. Petrakis, M. Polissiou, Authenticity of Food, 1st ed., Elsevier Ltd., (2016) , 285–293.
[12] S. Lohumi, S. Lee, H. Lee, B. Cho, A review of vibrational spectroscopic techniques for the detection of food authenticity and adulteration, Trends Food Sci. Technol. 46 (2015) 85–98.
[13] O. Abbas, M. Zadravec, V. Baeten, T. Mikus, T. Lesc, A. Vuli, Analytical methods used for the authentication of food of animal origin, Food Chem. 246 (2018) 6–17. [14] J.U. Porep, D.R. Kammerer, R. Carle, On-line application of near infrared ( NIR )
spectroscopy in food production, Trends Food Sci. Technol. 46 (2015) 211–230. [15] M.S. Larrechi, M.P. Callao, Strategy for introducing NIR spectroscopy and
multivariate calibration techniques in industry, Trends Anal. Chem. 22 (2003) 634– 640.
[16] M. Blanco, I. Villarroya, NIR spectroscopy: a rapid-response analytical tool, Trends Anal. Chem 21 (2002) 240–250.
[17] S. Lohumi, S. Lee, H. Lee, B.K. Cho, A review of vibrational spectroscopic techniques for the detection of food authenticity and adulteration, Trends Food Sci. Technol. 46 (2015) 85–98.
[18] A. Guelpa, F. Marini, R. Slabbert, M. Manley, Verification of authenticity and fraud detection in South African honey using NIR spectroscopy, Food Control. 73 (2017) 1388–1396.
[19] S. Li, X. Zhang, Y. Shan, D. Su, Q. Ma, R. Wen, J. Li, Qualitative and quantitative detection of honey adulterated with high-fructose corn syrup and maltose syrup by using near-infrared spectroscopy, Food Chem. 218 (2017) 231–236.
[20] A.P. Forchetti, R.J. Poppi, Use of NIR hyperspectral imaging and multivariate curve resolution ( MCR ) for detection and quanti fi cation of adulterants in milk powder, LWT - Food Sci. Technol. 76 (2017) 337–343.
[21] J.K. Winkler-Moser, M. Singh, K.A. Rennick, E.L. Bakota, G. Jham, S.X. Liu, S.F. Vaughn, Detection of Corn Adulteration in Brazilian Coffee (Coffea arabica) by Tocopherol Profiling and Near-Infrared (NIR) Spectroscopy, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 10662–10668.
[22] S.A. Haughey, S.F. Graham, E. Cancouët, C.T. Elliott, The application of Near- Infrared Reflectance Spectroscopy ( NIRS ) to detect melamine adulteration of soya bean meal, Food Chem. 136 (2013) 1557–1561.
[23] D.D.S. Fernandes, F. Romeo, G. Krepper, M.S Di Nezio, M.F. Pistonesi, M.E. Centurión, M.C.U. Araújo, P.H.G.D Diniz, Quantification and identification of adulteration in the fat content of chicken hamburgers using digital images and chemometric tools, LWT - Food Sci. Technol. 100 (2019) 20–27.
[24] J.M Hernandez-Hierro, R.J. Garcia-Villanova, I. Gonzales-Martin, Potential of near infrared spectroscopy for the analysis of mycotoxins applied to naturally contaminated red paprika, Anal. Chim. Acta 622 (2008) 189–194.
[25] P.I.C. Richardson, H. Muhamadali, D.I. Ellis, R. Goodacre, Rapid quantification of the adulteration of fresh coconut water by dilution and sugars using Raman spectroscopy and chemometrics, Food Chem. 272 (2019) 157–164.
[26] M.A. Quelal-Vasconez, E. Perez-Esteve, A. Arnau-Bonachera, J.M. Barat, P. Talens, Rapid fraud detection of cocoa powder with carob flour using near infrared spectroscopy, Food Chem. 92 (2018) 183–189.
[27] Y. Li, Y. Xiong, S. Min, Data fusion strategy in quantitative analysis of spectroscopy relevant to olive oil adulteration, Vib. Spectrosc. 101 (2019) 20–27.
[28] ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Alimento para Atletas. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/alimentos-para-atletas>
[29] BrasNutri - Associação Brasileira dos Fabricantes de Suplementos Nutricionais e Alimentos para Fins Especiais, Panorama do Setor, (2016). Disponivel em: <http://www.brasnutri.org.br/arquivos/numeros_setor/2017_atualizado.pdf>.
[30] K. Marshall, Therapeutic applications of whey protein, Alternative Medicine Review 9 (2004) 136-156.
[31] B.C. Garrido, G.H.M.F. Souza, D.C. Lourenco, M. Fasciotti, Proteomics in quality control: Whey protein-based supplements, J. Proteomics. 147 (2016) 48–55. [32] Revista Veja, Suplementos: os brasileiros adoram, (2015). Disponível em:
http://veja.abril.com.br/saude/suplementos-os-brasileiros-adoram/.
[33] V. Lagrange, D.C. Clark, Nutritive and Therapeutic aspects of whey proteins, Elsevier Inc., 2019.
[34] F.K. Haraguchi, W.C. Abreu, H. De Paula, Proteínas do soro do leite: composição , propriedades nutricionais , aplicações no esporte e benefícios para a saúde humana. Rev. Nutr.19 (2006) 479-488.
[35] B. Lönnerdal, Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. Am J Clin Nutr.77 (2003) 1537S–43S.
[36] M.T.B. Pacheco, N.F.G. Dias, V.L.S. Baldini, C. Tanikawa, V.C. Sgarbieri, Propriedades funcionais de hidrolisados obtidos a partir de concentrados protéicos de soro de leite, Ciência e Tecnol. Aliment. 25 (2005) 333–338.
[37] S.C. Fischborn, A influência do tempo de ingestão da suplementação de Whey Protein em relação à atividade física, Rev. Bras. Nutr. Esportiva. 3 (2009) 132–143. [38] S. Patel, Functional food relevance of whey protein: A review of recent findings and
scopes ahead, J. Funct. Foods. 19 (2015) 308–319. [39] EMBRAPA, Composição do Leite, (2019). Disponível em:
<http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/Agencia8/AG01/arvore/AG01_128_21720 039243.html>.
[40] M.E. Matthews, R. Plains, D. Company, N. Zealand, Whey Protein Recovery Processes and Products, J. Dairy Sci. 67 (1970) 2680–2692.
[41] J.R. Boschi, Concentração e Purificação das Proteínas do Soro de Queijo por Ultrafiltração, Dissertação (Mestrado em Engenharia Química), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, (2006), 1-12.
[42] C. Baldasso, Concentração , Purificação e Fracionamento das Proteínas do Soro Lácteo através da Tecnologia de Separação por Membranas, Dissertação (Mestrado em Engenharia Química), Universidade Federal do Rio Grande do Sul, (2008), 31-35.
[43] E.D, Rosa, M. Tsukada, L.A.P. Freitas, Secagem por atomização na industria alimentícia: Fundamentos e aplicações, (2006). Disponível em: <http://www.labmaqdobrasil.com.br/downloads/spray-dryers/Fundamentose
Aplicacoes da Secagem por Atomizacao na Industria de Alimentos.pdf.>
[44] C. Anandharamakrishnan, C.D. Rielly, A.G.F. Stapley, Spray-freeze-drying of whey proteins at sub-atmospheric pressures, Dairy Sci. Technol. 90 (2010) 321–334. [45] G1.com. Suplementos com supostas fraudes são tirados das prateleiras nos EUA.
Disponível em: <http://g1.globo.com/bom-dia-brasil/noticia/2015/02/suplementos- com-supostas-fraudes-sao-tirados-das-prateleiras-nos-eua.html>
[46] C.G. Pereira, J. Andrade, T. Ranquine, I.N. de Moura, R.A. da Rocha, M.A.M. Furtado, M.J.V. Bell, V. Anjos, Characterization and detection of adulterated whey protein supplements using stationary and time-resolved fluorescence spectroscopy,