Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso
PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE ASTROVÍRUS, SAPOVÍRUS, NOROVÍRUS GENOGRUPO I E II.
Autora: Thaiana Cirqueira Gonçalves Orientadora: Doutora Paula Andréia Silva
Brasília - DF 2010
THAIANA CIRQUEIRA GONÇALVES
PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE ASTROVÍRUS, SAPOVÍRUS, NOROVÍRUS GENOGRUPO I E II.
Monografia apresentada ao curso de
graduação em Biomedicina da
Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Doutora Paula Andréia Silva
Brasília 2010
Trabalho de conclusão de curso, na modalidade de monografia, de autoria de Thaiana Cirqueira Gonçalves, intitulado “Padronização da técnica de PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus, norovírus genogrupo I e II”, apresentado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 14 de maio de 2010, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
____________________________________________________ Prof. Doutora Paula Andréia Silva
Orientadora
Curso de Biomedicina – UCB
_____________________________________________________ Prof. Doutor Tatsuya Nagata
Departamento de Biologia Celular – UnB
_____________________________________________________ Prof. Mestre Ruiter Roberto Silva
LACEN/DF
Brasília 2010
Dedico este trabalho, primeiramente a minha mãe, a quem me deu a vida, e quem é meu exemplo de vida e minha força, a pessoa que mais desejou que este momento acontecesse e que estará contente onde estiver. Dedico a Deus, por sempre guiar meus passos; meus familiares, amigos e mestres, por me auxiliarem em todos os momentos e
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por tantas bênçãos que me dá diariamente e as várias conquistas que só a partir Dele sou capaz de conseguir, e esta foi mais uma delas.
As Professoras, Paula Andréia e Lídia Lima, pela paciência e dedicação durante todo o projeto, pela compreensão, pela a ingestão de estímulo e motivação, e por todo o conhecimento riquíssimo partilhado durante este período. Obrigada pela oportunidade que me deram, vocês realmente me ajudaram a crescer muito.
Ao Professor Tatsuya Nagata, por sempre se colocar à disposição quando necessário, compartilhando seu vasto conhecimento e contribuindo integralmente para a concretização deste projeto.
As minhas colegas de trabalho, por sempre estarem prestativas e me auxiliarem quando mais precisei, dividindo informações e conhecimentos.
Ao Instituto Evandro Chagas, especialmente a Dra. Yvone Gabbay, que gentilmente cedeu às amostras em estudo proporcionando assim que este projeto desenvolvesse. Aos laboratórios e colaboradores do LACEN/DF e da Universidade Católica de Brasília, que nos proporcionaram condições ideais, para a realização deste trabalho. Á minha família que sempre me apóia em todos os momentos da minha vida, a qual posso contar sempre, me tornando assim uma pessoa mais forte para lutar sempre pelos meus ideais.
E todas as pessoas que ajudaram a construir este trabalho, direta ou indiretamente. Obrigada!
GONÇALVES, Thaiana Cirqueira. Padronização da técnica de PCR multiplex para
detecção, no Distrito Federal, de astrovírus, sapovírus, norovírus genogrupo I e II.
2010. 44 p.. Trabalho de Conclusão de Curso (Biomedicina)- Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2010.
A gastroenterite aguda é um problema de saúde pública caracterizada por febre, vômitos e diarréias. É uma patologia que causa altos índices de morbidade e mortalidade em seres humanos em todo o mundo. Os principais enteropatógenos virais relacionados com a gastroenterite são os rotavírus, calicivírus, adenovírus e astrovírus. Para a detecção destes gastrovírus existem várias técnicas, classificadas como não moleculares, tais como, microscopia eletrônica, técnicas de isolamento viral para astrovírus e ensaio imunoenzimático (ELISA), e moleculares, incluindo hibridização, PCR e o sequenciamento. Existe uma variante da PCR convencional, denominada PCR
multiplex, o qual incorpora diferentes conjuntos de oligonucleotídeos específicos para
mais de um alvo, permitindo simultâneas amplificações em uma única reação. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II, descrita por Yan et al. (2003) com modificações, nos laboratórios de biotecnologia da Universidade Católica de Brasília e no LACEN/DF. Este trabalho analisou 30 amostras fecais humanas para execução cega, com resultados previamente conhecidos cedidas pelo Instituto Evandro Chagas de Belém para validação da técnica da PCR multiplex, a ser utilizado como diagnóstico no LACEN/DF. Os resultados obtidos são: 6,6% (n=02) de positividade para astrovírus, 3,3% (n=01) para sapovírus e 3,3% (n=01) para norovírus genogrupo II. O PCR
multiplex é uma metodologia rápida e com custos mais baixos que a PCR monoplex,
tendo uma boa sensibilidade e especificidade. Este é um trabalho que apresenta resultados preliminares e estudos futuros são necessários para validação final da técnica.
ABSTRACT
Gastroenteritis is an acute public health problem characterized by fever, vomiting and diarrhea. It is a disease that causes high morbidity and mortality in humans worldwide. The main pathogens associated with viral gastroenteritis are rotavirus, calicivirus, adenovirus and astrovirus. In order to detect these gastroviruses there are various techniques, classified as no moleculares such as electron microscopy, virus isolation techniques for astrovirus and enzyme immunoassay (ELISA), and molecular techniques, including hybridization, PCR and sequencing. There is a variant of the conventional PCR, termed multiplex PCR, which incorporates different sets of primers for more than one target, allowing simultaneous amplifications in a single reaction. The aim was to standardize the technique of multiplex PCR for detection of astrovirus, sapovirus and norovirus genogroup I and II, described by Yan et al. (2003) with modifications, to stardad this technique in the laboratories of UCB and LACEN. This study analyzed 30 fecal human samples for blind test with previously known results, provided by the Instituto Evandro Chagas, Belém, to validate the technique of multiplex PCR to be deployed as a diagnosis in LACEN/DF. The results showed that two out of 30 (6.6%) are astrovirus, 3.3% (01) for sapovirus and 3.3% (01) for norovirus genogroup II. The multiplex PCR method is faster and lower cost than PCR monoplex, with good sensitivity and specificity. This is a work presents preliminary results and future studies are needed for final validation of the technique.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
1-Microscopia eletrônica de astrovírus em amostra fecal ... 13
2-Organização do genoma de astrovírus ... 14
3-Microscopia eletrônica de calicivírus ... 17
4- Organização do genoma de calicivírus... 18
5- Amplificação do DNA usando técnica de PCR ... 21
6- Eletroforese em gel... 22
7- Eletroforese de norovírus, sapovírus e astrovírus com o tamanho de suas respetivas bandas. ... 31
LISTA DE TABELAS
1- Reagentes e seus respectivos volumes para a realização do mix1e mix2 da RT. ... 29 2- Conjunto de oligonucleotídeos com suas respectivas sequências de oligonucleotídeos e o tamanho o fragmento esperado.. ... 30 3- Reagentes e suas respectivas concentrações para a realização dos mix da PCR... 30
LISTA DE ABREVIATURAS
CDC- Centers for Disease Control cDNA - DNA complementar CEP - Comitê de Ética em Pesquisa DF -Distrito Federal
DNA - Ácido Desoxirribonucleico
dNTP - Desoxirribonucleotídeos tri-fosfato DTT - Ditiotreitol
FIOCRUZ - Fundação Osvaldo Cruz GI a GV - Genogrupo I a Genogrupo V HAstV - Astrovírus
kDa - Kilodalton
LACEN - Laboratório Central M – Molar
min - Minuto
MgCl2 - Cloreto de Magnésio mM – Mili molar
M-MLV - Monoley Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase nm- Nanômetro
nt – Nucleotídeo
ORF - Open Reading Frame PA- Pará
pb - Pares de base
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase RNA - Ácido Ribonucleico
RT - Transcriptase reversa s - Segundo
Taq - Thermus aquaticus U/ µL - Unidade por microlitro
SUMÁRIO 1-Introdução ... 12 1.1-Astrovírus ... 13 1.2-Calicivírus ... 16 1.3- Diagnóstico ... 20 4-Justificativa ... 25 5-Objetivo ... 27 4-Material e Métodos ... 28 5-Resultados ... 32 6-Discussão ... 33 7-Conclusão ... 36 8-Referências Bibliográficas ... 37
1-INTRODUÇÃO
A gastroenterite aguda é um problema de saúde pública, caracterizada por febre, vômitos e diarréias, e estima-se que ocorram 1,4 bilhões de casos de gastroenterite em humanos em todo o mundo, sendo que destes, cerca de dois milhões de indivíduos vão a óbito devido suas complicações (O'Ryan et al., 2005). A diarréia tem sido considerada a terceira principal causa infecciosa de morte em todo o mundo (World Health Organtion, 2004).
A etiologia infecciosa pode ser de origem bacteriana, parasitológica ou viral. Os enteropatógenos virais são reconhecidos atualmente como os mais importantes agentes etiológicos relacionados com as gastroenterites agudas (Finkbeiner et al., 2008), sendo os rotavírus (20-60%) os agentes mais identificados seguidos pelos calicivírus (3,5-29,3%), adenovírus (1-31%) e astrovírus (1,8-16%) (Caracciolo et al., 2007). Outros estudos demonstraram ainda a importância de outros agentes causadores de surtos de gastroenterites, como torovírus, pestivírus, picobirnavírus, bocavírus e o vírus aichi. (Middleton, 1996; Wilhelmi et al., 2003; Yamashita et al., 1998; Yamashita et al., 2001).
Estes vírus acometem principalmente crianças nos primeiros anos de vida. As gastroenterites possuem uma prevalência maior em países onde existem grandes diferenças
entre as classes socioeconômicas em termos de higiene, qualidade da água, comida e saneamento básico (Vernacchio et al., 2006).
O presente trabalho tem como objetivo validar uma técnica molecular para a detecção de astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II em uma única reação, denominada PCR multiplex, para que essa metodologia seja implantada no Laboratório Central do Distrito Federal (LACEN/DF), órgão da Secretaria de Estado de Saúde do DF, e nos laboratórios de biotecnologia da Universidade Católica de Brasília (UCB), a fim de contribuir no diagnóstico, que poderá auxiliar na determinação de medidas preventivas e de controle dos surtos causados por estes vírus, com o propósito de amenizar este problema de saúde pública.
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1.1-ASTROVÍRUS
Os astrovírus humanos (HAstV) foram descritos pela primeira vez em 1975, por Appleton e Higgins durante um estudo de surto de diarréia aguda em uma maternidade na Inglaterra (Appleton & Higgins, 1975). No mesmo ano, Madeley e Cosgrove também observaram o mesmo vírus através de microscopia eletrônica. Estes vírus apresentavam forma de estrela de cinco a seis pontas, e foram por este motivo denominados de astrovírus (Madeley e Cosgrove, 1975) (Figura 1).
Figura 1 – Microscopia eletrônica de astrovírus em amostra fecal. Forma de estrela de cinco a seis pontas. Fonte: Lee TW & Kurtz JB, 1981.
Os astrovírus pertencem à família Astroviridae, que por sua vez, possuem dois gêneros Avastrovirus e Mamastrovirus, porém, somente o Mamastrovirus acomete o homem. Seu material genético é constituído de RNA de fita simples, de polaridade positiva, com aproximadamente 6.800 nucleotídeos (nt) e apresentam cauda poli(A) na extremidade 3’ (Matsui & Greenberg, 2001). Esses vírus não apresentam envelope, têm diâmetro entre 28nm e 40nm e possuem nucleocapsídeo de simetria icosaédrica (Bass & Qiu, 2000).
O genoma de astrovírus possui três quadros de leitura aberta (Open Reading
Frame - ORFs), denominados ORF1a, ORF1b e ORF2 sendo organizados de 5 ' para 3'
(Figura 2). As regiões dos ORF1a e ORF1b, são responsáveis pela codificação de uma poliproteína não-estrutural denominada NSP1ab com tamanho aproximado de 160 kDa, a mesma é clivada em duas proteínas, NSP1a de 103 kDa, a qual é codificada para a serina protease viral; e uma outra proteína, NSP1b de 57 kDa que apresenta motivos de uma RNA polimerase-RNA dependente, respectivamente. (Méndez et al., 2003). A região de superposição observada entre esses ORFs abrange cerca de 60 a 70 nt e é
altamente conservada entre os genótipos (Mendéz & Arias, 2007). O ORF2 é responsável por codificar as proteínas estruturais deste vírus (Finkbeiner et al., 2008).
O ORF2 é transcrito sob a forma de RNA subgenômico, tendo este último a função de produzir proteínas virais estruturais em maiores quantidades, que auxiliam na produção da progênie viral de uma maneira mais eficiente (Monroe et al.,1993).
Figura 2 – Organização do genoma de astrovírus. Os astrovírus apresentam três ORFs que codificam para proteínas não estruturais (ORF1a - serina protease, e ORF1b - RNA polimerase-RNA dependente) e estruturais (ORF2), e cauda poli(A) na extremidade 3’. A ORF2 é transcrita também sob forma de RNA subgenômico. Fonte: modificado de Viralzone (http://expasy.org/viralzone/all_by_species/281.html)
Baseado na variabilidade genômica dos astrovírus, estes foram classificados em oito genótipos, (HAstV-1 a HAstV-8), fundamentados em sua reatividade a anticorpos policlonais e na análise por imunofluorescência, ensaios de neutralização e imunomicroscopia (Mendez &Arias, 2007). Recentemente, foi identificado dois novos genótipos de astrovírus, MLB1 astrovírus MLB1) e VA1 astrovírus (HAstV-VA1), em paciente com diarréia esporádica e pacientes de um surto de gastroenterites, respectivamente (Finkbeiner et al., 2009b; Finkbeiner et al., 2009c). Em outro estudo sugeriu três novos genótipos, VA2, MLB2 e VA3 (Finkbeiner et al., 2009a).
Dentre estes, o HAstV-1 é o tipo mais prevalente em vários países como observado no Brasil, Venezuela, Colômbia, Chile, Holanda, Alemanha, Itália e Espanha, seguido do HAstV-2, HAstV-3, HAstV-4 e HAstV-5. O HAstV-6, HAstV-7 e HAstV-8 são os menos detectados (Silva et al., 2001; Cardoso et al., 2002; Dalton et al., 2002; De Grazia et al., 2004; Gaggero et al., 1998; Koopmans et al., 1998; Medina et al., 2000; Oh & Schreier, 2001).
A rota de transmissão dos astrovírus é a fecal oral, caracterizada pela disseminação através de contatos íntimos com pessoas infectadas, pela ingestão de água
15 e alimentos contaminados, ou ainda por fômites contaminados (Matsui & Greenberg, 1996). A infecção por astrovírus não apresenta aparente sazonalidade (Chen et al., 2007).
O período de incubação observado em infecções por astrovírus varia de um a quatro dias. Indivíduos infectados com astrovírus têm como sintomatologia mais frequente a diarréia aquosa com duração de dois a quatro dias, e menos comumente vômitos, cefaléia, febre, dores abdominais e anorexia (Finkbeiner et al., 2008). A maior complicação resultante desta infecção é a desidratação, que pode estar relacionada com o estado de saúde do indivíduo, como baixo estado nutricional, infecção mista severa ou a imunodeficiência (Matsui & Greenberg, 2001).
A patogênese causada por estes vírus são pouco conhecidos, algumas pesquisas de gastroenterites em crianças tendo como agente etiológico os astrovírus, sugerem que a replicação viral ocorre em células epiteliais intestinais. Outros estudos mostram presença de partículas destes vírus no epitélio de biópsia duodenal e em macrófagos da lâmina própria de pacientes com infecção sintomática (Mitchell, 2002; Phillips et al., 1982).
As infecções humanas tendo como agente etiológico o astrovírus, têm incidência em todo o mundo, sendo detectadas em pessoas de diferentes idades, porém o principal grupo de risco são as crianças, idosos e pessoas imunocomprometidas (Finkbeiner et al., 2009a). Este dado sugere que anticorpos adquiridos por contato prévio com o vírus aferem resistência à reinfecção. Entretendo, os anticorpos tendem a declinar progressivamente com o tempo, acarretando na propensão a reinfecções de indivíduos com idade mais avançada (Matsui & Greenberg, 2001; Wilhelmi et al., 2003).
Alguns estudos relatam que os astrovírus humanos podem ser a segunda causa mais comum de gastroenterite viral em crianças, com rotavírus sendo o primeiro (Guix et al., 2002). Aproximadamente cerca de até 10% dos casos de gastroenterite aguda não bacteriana são responsabilidade dos astrovírus, tanto em países em desenvolvimento quanto os desenvolvidos (Liu et al., 2007). A prevalência de infecção por esses vírus relatada em estudos foi demonstrada da seguinte forma: África (2% a 9%), continente Europeu (3% a 7%), Estados Unidos (3% a 10%), países asiáticos e na Oceania (4% a 11%) e a América Latina com os maiores índices (4% a 17%) (Santos & Cardoso, 2005; Liu et al., 2004; Dalton et al., 2002; Cunliffe et al., 2002; Denno et al., 2005; Espul et al., 2004).
No Brasil, estudos sobre a prevalência destes vírus são bastante escassos, tendo suas taxas variando entre 3,4 a 28,2% (Gabbay et al., 2007; Victoria et al., 2007). Estudo realizado em crianças hospitalizadas em hospitais da rede pública nas cidades de Goiânia (1998-2002) e Brasília (1994-1996 e 1998-2002) revelou taxa de detecção de astrovírus de 3,7%, sendo que a maioria das amostras positivas eram provenientes da região do Distrito Federal (DF) (Santos et al.,2007), sendo que estudo realizado em crianças menores de cinco anos de idade, internadas em hospitais públicos, mostram que no DF o genótipo mais freqüente é o HAstV-2 (Silva et al., 2009).
1.2-CALICIVÍRUS
Estudo realizado pelo Centers for Disease Control (CDC) na cidade de Norwalk, Ohio, em outubro de 1968 investigou um surto de doença gastrointestinal (Adler & Zickl, 1969). A doença tinha um período de duração de cerca de 24 horas, com um período de incubação de 48 horas, sendo seus principais sintomas vômitos e náuseas, apesar de alguns pacientes apresentarem quadro de diarréia. Não se conseguiu encontrar o agente etiológico causador desta síndrome apesar de árdua pesquisa em laboratório (Adler & Zickl, 1969).
Em 1972, Kapikian et al. (1972), descobriram o agente causador presente nas amostras fecais do surto de Norwalk. Essas partículas foram visualizadas através de microscopia eletrônica, sendo os primeiros vírus associados com gastroenterite (Almeida & Waterson, 1969; Ardenne et al., 1941).
Posteriormente, em 1977, foi descoberto outro vírus, causador de um surto em uma creche em Sapporo, Japão, denominado assim de Sapporo virus (Chiba et al., 1979).
Estes vírus pertencem à família Caliciviridae, que possui quatro gêneros:
Norovirus, Lagovirus, Sapovirus e Vesivirus (International Committee on Taxonomy of
Viruses, 2007). Lagovirus e Vesivirus são, até o momento, exclusivos de animais, enquanto Norovirus e Sapovirus infectam principalmente seres humanos (Borges et al., 2005).
Os calicivírus não possuem envelope e apresentam um nucleocapsídeo com diâmetro entre 27 e 40 nm. Seu capsídeo é composto por uma proteína, a qual exibe uma simetria icosaédrica com 180 moléculas organizadas em 90 dímeros, que formam dois domínios, o domínio S e o domínio P. O domínio S forma a parte interna do
17 capsídeo que envolve o genoma, o domínio P, subdividido nos domínios P1 e P2, atribuem a esses vírus uma arquitetura característica em forma de cálice com cerca de 32 depressões observadas à microscopia eletrônica (Green et al., 2000) (Figura 3).
Figura 3 - Microscopia eletrônica de calicivírus. Vírus com arquitetura característica em forma de cálice com cerca de 32 depressões. Fonte: Friedrich Loeffler Institut, 2009.
Os calicivírus possuem RNA de fita simples, polaridade positiva e cauda poli(A) na extremidade 3’. Apresentam ainda uma proteína viral ligada a extremidade 5’ do RNA, denominada VPg. (Guo et al., 2001; Jiang et al., 1993; Meyers, 2003). A VPg tem um papel essencial na infectividade viral e na tradução inicial. As proteínas não estruturais são codificadas pela porção 5’ e as estruturais, pela porção 3’ do genoma (Guo et al., 2001; Jiang et al., 1993; Meyers, 2003).
Os calicivírus apresentam a organização genômica diferenciada entre seus gêneros (Figura 4). Nos gêneros norovírus e vesivírus, o genoma é organizado em três ORFs: ORF1, ORF2 e ORF3, sendo que a proteínas estruturais do capsídeo são codificadas pela ORF2. Os gêneros sapovírus e lagovírus são organizados em apenas ORF1 e ORF2, sendo que a ORF1 codifica uma poliproteína que é clivada para organizar proteínas estruturais e não estruturais (Green et al., 2000; Koopmans et al., 2002).
Figura 4 - Organização do genoma de calicivírus. Nos gêneros norovírus e vesivírus, o genoma é organizado em três ORFs: ORF1, ORF2 e ORF3. Os gêneros sapovírus e lagovírus são organizados em ORF1 e ORF2. Fonte: Viralzone (http://www.expasy.ch/viralzone/all_by_species/32.html).
O gênero norovírus tem sido classificado em cinco genogrupos (GI-GV), porém apenas o genogrupo I e II são clinicamente significantes, sendo o genogrupo IV menos significante para o homem (Ando et al., 2000; Koopmans et al., 2002; Bull et al., 2006; Hoffmann et al., 2010). Os genogrupos I e II do norovírus ainda podem ser subdivididos, sendo que, até o momento, o genogrupo I tem 15 genótipos, e o genogrupo II constituído de 18 genótipos (Okada et al., 2005).
O gênero sapovírus, é dividido em cinco genogrupos (GI-GV), dentre os quais o GI, GII, GIV e GV acometem o homem, enquanto GIII infectam suínos (Farkas et al., 2004; Hansman et al., 2007). Os sapovírus podem também ser subdivididos, onde somam um total de 13 genótipos (Farkas et. al., 2004).
Os calicivírus infectam indivíduos de todas as faixas etárias, distinguindo-se, dessa maneira, de outros agentes virais de gastroenterites que infectam preferencialmente crianças (Glass et al., 2000). Nas infecções sintomáticas em crianças, observa-se que cerca de 40% a 50% dos agentes predominantes são pertencentes ao genogrupo II dos norovírus, e o restante sendo distribuídos entre rotavírus, genogrupo I dos norovírus, astrovírus e adenovírus (Pang et al., 1999).
Como os astrovírus, os calicivírus também são transmitidos através da rota fecal oral. A ingestão de água e alimentos contaminados é a forma mais comum de contaminação por esses vírus, entretanto esta pode ocorrer mediante outras formas como por contato pessoal ou pela formação de aerossóis durante o vômito do indivíduo infectado (Koopmans et al., 2002). Seu sítio de replicação no homem não é bem definido, entretanto acredita-se ser na porção jejunal do intestino delgado, aonde ocorre desorganização das células epiteliais, achatamento das vilosidades intestinais, vacuolização do citoplasma e infiltração da lâmina própria por células mononucleares (Agus et al., 1973).
19 A doença causada por este agente etiológico é caracterizada por náuseas, vômitos, dor abdominal, diarréia e cefaléia. O vômito é mais frequente entre as crianças, e a diarréia entre adultos (Adler & Zickl 1969; Cubitt et al., 1979; Dolin et al., 1971). Os vírus do gênero norovírus frequentemente causam surtos de gastroenterite associados à água e a alimentos contaminados, provocando diarréia severa; já os vírus do gênero sapovírus, que infectam principalmente crianças, são geralmente associados à diarréia branda, podendo ocasionar casos severos (Sakai et al., 2001).
Os surtos de norovírus ocorrem mais comumente no inverno até o início da primavera e tem como característica a capacidade de ocasionar surtos em instalações fechadas e com grande movimentação de pessoas, tais como restaurantes, escolas, creches, hospitais, lares de idosos e navios. Fatores tais como uma dose infecciosa muito baixa ter a capacidade de ocasionar a doença, a ausência de imunidade duradoura, a estabilidade do vírus no meio ambiente, e sua transmissão por uma variedade de rotas contribuem para os índices de surtos pelos norovírus (Sakai et al., 2001; Chen et al., 2007).
Assim como nas infecções pelos astrovírus, os seres humanos adquirem anticorpos para os calicivírus com o decorrer da idade, alcançando índices de 50% a 90% entre adultos em diferentes países do mundo. Nos países em desenvolvimento, essa aquisição ocorre mais precocemente, indiferentemente se a doença é sintomática ou não, devido ao fato do saneamento básico e hábitos de higiene ainda serem precários, acarretando em uma maior prevalência das gastroenterites (Honma et al., 1998; O’Ryan et al., 1998).
Existem poucos estudos no Brasil avaliando a prevalência de calicivírus, porém alguns relatam uma taxa variando entre 3,6 a 33,3% de positividade para esses vírus (Soares et al., 2007; Parks et al.,1999). Estudo realizado em Campo Grande com crianças hospitalizadas com quadros de gastroenterites revelou amostras positivas em 3,6% dos casos (Andreasi et al., 2008).
Existem ainda relatos de infecção mista por vírus gastroentéricos, especialmente envolvendo astrovírus, norovírus, e rotavírus-A, isto porque as infecções por estes vírus ocorrem pela mesma via de contaminação, oral-fecal, podendo assim ser associado com condições precárias de saneamento (Carvalho-Costa et al., 2006.).
1.3-DIAGNÓSTICO
Os recursos usados para o diagnóstico laboratorial das gastroenterites, que incluem astrovírus e calicivírus, se dividem em ensaios não moleculares e moleculares. Entre os não moleculares podemos citar a microscopia eletrônica, técnicas de isolamento viral para astrovírus, já que os calicivírus não são cultiváveis em células laboratoriais, aglutinação em latex e ensaio imunoenzimático (ELISA). Os vários ensaios moleculares incluem a reação da cadeia da polimerase (PCR), hibridização
(dot-blot, Northern blotting e ensaio de hibridização líquida), NASBA (amplificação baseada
em seqüência de ácido nucléico) e sequenciamento (Yan et al., 2003; Belliot et al., 2001; Borges et al., 2005). Com base nas inúmeras sequências genômicas publicadas, vários ensaios de PCR foram estabelecidos para detecção de vírus específicos de diarréias.
A PCR é uma técnica altamente difundida, principalmente em pesquisas científicas. Apesar disso, apresentaremos os princípios desta técnica, neste trabalho. A PCR foi desenvolvida na década de 80 por Kary Mullis, onde o mesmo recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993. A PCR é amplificação enzimática, in vitro, de uma sequência específica de DNA localizado entre dois oligonucleotídeos visando à produção de bilhões de cópias em poucas horas (Cury et al., 2005; Mullis, 1990).
Para que ocorra a reação da PCR, são utilizados os seguintes reagentes: oligonucleotídeos; tampão; MgCl2; desoxirribonucleotídeos tri-fosfato, dNTPS, (adenina, timina, citosina, guanina); e DNA polimerase.
Os oligonucleotídeos são projetados de modo que um é complementar a um filamento da molécula de DNA num lado da sequência-alvo (sense) e o outro iniciador é complementar ao outro filamento da molécula de DNA no lado oposto da sequência-alvo (anti-sense) (Nussbaum et al., 2008). O tampão tem por finalidade oferecer condições adequadas de pH e salinidade a reação, possui pH variando entre 8,5 e 9,0 à 25°C, com o aumento da temperatura pelo termociclador o pH diminui para 7,4, sendo um valor ótimo para atividade da DNA polimerase na temperatura de 72°C. O MgCl2 é
importante para a atividade máxima da DNA polimerase, já que seus íons se ligam aos dNTPS, auxiliando na expressão genética. Os dNTPS são os nucleotídeos que irão compor as novos fragmentos de DNA (Cury et al., 2005).
A DNA polimerase é uma enzima que catalisa a incorporação de nucleotídeos na fita em construção. A mais utilizada é a Taq polimerase termoestável, a qual foi
21 isolada da bactéria Thermus aquaticus (Pasternak, 2007). Os filamentos de DNA recém-sintetizados são complementares entre si, e podem formar uma segunda cópia da sequência-alvo original. Ciclos repetidos de desnaturação pelo calor, hibridização dos iniciadores e síntese do DNA enzimático resultam em uma amplificação exponencial (Nussbaum et al., 2008).
O procedimento da PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes durante os ciclos de amplificação. A primeira etapa corresponde à desnaturação da dupla fita de DNA. Nesta, a temperatura é elevada de 92 a 96oC que leva à quebra das pontes de hidrogênio que ligam as bases nitrogenadas, separando as fitas complementares. Posteriormente, ocorre a etapa de anelamento dos oligonucleotídeos, onde a temperatura é reduzida entre 50 a 60oC por 30 segundos, e então os oligonucleotídeos sense e anti-sense se ligam no trecho a ser copiado. A terceira etapa, extensão, corresponde ao início da polimerização da cadeia, com a elevação da temperatura a cerca de 72°C, onde a Taq polimerase, dá início a síntese da cadeia adicionando oligonucleotídeos, e resultando na síntese do fragmento do DNA (Figura 5). Este ciclo se repete novamente, cerca de 25 a 35 vezes, onde as temperaturas e as repetições são controladas por um aparelho, denominado termociclador (Pasternak, 2007; Nussbaum et al., 2008).
Figura 5- Amplificação do DNA usando técnica de PCR. A PCR é composta por três etapas, a etapa 1, desnaturação, aonde ocorre a quebra das pontes de hidrogênio e a separação das fitas de DNA. Na etapa 2, ocorre o anelamento dos oligonucleotídeos sense e anti-sense. A terceira etapa, é aonde ocorre a síntese do DNA através da enzima DNA polimerase, e são adicionados os dNTPS. Este processo se repete por várias vezes, dando origem a bilhões de cópias de DNA. Fonte: Baseado em Fundamentos
da Biologia Celular – Alberts et al., 1999.
Os produtos de PCR são submetidos à técnica de eletroforese em gel de agarose, o qual se comporta como uma malha que separa o DNA por diferença de tamanho devido a sua porosidade irregular. Os géis podem ser preparados em diferentes
concentrados dependendo do tamanho do fragmento a ser analisado. É adicionado a esse produto um corante, o glicerol azul de bromofenol, para a inoculação dos produtos de PCR no gel, este dará, além da visualização do produto, um maior peso molecular para auxiliar a entrada no poço, então são submetidos a um campo elétrico. As amostras obtidas da PCR são carregadas negativamente, desta maneira estas serão repelidas do pólo negativo e atraídas para o pólo positivo. Porém, este material genético tem que estar em contato com um tampão que permita a condução elétrica através de íons, para o seu deslocamento. As amostras com um tamanho maior terão uma menor velocidade de deslocamento e serão retidas ao contrário das moléculas pequenas que irão se deslocar com uma facilidade maior (Figura 6) (Farah, 2000).
O gel contendo as amostras é submetido à coloração com brometo de etídeo, um análogo de base que se intercala as moléculas de DNA e emite fluorescência quando exitado por luz ultravioleta. O tamanho da banda obtida é então comparado com as bandas do marcador utilizado, que possui moléculas de tamanhos definidos e estima-se o tamanho do fragmento gerado na PCR (Alberts et al., 1999).
Figura 6- Eletroforese em gel. O produto da PCR aplicado no gel é submetido a um campo magnético, as amostras do PCR são carregadas negativamente, desta maneira estas serão repelidas do pólo negativo e atraídas para o pólo positivo. As amostras com um tamanho maior terão uma menor velocidade de deslocamento e serão retidas ao contrário das moléculas pequenas que irão se deslocar com
uma facilidade maior. Fonte: Só Biologia
(www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php).
Apesar do brometo de etídeo ser o corante mais utilizado e ter uma boa sensibilidade, possui algumas desvantagens como o poder altamente mutagênico. Existem outros corantes, como SYBR Green I e SYBR Gold, porém estes se degradam rapidamente em condições levemente alcalinas proporcionadas pelo tampão, logo não
23 podendo se confiar totalmente em sua coloração. Um novo corante, GelRed™, foi desenvolvido e possui uma sensibilidade maior do que os outros corantes e exibe notável estabilidade podendo ser utilizado durante ou apos a eletroforese, além de possuir poucos efeitos mutagênicos, entretanto seu custo é bem mais elevado que os outros corantes (Gencompare, 2010).
Em alguns casos o agente a ser detectado possui RNA como material genético, então se realiza o processo de transcriptase reversa (RT) para obtenção de DNA. Para a realização do RT, utiliza-se: dNTPs; oligonucleotídeo; tampão; ditiotreitol (DTT), estabilizante para a enzima; RNase OUT, é uma enzima inibidora de RNases com a finalidade de não ocorrer degradação da RNA molde; e a enzima transcriptase reversa, a qual dá origem ao cDNA a partir da fita de RNA (Alberts et al., 1999). Sabendo-se que a extensão de um fragmento ocorre de 5’ para 3’, o oligonucleotídeo utilizado é o anti-sense, o qual formará uma fita complementar de DNA.
Para aperfeiçoarmos este estudo, utilizamos oligonucleotídeo randômico na reação da transcriptase reversa. O oligonucleotídeo randômico permite a construção do cDNA a partir de qualquer RNA, tornando possível a detecção de diferentes agentes virais que contenham o RNA como material genético. Assim poderíamos otimizar a reação economizando tempo, custo e amostra primária, o qual as vezes é escassa.
Além da PCR convencional, que utiliza um par de oligonucleotídeos, tem sido relatada uma variante do método, conhecida como PCR multiplex. A PCR multiplex consiste em uma metodologia que incorpora diferentes conjuntos de oligonucleotídeos específicos para mais de um alvo, permitindo simultâneas amplificações de ácidos nucléicos em um único teste. O uso de oligonucleotídeos randômicos na RT reduz o uso de reagente, aumentando a agilidade da reação e consequentemente o custo como um todo (Svraka et al., 2009; Yan et al., 2003).
Com a diminuição dos reagentes e do trabalho, e sua agilidade na detecção, a PCR multiplex têm tido evidência nas análises clínicas e ambientais (Yan et al., 2003), principalmente, para avaliação de amostras clínicas para a determinação de etiologia de surtos de gastroenterite aguda, para que se tenha um diagnóstico rápido. Estes dados são utilizados para orientar as ações políticas de controle de infecção destes vírus gastroentericos (Svraka et al., 2009).
Estudo realizado por Yan et al. (2003) no Japão baseado na metodologia da PCR
multiplex utilizou a técnica para a detecção de norovírus (genogrupo GI e GII),
gastroenterite. Este estudo seguirá a metodologia descrita por Yan et al. com modificações, com o objetivo de validar a técnica para implantação desse sistema, de forma que se tenha um laboratório de referência para o estudo e detecção dos surtos gastroentéricos, para uma melhor conduta de tratamento e prevenção.
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2-JUSTIFICATIVA
O principal interesse dos astrovírus e calicivírus para a saúde pública é o fato de que estes vírus são causadores de diarréias esporádicas, surtos prolongados de gastroenterites, hospitalizações e até mesmo podendo levar o indivíduo ao óbito devido suas complicações (Walter & Mitchell, 2003).
As gastroenterites agudas podem ser causadas por bactérias, parasitas e por vírus, porém os vírus têm se destacando como agente etiológico. Dentre os gastrovírus, os rotavírus são os agentes mais identificados seguidos pelos calicivírus, adenovírus e astrovírus (Caracciolo et al. 2007).
Já existem disponíveis métodos rápidos e baratos para detecção de rotavírus e adenovírus, como o ensaio imunoenzimático para detecção de antígenos de rotavírus e adenovírus, conjunto de diagnóstico EIARA da Fundação Osvaldo Cruz/ Biomanguinhos (FIOCRUZ), os quais são produzidos no Brasil. A falta de um método com essas características para os outros agentes virais é que dificulta um diagnóstico mais abrangente das gastroenterites. Por este motivo é que propomos a padronização de um método mais rápido e mais barato para detecção de astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II (FIOCRUZ, 2010).
O LACEN/DF recebe amostras diarréicas provenientes de toda a rede pública da região e as submetem a detecção de bactérias, protozoários, helmintos e rotavírus. As amostras que são negativas para estes agentes ficam sem diagnóstico.
Neste sentido, este estudo propõe validação da técnica da PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II. Para isso, foram usadas amostras com resultados previamente conhecidos, enviadas pelo Instituto Evandro Chagas de Belém, PA. Considerando que a PCR multiplex têm mostrado praticidade e bons resultados, será utilizado neste projeto método previamente publicado onde se amplificará astrovírus e calicivírus em uma única reação.
Este trabalho será de relevância para o conhecimento da circulação de astrovírus e calicivírus no Distrito Federal durante os surtos de gastroenterites, uma vez que tais informações não são obtidas devido à falta de metodologia de identificação de um leque de vírus. Além disso, se padronizará a técnica utilizada neste estudo nos laboratórios do LACEN-DF e da Universidade Católica de Brasília.
É esperado que os resultados somados a outros estudos auxiliem na determinação de medidas preventivas contra astrovírus e calicivírus que irão amenizar esse problema de saúde pública.
É esperado que essa técnica uma vez padronizada se torne um meio de estudo constante da circulação e monitoramento desse vírus nessa região, principalmente para o auxílio ao diagnóstico.
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3-OBJETIVO
• Padronização da metodologia de PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II, nos laboratórios de biotecnologia da Universidade Católica de Brasília e no LACEN/DF.
4-MATERIAL E MÉTODOS
Foram incluídas neste trabalho 30 amostras de fezes diarréicas em suspensão, cedidas ao LACEN pelo Instituto Evandro Chagas de Belém, PA, Centro de Referência Nacional para Rotavírus, pela Dra. Yvone Gabbay, para serem usadas como amostras cegas no teste de validação com a metodologia do PCR multiplex.
As amostras foram testadas para norovírus (genogrupo I e II), sapovírus e astrovírus seguindo a metodologia descrita por Yan et al. (2003) com modificações, sendo que em todo o processo foi utilizado controles positivos e negativos. Como controle positivo foi utilizado um pool de amostras positivas para astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo II.
Esta pesquisa foi aprovada pelo comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Católica de Brasília (registro: CEP/UCB 026/2010).
Extração do RNA viral
As extrações do RNA das amostras estudadas foram realizadas com o QIamp Viral RNA Mini Kit (50) da QIAGEN, seguindo recomendações do fabricante.
Transcriptase Reversa - RT
Através da utilização de uma enzima transcriptase reversa, a Monoley Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT – Invitrogen), obteve-se o DNA
complementar (cDNA). Primeiramente realizou-se o mix1 que contém água RNAse free, RNA extraído da amostra, dNTP e oligonucleotídeo randômico e incubou-se por 5 minutos a 75°C (Tabela 1). Em seguida, realizou-se o mix2 que contém tampão de M-MLV, DTT, e a enzima M-M-MLV, o qual se adicionou ao mix1 e incubou-se por uma hora a 37 °C, seguidos de cinco minutos a 97°C, para inativação da enzima, e 10 minutos a 4°C.
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Tabela 1 – Reagentes e seus respectivos volumes para a realização do mix1e mix2 da RT.
Reagentes Mix1 Volume Reagentes Mix2 Volume
Água RNAse free 5,5 µL Tampão Buffer de
M-MLV 5x 4 µL Amostra 5 µL DTT 0,1M 2 µL dNTP 10 mM 1 µL M-MLV 200U/ µL 1 µL Oligonucleotídeo randômico 50mM
1 µL RNAse OUT 40U/ µL 0,5 µL
Volume final 7,5 µL 7,5 µL
Conjuntos de Oligonucleotídeos
Para a reação de amplificação utilizou-se um mix de oligonucleotídeos, com um total de quatro conjuntos de oligonucleotídeos que tem como alvo a região do capsídeo no genoma viral. Dois conjuntos de oligonucleotídeos G1-SKF/G1-SKR (Kojima et al., 2002) e COG2F/G2-SKR (Kojima et al., 2002; Shinohara et al., 2002) foram utilizados para amplificar norovírus genogrupo I e norovírus genogrupo II, respectivamente. Dois outros conjuntos de oligonucleotídeos SLV5317/ SLV5749 (Yan et al., 2003) foram utilizados para amplificar os sapovírus genogrupo I e II . E PreCAP1/82b (Matsui et al., 1998; Sakamoto et al., 2000) foram o conjunto de oligonucleotídeos usados para amplificar todos os sorotipos de astrovírus humanos. Cada oligonucleotídeo é composto por nucleotídeos conservados entre os diferentes genogrupos, tendo como produto da PCR quatro fragmentos específicos com os seguintes tamanhos: 330, 387, 434 e 719 pb para norovírus genogrupo I e II, sapovírus e astrovírus respectivamente (Tabela 2).
Tabela 2 – Conjunto de oligonucleotídeos com suas respectivas sequências de oligonucleotídeos e o tamanho o fragmento esperado.
Vírus Conjunto de
oligonucleotídeos utilizados
Sequência de oligonucleotídeos 1 Direção 2 Tamanho do
fragmento esperado
Astrovírus PreCAP1 5'-GGACTGCAAAGCAGCTTCGTG-3' (S) 719 bp
Astrovírus 82b 3'-TCCCTACCGACCACCGAGTG-5' (AS)
Norovírus G1 G1-SKF 5’-CTGCCCGAATTYGTAAATGA-3’ (S) 330 bp
Norovírus G1 G1-SKR 3'-ACATRTTACCRACCCAACC-5' (AS)
Norovírus G2 COG2F 5'-CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG-3' (S) 387 pb
Norovírus G2 G2-SKR 3'-TACATRTTRCCHRTACGNCCRCC-5' (AS)
Sapovírus SLV5317 5'-CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT-3' (S) 434 bp
Sapovírus SLV5749 3'-ACCCCBCCATSVAAACTYCRGGC-5' (AS)
1-Sendo que, a letra B corresponde aos nucleotídeos C, T ou G; a letra H corresponde aos nucleotídeos A, C ou T; a letra R aos nucleotídeos A ou G, a letra S corresponde aos nucleotídeos G ou C; a letra V corresponde aos nucleotídeos A, C, ou G; a letra W corresponde aos nucleotídeos A ou T; a letra Y corresponde aos nucleotídeos C e T; e a letra N corresponde a qualquer um nucleotídeo.
2- S (sense), AS (anti-sense).
Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
Para a reação da PCR realizou-se um mix contendo os seguintes reagentes: tampão 10x, MgCl2, mix oligonucleotídeos, água RNAase free, Taq polimerase
(Invitrogen), dNTP, e o cDNA proveniente da RT (Tabela 3). Ao finalizar, este mix foi encaminhado a um termociclador com as seguintes temperaturas: 80°C por 15 s., 94°C por 3 min., seguido de 35 ciclos de 94°C por 30 s., 55°C por 30 s., 72°C por 60s., e uma extensão final de 72°C por 7min., seguido de resfriamento a 8°C.
Tabela 3 - Reagentes e suas respectivas concentrações para a realização dos mix da PCR.
Reagentes Mix PCR Volume
Tampão 10x 2,5 µL
MgCl2 50Mm 1 µL
Mix oligonucleotídeos 10Mm 1,6 µL
Água RNAase free 15,7 µL
Taq polimerase 5U/ul 0,2 µL
dNTP 2,5Mm 2 µL
Cdna 2 µL
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Eletroforese
Para a visualização dos fragmentos amplificados, realizou-se eletroforese em um gel de agarose a 1% a qual separou as moléculas de acordo com o seu tamanho. Utilizou-se também o brometo de etídeo como intercalante dos ácidos nucléicos para vizualização.
O 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) foi utilizado como marcador molecular. As amostras positivas para norovírus genogrupo I, norovírus genogrupo II, sapovírus e astrovírus terão os seguintes tamanhos de bandas: 330pb, 387 bp, 434 pb e 719 bp, respectivamente (Figura 7).
Figura 7 - Eletroforese de norovírus, sapovírus e astrovírus com o tamanho de suas respetivas bandas. Controle positivo de norovírus GI com 330bp (1), Controle positivo de norovírus GII com 387 bp(2), Controle positivo de sapovírus com 434 pb (3); astrovírus cultivados 719 bp (4); Amostra positiva para os três vírus em estudo (5); Marcador de DNA(M). Fonte: Yan et al., 2003.
5-RESULTADOS
Este estudo analisou 30 amostras cedidas pelo Instituto Evandro Chagas, como amostras cegas, com resultados previamente conhecidos para validarmos a metodologia da PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus, norovírus genogrupo I e II.
Das amostras analisadas, 6.6 % (02) apresentaram positividade para astrovírus, 3,3%(01) apresentou positividade para sapovírus e 3,3% (01) apresentou positividade para norovírus (Figura 8).
Figura 8- Resultados das amostras positivas detectadas a partir da técnica de PCR multiplex. Controle positivo para sapovírus e astrovírus, amostra positiva para norovírus genogrupo II (N GII), amostra positiva sapovírus (S), e duas amostras positivas para astrovírus (A).
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6-DISCUSSÃO
Este estudo propõe a padronização de um método de diagnóstico para detecção de vírus gastroentéricos em amostras diarréica através da PCR multiplex. Esta metodologia possui como características uma maior rapidez nos resultados e um menor custo em relação a PCR convencional, características necessárias para um laboratório de referência para detecção dos agentes etiológicos de surtos gastroentéricos.
A pesquisa desses vírus no Brasil era inicialmente limitada às instituições as quais possuíam metodologia de microscopia eletrônica, sendo a positividade de 0,8% a 4,2% dos casos estudados (Leite et al., 1991). Ao incluir as técnicas moleculares, essa porcentagem na positividade aumentou para 2,8% a 33% dos casos estudados. (Silva et al., 2001; Cardoso et al., 2002). As metodologias moleculares trouxeram um avanço na detecção nas gastroenterites, já que possui uma maior sensibilidade para detecção desses patógenos, por isso a necessidade de se validar técnicas sensíveis de amplo aspectro para se obter estas informações necessárias.
O custeio geral das PCR convencionais tem um valor muito maior do que em relação a PCR multiplex, pois usam um único par de oligonucleotídeos durante a reação, permitindo a detecção de apenas um tipo viral. Geralmente os vírus causadores da gastroenterites têm sua sintomatologia clínica muito semelhante, o que não direciona a pesquisa laboratorial, acarretando um tempo maior na pesquisa do vírus causador da patologia (Yan et al., 2003).
Já a PCR multiplex utiliza diferentes conjuntos de oligonucleotídeos para dois ou mais alvos em uma única reação, proporcionando assim uma economia no custo da reação e agilidade de resultados, já que permite amplificação de ácidos nucléicos de alvos diferentes simultaneamente em um único teste (Yan et al., 2003).
Estudos semelhantes a este têm sido relatados utilizando a metodologia da PCR
multiplex, como por exemplo, um estudo que detectou o vírus da hepatite A, norovírus,
e poliovírus tipo I (Rosenfield et al., 1999), a detecção de todos os sorotipos de astrovírus humanos e norovírus (Sakon et al., 2000), a detecção do vírus da gripe tipos A, B e C (Poddar et al., 2002), detecção de agentes gastroentéricos adenovírus grupo F, rotavírus e norovírus (O’Neill et al., 2002), detecção de norovírus genogrupo II e rotavírus-A, e norovírus genogrupo I, adenovírus, astrovírus e sapovírus em amostras de pacientes com gastroenterite aguda (Svraka et al., 2009), e o próprio estudo realizado no Japão o qual este trabalho foi baseado, onde obteve 16,4% de positividade para os vírus
estudados, astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo I e II (Yan et al., 2003). Os quais obtiveram resultados satisfatórios para detecção dos vírus em estudo.
Sua maior utilização é para investigações de surtos nosocomiais e em comunidades, para obtenção de um resultado rápido e confiável para implantação de ações corretivas contra a disseminação da infecção.
A sensibilidade de um método diagnóstico é a capacidade de detectar positividade em amostras positivas, ou seja, o agente etiológico. E especificidade de um método diagnóstico é a capacidade de detectar negatividade em amostras que não possuem o agente etiológico, ou seja, verdadeiramente negativas. Alguns trabalhos mostram que pode ser que a sensibilidade da PCR multiplex caia até 10 vezes quando comparado com a PCR convencional, como foi o caso no estudo de Yan et al. (Jackson et al., 1996; Tsai et al., 1994). Alguns estudos mostram especificidade maior, de 92% para norovírus e 100% para os outros vírus, como rotavírus-A, adenovírus, astrovírus e sapovírus, como foi o caso do estudo de Svraka et al. Nesse estudo, não foi possível calcularmos a sensibilidade e especificidade exata da metodologia, pois os resultados do Instituto Evandro Chagas não estão disponíveis no momento uma vez que este estudo está em andamento.
Neste estudo foram encontradas 02 amostras positivas para astrovírus (6,6%) e 01 amostra para sapovírus (3,3%) e 01 para norovírus genogrupo II (3,3%). Estes dados mostram que a metodologia é eficiente para a detecção dos vírus em questão, uma vez que detectou-se astrovírus, sapovírus e norovírus genogrupo II. Os resultados oriundos do Evandro Chagas ainda não estão disponíveis, mas considerando que provavelmente em 30 amostras terão mais positivas que 13,33% (4 amostras), julga-se necessário alguns reajustes para melhorar a sensibilidade da técnica, já que houveram baixos índices de positividade.
Algumas hipóteses foram levantadas para esse fato, como a degradação do conjunto de oligonucleotídeos; a temperatura de anelamento não está adequada para a realidade da região de estudo, já a temperatura foi a mesma utilizada em estudo no Japão (Yan et al., 2003); a concentração de vírus poderia estar baixa, já que essas foram enviadas ao laboratório em forma de suspensão e provavelmente já sofreram alguns congelamentos e descongelamentos, o que pode levar a degradação do RNA viral; entre outros fatores, sendo necessário um maior tempo de pesquisa para se adequar a técnica a realidade local.
35 Este estudo apresenta resultados preliminares que indicam a especificidade do método e reforça a possibilidade de implantação de um método mais rápido e barato de diagnóstico das gastroenterites virais. Estudos futuros são necessários para a padronização da PCR multiplex nos laboratórios da Universidade Católica de Brasília e LACEN que utilizarão tais resultados para dar continuidade ao processo de validação da técnica. Poderão ainda, ser usados para auxiliar em novos estudos das gastroenterites virais, como na detecção da prevalência destes vírus na região, e podem também auxiliar nas medidas corretivas durante os surtos gastroentéricos, já que haverá um diagnóstico mais rápido e eficiente.
7-CONCLUSÃO
Este estudo teve como objetivo padronizar a técnica da PCR multiplex para detecção de astrovírus, sapovírus, norovírus genogrupo I e II, nos laboratórios do LACEN-DF e nos laboratórios de biotecnologia da Universidade Católica de Brasília.
O LACEN-DF recebe amostras diarréicas provenientes de toda a rede pública da região e as submetem a detecção de bactérias, protozoários, helmintos e rotavírus-A, as amostras que são negativas para estes agentes ficam sem diagnóstico.
Depois de validada está técnica, se terá a possibilidade de detecção dos enteropatógenos virais causadores de surtos, afim de melhor direcionar políticas de controle dessas infecções, além da possibilidade de realizar estudos para se identificação e caracterização dos agentes infecciosos virais circulantes na região do Distrito Federal. Outros estudos ainda podem ser realizados para complementar este e contribuir para a resolução dessa problemática de saúde pública.
Considerando que alguns parâmetros ainda precisam ser redefinidos para uma melhor amplificação e uma maior sensibilidade deste método, este estudo é preliminar e terá continuidade para resolucionar interferentes.
É esperado que os resultados somados a outros estudos possibilitem a padronização da técnica da PCR multiplex e que futuramente auxiliem na determinação de medidas preventivas contra surtos por astrovírus e calicivírus, além de se tornar parte efetiva na rotina dos laboratórios para o auxílio na detecção destes vírus, depois de padronizada.
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