AVALIAÇÃO ECOTOXICOLÓGICA DE
17 β-estradiol POR MEIO DE PARÂMETROS GENÉTICOS UTILIZANDO COMO MODELO EXPERIMENTAL Oreochromis niloticus
CURITIBA 2008
AVALIAÇÃO ECOTOXICOLÓGICA DE
17 β-estradiol POR MEIO DE PARÂMETROS GENÉTICOS UTILIZANDO COMO MODELO EXPERIMENTAL Oreochromis niloticus
Dissertação apresentada como requisito a obtenção do título de Mestre em Gestão Ambiental do curso de mestrado Profissional em Gestão Ambiental, Universidade Positivo (UP).
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Cíntia Mara Ribas de Oliveira
Colaboradora: Prof.ª M.Sc. Mônica Lucia Adam
CURITIBA 2008
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da Universidade Positivo - Curitiba – PR
S763 Sponchiado, Graziela.
Avaliação ecotoxicológica de 17 ß-estradiol por meio de parâmetros genéricos utilizando como modelo experimental
Oreochromis niloticus / Graziela Sponchiado. Curitiba :
Universidade Positivo, 2008. 90 p. : il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Positivo, 2008. Orientadora : Dra. Cíntia Mara Ribas de Oliveira. 1. Toxicologia – Aspectos ambientais. I. Título.
ESTA DISSERTAÇÃO FOI JULGADA ADEQUADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM GESTÃO AMBIENTAL (área de concentração: gestão ambiental) PELO PROGRAMA DE MESTRADO EM GESTÃO AMBIENTAL DA UNIVERSIDADE POSITIVO – UP. A DISSERTAÇÃO FOI APROVADA EM SUA FORMA FINAL EM SESSÃO PÚBLICA DE DEFESA, NO DIA 26 DE JUNHO DE 2008, PELA BANCA EXAMINADORA COMPOSTA PELOS SEGUINTES PROFESSORES:
1) Profª Cíntia Mara Ribas de Oliveira - UP - (Presidente);
2) Prof. Roberto Ferreira Artoni – Universidade Estadual de Ponta Grossa, UEPG (Examinador);
3) Profª Ana Flavia Locateli Godoi- Universidade Positivo (Examinador); 4) Profª Eliane Carvalho de Vasconcelos - Universidade Positivo (Examinador);
CURITIBA – PR, BRASIL
_______________________________________ PROF. MAURÍCIO DZIEDZIC
À minha família, Delvino, Lindamir, Daniella e Cassyano.
Ao meu marido Cassyano, pela ajuda nos testes estatísticos, por toda paciência e compreensão neste período.
Aos meus amigos que estiveram presentes a cada minuto me apoiando, para Dayana M. Santos em especial.
À Universidade Positivo (UP), pela oportunidade concedida ao fornecer uma bolsa de estudos.
À professora Dra. Cíntia Mara Ribas de Oliveira, por seu incentivo, confiança, apoio, ajuda e amizade nestes dois anos.
Ao Marco Aurélio Carvalho Filho, pela oportunidade cedida para eu poder cursar o mestrado e pela amizade.
À professora Dra. Marta Margarete Cestari, por ter permitido que a Wanessa Ramsdorf pudesse me dar treinamento na UFPR para as técnicas utilizadas neste trabalho.
A minha amiga Mônica Lucia Adam, por toda a ajuda, incentivo, confiança, apoio e colaboração na realização deste trabalho, e pela amizade.
A minha amiga Luciana Requião, pela ajuda na parte prática.
As minhas amigas e companheiras de mestrado Karla H. Preussler, Débora T. Ramos e Eliana M. R. Fortunato.
Ao Fernando Zasso e a Any C.B Andrade, pela ajuda na parte prática.
Ao Julio César Santi, por doar os peixes para realização do trabalho.
excretada pela urina e fezes em sua forma original ou de metabólitos. A maioria dos fármacos não é completamente biodegradada e, por serem parcialmente removidos em estações de tratamento de efluentes (ETE) e de água (ETA), tais compostos podem ser encontrados em corpos d’água. Embora sejam relatadas concentrações extremamente baixas detectadas em águas superficiais, subterrâneas e água potável, que poderiam não apresentar efeitos significativos ao ambiente em termos de toxicidade aguda, a necessidade de estudos adicionais a respeito é fato, principalmente no tocante à toxicidade crônica, principalmente por serem restritos os estudos usando baixas concentrações. Sendo assim, o presente estudo investigou os efeitos genotóxicos agudo e crônico sobre Oreochromis niloticus (Família: Cichlidae, nome popular Tilápia), em função da exposição a 17 β-estradiol (E2). Para tanto, foram avaliados parâmetros citogenéticos em células sanguíneas deste organismo, por meio de Teste do Micronúcleo (MN), Anormalidades Nucleares (AN) e Ensaio Cometa, para a concentração de 6 ng.L-1 do hormônio,para os tempos de exposição de 24 horas, 48 horas e 10 dias. Verificou-se, pela análise de micronúcleos, diferença significativa (p=0,036) entre os grupos controle e tratado, para o tempo de exposição de 10 dias a E2, evidenciando menor freqüência de MN para o grupo tratado. A análise de Anormalidades Nucleares demonstrou diferença significativa (p=0,018) entre os grupos, para o tempo de exposição de 24 horas, tendo sido observado mais alterações no grupo tratado. Já por meio do Ensaio Cometa, foram verificados danos mais pronunciados após exposição de 48 horas (p<0,001) a E2, tendo sido observado maior escore de danos para o grupo tratado em relação ao controle negativo. Os resultados sugerem que E2 na concentração ambiental de 6 ng.L-1 pode exercer interferências agudas e crônicas, produzindo efeitos genotóxicos e mutagênicos em células de sangue de O. niloticus. Os testes do MN, AN e Ensaio Cometa podem ser, em conjunto, úteis e adequados na avaliação da genotoxicidade do E2 , necessitando, no entanto, de estudos adicionais para se inferir mais precisamente acerca de seus efeitos clastogênico e aneugênico deste composto.
Palavras-chave: genotoxicidade; 17 β-estradiol; teste do micronúcleo; ensaio cometa, anormalidades nucleares, medicamento.
A significant quantity of human and veterinary medicines was excreted by urine and excrement, in their original structures or as their metabolites. Most of these drugs are not completely biodegraded, and due their partial removal during Waste Water Treatment (WWT) and. Water Treatment (WT), these contaminants can be detected in aquatic systems. Despite of very low levels being reported in surface water, groundwater and some drinking water, that may not show significant effects in the environment for acute toxicity, much more should be known about the potential for chronic effects of pharmaceuticals in low levels. The acute and chronic genotoxic effects of 17 β-estradiol (E2) were evaluated in Oreochromis niloticus (Family: Cichlidae) using the micronucleus test, nuclear abnormalities evaluation and comet assay, for fishes exposed to 6 ng.L-1 of E2 for 24 hours, 48 hours and 10 days. The results showed that E2 have genotoxic effect on blood cells because there was lower micronucleus frequencies in the test group in relation to the control group (without E2 treatment) for 10 days exposure (p=0.036). Differences were also observed for nuclear abnormalities at 24 h exposure, which were higher for the test group (p=0.018). The comet assay demonstrated genotoxic effects of E2 after 48 h of contact, when compared to the negative control (p<0.001) The results suggest that the tested concentration of the E2 probably gave rise to acute and chronic genotoxic and mutagenic disturbances in the erythrocytes of O. niloticus. The combination of micronucleus, nuclear abnormalities and comet assay proved to be suitable and useful in the evaluation of the genotoxicity of E2. However, further studies must be carried out to elucidate its clastogenic and aneugenic effects.
Keywords: genotoxicity; 17 β-estradiol; micronuclei test; alkaline comet assay; nuclear abnormalities; pharmaceutical.
Figura 1 – Fluxo dos medicamentos para o ambiente aquático 20
Figura 2 – Estrutura química do 17 β-estradiol e da estrona 28
Figura 3 – A) processo normal de divisão celular. B) formação do MN por fragmento cromossômico acêntrico ou de um cromossomo inteiro, por não terem sido incluídos no núcleo recém-formado e permanecerem no citoplasma após a fase da telófase; C) formação do MN por ponte citoplasmática com fragmento cromossômico acêntrico que não foi incluído no núcleo recém-formado, permanecendo no citoplasma após a telófase.
34
Figura 4 – Eritrócitos micronucleados de Poecilia vivipara 35
Figura 5 – - Anormalidades nucleares em eritrócitos de peixe. a) núcleo lobulado. b) núcleo evaginado. c) núcleo vacuolado. d) núcleo lobulado acentuado.
36
Figura 6 – Classes de dano no ADN observadas pelo Ensaio Cometa 38
Figura 7 – Exemplar de Oreochromis niloticus (Tilápia) 40
Figura 8 – Desenho experimental. a) Aquário sendo preenchido com 51 L de água. b) Peixes ambientalizando no aquário. c).Peixes sendo expostos a 6 ng.L-1 E2 em aquários com 52 L de água contaminada.
42
Figura 9 - MN encontrados em eritrócitos de O. niloticus no experimento com 17 β-estradiol
47
Figura 10 – Comparação estatística dos números das células com MN observados para os experimentos 1, 2 e 3 para grupo controle negativo e tratado dos tempos de 24 h (a, b), 48 h (c, d) e 10 dias (e, f)
Figura 11 – Comparação estatística dos escores médios de células com MN observados para o grupo exposto 17 β-estradiol (6 ng.L-1), por 24 h (a), 48 h (b) e 10 dias (c) (tratado) em relação ao grupo controle negativo (controle)
50
Figura 12 - Anormalidades nucleares encontradas em eritrócitos de O. niloticus no experimento com 17 β-estradiol a) células com núcleo lobulado; b) evaginado; c) vacuolado e d) lovado acentuado
51
Figura 13 – Comparação estatística dos números das células com Anormalidades Nucleares observados para os experimentos 1, 2 e 3 para grupo controle negativo e tratado dos tempos de 24 h (a, b), 48 h (c, d) e 10 dias (e, f)
52
Figura 14 – Comparação estatística dos números das células com Anormalidades Nucleares observados para o grupo exposto 17 β-estradiol (6 ng.L-1), por 24 h (a), 48 h (b) e 10 dias (c) (tratado) em relação ao grupo controle negativo (controle)
53
Figura 15 – Comparação estatística dos números das células com Anormalidades Nucleares observados para o grupo controle e tratado 48 h (experimento 1(a) , 2 (b) e 3(c))
54
Figura 16 – Comparação entre o número das células com Alterações Nucleares para cada alteração como: lobulado (CAN 1), evaginado (CAN 2), vacuolado (CAN 3) e lobulado acentuado (CAN 4), entre o grupo controle e tratado por 24 h (experimento 1, 2 e 3).
55
Figura 17 – Comparação entre o número das células com Alterações Nucleares para cada alteração como: lobulado (CAN 1), evaginado (CAN 2), vacuolado (CAN 3) e lobulado acentuado (CAN 4), entre o grupo controle e tratado por 48 h (experimento 1, 2 e 3).
vacuolado (CAN 3) e lobulado acentuado (CAN 4), entre o grupo controle e tratado por 10 dias (experimento 1, 2 e 3).
Figura 19 – Comparação estatística dos escores médios de danos nucleares observados para os experimentos 1, 2 e 3 para grupo controle negativo e tratado dos tempos de 24 h (a, b), 48 h (c, d) e 10 dias (e, f)
58
Figura 20 – Comparação estatística dos escores médios de danos nucleares observados para o grupo controle e tratado 24 h (experimento 1(a) , 2 (b) e 3(c))
59
Figura 21 – Comparação estatística dos escores médios de danos nucleares observados para o grupo controle e tratado 48 h (experimento 1(a) , 2 (b) e 3(c))
60
Figura 22 – Comparação estatística dos escores médios de danos nucleares observados para o grupo controle e tratado 10 dias (experimento 1(a) , 2 (b) e 3(c))
61
Figura 23 – Comparação entre os danos de classe 1, 2, 3 e 4, entre o grupo controle e tratado por 24 h (experimento 1, 2 e 3).
61
Figura 24 – Comparação entre os danos de classe 1, 2, 3 e 4, entre o grupo controle e tratado por 48 h (experimento 1, 2 e 3).
62
Figura 25 – Comparação entre os danos de classe 1, 2, 3 e 4, entre o grupo controle e tratado por 24 h (experimento 1, 2 e 3).
Tabela 1 – Uso terapêutico, concentrações em ETEs e a capacidade de remoção no processo convencional de tratamento de alguns fármacos
21
Tabela 2 – Uso terapêutico, localização e concentrações ambientais verificadas para alguns fármacos
21
Tabela 3 – Resumo de dados de testes crônicos e agudos realizados com Diclofenaco (D) e Propanolol (P) em organismos, encontrados na literatura científica
23
Tabela 4 – Concentrações ambientais verificadas para alguns hormônios 25
Tabela 5 – Uso terapêutico e concentrações de hormônios em ETEs e a capacidade de remoção no processo convencional de tratamento
29
Tabela 6 – Efeitos e anomalias atribuídas aos hormônios esteróides 30
Tabela 7 – Resultados dos testes do MN, Anormalidades Nucleares e do Ensaio Cometa para os grupos tratados com 6 ng.L-1 do hormônio 17 β-estradiol e controles: encontrados para os tempos de análise de 24 h, 48 h e 10 dias (Experimento 1, 2 e 3)
48
Tabela 8 – Valores de p para as avaliações de genotoxicidade de E2 (6 ng.L-1) em O. niloticus.
AC Aberrações Cromossômicas ADN Ácido Dexoxiribonucleotídeo (DNA) DES Dietilstestilbestrol
E2 17 β-estradiol
ETA Estação de Tratamento de Água ETE Estação de Tratamento de Esgoto FISH Hibridização in situ de Fluorescência LMP Baixo ponto de fusão (Low Meltin Fusion) MN Micronúcleo
MXR Resistência multixenobiótica PBS Tampão fosfato
SCE Troca de Cromátides Irmãns VTG Vitelogenina
1.1 OBJETIVOS 14
1.1.1 Objetivos Gerais 14
1.1.2 Objetivos Específicos 14
2 REVISÃO DE LITERATURA 15
2.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE BIOMARCADORES 15
2.2 USO DE MEDICAMENTOS E IMPLICAÇÕES AMBIENTAIS 19
2.2.1 Efeitos ecotoxicológicos de fármacos 21
2.3 ENSAIOS COM SUBSTÂNCIAS GENOTÓXICAS 31
2.3.1 Técnicas para análises ecotoxicológicas 32
3 MATERIAL E MÉTODOS 40
3.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS 40
3.2 DESENHO EXPERIMENTAL 40
3.3 TESTE DO MICRONÚCLEO E ANÁLISE DE ANORMALIDADES NUCLEARES 41 3.4 ENSAIO COMETA (Adaptado de Singh et al. (1988)) 43 3.4.1 Preparação das lâminas com agarose (1,5%, p/v) 43 3.4.2 Preparação das lâminas com agarose de baixo ponto de fusão (LMP) 0,5% 43 3.4.3 Procedimentos após o preparo da lâmina com agarose 1,5 % e LMP 0,5% 44
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 45
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 46
4.1 TESTE DO MICRONÚCLEO 46
4.2 ANORMALIDADES NUCLEARES (AN) 50
4.3 ENSAIO COMETA 57
4.4 ANÁLISE INTEGRADA 63
5 CONCLUSÕES 69
APÊNDICES 85
substâncias provenientes de indústrias, mineração, agricultura e águas residuárias. Alguns compostos são tóxicos por interferir nos processos vitais, e em uma determinada quantidade, podem representar uma ameaça para o ambiente (ÇAVAS; ERGENE-GOZUKARA, 2005a).
Dentro da categoria dos xenobióticos, uma importante fonte poluidora do ambiente aquático são os medicamentos. O fluxo de medicamentos no ambiente aquático pode se originar a partir da atividade terapêutica humana, veterinária (hormônios promotores de crescimento usados para criação de peixes, antibióticos), e por atividades não terapêuticas como a aplicação dos excrementos de animais tratados com drogas nos campos de produção em atividades agrícolas (WHO, 1993; WHO, 2007).
Uma quantidade significativa de medicamentos, utilizada pelos seres humanos e animais, é excretada em sua forma original ou sob a forma de metabólitos via urina e fezes. A maioria dos fármacos não é facilmente biodegradada e, por serem parcialmente removidos em processos convencionais de estações de tratamento de efluentes (ETE) e água (ETA), tais compostos podem ser encontrados em corpos d’água (KUMMERER, 2000; MEADE-CALLAHAN, 2007).
O impacto ambiental de tais substâncias tem sido descrito por muitos pesquisadores como sendo semelhante ao de pesticidas, principalmente porque os fármacos são desenvolvidos para apresentar caráter de resistência, sendo usualmente lipofílicos e freqüentemente apresentam uma baixa biodegradação. Esta propriedade intrínseca faz com que estes tenham um maior potencial de bioacumulação e persistência no ambiente (CHRISTENSEN, 1998).
Frente a isto, a vida aquática pode estar exposta em todo o seu ciclo de vida aos fármacos, devido a estes não serem totalmente removidos nas ETE e ETA. Embora sejam relatadas concentrações extremamente baixas detectadas em rios, lagos e água potável, que poderiam não apresentar efeitos significativos ao ambiente em termos de toxicidade aguda, a necessidade de estudos adicionais a respeito é fato, principalmente, no tocante à toxicidade crônica. Tal necessidade se
ao efeito agudo, sendo restritos os estudos para os efeitos crônicos (FENT, WESTON et al., 2006). Além disso, existem poucos estudos sobre os efeitos genotóxicos causados pela presença de fármacos em ambientes aquáticos (RAGUGNETTI et al., 2008).
Este estudo insere-se na temática da crescente preocupação quanto aos impactos ambientais de esteróides, que são lançados no ambiente via rede pública de esgoto, ou diretamente, podendo afetar tanto a população humana como todo o ecossistema. Assim, a avaliação genotóxica de tais micropoluentes é de relevante importância, e pode contribuir para a adequação do monitoramento de ambientes aquáticos, priorizando a melhoria da qualidade de vida e a conservação ambiental.
Este fármaco também pode ser produzido naturalmente pelo organismo, além de ser considerado um dos mais potentes xenoestrogênios (DORABAWILA; GUPTA, 2005).
1.1 OBJETIVOS 1.1.1 Objetivos Gerais
Avaliar os possíveis efeitos genotóxicos agudos (24 e 48 h) e crônicos (10 dias), do hormônio 17 β-estradiol em dose ambiental (6 ng.L-1), utilizando como modelo experimental a espécie Oreochromis niloticus (Tilápia), por meio de parâmetros citogenéticos.
1.1.2 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito da freqüência de micronúcleos em eritrócitos de O. niloticus frente à exposição do hormônio 17 β-estradiol em dose ambiental.
Avaliar o efeito genotóxico do 17 β-estradiol após os tempos de estudo com a utilização da metodologia de Anormalidades Nucleares.
Avaliar os danos nucleares promovidos pelo 17 β-estradiol por meio do Ensaio Cometa em eritrócitos de O. niloticus.
2 REVISÃO DE LITERATURA
Durante os últimos anos, a comunidade científica tem tomado consciência acerca dos impactos ambientais sobre a saúde humana e a sustentabilidade dos ecossistemas (BICKHAM et al., 2000).
Dos diversos compostos produzidos pela indústria farmacêutica e química, entre outras, apenas uma pequena parcela destes tem sido estudada quanto aos seus efeitos agudos, e crônicos em doses subletais nos seres vivos. Devido ao grande número de tais substâncias chegando ao ambiente, notadamente ao ambiente aquático, onde, via de regra se concentram, é natural supor que algumas possam se fixar nos indivíduos que compõem as cadeias alimentares (RABELLO-GAY et al., 1991), e, portanto, magnificar os seus efeitos nocivos.
Assim, o monitoramento da presença de xenobióticos em ambientes aquáticos pode, a partir de estudos com espécies, contribuir para a condução de tomadas de decisões a respeito da qualidade do ambiente, refletindo nas condições de saúde humana. Neste contexto, a localização e a determinação da concentração destes poluentes podem auxiliar na melhoria da qualidade de vida das espécies, e também, sendo indicativas para a definição de um ambiente saudável, garantindo ao homem sua utilização, quer para alimentação, quer para o abastecimento de água, ou lazer (NICARETA, 2004).
2.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE BIOMARCADORES
Durante décadas, os efeitos de xenobióticos sobre o ambiente aquático foram avaliados pelo monitoramento de mudanças ambientais em cada nível de organização do ecossistema (populações e comunidades) em relação à taxa de sobrevivência. Entretanto, estes estudos apresentam limitações, pois vários efeitos bioquímicos tóxicos subletais podem ocorrer simultaneamente, sem considerar a complexidade e as funções do ecossistema, dificultando a obtenção de resultados reais referentes à toxicidade de tais agentes (HUGGETT et al., 1992).
Em função de tais dificuldades, a necessidade da detecção subletal dos efeitos de substâncias tóxicas sobre os organismos levou ao desenvolvimento dos biomarcadores. Os biomarcadores refletem o status saudável de organismos nos
resposta ao estresse. Esses marcadores podem ser usados como indicadores precoces de alterações ambientais, antes da ocorrência de danos irreversíveis no ecossistema (HUGGETT et al., 1992). Além disso, os biomarcadores são quantificáveis bioquimicamente, fisiologicamente ou por metodologias histológicas. Também podem estabelecer, de acordo com a dose ou tempo-dependentes, o grau de disfunção que o contaminante pode produzir (NICARETA, 2004). Portanto, em função de sua caracterização, os biomarcadores apresentam uma alta importância toxicológica, possibilitando a análise da biotransformação de enzimas (fase I e II), parâmetros de estresse oxidativo, produtos de biotransformação, metalotioneínas, proteínas de resistência multixenobiótica (MXR), parâmetros imunológicos, hematológicos, reprodutivos, endócrinos, genotóxicos, neuromusculares, fisiológicos, e morfológicos (VAN DER OOST et al., 2003).
Três classes de biomarcadores podem ser distinguidas: a de susceptibilidade, a de exposição ou a de efeito. Os biomarcadores de susceptibilidade indicam a habilidade inerente ou adquirida de um organismo em responder à exposição a uma substância xenobiótica específica, incluindo fatores genéticos e mudanças nos receptores que alteram a susceptibilidade de um organismo a essa exposição (VAN DER OOST et al., 2003; WHO, 1993). Os biomarcadores de exposição podem ser definidos como xenobióticos, seus metabólitos ou produtos da interação entre o xenobiótico e uma molécula ou célula que é medida nos organismos ou mais subunidades dos mesmos (DEPLEDGE et al., 1995; LÓPEZ BAREA; PUEYO, 1998). Biomarcadores de efeito representam uma alteração química, fisiológica, comportamental ou outra que possa modificar o bem-estar de um organismo. Diversos componentes moleculares e celulares em diferentes espécies de peixe têm sido usados com biomarcadores de exposição e efeito, incluindo parâmetros bioquímicos, imunológicos e genéticos (VAN DER OOST et al., 2003).
O sistema imune inclui uma rede de células capazes de uma rápida proliferação e diferenciação, regulada por vários fatores, e é integrado com o sistema de outros órgãos e funções. Para tanto o sistema imune pode ser influenciado por uma grande variedade de estressores, surgindo a necessidade dos biomarcadores imunológicos, que podem ser úteis e sensitivos, mas muitas vezes não específicos. Muitos biomarcadores imunológicos podem ser utilizados para biomonitoramento ambiental, (principalmente em peixes) tais como: os glóbulos branco, status de linfócitos, fatores de defesa não especifica, peso e morfologia dos
linfócitos nos órgãos, função dos macrófagos, aumento da suseptibilidade de infecção de bactérias, entre outros (VAN DER OOST et al., 2003).
O uso de biomarcadores bioquímicos em programas de monitoramento oferece algumas vantagens, pois são, normalmente, os primeiros a se alterar, apresentam boa sensibilidade, relativa especificidade e baixo custo de análise, quando comparados às análises químicas convencionais. Em função da análise destes parâmetros, pode-se: 1) detectar precocemente a existência de contaminação por substâncias tóxicas e biologicamente significativas; 2) identificar que espécies ou populações se encontra em risco de contaminação; 3) determinar a magnitude da contaminação e 4) determinar o grau de severidade dos efeitos causados pelos xenobióticos (HAHN et al., 1994; STEGEMAN et al., 2001).
Os biomarcadores bioquímicos podem ser influenciados por fatores abióticos como variações sazonais, temperatura e pH. A avaliação e o controle destes fatores são, portanto, fundamentais para a eficácia do uso de respostas bioquímicas, no monitoramento do impacto promovido por xenobióticos sobre o ambiente (NICARETA, 2004). Um dos biomarcadores bioquímicos mais estudados é a alteração da expressão do citocromo P450-dependente de monooxigenases (CYP450), responsável pela primeira biotransformação de muitos xenobióticos, não apresentando, especificidade por um composto único. Sua elevada atividade pode indicar a exposição dos organismos frente a compostos indutores e, conseqüentemente, indicar o grau e o possível risco de contaminação ambiental (HAHN et al., 1994; STEGEMAN et al., 2001).
Outra abordagem para o estudo de toxicidade ambiental são os testes de ecogenotoxicidade. No Brasil, estes testes têm sido empregados para avaliações ambientais desde a década de 80 (VALENT, 1998). Também, tem-se verificado que os testes de genotoxicidade com organismos aquáticos constituem uma ferramenta efetiva para avaliação de efeitos de poluentes sobre os organismos vivos, para avaliação de risco/periculosidade de agentes químicos, no monitoramento da qualidade da água e no estabelecimento de limites permissíveis de lançamento de efluentes líquidos nos corpos hídricos (ZAGATTO, 1998).
Análises de genotoxicidade são realizadas em bioindicadores ou biomarcadores de toxicidade, ou de efeitos adversos (CAPELA, 2001). Desta forma, estudos sobre a genotoxicidade de poluentes revestem-se de grande importância,
Permitem, ainda, avaliar o impacto e o efeito destes sobre células, tecidos e órgãos, bem como inferir sobre possíveis perturbações metabólicas. Além do que as análises de seus efeitos sobre o material genético são importantes na avaliação de seu papel mutagênico e/ou carcinogênico e ainda seus possíveis efeitos sobre as populações, uma vez que estas substâncias podem atuar de maneira a diminuir a variabilidade genética da população (PANDRANGI et al., 1995). A exposição de um organismo a compostos genotóxicos pode induzir a uma cascata de eventos (SHUGART, 1992)apud(VAN DER OOST et al., 2003): indução de alterações estruturais no ADN, dano no ADN com subseqüente expressão de um gene mutante, e doenças (como câncer) resultantes do dano genético. A detecção e quantificação de vários eventos em seqüência podem empregar biomarcadores de exposição e de efeito em organismos expostos a substâncias genotóxicas no ambiente.
Organismos utilizados em testes de mutagenicidade devem ser selecionados utilizando critérios que permitam a evolução real do potencial mutagênico que induz mudanças no material genético. Tais mudanças se referem às alterações numéricas, e ou estruturais do cromossomo resultando em aberrações cromossômicas. Organismos aquáticos acumulam poluentes diretamente de água contaminada ou indiretamente através da ingestão de organismos aquáticos contaminados (biomagnificação). Assim, poluentes genotóxicos podem levar contaminação, não apenas para os próprios organismos aquáticos, mas podem entrar no ecossistema e, chegar aos humanos por meio da cadeia alimentar (MATSUMOTO et al., 2006). Sánchez-Galán et al.(1998) demonstraram que os peixes podem ser considerados bons indicadores para detecção de contaminação de corpos d’água por substâncias genotóxicas e mutagênicas. Eritrócitos de sangue periférico destes animais são comumente usados para a aplicação do teste do Micronúcleo (MN) (Seção 3.3) em conjunto com o Ensaio Cometa (Seção 3.4). Estas metodologias têm demonstrado a viabilidade do emprego de peixes como bioindicadores para a avaliação ambiental de contaminação genotoxicológica (BELPAEME et al., 1996; BUSCHINI et al., 2004; DA SILVA et al., 2002; RUSSO et al., 2004).
Entre os estudos realizados com a utilização de espécies de peixes bioindicadores, destacaram-se o de Grisólia e Cordeiro (2000) e Lemos et al. (2005). Tais pesquisadores demonstraram a toxicidade das águas de um lago utilizando o bioindicador Tilapia rendalli e teste do MN (GRISOLIA; CORDEIRO, 2000), sendo
esta toxicidade ratificada, posteriormente, pela metodologia do Ensaio Cometa (LEMOS et al., 2005). Tais experimentos demonstraram a adequação dos peixes como bioindicadora de genotoxicidade (LEMOS et al., 2005).
Em outros estudos, a espécie Oreochromis niloticus foi capaz de indicar o potencial genotóxico do efluente de uma refinaria de petróleo e de uma usina de extração de cromo utilizando o teste do MN e a avaliação de anormalidades nucleares (ÇAVAS; ERGENE-GOZUKARA, 2005a), de efluentes de curtume (MATSUMOTO et al., 2006), e do herbicida Atrazina utilizando o teste do MN, análise de anormalidades nucleares e o ensaio cometa (VENTURA et al., 2008).
2.2 USO DE MEDICAMENTOS E IMPLICAÇÕES AMBIENTAIS
Os medicamentos têm um importante papel no tratamento e prevenção de doenças, tanto em humanos como em animais, porém possuem efeitos na biota e no meio ambiente.
Considerando a farmacocinética das substâncias medicamentosas, sobretudo sua excreção, sabe-se que uma importante fração dos fármacos, é excretada pela urina e fezes (BOXALL, 2004; KUMMERER, 2000), tanto na forma de metabólitos como na forma inalterada. Infere-se, portanto, que a forma inalterada mantém suas características farmacológicas, ao menos em parte preservadas, e, desta forma, juntamente com os metabólitos, são lançados ao meio ambiente, sobretudo na água através dos sistemas de esgotamento sanitário ou diretamente nos corpos d’ água (WHO, 2007). Assim, os efeitos ambientais são um problema potencial que não pode ser menosprezado (BOXALL, 2004). Dentro deste aspecto, é importante, portanto, considerar a influência relevante dos problemas de acesso e uso irracional de medicamentos (WHO, 2007). Para se ter um panorama geral, em 2004, somente nos Estados Unidos, mais de 10 milhões de mulheres eram usuárias de contraceptivos orais (BOXALL, 2004). A Organização Mundial da Saúde (OMS) preocupa-se com esta situação, considerando as conseqüências para a saúde do uso indiscriminado de medicamentos para humanos e seu emprego veterinário e/ou agrícola, como evidenciado para antimicrobianos e hormônios (WHO, 2007), não discriminando o grande efeito ambiental destas práticas excessivas.
Outra fonte de contaminação ambiental dos fármacos ocorre em função do descarte indevido de medicamentos vencidos ou não utilizados diretamente nas redes de esgoto ou em sistemas convencionais de coleta de lixo. Os fármacos entram no meio aquático e, eventualmente, alcançam a água potável, se não forem biodegradados ou removidos completamente pelo tratamento de esgoto (KUMMERER, 2000). Um resumo das vias pelas quais os fármacos podem alcançar ao ambiente aquático é apresentando na Fig. 1.
Figura 1 – Fluxo dos medicamentos para o ambiente aquático. Adaptado de TERNES, 1998.
Esta persistência dos farmácos no ambiente deve-se pelo fato de serem desenvolvidos para manter suas propriedades químicas e servirem a propósitos terapêuticos (MEADE-CALLAHAN, 2007). A eficiência de remoção de alguns fármacos nas ETE pode ser verificada na Tab.1. As concentrações ambientais encontradas para alguns fármacos podem ser verificadas na Tab.2.
Frente a estas concentrações verificadas no ambiente, torna-se importante o estudo do efeito ecotoxicológico destes fármacos.
INDÚSTRIA QUÍMICA E FARMACÊUTICA
USOS NÃO TERAPÊUTICOS Atividades agrícolas ÁGUAS SUPERFICIAIS Terapêutica Humana Terapêutica Veterinária Excreção ETA Descarte Medicamentos Excreção ÁGUAS Abastecimento Esgoto ETE ÁGUAS SUBTERRÂNEAS
Tabela 1 – Uso terapêutico, concentrações em ETEs e a capacidade de remoção no processo convencional de tratamento de alguns fármacos.
Composto Uso Terapêutico Afluente (µg.LConcentração -1) máxima (%) Remoção Referência Ácido
Acetilsalicílico Analgésico 3,2 81 Ternes et al. (1999)
Diclofenaco Antiinflamatório 2,8 23 - 30 Quintana et al. (2005) Ibuprofeno Antiinflamatório 28 98 Roberts e Thomas (2005)
Paracetamol Analgésico 6,9 100 Roberts e Thomas (2005)
Carbamazepina Antiepilético 0,7 <50 Metcalfe et al. (2003)
Diazepam Antiepilético 0,59-1,18 93 Van Der Hoeven (2004)
Adaptada de FENT et al. (2006).
Tabela 2 – Uso terapêutico, localização e concentrações ambientais verificadas para alguns fármacos.
Composto Terapêutico Uso Concentração no ambiente (ng.L-1) Local Referência Ácido
Acetilsalicílico Analgésico < 50 – 1510 Efluente do tanque de sedimentação Stumpf et al. (1996) Diclofenaco Analgésico 38 - 489 Diferentes rios Stumpf et al. (1996) Ibuprofeno Analgésico 17 - 139 Diferentes rios Stumpf et al. (1996)
Metotrexato Antineoplásico <6,2
Água de rio;
Água potável Aherne (1985)
Diazepam Ansiolítico 10
Água de rio;
Água potável Waggott (1981) Adaptada de SORENSEN et al. (1998).
2.2.1 Efeitos ecotoxicológicos de fármacos
Alguns dos efeitos ecotoxicológicos dos xenobióticos ou compostos químicos genotóxicos em organismos aquáticos incluem: defeitos de hereditariedade devido a mutações; efeitos teratogênicos em células germinativas; declínio populacional; efeitos carcinogênicos (MITCHELMORE; CHIPMAN, 1998); redução de crescimento; desenvolvimento anormal e redução da sobrevivência de embriões, larvas e adultos (LEE; STEINERT, 2003). Em humanos, são citados, além da carcinogenicidade, a
incidência de doenças como aterosclerose, doenças cardiovasculares e precoce (GROVER; KAUR, 1999).
As concentrações de medicamentos para que estes alcancem seus efeitos farmacológico correspondem a cerca de três a quatro vezes maiores que a concentrações verificadas de resíduos de fármacos em água, correspondentes à ordem de ng.L-1. Poder-se-ia inferir, portanto, que riscos ante exposições agudas seriam improváveis, havendo a necessidade, no entanto, de determinar os efeitos de exposição durante longos períodos (DAUGHTON; TERNES, 1999; KOSJEK et al., 2005). Atualmente, não são conclusivos os estudos sobre os efeitos a longo prazo de fármacos em baixas concentrações (inferiores a 1000 ng.L-1), sejam em algas, crustáceos, peixes, homem e ambiente como um todo (FERRARI et al., 2003; HEBERER, 2002; KOSJEK et al., 2005; KOUTSOUBA et al., 2003; TERNES, 1998), Kummerer (2004) retoma, porém, a idéia de que o potencial agressor dos fármacos, considerando aspectos e impactos ambientais, pode ser comparado ao de pesticidas.
Efeitos ecotoxicológicos agudos de Diclofenaco, em termos de alteração no desenvolvimento dos indivíduos foram verificados em bioensaios, com algas e invertebrados à concentração de 100 µg.L-1 (WEBB, 2001)apud(FERRARI et al., 2003). Com o fitoplâncton Synechococcus lepolensis tais alterações foram observadas em uma concentração de 14,5 µg.L-1 por 96 h, enquanto que para o zooplâncton, Daphnia magna, a uma concentração de 22,43 µg.L-1 por 48 h (FERRARI et al., 2004) (Tab.3).
Já para os bioensaios com Propanolol, as menores concentrações em que foram verificados efeitos agudos ecotoxicológicos corresponderam a 800 µg.L-1 (HUGGETT et al., 2002), e a 1,51 µg.L-1 (FERRARI et al., 2004) para Ceriodaphnia dubia (crustáceo), por 48h de exposição, a concentração de 1,6 µg.L-1 para Daphnia magna (crustáceo) por 48h de exposição (HUGGETT et al., 2002), e para Synechococcus leopoliensis (cianofícea), por 96h de exposição, na concentração de 0,668 µg.L-1 (FERRARI et al., 2004).
Em relação ao efeito crônico, de Diclofenaco são poucos os trabalhos desenvolvidos. Os efeitos verificados para este composto, em Oncorhynchus mykiss (Truta Arco-íris) são lesões renais na concentração de 5 µg.L-1 (SCHWAIGER et al., 2004). Os efeitos subletais, tais como (alterações citológicas no fígado, rim e brânquias) também foi verificado na concentração de 1 µg.L-1, em período de
exposição de 28 dias (TRIEBSKORN et al., 2004). Para bioensaios crônicos com Carbamazepina, foram verificados efeito letal em Daphnia na concentração de 92 µg.L-1 e efeito subletal em Danio rerio (Peixe-zebra) na concentração de 43 µg.L-1 (PASCOE et al., 2003).
Tabela 3 – Resumo de dados de testes crônicos e agudos realizados com Diclofenaco (D) e Propanolol (P) em organismos, encontrados na literatura cientifica.
Composto Organismo Tempo de exposição Concentração(µg. L-1) Efeitos Referência D Alga verde Diatomácea Alga azul Crustáceo Rotífera Embrião de Peixe 96 h 96 h 96 h 96 h 96 h 96 h 96 h 48 h 48 h 7 dias 48 h 10 dias 16,3 10,0 19,2 10,0 14,5 10,0 22,4 22,7 1,0 12,5 4,0 4,0 Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Mortalidade Mortalidade Afeta a reprodução Afeta a reprodução Mortalidade Mortalidade Ferrari et al. (2004) P Embrião de Peixe Crustáceo Rotífera Alga azul Diatomácea Alga verde Peixe 10 dias 7 dias 7 dias 48 h 48 h 48 h 96 h 96 h 96 h 48 h 2,0 9,0 125,0 29,8 800,0 180,0 350,0 350,0 94,0 5,0 24,3 Mortalidade Mortalidade Afeta a reprodução Afeta a reprodução Mortalidade Mortalidade Afeta a reprodução Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Alteração no desenvolvimento Mortalidade Ferrari et al. (2004) Huggett et al. (2002) Ferrari et al. (2004) Huggett et al. (2002)
Outro estudo avaliou a toxicidade crônica utilizando uma mistura de sete fármacos (acetaminofen, diclofenaco, gemfibrozil, ibuprofeno, naproxeno, ácido salicilico, e troclosan) sobre várias gerações do anfíbio Hyalella azteca, na concentração ambiental de 100 ng. L-1 para cadafármaco, no período de 1-11 dias. Não foram encontrados resultados significantes na sobrevivência, desenvolvimento e reprodução, referentes a tais fármacos neste estudo (BORGMANN et al., 2007).
2.2.1.1 Concentrações ambientais e efeitos ecotoxicológicos de hormônios esteróides
Muitos compostos químicos têm demonstrado potencial para serem classificados como desreguladores endócrinos, dentre estes destacam-se os hormônios esteróides, que podem alterar os sistemas endócrinos animais (ANKLEY et al., 1998; BILA; DEZOTTI, 2007; BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; HUGHES, 2007; LINTELMANN et al., 2003).
Hormônios são substâncias químicas produzidas e secretadas pelas glândulas endócrinas e que, quando lançados na corrente sangüínea, coordenam o funcionamento do organismo como um todo, sendo denominados de mensageiros. Algumas funções que estes controlam são: atividades de órgãos, níveis de eletrólitos, açúcares e líquidos no sangue, uso e armazenamento de energia, crescimento e desenvolvimento de um determinado organismo, reprodução e características sexuais (BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; LINTELMANN et al., 2003; LÓPEZ DE ALDA; BARCELÓ, 2001b; SHIMADA et al., 2001).
Os compostos denominados desreguladores endócrinos são uma categoria recente de poluentes ambientais, que tem sido encontrada no meio ambiente em concentrações da ordem de µg.L-1 e ng.L-1 (Tab. 4). Suspeita-se que mesmos em tais concentrações podem ser capazes de causar efeitos adversos à saúde humana e veterinária (ANKLEY et al., 1998; BILA; DEZOTTI, 2007; BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; HUGHES, 2007; LINTELMANN et al., 2003).
Hormônios naturais como o estradiol, a estrona, a testosterona, e o estriol e o hormônio sintético etinilestradiol são constantemente lançados no ambiente (BAREL-COHEN et al., 2006). Os hormônios esteróides naturais com maior concentração no ambiente são a estrona e o 17β-estradiol, os quais exercem efeito fisiológico em baixas concentrações quando comparados com os outros esteróides. Tais hormônios podem ser encontrados no ambiente em concentrações muito baixas, como 10 ng.L-1, que exercem um efeito significativo como maior produção de vitelogenina (VTG) e inibem o desenvolvimento dos testículos em peixes machos (PANTER et al., 1998).
Nos rios e no solo, o estradiol é convertido em estrona. Sendo assim, para fins de estudos ambientais, a estrona e o estradiol (E1 + E2) podem ser considerados como estrogênios (COLUCCI et al., 2001; COLUCCI; TOPP, 2001)
Existem, ainda, outras definições para as substâncias estrogênicas presentes no meio ambiente. Freqüentemente, são referidos como estrogênios ambientais, os
estrogênios exógenos ou exoestrogênios (ZACHAREWSKI, 1997) e os xenoestrogênio (ANKLEY et al., 1998; BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; HUGHES, 2007; LINTELMANN et al., 2003). Exoestrogênios são diversos grupos de substâncias que não necessariamente apresentam alguma semelhança com a estrutura química do 17β-estradiol, mas causam respostas antagônicas e agônicas, possivelmente através de mecanismos de ação via receptores hormonais. A atividade agonista é a capacidade de uma substância acoplar-se ao receptor de hormônios esteróides e produzir uma resposta. Em contrapartida, a atividade antagonista é a habilidade de uma substância acoplar-se ao receptor de estrogênio e bloquear a ação do ligante natural (estrogênio) e, assim, sua resposta não será desencadeada. Essas substâncias podem ser identificadas por sua capacidade de ligar-se ao receptor de estrogênios (RE) e induzir ou atenuar uma resposta hormonal (BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; LINTELMANN et al., 2003; ZACHAREWSKI, 1997).
Tabela 4 – Concentrações ambientais verificadas para alguns hormônios.
Composto
Uso Terapêutico
Concentração no
ambiente (ng.L-1) Amostra Referência
17β-estradiol Hormônio 0,2 - 0,5 nmol.L-1 15 6 21 9 – 6 2 – 12 µg/mulher/dia < 0,6 – 12 < 0,3 – 5,5 < 0,5 – 20 < 0,5 – 7 11 – 17 5 – 9 1 - 3 2,7 – 48 0,5 – 7,0 1,6 – 7,4 1,1 0,5 5 – 49 1,5 0,27 – 2,67 0,48 – 3,66 10 – 31 3 – 8 0,002 – 0,006 0,15 – 5,2 0,15 – 3,6 0,0002 – 0,002 Esgoto doméstico Esgoto doméstico Efluente de ETE Esgoto doméstico Água natural Excretado na urina Efluente de ETE Água superficial Esgoto doméstico Efluente de ETE Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Efluente de ETE Água superficial Efluente de ETE Esgoto doméstico Efluente de ETE Lodo biológico Sedimento marinho Água superficial Efluente de ETE Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Efluente de ETE Água superficial Água potável Shore et al. (1993) Ternes et al. (1999) Kolpin et al. (2002) Belfroid et al. (1999) Johnson et al. (2000) Cargouët et al. (2004) Desbrow et al. (1998) Xiao et al. (2001) Larsson et al. (1999) Ternes et al. (2002) Snyder et al. (1999) Laganà et al. (2004) Kuch et al. (2002)
Tabela 4 – Concentrações ambientais verificadas para alguns hormônios (continuação).
Composto Terapêutico Uso Concentração no ambiente (ng.L-1) Amostra Referência 17α-etinilestradiol Hormônio 2 - 15 <0,2 5 1 9 73 < 0,2 – 7,6 < 0,1 – 4,3 < 0,5 – 10 < 0,2 – 2,2 0,2 – 7 5 – 7 3 – 4,5 1 – 3 0,3 – 1,7 4,5 2 2 – 17 0,9 0,25 – 0,52 0,24 – 0,76 0,1 – 8,9 0,1 – 5,1 0,00015 – 0,0005 Água superficial Água superficial Esgoto doméstico Efluente de ETE Efluente de ETE Água natural Efluente ETE Água superficial Esgoto doméstico Efluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Efluente de ETE Água superficial Efluente de ETE Esgoto doméstico Efluente de ETE Lodo ativado ETE Sedimento marinho Água superficial Efluente de ETE Efluente de ETE Água biológica Água potável Kalbfus (1995) Aherne (1985) Ternes et al. (1999) Kolpin et al. (2002) Belfroid et al. (1999 Johnson et al. (2000) Desbrow et al. (1998) Cargouët et al. (2004) Baronti et al. (2000) Larsson et al. (1999) Ternes et al. (2002) Snyder et al. (1999) Kuch et al. (2002) Estrona Hormônio 20 – 50 400 27 3 9 0,7 – 1,7 1 – 180 4 – 7 1 – 3 27 < 0,4 – 47 < 0,1 – 3,4 < 0,5 – 75 < 0,5 – 54 1,4 – 76 20 – 132 2,5 – 82,1 6,4 – 29 0,2 – 17 5,8 0,5 16 – 37 2 ng/g 15 – 60 5 – 30 5 – 12 0,35 – 18 0,1 – 4,1 0,2 – 0,6 Água superficial Esgoto doméstico Esgoto doméstico Efluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Água natural Efluente de ETE Água superficial Esgoto doméstico Efluente de ETE Efluente de ETE Esgoto doméstico Efluente de ETE Efluente de ETE Água natural Esgoto doméstico Efluente de ETE Lodo biológico Sedimento marinho Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Efluente de ETE Água superficial Água potável Stumpf et al. (1999) Ternes et al. (1999) Cargouët et al. (2004) Kolpin et al. (2002) Belfroid et al. (1999) Johnson et al. (2000) Desbrow et al. (1998) Baronti et al. (2000) Xiao et al. (2001) Larsson et al. (1999) Ternes et al. (2002) Laganà et al. (2004) Kuch et al. (2002)
Tabela 4 – Concentrações ambientais verificadas para alguns hormônios (continuação).
Composto
Uso Terapêutico
Concentração no
ambiente (ng.L-1) Amostra Referência
Estriol Hormônio 0,019 2 – 120 <0,5 – 28 24 – 188 0,43 – 18 2 – 4 1,2 – 3,1 23 – 48 1 2 – 5 10 – 15 5 – 7 1 – 3 Água natural Efluente de ETE Água superficial Esgoto doméstico Efluente de ETE Água superficial Água natural Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Kolpin et al. (2002) Belfroid et al. (1999) Baronti et al. (2000) Xiao et al. (2001) Laganà et al. (2004) Cargouët et al. (2004) Genisteína Fitoestrogênio 200 – 400 15 – 83 4 – 7 Afluente de ETE Efluente de ETE Água superficial Laganà et al. (2004) Adaptado de SORENSEN et al. (1998) e BILA e DEZOTTI (2007)
A exposição de espécies de animais aos desreguladores endócrinos têm sido associada, a alguns efeitos, tais como a diminuição na eclosão de ovos de pássaros, peixes e tartarugas; feminização ou masculinização de peixes (ANKLEY et al., 1998; BILA; DEZOTTI, 2007; BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; LINTELMANN et al., 2003); problemas no sistema reprodutivo de peixes, répteis, pássaros e mamíferos e alterações no sistema imunológico de mamíferos marinhos. Em alguns casos, esses efeitos podem conduzir ao declínio da população. Em seres humanos, esses efeitos incluem a redução da quantidade de esperma, o aumento da incidência de câncer de mama, de testículo e de próstata e de endometriose (BILA; DEZOTTI, 2007).
Várias são as substâncias que possuem a capacidade de afetar o sistema endócrino, ou competir com o estradiol pelos receptores de estrogênio, e/ou competir com a dietildrotestosterona pelos receptores de androgênio (ANKLEY et al., 1998; BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007; LINTELMANN et al., 2003). Estas substâncias podem ser sintéticas (alquilfenóis, pesticidas, ftalatos, policlorados de bifenilas (PCD), bisfenol A, substâncias farmacêuticas, entre outras) ou substâncias naturais (estrogênios naturais e fitoestrogênios) (BILA; DEZOTTI, 2007).
Estrogênios sintéticos tais como, dietilestilbestrol (DES) e 17α-etinilestradiol, são usados como contraceptivos orais, na reposição terapêutica na menopausa ou na prevenção do aborto. A maior aplicação médica do 17α-etinilestradiol tem sido no
desenvolvimento de pílulas contraceptivas, que contêm de 30 a 50 µg de 17α-etinilestradiol por pílula (BEAUSSE, 2004). O DES foi muito usado nos anos 70 na prevenção do aborto (BIRKETT; LESTER, 2003; GHISELLI; JARDIM, 2007).
Pesquisas demonstram que os estrogênios 17 β-estradiol (Fig. 2) e estrona (Fig. 2) são os maiores responsáveis pela atividade estrogênica nos efluentes de ETE. Isto se deve ao fato destes hormônios serem naturalmente e diariamente excretados na urina, sendo assim, descartados no esgoto doméstico (SOLÉ et al., 2003). Estrogênios naturais também são encontrados em águas naturais, no solo e lodos biológicos em várias partes do mundo (BELFROID et al., 1999; LÓPEZ DE ALDA; BARCELÓ, 2001a; TERNES et al., 1999).
Figura 2 – Estrutura química do 17 β-estradiol e da estrona. Adaptado de BILA, 2007.
A Tab. 5 apresenta concentrações de hormônios em amostras de esgoto doméstico (bruto e tratado), provenientes de uma ETE. Estas concentrações demonstram uma das principais fontes de esteróides sexuais, naturais e sintéticos, nas águas superficiais (FENT, ESCHER et al., 2006; LINTELMANN et al., 2003).
Os hormônios classificados como desreguladores endócrinos são em geral solúveis em gordura. Assim, altos níveis podem estar presentes em carne, peixe, ovos e derivados do leite. Hartmann et al. (1998) relataram a ocorrência de hormônios sexuais (17β-estradiol, estrona, testosterona e progesterona) em carnes (gado, porco, aves, peixe), leite e seus derivados, ovos e plantas (gramíneas e leguminosas) (HARTMANN et al., 1998). A contaminação de alimentos também pode vir do fato de que alguns hormônios são aplicados na criação de animais e
consumidos na alimentação humana, sendo que, em grande parte dos países essa prática está proibida (PETERSON et al., 2000).
Tabela 5 – Uso terapêutico e concentrações de hormônios em ETEs e a capacidade de remoção no processo convencional de tratamento.
Composto Uso
Terapêutico Concentração Afluente Concentração Efluente Referência 17α-etinilestradiol Hormônio 3 ng L-1 0,4 ng L-1 Baronti et al.
(2000)
Testosterona Hormônio 19 – 273 ng.L-1 1,6 -7,2 ng.L-1 Lintelmann et al. (2003)
Estrogênio Hormônio 49 – 73 ng.L-1 0,8 – 4,0 ng.L-1 Lintelmann et al. (2003) LINTELMANN et al. (2003) e FENT et al. (2006).
Na Tab. 6 são apresentados efeitos e anomalias em animais atribuídos aos hormônios esteróides.
Estudos realizados para testar a toxicidade crônica do hormônio 17 α–etinilestradiol, com Amphiprion frenatus (Peixe Palhaço), demonstraram que a dose 1 ng.L-1, ministrada intraperitonial, causou um aumento na produção da enzima vitelogenina (VTG) (BRIAN et al., 2005), cuja síntese hepática é regulada por estrogênio (ANKLEY et al., 1998; LINTELMANN et al., 2003; MEDLOCK et al., 1995); Na concentração de 0,32 ng.L-1(exposto da fase larval até adulto), foi verificado o decréscimo na produção de ovos fertilizados e na proporção entre os sexos (PARROTT; BLUNT, 2005). Quando utilizaram a Danio rerio (Peixe-zebra), e a concentração de 5 ng.L-1 , na água, do mesmo hormônio, Nash et al. (2004) verificaram uma redução de 56% na fecundidade dos indivíduos e infertilidade na Geração F1.
Para o hormônio 17 β-estradiol, são ainda mais restritos os estudos de toxicidade, mesmo este sendo um dos hormônios mais excretados, devido à sua grande utilização como contraceptivo oral e para reposição hormonal (CHRISTENSEN, 1998). Além disso, 17 β-estradiol é considerado o mais potente xenoestrogênio, tendo geralmente como efeito a promoção de disfunções endócrinas (DORABAWILA; GUPTA, 2005).
No estudo de Routledge et al.(1990), duas espécies de peixes, Oncorhynchus mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a concentrações de
(ROUTLEDGE et al., 1998). De acordo com pesquisadores, os resultados confirmaram que os estrogênios identificados em efluentes domésticos estão presentes em quantidades suficientes para induzir a síntese de VTG em espécies de peixes (DESBROW et al., 1998) e vêm sendo apontados como a maior causa de efeitos estrogênicos naqueles animais. Rodgres-Gray et al., (2000) observaram um aumento nos níveis de VTG no plasma de peixes da espécie Rutilus rutilus quando expostos ao efluente de ETE do Reino Unido. Neste efluente, foi detectada a presença dos estrogênios 17 β-estradiol, estrona e 17 α-etinilestradiol nas concentrações de 4, 50 e 1,7-3,4 ng.L-1, respectivamente, em machos e fêmeas (RODGERS GRAY et al., 2000)
Tabela 6 - Efeitos e anomalias atribuídos aos hormônios esteróides.
Composto Organismo Efeitos Referência
17β-estradiol Peixe Tartaruga Mexilhão Copépodo Feminização de peixes Feminização de peixes Feminização de peixes Alterações nas gônadas
Hermafroditismos Hermafroditismos
Incidência de testículos-óvulos nas gônadas Declínio na reprodução
Declínio na reprodução Inibição do crescimento testicular Mortalidade elevada dos descendestes
Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução à síntese de VTG no sangue
Alterações da produção de ovos Indução da síntese de VTG Anomalias no crescimento da concha
Estimulação da produção de ovos
Rodger-Gray et al. (2001), Körner et al. (2000) e Knörr et al. (2002) Panter et al. (2000) Körner et al. (2000) e Hartley et al. (1998) Kang et al. (2002) Körner et al. (2000) e Shioda et al. (2000) Panter et al. (1998) Knörr et al. (2002) Routledge et al. (1998), Panter et al. (2000), Moncaut et al. (2003) e Rose et al. (2002) Rodger Gray et al. (2000)
Irwin et al. (2001) Gagné et al. (2001) Andersen et al. (1999)
17α-etinilestradiol Peixe Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG
Mortalidade da espécie Declínio na reprodução Decréscimo na produção de ovos
fertilizados
Decréscimo na proporção entre os sexos
Rose et al. (2002), Schmid et al. (2002) e
Folmar et al. (2000) Brian et al. (2005) Rodger Gray et al. (2000)
Schmid et al. (2002) Robinson et al. (2002)
Parrott et al. (2005)
Estrona Peixe Indução da síntese de VTG
Indução da síntese de VTG Indução da síntese de VTG Inibição do crescimento testicular
Routledge et al. (1998) e Panter et al. (1998) Rodger Gray et al. (2000)
Panter et al. (1998)
Em estudo realizado com o Copépodo, Acartia tonsa, foi verificado um aumento significativo na estimulação da produção relativa de ovos em um período de 10 dias na concentração de 23 µg.L-1 de 17 β-estradiol (ANDERSEN et al., 1999).
A indução da síntese de VTG não ocorre só em espécies de peixes, mas também em outras espécies de animais. Concentrações ambientalmente relevantes de 17 β-estradiol são suficientes para induzir a síntese de VTG em tartarugas e em mexilhões (GAGNÉ et al., 2001).
Apenas um estudo de genotoxicidade para 17 β-estradiol foi identificado, no qual os autores utilizaram duas concentrações do fármaco, 200 ng.L-1 e 2000 ng.L-1, para um período de 10 dias de exposição de alevinos. Os resultados para o teste do micronúcleo demonstraram diferença significativa entre cada concentração e o controle negativo, sem, porém, serem evidenciadas diferenças estatística entre as concentrações (TELES et al., 2006).
2.3 ENSAIOS COM SUBSTÂNCIAS GENOTÓXICAS
Ensaios com substâncias de propriedades mutagênicas, e, portanto, potencialmente carcinogênicas, podem ser realizados com microrganismos e extrapolados para organismos superiores. No entanto, muitas vezes esta extrapolação apresenta falhas, oriundas provavelmente da simplicidade estrutural e metabólica destes organismos. Desta maneira, os testes in vivo e in vitro, realizados com plantas e vertebrados, capazes de detectar mutações gênicas, alterações cromossômicas ou danos no ADN são mais relevantes (RABELLO-GAY et al., 1991). Por este motivo, alguns pesquisadores afirmam que a função primária dos testes de toxicologia genética é investigar, usando células ou organismos, o potencial de compostos químicos induzirem mutações nas células somáticas ou que possam ser transmitidas às futuras gerações (DA SILVA et al., 2003).
Entre as plantas ou vertebrados escolhidos, para os ensaios de mutagenicidade ou genotoxicidade, o uso de organismos endêmicos como sentinelas ambientais será sempre preferível ao uso de espécies exóticas. No entanto, para que este objetivo possa ser alcançado de maneira eficiente, o organismo endêmico eleito deve ser submetido a ensaios suficientemente sensíveis, com a finalidade de ser estabelecido um padrão de resposta aos agentes genotóxicos (PANDRANGI et al., 1995). No caso de ensaios com substâncias
mutagênicas presentes na água ou em sedimentos, estes podem ser realizados em condições laboratoriais com o uso de vários tipos de animais como, por exemplo, anfíbios, moluscos, peixes, e mamíferos os quais servirão como bioindicadores da poluição do meio aquático (MINISSI et al., 1996). Para este propósito, os mais adequados são os peixes, assim como os mamíferos, pois sofrem bioacumulação, respondem a agentes mutagênicos em baixas concentrações e são capazes de alterar a expressão gênica do citocromo P450, em resposta a poluentes (GOKSOYR, ANDERSON et al., 1991; GOKSOYR, LARSEN et al., 1991).
2.3.1 Técnicas para análises ecotoxicológicas
A avaliação da exposição a xenobióticos tem proporcionado informações sobre concentrações em constante expansão, bem como de seu potencial tóxico em ambientes selecionados. Os métodos para avaliação da exposição a xenobióticos segue duas categorias (WHO, 1993): a mensuração dos níveis de agentes químicos e seus metabólitos e/ou derivações em células, tecidos, fluidos corporais e excreção; e a mensuração de respostas biológicas como alterações genéticas avaliadas por metodologias citogenéticas e trocas fisiológicas reversíveis em indivíduos expostos.
Métodos citogenéticos estão entre os mais sensitivos e eficientes para detecção de efeitos genotóxicos (BELPAEME et al., 1996).
As técnicas citogenéticas utilizadas para análises de genotoxicidade e mutagenicidade ambiental são: teste de aberrações cromossômicas (AC) (NATARANJAN, 2002; OBE et al., 2002), troca de cromátides irmãs (SCE)(PERRY; WOLFF, 1974),ensaio cometa (GONTIJO; TICE, 2003; SINGH et al., 1988), teste do MN e alterações nucleares (FENECH, 2000; KIRSCH-VOLDERS et al., 2002), e Hibridização in situ Fluorescente(FISH) (SAKAMOTO-HOJO, 2003).
2.3.1.1 Teste do micronúcleo písceo (MN)
Alguns estudiosos propuseram um tipo de ensaio que permitia a avaliação do dano no ADN pela análise e quantificação de uma estrutura citoplasmática conhecida pelos hematologistas como corpúsculo de Howell-Joly, encontrado em populações celulares em divisão. Estas estruturas receberam o nome de micronúcleos (HEDDLE, 1973; SCHMID, 1975).
Originalmente, o teste do micronúcleo foi desenvolvido para estudos in vivo dos efeitos de compostos químicos. Para este fim, eram utilizadas células eritrocitárias policromáticas, obtidas de medula óssea do fêmur de camundongos. Posteriormente, passou-se a utilizar eritrócitos circulantes. Em ambos os casos, os testes eram realizados, normalmente, com animais criados em laboratório e sob condições laboratoriais bem controladas (SCHMID, 1975).
Hooftman e Raat (1982) basearam-se no teste do micronúcleo, originalmente desenvolvido por Schmid (1975), e o introduziram nos estudos de células sanguíneas de peixes mantidos em laboratório. Esta modificação do teste original passou a ser conhecida como Teste do Micronúcleo Písceo (CARRASCO et al., 1990).
O princípio do teste está baseado no fato de que, durante a anáfase, as cromátides e fragmentos cromossômicos acêntricos não são transportados pelas fibras do fuso para pólos opostos, enquanto que os fragmentos com centrômeros são. Após a telófase, os cromossomos sem danos são incluídos no núcleo de cada uma das células filhas. Elementos que não foram transportados pelo fuso também podem ser englobados pelos núcleos recém-formados. No entanto, alguns destes elementos, normalmente muito pequenos, não são incluídos nos núcleos recém-formados e permanecem no citoplasma, constituindo as estruturas caracterizadas como MN (SCHMID, 1975) (Fig. 3).
Pode-se conceituar, portanto, os micronúcleos como sendo corpúsculos extracelulares formados durante o processo da mitose, os quais são resultantes de fragmentos cromossômicos acêntricos ou de cromossomos inteiros que não foram incluídos em nenhum dos núcleos filhos, originados no processo de divisão celular (ALBERTINI et al., 2000) (Fig. 4).
O teste do MN é uma das metodologias mais utilizadas para avaliar danos causados por substâncias xenobióticas nos organismos (SCHMID, 1976; VANZELLA et al., 2007). Para Hose et al. (1987), este teste revelou grandes potencialidades por ser de rápida execução, não dispendioso e um excelente indicador da contaminação por compostos químicos em peixes. Estas potencialidades foram posteriormente confirmadas por outros autores (AYLLON; GARCIA-VAZQUEZ, 2000; , 2001; PACHECO; SANTOS, 1998).
Figura 3 - A) processo normal de divisão celular. B) formação do MN por fragmento cromossômico acêntrico ou de um cromossomo inteiro, por não terem sido incluídos no núcleo recém-formado e permanecerem no citoplasma após a fase da telófase; C) formação do MN por ponte citoplasmática com fragmento cromossômico acêntrico que não foi incluído no núcleo recém-formado, permanecendo no citoplasma após a telófase.
Esse tipo de teste tem sido recomendado para estudos de biomonitoramento ambiental, principalmente por sua capacidade de detectar agentes clastogênicos , e agentes aneugênicos (AYLLON; GARCIA-VAZQUEZ, 2000; , 2001; BOMBAIL et al., 2001; ELHAJOUJI et al., 1995; FENECH, 2000; GUILHERME et al., 2007; RIBEIRO et al., 2003; STOIBER et al., 2004; STRUNJAK-PEROVIC et al., 2008).
Figura 4 - Eritrócitos micronucleados de Poecilia vivipara (seta) (SPONCHIADO, ADAM, TORRES, OLIVEIRA et al., 2005; SPONCHIADO, ADAM, TORRES, VALENTE et al., 2005)
O teste do MN foi utilizado em um estudo para biomonitoramento ecotoxicológico nos Rios Itajaí-Açú e Itajaí-Mirim, no Estado de Santa Catarina-BR. Neste estudo, foi verificado o nível de poluição, utilizando como modelo experimental tilápia (Oreochromis niloticus), testando sua resistência, até 10 dias de exposição às águas dos Rios (BÜCHER et al., 2006; BÜCKER; CONCEIÇÃO, 2004). Na bacia Amazônica, o teste do MN foi utilizado para avaliação mutagênica de altas concentrações de mercúrio, encontrado no Rio Madeira, examinando-se três espécies comercialmente importantes da região: o Curimatã (Prochilodus nigricans); o Pacu branco (Mylossoma duriventris); e Traíra (Hoplias malabaricus). A análise demonstrou a ação genotóxica significativa quando comparada ao controle negativo correspondente a peixes do Rio Solimões (PORTO et al., 2005).
2.3.1.2 Anormalidades nucleares em eritrócitos de peixe
Anormalidades nucleares são frequentemente observadas em eritrócitos de peixes (CARRASCO et al., 1990) apud (AYLLON; GARCIA-VAZQUEZ, 2000; , 2001; BOMBAIL et al., 2001; MATSUMOTO et al., 2006; RAMSDORF, 2007; VENTURA, 2004; VENTURA et al., 2008) como:
a) Lobulado (lobed): núcleos com evaginações mais largas do que as descritas para os blebbed. Sua estrutura não é tão definida como a anterior. Alguns núcleos apresentam várias destas estruturas (Fig. 5 a).
tamanho destas evaginações varia desde pequenas protuberâncias a estruturas completamente circunscritas, semelhantes aos micronúcleos, mas ainda ligadas ao núcleo principal (Fig. 5 b).
c) Vacuolado (vacuolated): núcleos que apresentam uma região que lembra os vacúolos no seu interior. Estes “vacúolos” apresentam-se destituídos de qualquer material visível no seu interior (Fig. 5 c).
d) Lobulado acentuado (notched): núcleos que apresentam um corte bem definido em sua forma. Geralmente, com uma profundidade apreciável no núcleo. Esses cortes parecem não possuir nenhum material nuclear e parecem ser delimitados pela membrana nuclear (Fig. 5 d).
Figura 5 - Anormalidades nucleares em eritrócitos de peixe. a) núcleo lobulado. b) núcleo evaginado. c) núcleo vacuolado. d) núcleo lobulado acentuado.
Essas anormalidades têm sido utilizadas por alguns autores como um indicativo do dano citogenético em espécies de peixes. Porém, Carrasco et al., (1990), que descreveram essas alterações, não observaram uma associação significativa entre variações na morfologia do núcleo (incluindo MN) e os níveis de poluição química em sedimentos ou em tecidos de peixes, indicando uma fragilidade do uso do teste do MN em peixes. Sua possível falta de sensibilidade é devido à baixa e também variável freqüência de micronúcleos em peixes silvestres (CARRASCO, 1990 apud (RAMSDORF, 2007). Outros autores sugerem que as anormalidades nucleares devem ser incluídas nas análises de genotoxicidade em peixes, incluindo contagem de MN, por apresentarem resultados mais confiáveis e mais completos (AYLLON; GARCIA-VAZQUEZ, 2000; , 2001).
Outros estudiosos concordam com Ayllon e Garcia-Vazquez (2000, 2001) e classificam anormalidades nucleares como sendo um dano genotóxico, que serve para avaliar o potencial clastogêncico e/ou aneugênico, da exposição dos peixes a
compostos químicos ou xenobioticos no ambiente (BOMBAIL et al., 2001; GUILHERME et al., 2007; MATSUMOTO et al., 2006; PACHECO; SANTOS, 1998; PACHECO et al., 2005; STRUNJAK-PEROVIC et al., 2008). Estudos realizados para avaliar a genotoxicidade (potencial clastogênico e/ou aneugênico) do mercúrio no ambiente demonstraram que a análise das anormalidades nucleares em eritrócitos de peixe foi um método eficiente para este fim (AYLLON; GARCIA-VAZQUEZ, 2000; , 2001; GUILHERME et al., 2007).
2.3.1.3 Ensaio cometa
O ensaio Cometa é uma técnica capaz de detectar danos no ADN em células individualizadas através da eletroforese em gel (SPEIT; HARTMANN, 1999). Esta metodologia possui ampla utilização para se testar, como estratégia de biomonitoramento de agentes genotóxicos, dejetos industriais, domésticos e agrícolas, a indução de danos e reparo no ADN, assim como em aplicações clínicas (HARTMANN et al., 2003; WHITE; RASMUSSEN, 1998). As vantagens do Ensaio Cometa incluem sua simplicidade, rápido desempenho e alta sensibilidade para vários tipos de danos no ADN (DA SILVA et al., 2003).
O ADN contido em células de organismos eucariotos possui alguns centímetros de comprimento, porém para que seja acomodado no interior do núcleo, que possui entre 5 µm e 10 µm de largura, essa molécula tem que ser fortemente condensada. Danos impostos à molécula de ADN provocam um relaxamento desta condensação e ocasionalmente quebras na estrutura molecular (ROJAS et al., 1999).
Para o desenvolvimento desta técnica as células, nas quais se deseja verificar o dano ocasionado no seu ADN, são suspensas em agarose de baixo ponto de fusão (LMP) e, então, colocadas em lâminas de vidro para microscopia, previamente recobertas com uma camada de agarose normal. As lâminas contendo as células são, então, submetidas a uma corrida de eletroforese e coloração (SPEIT; HARTMANN, 1999). O princípio desta técnica baseia-se no fato de que o ADN da célula que não tiver dano migrará em conjunto formando um círculo. Caso ocorram danos no ADN, serão formados fragmentos de diversos tamanhos. Os fragmentos menores tendem a migrar mais rapidamente do que os maiores. Ocorrendo um dano muito intenso, em uma célula, muitos fragmentos de diversos tamanhos serão
formados e migrarão em velocidades diferentes, formando-se, então, a figura típica de um cometa (OLIVE et al., 1990). A avaliação destes danos é feita pela relação entre o raio do núcleo e a extensão das “caudas” formadas pelo ADN em migração (classificados como: Classe 0 – nenhum dano, Classe 1 – pouco dano, Classe 2 – médio dano, Classe 3 – Médio para máximo dano e Classe 4 – máximo dano) (Fig. 6). Esta análise tanto pode ser feita visualmente como por softwares especiais (COLLINS, 2004).
Figura 6 - Classes de dano no ADN observadas pelo Ensaio Cometa (BIRIMI, 2007).
As quebras detectadas pelo ensaio podem ocorrer em virtude da digestão do ADN no processo de apoptose. As células que se encontram neste processo são distinguíveis das outras, pois não apresentam um nucleóide típico, estando todo seu ADN fragmentado (OLIVE et al., 1990).
Ao contrário de outros tipos de ensaio, como o MN, de AC ou de SCE, que necessitam de células em proliferação para sua viabilidade, o Ensaio Cometa não necessita desta condição e pode ser utilizado em, praticamente, qualquer tipo de célula (COLLINS et al., 1997; PANDRANGI et al., 1995; RIBEIRO et al., 2003; ROJAS et al., 1999). Uma vez que, substâncias genotóxicas, muito freqüentemente, são tecido-específicas, ficam evidentes as vantagens do uso do Ensaio Cometa, pois, o tecido-alvo do agente genotóxico pode ser analisado diretamente, e as células danificadas, podem ser quantificadas individualmente (PANDRANGI et al., 1995).
Apesar de o Ensaio Cometa ter sido originalmente desenvolvido para detectar efeitos genotóxicos em mamíferos, esta se mostrou de grande eficiência na detecção de substâncias genotóxicas em organismos de ambiente aquático, além de encontrar amplo emprego na área clínica em estudos de reparo do ADN, no biomonitoramento ambiental e no monitoramento humano (FERRARO, 2003).
Utilizando-se dos peixes Ameriurus nebulosus (PANDRANGI et al., 1995) e Cyprinus carpio (SILVA et al., 2000), do vegetal superior (Allium cepa), diferentes estudos demonstraram a grande eficiência do referido ensaio para monitoramento ambiental (NAVARRETE et al., 1997).
No caso específico do Ensaio Cometa realizado com peixes, o sangue revela-se um tecido potencialmente útil no biomonitoramento ambiental, em primeiro lugar, por ser um material que pode ser obtido de maneira pouco invasiva (pela veia caudal) e, em segundo lugar, por apresentar em grande quantidade, eritrócitos nucleados (~97%) e aproximadamente 3% de leucócitos, garantindo, desta forma, uma substancial homogeneidade no tecido (MITCHELMORE; CHIPMAN, 1998).
A simplicidade e sensibilidade do Ensaio Cometa fazem dele um sistema adequado de teste para biomonitoramento em níveis crônicos de exposição, podendo ser utilizado em inúmeras análises, nas quais se podem avaliar células viáveis (BELPAEME et al., 1998).
