UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Dissertação

Produção de Quimera roptria 2 de Neospora caninum

com a porção B da toxina termo lábil de Escherichia

coli

enterotoxigênica

(rROP²/LTB)

como

imunobiológico.

Alceu Gonçalves dos Santos Junior

ALCEU GONÇALVES DOS SANTOS JUNIOR

Produção de Quimera de roptria 2 de Neospora caninum com a porção B da toxina termolábil de Escherichia coli enterotoxigênica (rROP²/LTB) como

imunobiológico.

Orientador Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite Coorientador Prof. Dr. Leandro Quintana Nizoli

Pelotas, 2013

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área do conhecimento: Imunologia parasitária)

Banca examinadora:

Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite – Universidade Federal de Pelotas Prof. Dr. Leandro Quintana Nizoli - Universidade Federal de Pelotas Prof. Dr. Éverton Fagonde da Silva - Universidade Federal de Pelotas Prof. Dra. Maria Elisabeth Aires Berne - Universidade Federal de Pelotas

Para minha família, com carinho e gratidão. DEDICO.

6

Agradecimentos

Agradeço a Deus!

A minha família pela colaboração, estímulo, pelo suporte nas horas difíceis, por depositar sua confiança.

A uma pessoa muito especial em minha vida, Tatiana, por seu carinho, companheirismo e paciência durante esta etapa. Obrigado por dividir comigo a tua companhia!

A um grande orientador e amigo sem palavras para expressar reconhecimento a esse distinto professor: Fábio P. Leivas Leite, meu muito obrigado!

Aos amigos que passaram, e os que hoje compartilham os agradáveis momentos no Laboratório 4 (biotecnologia), obrigado pela ajuda e paciência.

Aos colegas do Laboratório 11 (parasito), obrigada pela disposição em sempre ajudar.

Aos colegas de trabalho do centro de Biotecnologia e seus laboratórios.

Aos Professores da Veterinária pela ajuda na formação nesta nova etapa, em especial a Leandro Nizoli, Sérgio Silva e Tânia Betin.

A Capes pela bolsa concedida.

Ao programa de Pós-graduação em Veterinária pela oportunidade de qualificação na carreira profissional.

“...No son las perdidas ni las caídas lo que pueden hacer fracassar nuestra vida, sinó la falta de coraje para levantarnos y seguir adelante...” S.A.W.

Resumo

SANTOS JUNIOR, A. G. Produção de Quimera de roptria 2 de Neospora caninum com a porção B da toxina termolábil de Escherichia coli Enterotoxigênica (rROP²/LTB) como imunobiológico. 2013. 60f. Dissertação (Mestrado) - Programa

de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

O protozoário intracelular Neospora caninum, é considerado principal agentes causadores de aborto em bovinos. A infecção ocorre pela ingestão de oocistos esporulados no ambiente, inicialmente ocorre parasitemia sistêmica caracterizando fase aguda da infecção e posteriormente fase crônica com formação de cistos teciduais, permanecendo assim o hospedeiro infectado e assintomático. O diagnóstico é feito através de provas sorológicas. Atualmente, não há dados que assegurem a eficácia da vacina comercial disponível para bovinos. Antígenos do complexo apical do parasito estão sendo estudados, pois apresentam papel importante na infecção. As roptrias, glândulas secretoras presente nesta região do parasito N. caninum, desempenham papel importante na invasão e formação do vacúolo parasitófago, essas propriedades produziram interesse na sua utilização em formulações de vacina experimentais. Experimentalmente apresentou resultados parciais de proteção ao desafio, quando fusionada a outras proteínas deste protozoário, aumentou a proteção, sugerindo que fusão de antígenos é eficiente para proteção contra N. caninum. O presente trabalho produziu um novo antígeno quimérico, originado da fusão entre ROP² de N. caninum com a subunidade B, da enterotoxina termolábil de Escherichia coli. A construção da quimera foi realizada por clonagem em sequência, onde gene ROP² foi inserido diretamente na porção N-terminal da LTB. A construção, ROP²/LTB, foi expressa em cepa E. coli BL 21 (DE3) StarTM onde apresentou tamanho de aproximadamente 24kDa. A fusão de antígeno não prejudicou a antigenicidade quando testado frente a soro bovino positivo por Imunofluorescência, na técnica de

Western blot, portanto, apresentando grande potencial para ser utilizado como vacina

recombinante.

Abstract

Santos Junior, A. G. Produção de Quimera de roptria 2 de Neospora caninum com a porção B da toxina termolábil de Escherichia coli enterotoxigênica (rROP²/LTB) como imunobiológico. 2013. 60f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-

Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

The intracellular protozoan Neospora caninum, is considered the main causative agent of abortion in cattle. Infection occurs by ingestion of sporulated oocysts in the environment, first occurs systemic parasitemy characterizing acute phase of infection and subsequent chronic phase with formation of tissue cysts, thus persisting the infected and the asymptomatic host. Diagnosis is made by serologic tests. Currently, there are no data to ensure the effectiveness of commercial vaccine available for cattle. Apical complex antigens of the parasite are being studied, since they have an important role in infection. The rhoptries, secretory glands present in this region of the parasite N. caninum, play an important role in invasion and formation of parasitophago vacuoles, these properties have generated interest in its use in experimental vaccine formulations. Experimentally it showed partial results of protection in challenge, when fused to other proteins of this protozoan, the protection was increased, suggesting that antigens fusion is effective for protection against N. caninum. This work produced a new chimeric antigen, originated from the fusion of ROP² N. caninum with the B subunit of heat labile enterotoxin of Escherichia coli. The construction of the chimera was accomplished by cloning in sequence where ROP² gene was inserted directly into the N-terminus of LTB. The construction ROP²/LTB was expressed in E. coli strain BL 21 (DE3) StarTM _{where it presented a size of approximately 24kDa. The fusion antigen did}

not impair the antigenicity when tested against positive bovine serum by immunofluorescence, the Western blot technique, therefore, show great potential for use as a recombinant vaccine.

Lista de Figuras

Figura 1 Eletroforese em gel da agarose. A- Extração do DNA de

taquizoítos de N. caninum... 31 Figura 2 Sequência do gene NcROP2, obtido a partir do número de

acesso HM587954 no GenBank... 32 Figura 3 Eletroforese em gel de agarose 1%, A- Pesquisa dos clones

recombinantes nas colônias cultivadas... 33 Figura 4 Eletroforese em gel de poliacrilamida 15 % da expressão da

quimera rROP²/LTB... 34 Figura 5 Western Blot (WB) da caracterização da quimera ROP²/LTB.

Lista de Tabelas

Tabela 1 Sequências dos oligoiniciadores e suas respectivas enzimas de restrição... 26

Lista de Abreviaturas

µg/µL micrograma por microlitro

µL microlitro

cDNA DNA complementar

D.O. densidade óptica

DAB diaminobenzina

DNA ácido desoxirribonucléico

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético FIA adjuvante incompleto de Freund

g grama

GRA proteína relacionada a grânulos densos HD hospedeiro definitivo

HI hospedeiro intermediário

IgA Imunglobulina A

IgG Imunoglobulina G

IgG1 Subtipo de imunoglobulina G IgG2a Subtipo de imunoglobulina G IPTG isopropylthio-ß-D-galactoside

Kb quilobases

kDa quilo Dalton

L litro

LB Low salt meio de cultura Luria Bertani com baixa concentração de sal LTB enterotoxina termolábil de E. coli

mA miliampere

mg/mL miligrama por mililitros

MIC proteína relacionada a micronemas

mL mililitro

mM milimolar

Ni2+ níquel

nm nanômetro

pb pares de bases

PBS solução tampão de fosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase ROP2 proteína relacionada com roptrias

SAG antígenos imunodominantes de superfície SDS-PAGE eletroforése em gel de poliacrilamida WB Western Blotting

Sumário

1 INTRODUÇÃO ... 16

1.1 Etiologia ... 17

1.2 Biologia ... 18

1.2.1 Ciclo de Vida e Transmissão ... 18

1.3 Diagnóstico ... 20

1.4 Tratamento e Controle ... 21

1.5 Imunidade na Gestação ... 22

1.6 Estudos de Antígenos ... 23

1.7 Subunidade LTB como adjuvante ... 24

2 OBJETIVOS ... 26

3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 27

3.1 Construção dos Iniciadores ... 27

3.2 Reação em Cadeia da Polimerase ... 28

3.3 Extração de DNA ... 28

3.4 Amplificação da sequência e clonagem ... 28

3.5 Condições de cultivos e meios de Cultura para E. coli ... 29

3.6 Transformação das cepas de E. coli ... 29

3.7 Seleção e confirmação de clones recombinantes ... 29

3.8 Expressão e purificação da rROP²/LTB ... 30

3.9 Purificação da rROP²/LTB ... 30

3.10 Caracterização de rROP²/LTB por Western blotting ... 31

4 RESULTADOS ... 32

4.1 Extração DNA e Amplificação do fragmento ROP² ... 32

4.3 Seleção dos clones recombinantes ... 33

4.5 Caracterização da quimera rROP²/LTB por Western Blot ... 35 5 DISCUSSÃO ... 37 6 CONCLUSÃO GERAL ... 40 7 REFERÊNCIAS ... 41 8 ARTIGO ... 51 ANEXOS ... 60

1 INTRODUÇÃO

Na bovinocultura atual, muito se tem pesquisado para melhorar a qualidade sanitária dos rebanhos, principalmente na prevenção e controle doenças infecciosas que geram perdas econômicas. Dentre essas destaca-se a neosporose, causada pelo protozoário Neospora caninum (Apicomplexa: Sarcocystidae) responsável por perdas reprodutivas em (DUBEY et al, 2007).

A cerca desta doença é importante ressaltar sua ocorrência mundial em animais domésticos e silvestres, sendo descrita pela literatura cientifica como principal causador de abortos na espécie bovina e responsável por alto percentual de mortalidade neonatal nestes animais (BARR et al., 1997; HERNANDEZ et al., 2001). Em cães, o parasito é responsável por desordens neurológicas severas, principalmente em ninhadas congenitamente infectadas (DUBEY et al, 1988; DUBEY, 1999).

Prejuízos descritos mundialmente por esta parasitose tem sido alvo de estudos em rebanhos de corte e de leite em todo o mundo, devido à importância econômica associadas aos transtornos reprodutivos e produção de leite (DUBEY et al., 2007). Estimativas indicam que, na Califórnia, Estados Unidos, a neosporose custa milhões de dólares/ano à indústria do leite (BARR et al., 1997). Estudos de prevalência sorológica da neosporose na comunidade Europeia apresentam taxas de 10 a 60% de positividade, sendo comprovada a sua relação com o aborto em bovinos (DUBEY et al., 2007). Na Austrália e Nova Zelândia a neosporose é responsável por perdas que chegam a 100 milhões de dólares por ano (REICHEL, 2000; PFEIFER et al., 2002).

Não há dados concretos no mundo sobre a perda causada por neosporose, no entanto são estimadas em milhões de dólares. Cerca de 42% de vacas com neosporose abortam e o impacto econômico vai depender do custo de cada feto, já os custos indiretos são gerados com o diagnóstico, perda de produção de leite e substituição das vacas que abortaram (THURMOND; HIETALA, 1996; HERNANDEZ et. al, 2001). Nos Estados Unidos, com uma prevalência de ~20% de neosporose em

gado de corte no estado do Texas, estimou-se perdas na casa de milhões de dólares (KASARI et al., 1999).

No Brasil, a neosporose tem sido diagnosticada por sorologia tanto em bovinos de corte e leite, mas seu impacto econômico ainda não está bem definido (SARTOR et al., 2003). Sabe-se que a presença de anticorpos detectáveis no soro dos animais indica exposição ao agente, o que o caracteriza como positivo. Não existem métodos que permitam diferenciar animais vacinados dos naturalmente infectados por N. caninum (WILLIAMS et al., 2007).

A falta de diagnostico em regiões distantes de grandes centros, à dificuldade de encontrar fetos pequenos abortados durante o primeiro terço da gestação, o desconhecimento dos produtores e técnicos sobre a neosporose, devido à falta de sinais clínicos dos animais positivos podem ser fatores que preservam esta enfermidade silenciosa em cães e nos rebanhos (DUBEY, 2003).

1.1 Etiologia

A neosporose, causada pelo protozoário N. caninum, é uma doença conhecida por causar patologias severas em cães e abortamentos em bovinos em todo o mundo. N. caninum é um protozoário formador de cistos semelhante ao Toxoplasma gondii, porém distinto em sua estrutura antigênica, imunogenicidade e patogenicidade relacionada ao hospedeiro (DUBEY et al., 2002). Até meados de 1988 foi erroneamente diagnosticado como T. gondii, porém baseado nas características diferenciais de outros parasitos formadores de cistos pertencentes ao filo Apicomplexa, N. caninum foi denominado por Dubey et al., em 1988.

Thilsted e Dubey (1989) foram os primeiros a diagnosticar neosporose bovina, em fetos abortados em uma propriedade leiteira no Novo México, onde 29 vacas de um total de 240, abortaram durante um período de 5 meses. Parish et al. (1987) já haviam encontrado cistos de um protozoário que apresentava diferenças estruturais e antigênicas de T. gondii e Sarcocystis sp. no sistema nervoso central de terneiros recém nascidos com sinais clínicos neurológicos.

Na América do Sul, os dados sobre neosporose bovina ainda são escassos. O primeiro relato de identificação do agente foi feito por Venturini et al. (1995) na Argentina, através de teste sorológico em rebanho com histórico de aborto, que posteriormente seria confirmado por imunohistoquímica em feto bovino abortado

(CAMPERO et al., 1998). No Brasil, a primeira notificação de N. caninum em bovinos foi em 1999 na Bahia, através de reação de imunofluorescência indireta (RIFI) (GONDIM et al., 1999). Posteriormente outros estudos revelaram prevalências variando de 6 a 58% dependendo do tipo de rebanho e localização geográfica (LOCATELLI-DITTRICH et al., 2001; MELO et al., 2001; 2006; RAGOZO et al., 2003; SARTOR et al., 2003; ANDREOTTI et al., 2004; MUNHOZ et al., 2006).

Estudos realizados na região sul do Rio Grande do Sul apresentaram prevalência de anticorpos contra N. caninum em 15,63% dos cães avaliados, sendo que os cães da área rural apresentaram uma ocorrência quatro vezes maior quando comparado com cães urbanos (CUNHA FILHO et al., 2008).

1.2 Biologia

N. caninum é um parasito intracelular obrigatório pertence ao filo Apicomplexa, classe Sporozoa, ordem Eucoccidiida, família Sarcocystidae, gênero Neospora. Apresenta um ciclo de vida heteróxeno, com duas fases distintas de reprodução, uma assexuada em hospedeiros intermediários, diversos mamíferos, e outra sexuada em hospedeiros definitivos, canídeos (DUBEY et al., 2007). Durante seu ciclo pode apresentar-se de três formas infectantes: (1) taquizoítos apresenta forma ovoide, lunares ou globulares medindo 3-7 x 1-5µm sendo esta forma evolutiva responsável pela rápida multiplicação nos tecidos do hospedeiro, (2) Bradizoítos, forma lenta de multiplicação nos tecidos, presente em cistos teciduais medindo de 6-8 x 1-1,8µm; e (3) Oocistos esporulados contendo esporozoítos, cada oocisto apresenta dois esporocistos cada qual com quatro esporozoítos em seu interior (LINDSAY et al., 1996; DUBEY, 1999).

1.2.1 Ciclo de Vida e Transmissão

O ciclo biológico do N. caninum foi descrito quando oocistos foram encontrados nas fezes de cães após estes terem ingerido tecidos de camundongos infectados experimentalmente, caracterizando este carnívoro como hospedeiro definitivo (HD) (McALLISTER et al., 1998; LINDSAY et al., 1999). Filhotes de coiotes alimentados com tecidos de bovinos experimentalmente infectados também eliminaram oocistos

de N. caninum, demonstrados a partir da avaliação morfológica e biomolecular dos oocistos eliminados (GONDIM et al., 2004).

Uma vez que o HD, cães e coiotes, ingiram tecidos de HI contendo cistos com bradizoítos, liberados penetram nas células intestinais transformam-se em gametas e inicia-se a reprodução sexuada, produzindo oocistos, que são liberados nas fezes. Oocistos esporulados são compostos de dois esporocistos com quatro esporozoítos em cada, sendo considerado o estágio infeccioso de maior resistência no ambiente (McALLISTER et al., 1998, DUBEY, 1999).

De forma geral oocistos não esporulados são eliminados juntamente com as fezes do HD contaminando o ambiente. Após 42 a 72 horas, os oocistos esporulam, tornando-se infectantes (McALLISTER et al., 1998; BASSO et al., 2001; DUBEYet al., 2007).

Em relação à transmissão esta pode ser de duas formas: horizontal, dos canídeos para bovinos, a qual foi comprovada quando bovinos foram infectados oralmente com oocistos de N. caninum, (DE MAREZ et al., 1999). Posteriormente Dijkastra et al. (2001) e Gondim et al. (2002) comprovaram que cães excretam oocistos quando alimentados com placenta de vacas soropositivas para N. caninum, o mesmo acontece quando consomem tecidos de bezerros infectados naturalmente. Outra forma de transmissão é a transplacentária, chamada vertical, onde fêmea infectada transmite durante a gestação ao feto. A infecção congênita é considerada a principal via de transmissão e manutenção do N. caninun nos rebanhos bovinos (DUBEY et al., 2007).

Trees e Williams (2005) elucidaram os dois tipos de transmissão vertical que ocorre na neosporose bovina, denominando-as endógena e exógena. A transmissão vertical endógena ocorre como resultado da reativação de formas encistadas do parasito, cursando com parasitemia sistêmica chegando ao feto, já a transmissão transplacentária exógena ocorre quando a fêmea adquire a infecção durante a gestação, através da ingestão de oocistos, gerando fase aguda da doença e consequente infecção do feto.

A contaminação horizontal dos hospedeiros intermediários (HI) ocorre quando estes ingerem oocistos esporulados. No intestino, ocorre a liberação dos esporozoítos, que penetram nas células da parede gastrintestinal, transformando-se em taquizoítos. Os quais por sua vez penetram ativamente e formam vacúolo parasitófago no citoplasma de diferentes células (neurônios, macrófagos, fibroblastos,

células endoteliais, células musculares, células dos túbulos renais e hepatócitos), reproduzindo-se, rapidamente, por endodiogenia (reprodução assexuada) provocando a lise celular, liberação e penetração em outras células ocorrendo disseminação da infecção a outros órgãos. Esse período caracteriza a fase aguda da infecção (DUBEY, 2003).

A resposta imune do hospedeiro combate às formas circulantes, parasitemia, assim os taquizoítos diferenciam-se em bradizoítos e passam a se dividirem lentamente dentro das células hospedeiras, levando a produção de cistos teciduais, caracterizando a fase crônica (INNES et al., 2007). Os cistos comumente estão presentes no sistema nervoso, coração e fígado de fetos abortados de bovinos (WOUDA et al., 1997).

N. caninum já foi isolado de diversos hospedeiros como bovinos, búfalos, ovinos, caprinos, cervídeos e equinos, evidenciando infecções naturais (DUBEY et al., 1988; BARR et al., 1994; LINDSAY et al., 1996). Pesquisas relatam a presença de anticorpos contra N. caninum no soro de animais silvestres demonstrando que estes entraram em contato com o agente. Desta forma estes animais podem ser classificados como possíveis hospedeiros da neosporose (BUXTON et al., 2002; CAÑÓN-FRANCO et al., 2004; VITALIANO et al., 2004). Evidências sorológicas da exposição ao agente também já foram descritas em diferentes populações humanas (TRANAS et al., 1999).

1.3 Diagnóstico

O diagnóstico da neosporose pode ser realizado através da detecção de anticorpos específicos, presentes no soro de animais, ou através da identificação do parasito em cortes histológicos (DUBEY et al., 2007). A Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) é amplamente utilizada, baseando-se na pesquisa de anticorpo, para cães o ponto de corte da reação 1:50 e bovinos 1:100. Animais que reagem com este título ou superior são considerados positivos (DUBEY et al., 2007). Para menores titulações é possível encontrar reações inespecíficas, e precisam ser interpretadas com cautela, pois o teste pode apresentar falsos positivos devido à grande semelhança com T. gondii (ATKINSON et al., 2000). No entanto, outras técnicas utilizando antígenos recombinantes específicos de N. caninum como ELISA, aumentam a sensibilidade evitando falsos diagnósticos. Borsuk et al. (2011) ao realizar estudos

com proteína recombinante rNcSRS2, obteve resultados relevantes, quanto a sua especificidade 96% e sensibilidade 95%.

A pesquisa do parasito em tecido pode ser feita através da reação em cadeia da polimerase (PCR) (LOSCHENBERGER et al., 2004; PAULA et al., 2004), utilizando iniciadores para porções conservadas do gene como ITS1 e Nc5. Pequenas quantidades de DNA presente em amostras são suficientes para pesquisa do protozoário mesmo que apresentem tecidos autolizados (COLLANTES-FERNÁNDES et al., 2006).

1.4 Tratamento e Controle

Medidas preventivas podem auxiliar no controle da neosporose. Os cães não devem ser alimentados com carne crua ou vísceras de bovinos, mantendo o controle de populações dentro e arredores de fazendas (McALLISTER et al., 1998), para evitar a contaminação do ambiente. Bovinos sorologicamente positivos precisam ser retirados da reprodução encaminhados para o abate, com objetivo impedir a transmissão vertical (WILLIAMS; TREES, 2006).

Para diminuir a perdas no rebanho é possível adotar técnicas reprodutivas, como a transferência de embrião, onde são coletados embriões de uma fêmea positiva para neosporose, fecunda-los e implantar e ventres livres da doença, preservando o embrião da infecção. Dessa maneira é possível manter as fêmeas positiva no rebanho, e produzir uma progênie livre de N. caninum (BAILLARGEON et al., 2001; LANDAMNN et al., 2002; MOSKWA et al., 2008).

Tratamento químico não é o mais indicado para rebanhos devido a custos e manejo, entretanto estudos demonstram a capacidade parasiticida do toutrazuril, utilizado contra coccídeos formadores de oocistos, como alternativa para falta de um quimioterápico seguro e eficaz para tratamento da neosporose (HABERKORN, 1996). As indicações de toutrazuril demonstraram a ação posterior a 14 dias de tratamento contínuos, in vitro (STROHBUSCH et al., 2008). O mesmo princípio, testado em camundongos desafiados, preveniu sinais clínicos e formação de lesões cerebrais, como também a transmissão transplacentária (GOTTSTEIN et al., 2001; DARIUS et al., 2004 a; b; STROHBUSCH et al., 2009; GOTTSTEIN et al., 2005).

Haerdi et al., (2006) propuseram avaliar a eficácia do toutrazuril em bovinos infectados congenitamente sendo administrado aos animais, doses da medicação

durante sete dias após o nascimento, entretanto a eficácia do tratamento não pode ser comprovada devido a interferência da resposta humoral apresentada pelos terneiros no 4º e 6º mês de idade.

A infecção natural de N. caninum em bovinos não produz resposta imune suficiente para proteger de reinfecções e da transmissão vertical, a vacina disponível não protege da infecção congênita (ROMERO et al., 2004).

1.5 Imunidade na Gestação

A transmissão transplacentária é principal fonte de infecção por N. caninum em bovinos. Os fatores que influenciam a infecção por N. caninum durante a gestação incluem: (1) a duração de tempo e parasitemia durante a gestação, (2) a eficácia da resposta imune materno, e (3) a capacidade do feto para montar uma resposta imune eficaz (INNES et al., 2002).

A proteção contra a infecção congênita não é adquirida em várias exposições ao agente, entretanto fêmeas infectadas apresentam menor probabilidade de abortar (THURMOND, M. C.; HIETALA, S. K., 1997; McALLISTER, 2000). A resposta imunológica Th-1, baseada em células (CMI), é considerada eficaz, atua reduzindo a multiplicação do protozoário no hospedeiro (ALMERIA et al., 2003). A produção de citocinas, tais como IL-12 e IFN-y e ativação de linfócitos T, são característicos da infecção por N. caninum (KHAN et al., 1997, WILLIAMS et al., 2000). Contudo, a produção de elevados níveis de IFN-y e óxido nítrico, decorrentes da infecção, no início da gestação podem ocasionar rejeição ou aborto do feto (INNES et al., 2002; ALMERIA et al., 2003; QUINN et al., 2002).

No momento de infecção N. caninum invade as células do útero gravido, multiplica-se e causando destruição focal dos tecidos materno e fetal, resultando resposta inflamatória na interface materno-fetal. Esta lesão acarreta na infecção do feto e consequentemente lesão em diversos órgãos do mesmo (BUXTON 2002).

A partir dos 150 dias de gestação ocorre aumento na produção de progesterona a qual induz uma modulação para uma resposta mais para Th-2, havendo a produção das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10. Estas, no entanto garantem o desenvolvimento do feto, porém não são adequadas para o controle da infecção parasitária, levando, por conseguinte uma grande carga parasitária na mãe, aumentando os riscos da transmissão congênita (QUINN et al., 2002).

Portanto, a infecção ocorrendo no primeiro trimestre de gestação, quando os níveis hormonais de progesterona são baixos, o risco de aborto é relativamente alta, entretanto a transmissão do parasita para o feto é baixa. Caso a infecção ocorra durante o terceiro trimestre de gestação, quando há ação da progesterona, iniciando-se um aumento de uma resposta com tendência a Th-2, o risco de aborto é baixo, entretanto a transmissão congênita é alta (QUINN et al., 2002).

1.6 Estudos de Antígenos

A biologia molecular moderna permite estudar antígenos de N. caninum de forma isolada ou em associações, para assim determinar a real importância que desempenham na interação parasito/hospedeiro durante infecção. Muitos antígenos foram isolados e avaliados quanto a sua especificidade, antigenicidade e imunogenicicade, para utilização em diagnostico e vacinas. As principais proteínas que estão sendo estudadas para diagnóstico e confecções de vacinas estão em quatro grupos: (i) antígenos imunodominantes de superfície de N. caninum, especialmente NcSAG1 e NcSRS2 (HALDORSON et al., 2005). (ii) Roptrias - organelas secretoras localizadas no complexo apical que atuam na junção com a célula do hospedeiro, sendo responsáveis pela penetração e formação do vacúolo parasitófago nas células infectadas, NcROP2 (DUBREMETZ, 2007; MARTIN et al., 2007). (iii) Micronemas - possuem propriedades semelhantes às roptrias, NcMIC1 (ALAEDDINE et al., 2005), NcMIC3 (CANNAS et al., 2003), NcMIC4 (SRINIVASAN et al., 2007). (iiii) Proteínas de grânulos densos - organelas secretórias envolvidas no processo de invasão e captação de nutrientes, destacando a NcGRA7 (JENKINS et al., 2004).

A primeira descrição do uso da proteína rNcROP2 como vacina foi feita por Debache et al. (2008) em estudo com modelos murinos, onde obtiveram proteção contra a invasão cerebral. O mesmo antígeno utilizado em associações com diferentes adjuvantes produziu diferenças significativas na resposta imune, para grupos vacinados com adjuvante FIA (adjuvante incompleto de Freund´s) observando-se um incremento na produção de IgG2a, o que não ocorreu no grupo com Saponina, com grande produção de IgG1, contudo, ambas foram eficazes na proteção segundo os autores, indicando uma modulação de resposta principalmente Th1 e Th2.

Debache et al., (2009) utilizaram mesmo antígeno e avaliaram a proteção conferida, em camundongos, quando associada com micronemas (MIC1 e MIC3). Observaram que em grupos vacinados com rNcROP2 sobreviveram 50% dos animais posterior ao desafio e quando associada com MIC1 e MIC3 sobreviveram apenas 35%.

A proteína rNcROP2 foi avaliada em diferentes vias de administração, intranasal e intramuscular, contudo não foi evidenciado modulação ou incremento na resposta imune para as diferentes vias, utilizando saponina como adjuvante (DEBACHE et al., 2010).

Monney et al. (2011) sugeriram a proposta de trabalhar com sequências mais imunogênicas da proteína rNcROP2, desta forma, com auxílio de softwares estudaram a sequência da proteína NcROP2, para encontrar sequências mais promissoras para desenvolver resposta imune de interesse. A região identificada compreende entre os aminoácidos 191 ao 359. O mesmo estudo foi realizado sobre as proteínas de MIC1 e MIC3. As regiões caracterizadas nas três proteínas foram fusionadas e testada em modelos murinos. A quimera construída com regiões de roptrias e micronemas foi reconhecida como antigênica e gerou proteção 100% nos camundongos desafiados. Em continuação a esses estudos, Monney et al. (2012) buscaram avaliar o padrão de resposta imune que os antígenos quiméricos podem proporcionar em modelo murinos desafiados durante a gestação. Os animais foram vacinados com o antígeno quimérico contendo porção da proteína rNcROP2 (rNcMIC3-1-R), o que produziu resultados diferentes em grupo de gestantes e não gestantes (MONNEY et al, 2012). Enquanto a quimera (rNcMIC3-1-R) apresentou elevado nível de proteção associada a uma resposta tipo Th1/Th2 mista em ratas não gestantes, o mesmo nível de proteção não foi observada para fêmeas gestantes, a qual foi associada a baixos níveis de IgG total e citocinas. Monney et al. (2012) sugerem que a imunomodulação que ocorre durante a gestação é crucial para avaliação de vacina contra nesporose.

1.7 Subunidade LTB como adjuvante

Vacinas utilizando subunidades passaram a ser estudadas por apresentarem diferenciais, como a possibilidade de incluir apenas antígenos especificos para imunização, e garantir uma segurança maior quando comparados a bacterinas e vacinas atenuadas (BURNETTE, 1991). Essas vacinas de subunidade apresentam

alto grau de pureza, porém são deficientes em efeitos imunomodulatóro e auto-adjuvantes, devido à falta de outros componentes celulares. Contudo, com a utilização de potentes adjuvantes imunológicos associados a vacinas de subunidades sua ação foi potencializada (GUPTA et al., 1993).

Alguns produtos microbianos tem capacidade de modular a resposta imune adaptativa, entre estes pode-se citar a enterotoxina termolábil da E. coli (LT) a qual tem ganhado destaque em vacinas de subunidade (SIMMONS et al., 2001a). A toxina LT é formada por uma subunidade A (LTA) com 27kDa com atividade ribosiltrasferase, ligada a um pentâmero de subunidade B (LTB) que possui 11,6kDa, altamente estável e com função de ligação ao gangliosideo GM1 de células de mamíferos (SIXMA; et al., 1991; SPANGLER, 1992). A subunidade B da LT tem sido utilizada em vacinas de subunidade como um potente adjuvante, já a subunidade A por apresentar caráter tóxico não é alvo para estudos de adjuvantes (DE HAAN et al., 1998).

Simmons et al. (2001b) demonstraram em seus estudos a eficiência da LTB na capacidade de induzir resposta imune celular, incluindo Linfócitos T citotóxicos, como também resposta humoral e produção de anticorpos, quando utilizada em antígenos co-administrados ou fusionados (FINGERUT et al., 2006; CONCEIÇÃO et al., 2006; PITCOVSKI et al., 2006; ROCHA et al., 2008).

Estudos demonstram a eficiência da LTB administrada em fusão com outras proteínas. Conceição et al. (2006) ao avaliaram uma quimera formada LTB-R1 em camundongos, observam que a LTB potencializou a resposta imune tanto celular quanto humoral, com grande produção sistêmica de anticorpos. Rocha et al. (2008) administraram a mesma quimera, rLTBR1 no entanto expressa em BCG a qual produziu altos índices de IgA contra o antígeno e induziu resposta imune do tipo celular, comprovando o efeito imunomodulador de LTB.

Diversos tipos de vacinas envolvendo antígenos recombinantes já estão sendo testados, entretanto se faz necessário que estas novas vacinas permitam distinguir entre animais vacinados e desafiados, para monitoramento do rebanho.

2 OBJETIVOS

 Clonar e Expressar a região da NcROP2 descrita entre os aminoácidos 191 ao 359, fusionada a LTB, produzindo a quimera ROP²/LTB, em Escherichia coli;

 Caracterizar a quimera ROP²/LTB, quanto sua conformação para teste de antigenicidade e reconhecimento de subunidades pela técnica de Western blot.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

A construção e caracterização da rROP²/LTB foi realizada no Laboratório de Bacteriologia do Núcleo de Biotecnologia CDTec-UFPel. Todos os protocolos de clonagem foram organizados de acordo com Sambrook e Russell (2001), com modificações.

3.1 Construção dos Iniciadores

Os iniciadores foram construídos para expressão em procarioto, utilizando as mesmas porções antigênicas descritas por Monney et al., (2011), entretanto para fusão com a subunidade LTB de E. coli, foi adicionado sítios de restrição para direcionamento da clonagem (Tab.1).

Tabela 1. Sequências dos oligoiniciadores e suas respectivas enzimas de restrição.

Nome Sequência Enzima

FOR-RL 3´-ACGAATTCCTGCGACCAGGCCA-5´ EcoRI

REV-RL 3´- CTCAAGCTTGGCGTGTTAGTCGGG-5´ HindIII

A síntese foi realizada pela empresa SINAPSE Biotecnologia, na concentração de 0,025µmol, com purificação por BioRP. A concentração de 100 pmol foi utilizada como solução estoque.

O mapa da construção da quimera ROP²/LTB em vetor pAE a partir dos iniciadores descritos acima, foi desenhado em software Vector NTI AdvanceTM ₁₁

3.2 Reação em Cadeia da Polimerase

O protocolo para reação da PCR teve as seguintes condições: 95ºC por 4 minutos, desnaturação inicial seguido de 30 ciclos de 94ºC por 1m, 58ºC por 45s e 72ºC por 45s. A extensão final foi 72ºC por 5m. A reação foi realizada em termociclador Biocycler, modelo MJ96G.

3.3 Extração de DNA

Amostra de taquizoítos de N. caninum (NC-1) foram cedidas gentilmente pela professora Fernanda Flores, da Universidade Federal de Santa Maria, e submetidas à extração de DNA pelo método lise mecânica com pérolas de vidro descrito por Sambrook e Russell (2001).

3.4 Amplificação da sequência e clonagem

As concentrações dos reagentes para a PCR, para uma reação de 25µl, foram: 2,5µL de tampão 10x, 0,5µL de dNTP 100mM, 0,01pmol de cada primer, 0,5µL (2 unidade) de TaqTM _{DNA polimerase (Invitrogen), 1µL de Cl2Mg a 50mM, 18µL de}

água Milli-Q e 40ng de DNA molde. O produto da reação de PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose 1 % (Fig. 1), corado com brometo de etídeo e fodocumentado. Posteriormente foi purificado utilizando kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel). O produto de PCR apresentou tamanho esperado de 522pb compreendido entre os aminoácidos 191 ao 359 do gene NcROP2.

Na sequência o produto de amplificação e o vetor de expressão pAE contendo o gene LTB (pAE-LTB) foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII (Biolabs®_{). A reação foi realizada a 37°C durante 3h. A digestão foi purificada}

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, analisada em eletroforese em gel de agarose 1%.

A ligação entre inserto ROP² e vetor pAE/LTB foi estabelecida de acordo com protocolo da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen), com proporção de 1:3 de inserto e vetor, incubada 24ºC por 1h. A proteína ROP² foi inserida na porção N-terminal de LTB, sem adição de aminoácidos de ligação.

3.5 Condições de cultivos e meios de Cultura para E. coli

As cepas utilizadas foram E. coli BL21 (DE3) Star™, RIL, pLyss e E. coli TOP10, todas presentes em estoques no Núcleo de Biotecnologia, UFPel, e comercializadas pela InvitrogenTM_{. As cepas foram cultivadas a 37°C em meio Luria-Bertani (LB) sob}

agitação a 200rpm ou em meio LB acrescido de 1,5 % de ágar-ágar, e quando transformadas, o meio foi suplementado com 100µg/mL de ampicilina.

3.6 Transformação das cepas de E. coli

A partir de um repique em agar-LB de 24h, foram coletadas duas colônias isoladas de E. coli TOP10, homogeneizadas com 100µL de solução de CaCl2 100mM

estéril e 3µL do produto da reação de ligação em microtubo de 1,5mL. Após homogeneização, o material foi incubado em gelo por 15min, seguida de um choque térmico a 42ºC por 1min, retornando ao gelo por mais 3mim. Posteriores ao choque térmico foram incubadas em agitador orbital 37ºC, 150rpm, durante 1h para restabelecimentos de suas condições celulares. As células transformadas foram cultivadas em placa com LB sólido suplementado com 100µg/mL de ampicilina a 37ºC por 24h.

3.7 Seleção e confirmação de clones recombinantes

Colônias bacterianas que cresceram isoladas na placa foram submetidas a um processo de triagem por extração rápida de DNA com fenol-clorofórmio, pelo método microprep (Sambrook e Russell, 2001). Os clones caracterizados como recombinantes nesta triagem apresentaram na eletroforese em agarose tamanho superior, quando comparados ao plasmídeo sem inserto, controle (Fig. 3). Os clones recombinantes foram cultivados por 24h em meio LB suplementado com 100µg/µL de ampicilina. Neste cultivo, realizou-se uma extração do DNA plasmideal pelo kit comercial NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel). Os plasmídeos extraídos foram confirmados por restrição enzimática para checar a presença do inserto (Fig. 4). Posteriormente os mesmos foram cultivados e induzidos para expressão da quimera.

3.8 Expressão e purificação da rROP²/LTB

A cepa de expressão E. coli BL21 Star™ (DE3) foi transformada por choque térmico com o vetor de expressão pAE-ROP²/LTB, como já descrito. O clone recombinante foi transformado e cultivado sob agitação e temperatura constante de 37ºC, 150rpm, durante 12h em 25mL de LB contendo 100µg/mL de ampicilina. Esta cultura foi utilizada como pré-inoculo para volume final de 500mL de LB com 100µg/mL de ampicilina. O cultivo foi expandido e recolocado em agitador orbital a 37ºC, até atingir fase log de crescimento (absorbância em DO600 de 0.6 a 0.8). Atingida a D.O.

foi induzida a expressão da rROP²/LTB com 0,1mM de IPTG (isopropylthio-ß-D-galactoside) por 3h30min.

Duas alíquotas foram coletadas, uma antes da indução com IPTG e outra no final do período de indução, para verificação da expressão da proteína rROP²/LTB. Paralelamente foi cultivada sob mesmos parâmetros a cepa E. coli BL21 Star™ (DE3) não transformada, para fins de controle. Para controle da expressão por eletroforese ambas amostras foram centrifugadas e adicionado as células 80µL de solução tampão de fosfato (PBS) e 20µl de tampão de SDS 5X, logo após desnaturadas 98ºC por 10min.

A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 15% foi realizada com 15µL de cada fração obtida, com o intuito de confirmar a expressão heteróloga da quimera recombinante. O restante da cultura foi fracionada em tubos de 250 mL, centrifugada a 9000 x g por 15min, e os pellets armazenados a - 20ºC. As cepas E. coli BL21 (DE3) RIL e BL21 (DE3) pLyss não apresentaram os mesmos rendimentos quando comparados a BL21 (DE3) Star, logo deixaram de ser utilizadas.

3.9 Purificação da rROP²/LTB

Para a purificação da proteína recombinante, o pellet de células foi suspendido em tampão de solubilização (NaH2PO4 50mM; NaCl 300mM; imidazole

15mM) incubado por 1h a 4ºC com 1mg/mL de lisozima (Invitrogen) e, em seguida sonicado. A amostra foi centrifugada 9000 x g por 15min, o sobrenadante armazenado e o pellet ressuspendido em tampão com ureia (NaH2PO4 50mM; NaCl 300mM;

sobrenadante. Uma alíquota de cada fração coletada foi analisada em SDS- PAGE 15 % para avaliação da pureza.

O sobrenadante contendo ureia foi que apresentou maior concentração da proteína rROP²/LTB, sendo purificado através de cromatografia de afinidade His-tag em equipamento Akta Primer 3. O produto da purificação foi analisado em gel de SDS-PAGE 15%, posteriormente, amostras com maior grau de pureza foram dialisadas contra solução tampão de fosfato (PBS) pH 7,4 a 4ºC, durante 24h, para remoção do agente desnaturante (Ureia). A proteína dialisada foi então alíquota e armazenada com 10% de glicerol, a –20°C.

3.10 Caracterização de rROP²/LTB por Western blotting

Primeiramente a quimera purificada foi submetida à SDS-PAGE 15%, para visualização da massa molecular aparente. A caracterização foi realizada por Western

blot com três diferente anticorpos, seguindo-se estas amostras foram

eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose HybondTM _ECLTM

(Amersham Biosciences) que foi dividida para revelação com cada anticorpo. As membranas passaram por uma etapa de bloqueio onde permaneceram submersas por 1h em PBS-T (0,05 % de Tween 20) acrescido de 5% de leite em pó desnatado. Posteriormente, foram incubadas separadamente, 1h30min a temperatura ambiente, com anticorpo policlonal anti-CT 1:6000; MAb anti-6xHis 1:6000 e soro bovino positivo para N. caninum por IF 1:500. Após três lavagens com PBS-T, as membranas foram incubadas com soro anti-imunoglobulina de coelho conjugado com peroxidasse (Sigma) na diluição de 1:4000 (para anti-LTB) ou com soro anti- imunoglobulina de camundongo conjugado com peroxidasse (Sigma) na diluição de 1:5000 e outra com soro anti-imunoglobulina de bovino conjugado com peroxidasse (Sigma) diluído 1:6000. Após três lavagens, as reações foram reveladas com diaminobenzidina (DAB) e H2O2. Prestained Standards Low Ranger (BIO-RAD) foi usado como marcador

4 RESULTADOS

4.1 Extração DNA e Amplificação do fragmento ROP²

A extração de DNA utilizando o método lise mecânica descrita por Sambrook e Russell (2001) foi efetiva (Fig. 1-A), o material não necessitou de purificação para reação da polimerase. A reação da PCR amplificou a região codificadora que compreender do amino ácido 191 a 359 da proteína NcROP2, fragmento com cerca de 522 pb, condizente com o tamanho esperado (Fig. 1-B). O mapa da sequência da proteína ROP² esta apresentado na Fig. 2.

Figura 1. Eletroforese em gel da agarose. A- Extração do DNA de taquizoítos de N. caninum. 1) Marcador Ladder 1kb Plus, 2-3) Amostra 1 e 2. B- Amplificação do gene

522p b

564pb

B

ROP² 522pb. 1-3) amplificação do fragmento ROP² com 522pb, 4) Marcador de peso molecular λ Lambda HindIII (Invitrogen).

Figura 2. Sequência do gene NcROP2, obtido a partir do número de acesso HM587954 no GenBank. Os iniciadores estão destacados em vermelho flanqueando a sequência da ROP² que corresponde a 505pb.

4.3 Seleção dos clones recombinantes

A ligação resultante entre o vetor pAE-LTB e inserto ROP² foi utilizado na transformação por choque térmico de células de E. coli TOP 10, previamente cultivadas em ágar-LB. Posteriormente as células transformadas passaram a ser cultivadas no mesmo meio acrescido com 100µg/mL de ampicilina, e as colônias que obtiveram

TACGTATGTATTTTAACCTCTGAATATTTGTGTTTTTGTTGGTGACGGTTTTTCACCATGGAACAG TCTGCGTCTGTCGGACCGTCGTCCTGTCTTGTCCGGCTAGCTGGGGCATTGCTTGTCTTGGCAC TTTGCCACGCACAGCGAGGCGCTGGCATTCTGCTGCCTCAGTCCTGGGATGACTCGGAAGCAG CTTTGAGTGTCAGTCCCGTGGGAGGTCTCATGGGTGAACATCGCACCGCTTCTGCTGAGCAAGC CAACTTTGTCGCAGAGGAGCAAGTGGAGGACAAGCGTGGGGGTTCATGGTTGCAGCAAGAAGA GGTCGAGCAAGTGCCATCCGAAGCACAAAACCAGACCGACGCAGAGCCCGGGACCCAGTCCTC CACACGTTTCGGAAGGTTACTCGCGCGCCTGCGTTGGCGAGGAAGGGGGAGAGGGGGATCAG CTGGTGCGGCACAAGAGCAGCAGAGGCGTCGAGTTCCTCTACGTACGAGGCTGCTTCAGCACT TGAAGCGTGGAGTAAGATTTCTCCGACACGACATACCGGCTGCCGCTGCACGATTGTACAGGCG ACTGCGACCAGGCCAGCCACGTCTGTTTCCAGTTGACGAGGTGCCTCGGATGTAGAGACGAAT CCTATGTATTATCATGGCAGAGATAGCGGAGACGTCATACTTGAGGAACTGTTTAAACGTATTCC GGAAGCGGGGCAGCCAATCATCTACAGGGAAGCCTCGGCATACGATGATTTGGTCTCCAGGAT GTTGTGGCGTAATCAGAAGCACTTTAGCGTCGTCTCGGAACTAGGCGAGCCTTCACGGACGCTG ATAAGAGGGCGAATGCTCGGCAAAGGTCCATCGGCTATCGTGTTTGAAGCCACAGACCGAGAG ACGGGAGAAACGCTCGCTGTGAGTGTTCCATATTTTACGGAGAAACCGTCTGCCATGGATATTG AAGGGCTGCGCGACGAGGTACTGTGCATCAACTTGTTTCCAAACATCAAAAACCCAAAGCAAGC TCAGACGTACATGAGATTGCTGGTTCCCACCGATATAGTGAGGGCCCGACTAACACGCCTGTCG CGCCGGGGCCTCGTAGGGCAGAGTCGCATTTGGATCGTGAACCGATACTTTTTGTATCCCCTGA TGCAAACTAATCTTATCTCGCTTATAGAGGGCTTGTCGAGATCATCTGATGTAAACAGCAACCTC GCGATCCATGCTCGGCTGCAGCTCACTGTTCAGGTCATAAAACTGGCGGCCAGCCTGCACCAC CACGGTGTCGTGCATGGAAATTTGCAAATGAGTAGTATCTTCATACAGAAGAACGGAGCCGTGTT CTTGGGTAAGTTGAGGTATATGGTGAAAGAAGGTGAATATTCGGAATTTACCTTCGGTCGAGGAT TTGAGCCACCGGAAACCACTGACCCGTCAAGACAGGGCCGTTCTTATGATCCAAGGAAGCACAA GAGATATGCATTTGATGCATGGGCAGTGGGTTTGGCGATACACTGGATCTGGTGCGAGGACCTT CCTGATACCGAGTCGGCGCCTTTGGGCGGCACCGAATGGATTTTTAAACGCTGCAGAAACATTG AATTGTCGGAGCCAGTGAAATTTCTGCTGGAGGGGTTCCTACGACACGATCCGGAAGACCGCCT TCTTCCTCTCCAAGCGACAGAGACTCCGCAGTTCGAAAACATCAAAGAAATGATTTCCTCTGTGT TGAATCAATACGACCAACAAGGTGAACCGAAACTATGGGGAAAGGGTGATTTGCCAACTTCGGG AACGACTCAAGGCGACGACGGCGTAGATGAAACGGAGGACACGAGGCTATAGGATCTCCGAGG GGAGGTTACCGCAGATTTTGGAATCGCCGGCGTCCGTTTTGCCGAAACCACCGTTTTTTCGTAT GTGTTTTGAAACAGTGTAATGTATTTTCTGGCTGAGGCGATGCTGCAGACATAGTAGCAGTTGGC AGACGTGTTGAGAGGAGATGCGCGTGATCGCCTGCAAATGCTGCAGCTGCAGTCCTTGTGGTC AGCCGTCTTTTCCAGTGTGTGTAGCTTCGTCGACGGCGCAGTTGGAGGGGGGGAAGGGGAGAT CGGAGGTTCTTTCGGGCACATCAGCGCCGTGCGTGGCCGAGGTCCGGCTTCGCCTCTGTGTAG TTTCCACCATGAGTGGCATTCACGAATGTGGATTCTGAACGCGTGCCACGCCGCTGCCCCTCTG GCGGTGCAGCCCCTAACACTGATTGATGCTTTTGGGGACACAC

crescimento no meio seletivo foram selecionadas aleatoriamente e submetidas ao método de triagem microprep (SAMBROCK e RUSSEL, 2001).

A verificação da extração foi por eletroforese em gel de agarose 1%, indicando possíveis clones recombinantes, os quais apresentaram tamanho, em pares de bases, superior quando comparado com o vetor de origem, indicando a inserção do gene (ROP²) de interesse (Fig. 3 - A). Os clones obtidos foram confirmados com uso de enzima de restrição para confirmação da presença do inserto. O resultado do padrão de bandas posterior à digestão dos plasmídeos recombinantes foi verificado através da eletroforese em gel de agarose, 1% (Fig. 3 - B). Confirmando a diferença entre os plasmídeos, gerada pela presença do inserto ROP² (522pb). Este clone, passou a ser classificado de seguinte forma pAE-ROP²/LTB 12, foi considerado clone recombinante.

Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1%, A- Pesquisa dos clones recombinantes nas colônias cultivadas após transformação; 1 ao 4) extração de DNA total de colônias transformadas com o produto da ligação; 5) vetor pAE-ltb purificado, utilizado como controle. O plasmídeo da coluna 2, indicado com a seta, é o provável clone recombinante. B- Demonstração da digestão com enzima de restrição do clone selecionado na Fig. 3A-. M) Marcador DNA Ladder Plus 100pb (Invitrogen); 1) vetor pAE/LTB não digerido; 2) vetor pAE/LTB digerido; 3) Clone 12 pAE-ROP²/LTB não digerido; 4) vetor pAE-ROP²/LTB digeridos por EcoR1; 5) Marcador de peso molecular λ Lambda HindIII (Invitrogen).

4.3 Expressão e purificação de rROP²/LTB

O clone contendo a quimera rROP²/LTB foi transformado em E. coli BL21 Star™ (DE3) onde expressou uma proteína recombinante de aproximadamente 24kDa, massa molecular estimada quando comparada com marcador Prestained

Standards Low Ranger (BIO-RAD) Fig.4.

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6

B

A

Figura 4. Eletroforese em gel de poliacrilamida 15 % da expressão da quimera rROP²/LTB. 1) Marcador Prestained Standards Low Ranger (BIO-RAD), 2) extrato da cepa não transformada E. coli BL21 Star™ (DE3), 3) extrato da cepa E. coli BL21 Star™ (DE3) antes da indução com IPTG, 4) extrato de E. coli BL21 Star™ (DE3) após 3 h expressão da proteína rROP²/LTB.

A lise das células por lisozima seguida ultrasom não foram suficientes para que a quimera recombinante fosse solubilizada do pellet, indicando que a proteína recombinante foi expressa na forma insolúvel (corpos de inclusão). A solubilização da proteína foi possível com adição do tampão contendo 8M de ureia, seguindo centrifugação, e o sobrenadante foi analisado em SDS-PAGE, com a identificação da quimera. Esta foi purificada por cromatografia de afinidade, e as alíquotas obtidas foram dialisadas em PBS durante 48h, ao sobrenadante contendo ROP²/LTB foi adicionado de 10% de glicerol estocado a –20°C.

4.5 Caracterização da quimera rROP²/LTB por Western Blot

A antigenicidade da quimera foi avaliada mediante Western Blot (WB) com anticorpos específicos para subunidades LTB, cauda de 6x histidina e soro de bovino positivo para neosporose (Fig. 5). O WB foi realizado com MAb anti-6×his (Fig. 5 – A) reconhecendo a proteína ROP²/LTB e LTB, uma vez que as mesmas foram

1 2 3 4

24kDa

21kDa 29kDa

produzidas adicionadas de uma cauda de 6x histidinas. A proteína rLTB foi utilizada como parâmetro para as reação frente a quimera, sendo para alguns teste controle positivo e outros controle negativo. O WB realizado com anticorpo policlonal anti-CT (Fig. 5 – C) apresentou reação positiva específica para quimera ROP²/LTB, devido a fusão da LTB com a ROP² em sua molécula. A quimera, purificada, quando submetida ao soro bovino confirmado por IF foi reconhecida (Fig. 5 – B) demonstrando a capacidade de antigenicidade do antígeno construído.

Figura 5. Western Blot (WB) da caracterização da quimera ROP²/LTB. Com anticorpos específicos contra cada subunidade. A- WB utilizando anticorpo monoclona anti-his, 1) marcador Prestained SDS-PAGE Standards Low Ranger (BIO-RAD), 2) rLTB, 3) rROP²/LTB. B- WB utilizado submetida ao soro bovino positivo para N. caninum por IF, 4) extrato da cepa E. coli BL21 Star, 5) rROP²/LTB. C- WB utilizado anticorpo policlonal anti-CT, 6) extrato da cepa E. coli BL21 Star, 7) rLTB, 8) rROP²/LTB.

A massa molecular de todas as proteínas observadas seguiu o esperado. Nenhum anticorpo reconheceu o extrato de E. coli BL21 Star™ (DE3). Estes resultados sugerem que a fusão das proteínas e a presença da cauda de histidina não alterou significativamente a conformação destas proteínas, permitindo que anticorpos específicos reconhecessem cada subunidade da quimera e cauda de histidina.

1 2 3 4 5 6 7 8

A

B

C

5 DISCUSSÃO

No presente estudo foi expresa a quimera recombinante rROP²/LTB, composta pela porção mais imunogênica da roptria 2 de N. caninum e a subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli. O sistema de expressão heteróloga testado, fazendo uso da cepa E. coli BL21 Star™ (DE3) e do vetor pAE, mostrou-se eficiente, em relação á quantidade de proteína recombinante obtida. Este sistema de expressão possui características que o tornam interessantes. A cepa em questão possui em seu genoma uma cópia mutada do gene rne (rne131) que codifica uma RNaseE truncada, portanto esta enzima é incapaz de degradar mRNA, resultando em tempo maior de estabilidade deste e consequente acréscimo de expressão de proteínas. Esta cepa é B/r e não contém a protease lon, tampouco a protease de membrana externa (OmpT). A ausência destas proteases reduz a degradação de proteínas heterólogas expressadas (GRUNBERG-MANAGO, 1999; KIDO et al., 1996; LOPEZ et al., 1999). Além disso, o vetor pAE tem a capacidade de adicionar a proteína de interesse seis aminoácidos histidina, permitindo a purificação por cromatografia de afinidade, bem como a identificação da proteína recombinante em Western blot com MAb anti-6xHis. Na quimera produzida, a inclusão destes amino ácidos não prejudicou a antigenicidade e reconhecimento da subunidade LTB e ROP², como pode ser observado na Fig. 5.

Considerando estar disponivel o vetor pAE contendo o gene LTB, o gene fusionado ROP²/LTB foi obtido usando apenas uma PCR, uma reação de restrição enzimática e outra de ligação. Houve a confirmação que a sequência amplificada na PCR e que o fragmento inserido no vetor eram o gene de interesse, baseando-se nos resultados encontrados na digestão com enzima de restrição para confirmação do clone recombinante e a antigeniciade reconhecida no Western bolt (Fig. 4 e 5).

Estas informações indicam que o método usado para fusão dos genes foi eficiente. Monney et al. (2011) usou para construção de três quimeras Kit comercial InFusionTM _{Advantage PCR Cloning, também obteve sucesso, porém o método usado}

A proteína rROP²/LTB foi expressa na forma insolúvel, necessitando de um agente desnaturante para a solubilização dos corpos de inclusão do interior da célula. A estratégia mais comumente adotada para este tipo de problema é o uso de solução com 8M de uréia, que desnatura completamente a proteína, interrompendo as interações moleculares que proporcionam a estrutura tridimensional. Entretanto, durante a diálise, a uréia é praticamente toda retirada, porém isso necessita uma diálise lenta com reduções parcias da ureia, para que a proteína possa retornar a conformação estrutural inicial.

A quimera ROP²/LTB, mesmo utilizando uréia, nas condições extracelulares apresentou conformação estrutural capaz de permitir o reconhecimento da subunidade LTB. A desnaturação com uréia também não comprometeu os determinantes antigênicos da porção ROP² visto que na Fig. 5 é reconhecida a sua antigenicidade, por soro bovino positivo para N. caninum confirmado por IF. O não retorno a conformação original ou perda da atividade desejada é comum acontecer para proteínas que são precipitadas por ureia (SAMBROOK; RUSSELL, 2001).

Os anticorpos testados no Western blot reagiram especificadamente com a quimera, não havendo reação com controles negativos. Desta forma, a caracterização antigênica evidenciou a identidade de cada subunidade da quimera, mostrando que a fusão conservou epitopos antigênicos importantes da LTB e da ROP² e que apesar de expressa em corpos de inclusão, sua conformação pareceu satisfatória.

A fusão do gene ROP² na sequencia de LTB foi na porção N-terminal sem adição de aminoácidos espassadores, esta abordagem não prejudicou a conformação da proteina ROP² dentro da quimera, pois a mesma foi reconhecida por soro de bovino infectado naturalmente.

Simmons et al., (2001a) avaliou produtos microbianos com moduladores para ativar a imunidade adaptativa, entre as quais a subunidade B da enterotoxina termolábil de E. coli, a qual apresentou melhor resultado. A LTB é uma molécula que apresenta diversas propriedades biológicas, uma destas é a capacidade imunomoduladora utilizada em formulações como adjuvantes de mucosa, transcutâneo ou parenteral (DE HAAN et al., 1998; WELTZIN et al., 2000; CONCEIÇÃO et al., 2006; PITCOVSKI et al., 2006).

Estudos anteriores demonstraram que ROP², pesentes em diferentes quimeras, foi capaz de induzir resposta imune 100% protetora contra desafio letal. Os grupos vacinados com quimeras contendo ROP² não apresentaram diferenças

significativas na produção de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a, porém a IL-4 foi altamente estimulada, após o desafio com taquizoitos, sendo observado uma acentuada produção de IFN-γ, sugerindo que o perfil imunológico Th2/Th1 induzido pelas quimeras foi suficiente para proteção. Estes resultados foram obtidos utilizando como adjuvante saponina (MONNEY et al., 2011).

A LTB é um potente adjuvante de mucosa, capaz de estimular resposta imune celular, com ativação de células T citotóxicas (SIMMONS et al., 2001b) e humoral, estimulando a produção de anticorpos de forma sistêmica contra antígenos fusionados (CONCEIÇÃO et al., 2006; ROCHA et al., 2008). Desta forma, a rROP²/LTB é uma molécula importante para um estudo de imunoproteção contra N. caninum.

Neste estudo foi construído quimqre composta pela porção mais imunogênica da roptria 2 de N. caninum, ROP², presente nas glândulas do complexo apical do parasito, e LTB, um adjuvante com propriedade não apenas de aumentar a resposta imune, mas de modulá-la, direcionando para ampla imunidade humoral e celular. Desta forma, rROP²/LTB mostra ser uma imprtante candidata a uma vacina recombinante de subunidade contra neosporose e será brevemente testada, em camundongos e bovinos, sob administrações por diferentes vias (nasal, muscular, subcutânea e vaginal) e doses, para avaliação do padrão de imunidade induzido e sua resposta ao desafio com a cepas NC-1 de N. caninum.

6 CONCLUSÃO GERAL

 As estratégias de clonagem adotadas no presente estudo para a obtenção do plasmídeo recombinante pAE-ROP²/LTB são eficazes;

 A caracterização antigênica por Western blot evidencia a identidade das subunidades ROP² e LTB, mostrando que a fusão realizada conserva epítopos antigênicos, reconhecidos por soro bovino positivo para N. caninum por IF e anticorpos contra toxina colérica.

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