UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
GILBERTO SANTOS CERQUEIRA
EFEITOS FARMACOLÓGICOS E POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO DA HECOGENINA EM MODELOS ANIMAIS DE LESÃO GÁSTRICA
GILBERTO SANTOS CERQUEIRA
EFEITOS FARMACOLÓGICOS E POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO DA HECOGENINA EM MODELOS ANIMAIS DE LESÃO GÁSTRICA
Tese apresentada à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Orientadora:
Profa. Dra. Glauce Socorro Barros Viana Co-orientadora
Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde C394a Cerqueira, Gilberto Santos.
Atividade gastroprotetora do Hecogenina em modelos de lesão gástrica aguda / Gilberto Santos Cerqueira. – 2012.
193 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2012.
Orientação: Profa. Dra. Glauce Socorro Barros Viana.
1. Agave. 2. Úlcera Gástrica. 3. Etanol. I. Título.
GILBERTO SANTOS CERQUEIRA
EFEITOS FARMACOLÓGICOS E POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO DA HECOGENINA EM MODELOS ANIMAIS DE LESÃO GÁSTRICA
Tese apresentada a Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmacologia como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Aprovada em 14 / 12 / 2012
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________ Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________________________ Profª. Dr. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal (Co-orientadora)
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________________________ Profª. Drª. Gerly Anne de Castro Brito
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________________________ Profª. Dr. Pedro Marcos Gomes Soares
Universidade Federal do Ceará
______________________________________________________________ Profa. Dra. Caden Souccar
Universidade Federal de São Paulo
______________________________________________________________ Profª. Dr. Saulo Rios Mariz
Dedico,
À Deus em nome de Jesus Cristo, pela saúde e força.
“Glorificai a Deus no vosso Corpo e no vosso Espírito, os quais pertencem a Deus”
Aos meus pais Severino e Lourdes Cerqueira
(In memorian)
Pelo Amor, incentivo e apoio.
A minha Esposa Ana Paula
Minha musa inspiradora, uma mulher
encantadora pela paciência, conselhos
dedicação a mim e a nossa filha
A minha filha Giovanna Maria, presente de
Deus fonte das minhas lutas
As minhas irmãs Elzeni e Suzana que aos 11 anos tornaram-se minha mãe e que me proporcionaram a oportunidade de estudar.
À MESTRE
Profa. Dra. Glauce Viana,
Pelos ensinamentos, conselhos e críticas
À MESTRE
Profa. Dra. Gerly Anne Brito,
AGRADECIMENTOS
Á Deus, pela minha fortaleza conhecedora das minhas virtudes é constante fonte de toda a coragem e motivação para superar as dificuldades.
Aos meus familiares, aos meus pais Severino José e Lourdes; aos meus irmãos Suzy, Chuca, Gaspar, Roberto e Paulo; pela força e confiança que me deram em todos os momentos de minha vida.
Aos meus pais, Severino José de Cerqueira e Lourdes Santos Cerqueira (In Memorian), pelo apoio, carinho, incentivo durante esses anos e por terem permitido sair cedo de casa trabalhar e estudar.
À minha Esposa Ana Paula Fragoso Cerqueira (Painha) e minha filha Giovanna Maria (Nega Tingolé) pelo amor, carinho, compaixão, amizade e fraternidade e por agüentarem todos esses anos.
Á minha orientadora, Profª. Drª. Glauce Socorro de Barros Viana, não somente por ter me aceitado como orientando, mas por acreditar em mim e ter confiado no meu potencial, mesmo diante de diversas circunstâncias e desafios.
A minha querida Professora e Conselheira Profª. Drª. Gerly Anne de Castro Brito, pela ajuda, orientação, conselhos, amizade e por ter proporcionado grande parte dos resultados histopatológicos.
Á Profª. Drª. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal pelas orientações, conselhos e paciência durante a pós-graduação.
À Profª. Drª. Renata Carvalho Leitão por ter aceitado participar da minha banca examinadora de qualificação, pelos conhecimentos, orientações, paciência, e pela excelente contribuição de forma tão essencial para o enriquecimento deste trabalho.
À todas outras professoras do Laboratório de Neurofarmacologia, profª. Francisca Cléa Florenço de Sousa, profª. Danielle Silveira Macedo pelo apoio, orientações e conselhos e em especial a profª. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos pela oportunidade de ministrar aulas de farmacologia na graduação durante esses quatros anos.
Á doutora Caden Souccar pelo acolhimento e orientações durante a minha estada em seu Laboratório de Farmacologia Celular na Escola Paulista de Medicina (UNIFESP).
À Profª Drª. Tais Maria Bauab e seu aluno Leonardo Gordula da UNESP Araraquara pelo teste de atividade contra Helicobacter pylory.
Ao Saulo Mariz, pelo apoio científico, moral, espiritual, carinho nos momentos de sofrimento, na quais que mesmo a distância nos apoiou.
Aos colegas do laboratório NEMPI Josiane, Elilce, Andrea e Socorro que participaram da realização dos experimentos histopatológicos, nos auxiliando em tudo que era necessário.
Aos demais amigos de laboratório Alyne Mara, Kelly Rose, Eduardo, Sarah, Leonardo, Giuliana, Charliane, Taciana, Rafael, Danilo, Junia, Caca, Rufino, Eduardo, Edna, Valdécio pelo convívio agradável e colaborações em muitos momentos.
Aos funcionários e amigos do laboratório Vilani, Arnaldo e Vandinha (LAFICA) sempre presentes e dispostos a ajudar.
Às secretarias Aura e Márcia, por agüentar os aperreios e por serem amigas sempre dispostas a nos ajudar.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Ana Paula, Alana, Fernando, Haroldo.
Aos técnicos de laboratório do Laboratório de Plantas Medicinais da UNIFESP Celso, Alex, Mador, Camila em especial a Vilma pelo apoio na realização dos experimentos.
Aos queridos bolsistas e voluntários envolvidos nesse projeto Gabriela, Raoni, Junia, Susie, Josimar, Aline Monte, Mailson e Victor pela dedicação e colaboração inestimáveis, além da agradável relação ensino-aprendizagem;
Ao Laboratório de Oncologia Experimental, em particular aos Professores Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, e ao Dr. Hemerson Yuri ,pelo apoio nos estudos de toxicidade in vitro.
A coordenadora do Programa de Pós-graduação em Farmacologia Professora Drª Letícia Veras pelos conhecimentos e ajuda durante o doutorado.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Cirurgia, Patologia, Saúde Coletiva, Educação e Ciências Médicas que contribuíram para minha formação acadêmica.
À CAPES (PROEX) e CNPq pelo apoio financeiro importantíssimo no desenvolvimento deste trabalho.
"Antes de julgar a minha vida ou o meu caráter... calce os meus sapatos e percorra o caminho que eu percorri, viva as minhas tristezas, as minhas dúvidas
e as minhas alegrias. Percorra os anos que eu percorri, tropece onde eu tropecei e levante-se
assim como eu fiz. E então, só aí poderás julgar. Cada um tem a sua própria história. Não compare a sua vida com a dos outros. Você não sabe como foi o caminho que eles tiveram que trilhar na vida”.
RESUMO
Este estudo investiga os efeitos gastroprotetores da hecogenina, uma saponina esteróide, isolada de Agave sisalana, em modelos experimentais de úlcera gástrica. Camundongos Swiss machos foram utilizados nos modelos de úlcera gástrica induzida pelo etanol e indometacina. Para identificarmos os mecanismos de ação da hecogenina, os papéis de óxido nítrico (NO), do grupos sulfidrilicos não protéicos (GSH), dos canais de K+ ATP e das prostaglandinas foram também investigados assim como determinações da peroxidação lipídica (TBARS) e dos níveis de nitrito no estômago de animais tratados com hecogenina e de grupos controle foram realizadas. Além disso, foi avaliado o efeito da hecogenina sobre a contagem de mastócitos, bem como sobre a liberação da mieloperoxidase (MPO), um biomarcador de inflamação foram estudados em neutrófilos humanos in vitro. Foram avaliados a atividade antimicrobina para o Helicobacter pylori e a expressão de COX-2, TNF-α, IL-1 , óxido nítrico sintase induzida (iNOS), NF-kB-p50 NLS (sequência de localização nuclear) através da técnica de imunohistoquímica em modelo de úlcera gástrica agudo e crônico. Os nossos resultados mostraram que a hecogenina (15, 30,60 e 90 mg/ kg, p.o.) administrada de forma aguda, antes do etanol ou indometacina, exibiu um potente efeito gastroprotetor, bem como reduziu o número de mastócitos. Embora os pré-tratamentos com L-NAME, um inibidor de iNOS, e capsazepina, um agonista do receptor TRPV1, não foram capazes de reverter o efeio da hecogenina, este foi revertido por glibenclamida, um bloqueador de K+ATP e por indometacina no modelo de úlcera induzida por etanol. O pré-tratamento com hecogenina reduziu de modo significativo os níveis de GSH, peroxidação lipídica e nitrito no modelo de lesão gástrica induzida por etanol. A droga por si só aumentou a expressão de COX-2, e este efeito foi ainda melhor na presença de etanol tendo diminuido também a liberação de MPO. A hecogenina não demonstrou efeitos significativos sobre o modelo de ligadura do piloro e trânsito intestinal em camundongos. No modelo crônico, o tratamento com a hecogenina foi capaz de melhorar a cicatrização de úlceras gástricas induzidas pelo ácido acético promovendo significativa regeneração da mucosa gástrica. Ademais, hecogenina 90 mg/Kg diminuiu a marcação imunohistoquímica para TNF-α, NOSi, IL-1 , NF-kB-p50 NLS na mucosa gástrica tanto em experimento agudo como no crônico. Em conclusão, os resultados obtidos indicam que a hecogenina possui atividade gastroprotetora em modelos agudo e crônico e capacidade de promover cicatrização de úlcera da mucosa gástrica. Além disso, demonstramos que a hecogenina apresenta um efeito gastroprotetor significativo que parece ser mediado pela abertura de canais de K+ATP pela via COX- 2/PG. Além disso, as propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias podem desempenhar um papel no efeito gastroprotetor da droga. Constata-se também que o efeito anti-úlcera pode ser devido às suas propriedades de aumentar o mecanismo de defesa da mucosas e através da supressão da inflamação mediada por TNF-α, NOSi, IL-1 , NF-kB.
Palavras-chave: Agave sisalana; Gastroproteção; Hecogenina; Produtos Naturais. Saponina esteróidal; Ulcera Gásrica.
ABSTRACT
This study investigates the gastroprotective effects of hecogenin, a steroid saponin isolated from Agave sisalana, on experimental models of gastric ulcer. Male Swiss mice were used in the models of ethanol- and indometacin-induced gastriculcer. To clarify the hecogenin mechanism of action, the roles of nitric oxide (NO), sulfhydryls (GSH), K+ATP channels and prostaglandins were also investigated, and measurements of lipid peroxidation (TBARS assay) and nitrite levels in the stomach of hecogenin-treated and untreated animals were performed. Furthermore, the effects of hecogenin on myeloperoxidase (MPO) release from human neutrophils were assessed in vitro. Our results showed that hecogenin (3.1, 7.5, 15, 30, 60 and 90 mg/kg, p.o.) acutely administered, before ethanol or indomethacin, exhibited a potent gastroprotective effect. Although the pretreatments with L-NAME, an iNOS inhibitor, and capsazepine, a TRPV1 receptor agonist, were not able to reverse the hecogenineffect, this was reversed by glibenclamide, a K+ATP blocker, and indomethacin in the model of ethanol-induced gastric lesions. The hecogenin pretreatment normalized GSH levels and significantly reduced lipid peroxidation and nitrite levels in the stomach, as evaluated by the ethanol-induced gastric lesion model. The drug alone increased COX-2 expression and this effect was further enhanced in the presence of ethanol. It also decreased MPO release and significantly protected the gastric mucosa. In conclusion, we showed that hecogenin presents a significant gastroprotective effect that seems to be mediated by K+ATP channels opening and the COX-2/PG pathway. In addition, its antioxidant and anti-inflammatory properties may play a role in the gastroprotective drug effect.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Divisão anatômica do estômago e desenho mostrando elementos da mucosa gástrica...
20 Figura 2. Fisiopatologia da úlcera gástrica... 31 Figura 3. Agave sisalana... 42 Figura 4. Estrutura química da hecogenina... 46 Figura 5. Efeito da Hecogenina sobre a área ulcerada no modelo de indução de úlcera por etanol...
71 Figura 6. Efeito da hecogenina sobre a mucosa gástrica de camundongos submetidos às lesões gástricas induzidas por etanol pré-tratados ou não com hecogenina...
75 Figura 7. Efeito da hecogenina sobre número de mastócitos na mucosa gástrica de
camundongos submetidos às lesões gástricas induzidas por etanol pré-tratados ou não com hecogenina... 76 Figura 8. Efeito da hecogenina sobre contagem de mastócitos na mucosa gástrica de camundongos submetidos às lesões gástricas induzidas por etanol pré-tratados ou não com hecogenina... 77 Figura 9. Envolvimento do Óxido Nítrico (NO) no efeito gastroprotetor associado a
hecogenina em modelos de úlcera induzida por etanol absoluto em camundongos... 79 Figura 10 Fotomicrografias de imunohistoquímica para NOSi de estôamgos de
camundongos... 83 Figura 11. Envolvimento dos canais de potássio ATP-dependentes (K+ATP) na gastroproteção induzida por hecogenina no modelo de úlcera induzida por etanol absoluto em camundongos... 85 Figura 12. Envolvimento da síntese de prostaglandinas no efeito gastroprotetor associado à hecogenina no modelo de úlcera induzida por etanol absoluto em camundongos... 87 Figura 13. Efeito da hecogenina no índice de úlceras modelo de úlceras gástricas induzido pelo estresse hipotérmico...
91 Figura 14. Efeito da hecogenina sobre o número de úlcera no modelo de úlceras gástricas induzido pelo estresse hipotérmico...
Figura 17. Efeitos de hecogenina sobre a liberação e atividade da mieloperoxidase em
neutrófilos humanos estimulada por N-formil-metil-leucil-fenilalanina... 100
Figura 18. Efeito da hecogenina no transito intestinal de camundongos F1. Os resultados estão expressos como médias ± erro padrão das médias de 6 a 7 animais por grupos. ... 101
Figura 19. Figura imunohistoquímica para TNF-... 103
Figura 20. Fotomicrografias de imunohistoquímica para COX-2 de estômagos de camundongos... 104
Figura 21. Efeito da hecogenina sobre contagem de células positivas imunocoradas para COX-2, (3 animais de cada grupo)... 107 Figura 22. Figura imunohistoquímica para IL1- ... 109
Figura 23. Figura imunohistoquímica para NFkB... 111
Figura 24. Efeito gastroprotetor da hecogenina no modelo de lesões gástricas crônicas induzidas por ácido acético a 20% em ratos... 113
Figura 25. Aspecto Microscópico da mucosa gástrica de ratos tratados durante 8 dias com solução salina operados porém sem indução de úlcera gástrica ou seja grupo sham (A e B) ou mucosa gástrica de ratos submetidos úlcera crônica por ácido acético a 20% 115 Figura 26. Fotomicrografia de imunohistoquímica para NOSi... 119
Figura 27. Fotomicrografia de imunohistoquímica para TNF-α... 121
Figure 25. Aspecto Microscópico da mucosa gástrica de ratos tratados durante 8 dias 125 Figura 26. Fotomicrografia de imunohistoquímica para NOSi ... 119
Figura 27. Fotomicrografia de imunohistoquímica para TNF-α... 121
Figura 28. Fotomicrografia de imunohistoquímica para IL-1 ... 123
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Determinação do índice de lesões gástricas induzidas por indometacina segundo SZABO et al. (1985)...
62
Tabela 5. Escores das alterações histopatológicas na mucosa gástrica de camundongos submetidos às lesões gástricas induzidas por etanol pré-tratados ou não com hecogenina e NAC... 74 Tabela 6. Efeito da hecogenina sobre a concentração de nitrito/nitrato... 82
Tabela 7. Papel dos Receptores Vanilóides (TRPV1), no efeito gastroprotetor da hecogenina em modelos de lesões gástricas induzidas pelo etanol em camundongos... 90 Tabela 8. Efeito da hecogenina (10, 30 e 100 mg/Kg) sobre a secreção ácida gástrica... 93 Tabela 9. Efeito da hecogenina sobre os níveis de grupos sulfidrílicos não-protéicos
(NP-SH), e peroxidação lipídica (MDA) em modelo de lesões gástricas induzidas por etanol em camundongos... 99 Tabela 10. Análise microscópica dos estômagos de ratos submetidos ao modelo de
ulcera crônico induzido pelo ácido acético a
LISTA DE SIGLAS
5-HT Serotonina
ADP Adenosina Difosfato
AINE Antiinflamatório não esteroidal ALT Enzima Alanina Aminotransferase ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AST Enzima Aspartato Aminotransferase ATP Adenosina trifosfato
BSA Albumina sérica bovina
Cag Produtos associados ao gene da citotoxina CEPA Comitê de Ética Institucional
CGRP Calcitonin Gene-related Peptide COX Ciclooxigenase
DTNB ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzóico) ECL Enterocromafin like cell
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético EGF Fator de crescimento epidermal Egr-1 (fator de transcrição)
eNOS NOS endotelial (tipo 3)
EP1 Receptor de Prostaglandina tipo 1 EP3 Receptor de Prostaglandina tipo 3 EP4 Receptor de Prostaglandina tipo 4 EPM Erro Padrão da Média
ERO Espécie Reativa de Oxigênio EUA Estados Unidos da América
g Grama
GR Glutationa Redutase GS Glutationa Sintase GSH Glutationa reduzida GSH-px Glutationa Peroxidase GSSG Disulfeto Glutationa
h Hora
H2R Receptor Histamínico tipo 2 HECO Hecogenina
HE Hematoxilina-eosina i.p. Intraperitoneal
ICAM Molécula de adesão intracelular IL Interleucina
IP Receptor de Prostaglandina I KATP Canais de Potássio sensíveis a ATP
Kg Kilograma
L-NAME NG-Nitro-L-arginina-metiléster M3R Receptor colinérgico muscarínico M3 MALT (linfoma)
MAPK p38 Mytogen activated protein kinase mRNA Ácido ribonucléico mensageiro NAC N-acetilcisteína
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NF-kB Fator nuclear κB
nm Nanômetro
nNOS NOS neuronal (tipo 1)
NO Óxido Nítrico
NOS Óxido Nítrico Sintetase NOS-II NOS indutível
NSAID Nonsteroidal anti-inflammatory drugs p Nível de significância
CYP2B1 Sub-família 2B, citocromo p450 PBS Tampão fosfato
PG Prostaglandina PGD2 Prostaglandina D2 PGE2 Prostaglandina E2 PGF2 Prostaglandina F2 PGI2 Prostaglandina I2
pH Potencial hidrogeniônico PKG Proteínas Quinases G rpm Rotação por minuto SOD Superóxido Dismutase TGI Trato Gastrointestinal TNF Fator de necrose tumoral
TRPV1R Receptor de Potencial Transiente Vanilóide 1 UFC Universidade Federal do Ceará
v.o. Via oral
VacA Citotoxina Vacuolizante A
VEGF Fator de crescimento derivado do endotélio VGCC Canais de Cálcio Voltagem Dependentes
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 20
1.1 Anatomia e fisiologia do Estômago... 20
1.2 Mecanismos da secreção ácida gástrica... 22
1.2.1 Barreira Muco-Bicarbonato... 23
1.2.2 Microcirculação... 24
1.2.3 Neurônios sensíveis à capsaicina e a proteção gástrica... 25
1.2.4 Prostaglândinas... 26
1.2.5 Óxido Nítrico (NO)... 27
1.2.6 Canais de Potássio ATP dependentes... 28
1.2.7 Sistema Antioxidante... 29
1.3 Fisiopatologia da Úlcera Péptica... 31
1.4 Papel dos citocinas inflamatórios na úlcera gástrica ... 32
1.5 Helicobacter pylori……… 38
1.6 Farmacoterapia da úlcera péptica... 40
1.7 Produtos naturais na proteção gástrica... 42
1.8 Agave sisalana e hecogenina... 43
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA... 48
3 OBJETIVOS... 49
3.1 Objetivo Geral... 50
3.2 Objetivos Específicos... 51
4 MATERIAIS... 52
4.1 Drogas e reagentes... 53
4.2 Animais ... 55
5 MÉTODOS... 56
5.1 Investigação dos mecanismos gastroprotetores do hecogenina no modelo de lesão gástrica induzida por etanol... 57
5.1.1 Estudo do envolvimento do óxido nítrico (NO)... 58
5.1.2 Efeito sobre expressão da iNOS... 59
5.1.3 Investigação do papel dos canais de potássio dependentes de ATP (KATP)... 60
5.1.4 Investigação do papel das prostaglandinas (PGs)... 60
5.1.6 Efeito protetor do Hecogenina na lesão gástrica induzida por Indometacina: curva
dose-resposta...
62
5.1.7 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol... 62
5.1.8 Lesões gástricas induzidas por estresse hipotérmico... 63
5.2 Ligadura do piloro em camundongos... 63
5.3 Papel dos grupos sulfidrílicos não-protéicos (NP-SH) no efeito antioxidante e gastroprotetor da hecogenina em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos... 64
5.4 Liberação de mieloperoxidase a partir de PMA-estimuladas neutrófilos humanos in vitro papel da Mieloperoxidase (MPO) no efeito antioxidante da hecogenina... 65
5.5 Papel da lipoperoxidação no efeito antioxidante e gastroprotetor da hecogenina em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos... 65
5.6 Análise da expressão de citocinas pró-inflamatórias... 65
5.6.1 Análise da expressão de citocinas pró-inflamatórias ... 65
5.6.2 Avaliações da atividade anti-ulcerogênica em modelo de úlcera crônica 67 5.6.3 Imunohistoquímica para TNF-α, IL-1, COX-2, NOSi e NFB para ulcera induzida por ácido acético... 68
5.6.4. Avaliações da atividade antimicrobiana contra Helicobacter pylory... 69
5.7 Análise Estatística... 70
6 RESULTADOS... 72
6.7 Avaliação do envolvimento da síntese de prostaglandinas no efeito gastroprotetor da hecogenina no modelo de úlcera induzida por etanol absoluto
88
6.8 Efeito gastroprotetor do Hecogenina no modelo de lesão gástrica induzida por etanol
em camundongos independe da ativação dos receptores TRPV1 nos neurônios
aferentes... 90
6.8 Hecogenina reduz as lesões gástricas induzidas por estresse hipotérmico... 92
6.9 Hecogenina inibe a redução dos níveis de glutationa reduzida (GSH) na mucosa gástrica de camundongos com lesão gástrica induzida por etanol... 92
6.9 Hecogenina não altera a atividade anti-secretória gástrica no modelo de ligadura do piloro em camundongos... 94
7.0 Hecogenina reduz as lesões gástricas induzidas pelo etanol acidificado... 95
7.1.1 Hecogenina reduz de forma dose-depedente às lesões gástricas induzidas por Indometacina em camundongos... 97 7.1.2 Hecogenina aumenta os níveis de NP-SH e diminui a peroxidação lipídica (MDA) em modelo de lesões gástricas induzidas por etanol em camundongos... 99 7.1.3 Hecogenina reduz a atividade da Mieloperoxidase (MPO)... 101
7.1.4 Hecogenina não altera a motilidade intestinal em camundongos... 103
7.1.5 Análise da expressão de citocinas pró-inflamatórias e da expressão de enzimas induzidas pelo processo inflamatório agudo 104 7.1.6 Tratamento com Hecogenina aumenta a imunomarcação para COX-2 na mucosa gástrica de camundongos com lesão gástrica induzida pelo etanol... 106
7.1.7 Tratamento com Hecogenina diminui a imunomarcação para IL-1, na mucosa gástrica de camundongos com lesão gástraica induzida pelo etanol... 109
7.1.8 Tratamento com Hecogenina diminui a imunomarcação para NFB, na mucosa gástrica de camundongos com lesão gástraica induzida pelo etanol... 111
7.1.9 Hecogenina reduz as lesões gástrica induzida pelo ácido acético em modelo de úlcera crônica induzida pelo ácido acético a 20%... 113
7.1.10 Hecogenina reduz os escore das lesões histopatológica da mucosa gástrica de ratos tratados com ácido acético a 20%... 115
7.1.11Hecogenina demonstra atividade anti-Helicobacter pylory in vitro... 118
8 DISCUSSÃO... 155
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 156
1 INTRODUÇÃO
1.1Anatomia e fisiologia do estômago
O estômago está entre os primeiros órgãos a serem descritos por sacerdotes, médicos e anatomistas, havendo sido estudado funcionalmente pelos alquimistas, químicos e fisiologistas (ROSENFELD, 1985; MODLIN, 1990; SOYBEL, 2005).
O estômago localizado no epigástrio do abdômen, à esquerda da linha mediana do plano sagital mediano, situando-se caudalmente ao esôfago e cranialmente ao duodeno. É anatomicamente dividido em cárdia, fundo, corpo, antro e piloro (WILLARD, 1995; STURGES, 2001). O cárdia situa-se na junção do esôfago com o estômago e tem por função permitir a passagem de alimento e de água para o interior do estômago, e de impedir o refluxo gastroesofágico. Tanto o corpo quanto o fundo armazenam alimento e água, e podem dilatar-se para acomodar o material alimentar. Além disso, o corpo dilatar-secreta enzimas digestivas juntamente com ácido clorídrico (HCl). O antro é responsável pelo fracionamento mecânico do alimento e o piloro constitui-se em válvula muscular que limita as dimensões das partículas eliminadas para o duodeno e ajuda a evitar o refluxo gastroduodenal (WILLARD, 1995).
A parede do estômago é composta de quatro camadas: mucosa, submucosa, muscular e serosa (DYCE et al., 1990). As anastomoses ocupam toda a região da camada submucosa do estômago, entre a camada muscular e a mucosa, sendo formadas por plexos entre pequenas artérias e também entre capilares e realizando interconexões entre os mesmos (WOMACK, 1969; PROKOPIW,1991; ARAUJO et al., 2007).
No fundo e no corpo do estômago, observa-se maior suprimento sanguíneo devido ao maior número de anastomoses, ao passo que, no antro e na curvatura menor, a rede basal consiste de pequenos capilares tortuosos que se originam de arteríolas, oriundas da submucosa. Esses capilares são estreitos e possuem menor diâmetro do que em outras regiões do estômago. São mais separados entre si e apresentam poucas anastomoses entre os capilares ascendentes (PROKOPIW, 1991).
No estomâgo, cada curvatura apresenta uma dobra reentrante e, ao longo de sua curvatura menor, é distinto um entalhe, a incisura angularis, que é produzida pelo arranjo das fibras musculares involuntárias da parede do estômago (CASTRO, 1985; ELLIS, 2011). As várias partes do estômago (Figura 1) são bem definidas, possuem diferenças fisiológicas e são utilizadas pelo endoscopista, radiologista ou cirurgião, na localização das patologias gástricas (ELLIS, 2011).
Figura 1. Divisão anatômica do estômago e desenho mostrando elementos da mucosa gástrica.
A barreira que protege a mucosa de autodigestão pelo suco gástrico é um dinâmico sistema de multicomponentes. A camada epitelial fornece uma barreira permeável, podendo reparar rapidamente danos superficiais, por um processo de migração celular, correspondendo à reepitelização ou reconstituição (ESTIVALLET et al., 1998) .
A vascularização abundante propicia um suprimento de bicarbonato (HCO3-) por transporte transcelular e/ou difusão na camada de muco (ALLEN et al, 1993). O muco gel atua como barreira física contra a pepsina luminal e fornece uma camada estável que possibilita, na superfície, a neutralização do ácido pelo HCO3-. O muco secretado pela superfície das células epiteliais e das células mucosas possui uma importante função como lubrificante; uma armadilha para micróbios (WALLACE, 1989).
O muco é considerado por Zaterka (1993) como um fator defensivo pré-epitelial, recobrindo o epitélio de revestimento juntamente com o bicarbonato secretado pelas células de revestimento e com os fosfolipídios, dispostos logo acima da membrana celular, responsáveis pela propriedade hidrófoba da superfície. O muco existe sob duas formas: o aderente e o solúvel.
Uma das funções da camada de muco que reveste o sistema gástrico é o recolhimento de radicais livres altamente reativos derivados de oxigênio. Esse evento fornece proteção antioxidante para as camadas abaixo das células mucosas epiteliais, impedindo as lesões oxidativas. Quando o muco que recolhe as espécies ativas é fragmentado, há redução da viscosidade e das propriedades gel. Sob condições normais, a secreção de muco recuperaria essa perda. As células das camadas inferiores seriam somente danificadas por uma forte agressão externa (HALLIWELL; GUTERRIEDGE, 1989).
1.2 Mecanismos da secreção ácida gástrica
Dos órgãos que compõem o tubo digestivo, o estômago exerce papel de reservatório de alimento. Este sofrerá aí redução de tamanho em partículas menores, através da digestão que é sua mistura com o suco gástrico (PAPINI-BERTO; BURINI, 2001).
gástrica, a produção de ácido é o componente único e central da contribuição do estômago para o processo digestivo (RAMSAY; CARR, 2011).
A fisiologia do ácido gástrico é um processo complexo que envolve o nervo parassimpático vago e uma variedade de hormônios, incluindo a gastrina, histamina, somatostatina e prostaglandinas (MERCER; ROBINSON, 2011).
Os principais agentes que estimulam a secreção ácida incluem a gastrina, a acetilcolina e a histamina. A inibição é feita por somatostatina, fatores de crescimento epidérmico (EGF) e pelas prostaglandinas E2 e I2; estas últimas também estimulam as células superficiais a produzirem muco e bicarbonato (AIRES, 2008; GUYTON, 2006).
As mucosas do corpo gástrico e, em menor medida, do fundo contêm as células parietais. Uma função da célula parietal é produzir o ácido gástrico, ativando a partir de pepsina o pepsinogênio; este ultimo auxilia a digestão da proteína e diminui a colonização bacteriana do estômago e duodeno. Além disso, as células parietias produzem o fator instrínseco, essencial para absorção da vitmaina B12 no íleo (MERCER; ROBINSON, 2011).
1.3Mecanismo de Defesa da Mucosa Gástrica
1.3.1 Barreira muco/bicarbonato
Uma das importantes defesas das células epiteliais gástricas consiste na secreção de uma camada de muco. Células secretoras de muco são abundantes na superfície da mucosa gástrica. Íons de bicarbonato são secretados pelas células epiteliais gástricas e retidos no muco, formando um gel de proteção que mantém a superfície mucosa a um pH de 6-7, apesar de haver um ambiente muito mais ácido (pH 1.2) na luz do estômago (RANG et al., 2007). A secreção de bicarbonato é regulada por diversos fatores, tais como prostaglandinas, óxido nítrico, neurônios aferentes sensíveis a capsaicina, peptídeos e fatores neuronais (AIHARA et al., 2007).
acelerando a recuperação da mucosa lesada (MAITY et al., 2003). Em estudo realizados em ratos, observou-se uma relação inversa entre a espessura da camada de muco e a acidificação intracelular do epitélio gástrico (PHILLIPSON et al., 2002).
O muco também tem um importante papel na prevenção da agressão mecânica ao epitélio e fornece um microambiente sobre a área lesionada que é rapidamente restituída (WALLACE et al., 1986). Em combinação com o bicarbonato secretado pelas células epiteliais superficiais, o muco tem um importante papel na proteção gástrica contra a lesão induzida por ácido e pepsina (ALLEN et al., 1980). A secreção de muco e o bicarbonato são alguns dos recursos regulados pela síntese de prostaglandinas. Assim, os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES) podem reduzir a secreção de muco e o bicarbonato, aumentando assim a susceptibilidade da mucosa à lesão, isso ocorre devido a inibiação da biosintese de prostaglândinas (WALLACE, 2001).
1.3.2 Microcirculação
A microcirculação é a porção do leito vascular em que os vasos têm diâmetro interno médio inferior ou igual a 100 µm. A chamada unidade microcirculatória inclui arteríolas, arteríolas terminais, meta-arteríolas, capilares (precedidos ou não do esfíncter pré-capilar) e vênulas pós-capilares (AGUIAR et al., 2007).
O estudo da microcirculação, desde o início do século passado, vem permitindo a análise e diagnóstico de uma série de doenças que afetam a microcirculação, como diabetes mellitus e úlcera gástrica.
A microcirculação da mucosa gástrica é alterada pelos mediadores secretados pelos nervos sensoriais aferentes, localizados na mucosa e submucosa gástrica. A difusão de ácido ou toxinas para a mucosa gástrica resulta em uma elevação do fluxo sangüíneo, que é essencial para limitar os danos e facilitar a reparação celular (WALLACE; GRANGER, 1996).
A elevação do fluxo sanguíneo é importante ao prover bicarbonato para a secreção tamponante das células epiteliais e para drenar o excesso de ácido, em momentos em que a barreira protetora da mucosa é rompida, ocorrendo uma redifusão de íons H+ para a mucosa (MAITY et al., 2003).
poderia comprometer a microcirculação gástrica (GUTH, 1992; LAINE et al., 2008). O sulfeto de hidrogênio (H2S), outro composto endógeno, também exerce efeito protetor da mucosa, similarmente ao NO, o qual reduz a expressão de fator de necrose tumoral alfa
(TNFα), diminui a aderência de leucócitos e inibe lesões induzidas por AINES (LAINE et al.,
2008).
1.3.3 Neurônios sensíveis à capsaicina e a proteção gástrica
A capsaicina, o ingrediente picante da pimenta vermelha, tem sido utilizada desde a antiguidade como um tempero, apesar da sensação de queimação associados com sua ingestão. Mais de 50 anos atrás, Nikolaus Jancsó descobriu que a capsaicina pode seletivamente estimular neurônios aferentes primários nociceptivos (HOLZER, 2004).
A investigação subsequente estabeleceu que as propriedades neurofarmacológicas da capsaicina eram devidas à ativação do receptor transiente potencial do tipo vaniloide 1 (TRPV1), expressa por neurônios aferentes primários que inervam o intestino e outros órgãos (HOLZER, 2004; IMMKE; GAVVA, 2006).
Esse tipo de receptor é sensível a capsaicina e também é ativado por calor nocivo, acidose e mediadores lipídicos intracelulares, tais como os produtos de lipoxigenase e anandamida (LEITE et al., 2011; IMMKE; GAVVA, 2006 ). Em animais, várias substâncias como a capsaicina, mostarda e ciclofosfamida, aplicadas a estruturas viscerais, podem provocar dor e comportamentos relacionados, envolvendo capsaicina nos neurônios aferentes primários. Essas substâncias são capazes de induzir dor, bem como reação inflamatória, quando estimuladas (Leite et al., 2011).
A transmissão sináptica entre neurônios aferentes primários e neurônios do corno dorsal da medula espinhal é mediada principalmente por glutamato, atuando em receptores NMDA (N-metil-D-aspartato) e AMPA (α-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazoil ácido propiônico). Além disso, outras substâncias podem modular a transmissão na medula (ATP, prostaglandinas, substância P) (DOUBELL et al., 1999). Na medula, a transmissão dos sinais dolorosos, após a liberação dos neurotransmissores, envolve a participação de canais iônicos.
No estômago, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) está presente nos terminais periféricos dos nervos aferentes sensíveis à capsaicina e exerce ação protetora. Estas terminações nervosas e os mediadores estão envolvidos com a resposta protetora da mucosa ao ácido luminal, incluindo aumento do fluxo sangüíneo da mucosa e da secreção de muco e bicarbonato (DEMBINSKI et al., 2005; MEDEIROS, 2009).
A liberação de CGRP de neurônios sensoriais aferentes resulta na geração de NO, presumivelmente por células endoteliais que revestem as arteríolas submucosas (WALLACE; GRANGER, 1996), com um consequente aumento do fluxo sanguíneo, o que torna o estômago menos suscetível a danos (EVANGELISTA, 2006). Além disso, o CGRP liberado estimula a liberação de somatostatina pelas células D e, assim, inibe a secreção de histamina e gastrina, resultando em inibição da produção de ácido gástrico (KOMASAKA et al, 2002).
1.3.4 Prostaglandinas
As prostaglandinas (PGs) exercem efeitos inibitórios sobre a célula parietal; e a inibição da sua síntese pode resultar em um aumento da secreção ácida gástrica (WALLACE, 2001). As PGs unem-se ao receptor de PGE2 na célula parietal e ativam uma proteína G inibitória (Gi), que inibe a enzima adenilato ciclase. As PGs endógenas modulam a secreção ácida pelo bloqueio do aumento de AMPc, estimulado por histamina dentro da célula parietal (ATAY et al., 2000).
1.3.5 Óxido Nítrico
A descoberta do óxido nítrico (NO), como um mensageiro molecular para os vários sistemas do organismo de mamíferos, revolucionou as pesquisas acerca da extensão de sua atividade biológica (FLORA FILHO; ZILBERSTEIN, 2002). Desde então, um crescente número de pesquisas quanto à molécula NO, na fisiopatologia humana e animal, se tem desenvolvido (QUEIROZ; BATISTA, 1998).
O óxido nítrico é sintetizado por três enzimas: as sintases do óxido nítrico, presentes em vários órgãos, entre entre os quais o estômago, pulmões, narinas, seios paranasais e coração (BUSH, 2008). A sintase indutível do óxido nítrico (inductive nitric oxide synthase, iNOS) é induzida em várias células, pela exposição de citocinas pró-inflamatórias e endotoxinas (ANDRADE et al., 2010). O óxido nítrico é gerado a partir da reação entre L-arginina e O2, catalisada pela enzima óxido nítrico sintetase (NOS), utilizando NADPH e BH4 como cofatores (PALMER; FERRIGE; MONCADA, 1987). Três diferentes cDNAs codificam três distintas isoformas da NOS. A NOS neuronal (nNOS ou NOS tipo 1), identificada constitutivamente nos neurônios; a endotelial (eNOS ou tipo 3), identificada constitutivamente do endotélio vascular e plaquetas; e a forma induzida (iNOS ou tipo 2), que é induzida por citocinas e/ou endotoxinas em uma variedade de células, incluindo-se macrófagos, linfócitos T, células endoteliais, miócitos, hepatócitos, condrócitos, neutrófilos e plaquetas (MACMICKING et al., 1997; DUSSE et al., 2003).
O óxido nítrico (NO) possui funções metabólicas altamente ativas, principalmente na regulação das atividades cardiovasculares. O NO formado nas células endoteliais promove vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo, inibição da agregação e da adesão plaquetárias, redução da migração e adesão leucocitárias e diminuição da proliferação de células musculares lisas (TATSCH et al., 2011).
células epiteliais podem determinar os efeitos do NO na permeabilidade da mucosa e proteção (SHAH et al., 2004).
O NO atua ainda em sinergia com outros mediadores endógenos, como as prostaglandinas e os neuropeptídios, na proteção da mucosa gástrica, agindo de forma citoprotetora (TEPPERMAN; WHITTLE, 1992). Contudo, estudos mais recentes demonstram que o NO atua de maneira bifásica na resposta ulcerogênica da mucosa gastrointestinal, dependendo das isoformas da NOS, ou seja, o NO produzido pela NOS constitutiva apresentaria efeito protetor, e o NO originário da NOS induzível teria um efeito pró-ulcerogênico (NISHIO et al., 2006).
Estudos clínicos têm demonstrado que a coadministração de agentes doadores de NO com AINE pode proteger contra a indução da úlcera pelos AINE, e a combinação aos AINE de uma molécula que libere NO pode resultar em menos dano à mucosa, quando comparada com os tradicionais inibidores de COX, e podem até aumentar a reparação do tecido mucoso (SHAH et al., 2002).
1.3.6 Canais de Potássio ATP dependentes
Os canais de potássio sensíveís ao ATP (K+ATP) são canais de ligação importantes para a excitabilidade da membrana da célula, para seu estado celular bioenergético. São canais que se encontram normalmente fechados, somente entrando em ação na presença de baixos níveis de ATP. Supõe-se que sua abertura seja determinada pela diminuição da fosforilação oxidativa, o que os leva a funcionarem em condições fisiológicas adversas, como na isquemia miocárdica (BARBOSA et al., 2004).
Os canais de potássio foram identificados em vários tecidos, como o pâncreas, coração, fígado. Até mesmo no estômago alguns compostos, como o diazóxido, ativam e abrem os canais de potássio em diversos tecidos, causando hiperpolarização da membrana plasmática e redução da atividade elétrica (ASHCROFT; GRIBLLE, 2000; JAHANGIR et al., 2001). O diazóxido, no estômago, inibe as lesões na mucosa gástrica, induzidas por etanol, enquanto a glibenclamida, um agente hipoglicemiante oral que estimula a secreção de insulina por bloquear os canais de potássio ATP-dependente, aumenta as lesões gástricas (TOROUDI etal., 1999; GUEDES et al., 2008).
Os canais de KATP parecem estar envolvidos com o mecanismo de prostaglandinas endógenas e exógenas, vez que a gastroproteção promovida pelas prostaglandinas é inibida não apenas pela indometacina, mas também pela glibenclamida, uma droga inibidora dos canais de KATP (PESKAR et al., 2002).
1.3.7 Sistema Antioxidante
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são moléculas reduzidas, transitórias e altamente reativas, produzidas no caminho metabólico de transformação do oxigênio molecular (O2) a água (H2O) (MEHDY et al., 1996.). A partir da adição de um simples elétron, o oxigênio molecular é convertido ao radical ou ânion superóxido (O2.- ), um processo mediado, provavelmente, por peroxidases ou NAD(P)H oxidases associadas à membrana, ou mesmo por lipoxigenases, a partir de ácidos graxos e O2 (DOLATABADIAN; JOUNEGHANI, 2009)). O superóxido formado pode passar por reações de óxido-redução ou ser "dismutado" e regenerar O2 e peróxido de hidrogênio (H2O2), o que pode ocorrer espontaneamente em pH neutro ou pela ação da enzima superóxido dismutase. O H2O2 formado pode sofrer diferentes transformações: reduzido ao radical hidroxil (OH·); convertido a H2O e O2 pela ação da catalase; convertido a H2O pela oxidação de moléculas substratos, como o ascorbato, via peroxidases (WOJTASZEK, 1997; BALDO et al., 2011).
Em altas concentrações, devido a sua alta reatividade, as EROs causam lesões irreversíveis por meio de alterações oxidativas em lipídios, proteínas e no DNA. Suspeita-se que alterações nestas estruturas estejam ligadas ao desenvolvimento de várias patologias humanas, incluindo-se a úlcera péptica, morte celular e câncer (CUTLER, 2005; ALMONDES, et al., 2010). Para limitar os efeitos maléficos das EROs, um sistema antioxidante de alta performance composto por um sistema enzimático e não-enzimático pode interagir com EROs e regular sua produção, diminuindo-a a limites fisiológicos. Se esta defesa antioxidante for superada pela produção de EROs ou não suficientemente provida via dieta ou suplementação, ocorre o estresse oxidativo (CUTLER, 2005).
A degradação oxidativa é considerada como sendo um fator comum na patogênese de úlceras, por diferentes modelos experimentais e clínicos (SAIRAM et al., 2002). A atividade antioxidante foi descrita para vários produtos naturais como os triterpenos, tais como: α- e -amirina, ácido oleanólico, ácido ursólico e lupeol, entre outros compostos relacionados (ANDRIKOPOULOS et al., 2003.).
Exisem varias evidências indicando que as substâncias naturais de plantas comestíveis e medicinais demonstram atividade antioxidante forte que pode atuar contra a toxicidade gástrica por vários agentes tóxicos (MADUREIRA et al., 2011). Um mecanismo de defesa importante envolve as enzimas antioxidantes, incluindo-se o superóxido desmutase, catalase, e a glutationa, que convertem as moléculas de oxigênio ativo em compostos não-tóxicos (YEH et al., 2012).
Antioxidantes não-enzimáticos, tais como GSH, vitamina C e vitamina E, estão intimamente ligados um ao outro e têm um papel relevante na proteção da célula, a partir da peroxidação lipídica. O nível de esgotamento de GSH ocorre devido à eliminação de radicais tóxicos (HUANG et al., 2010). GSH atua como um antioxidante enzimático, tanto intracelularmente quanto extracelularmente, em conjunto com vários processos enzimáticos, reduzindo o peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos.
transitório, pois é reduzido rapidamente pela glutationa redutase (DICKINSON; FORMAN, 2002).
1.4 Fisiopatologia da úlcera péptica
Nas últimas décadas, a prevalência da doença ulcerosa péptica declinou no mundo ocidental. Entretanto, com incidência variando de 2 a 10/100.000 indivíduos, permanece como problema de saúde pública na sociedade moderna. A faixa de idade predominante na qual a úlcera duodenal ocorre é entre 20 e 50 anos, enquanto que a gástrica é mais comum em pacientes com mais de 50 anos (KOMEN et al., 2008; CASALI et al., 2012).
A úlcera péptica constitui desordem do trato gastrintestinal que afeta milhões de pessoas em todo o mundo e têm sido, há bastante tempo, uma das causas mais importantes de morbidade e mortalidade (BIRDANE et al., 2007). Apesar de grandes avanços na compreensão da doença, sua etiologia ainda não foi completamente elucidada. O conhecimento da fisiopatologia da úlcera gástrica permanece incompleto (GLAVIN E SZABO, 1992).
A úlcera gástrica é um processo multifacetado, incluindo a secreção de ácido, a produção de espécies reativas de oxigênio, a inibição das prostaglandinas e a degradação da matriz extracelular. As metaloproteinases de matriz (MMPs) têm a capacidade para clivar a matriz extracelular e remodelar? (RIOS et al., 2010; ROCHA et al., 2010; SONIS, 2008; GARAVITO; DEWITT, 1999; HAWKEY, 1999).
O epitelio gástrico possui um grande turnover de células: na manutenção de um equilíbrio bem regulado entre proliferação e apoptose, um rompimento desse equilíbrio é um passo inicial para um processo inflamatório ou uma neoplasia (MEEGAN et al., 2008).
Figura 2. Fisiopatologia da úlcera gástrica. Fonte Rios, 2010
1.5 Papel das citocinas inflamatórias na úlcera gástrica
Durante a patogênese da gastrite, o dano epitelial causado pela injúria celular inicial é seguido por produção local de citocinas, que conduz à inflamação, seguida de úlceração. Existem várias linhas de evidência que apontam para um componente inflamatório na úlcera gastroduodenal, com a produção de alguns mediadores inflamatórios, tais como: fator nuclear kB (NF-kB), ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina 1 beta (IL-1 ), IL-6 e factor de necrose tumoral α (TNF-α).
As prostaglandinas são produzidas, a partir de fosfolipídios da membrana celular, por uma cascata enzimática. O processo tem início com a conversão de fosfolipídios em ácido araquidônico, pela enzima fosfolipase A2. O ácido araquidônico, por sua vez, é convertido em prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos, a partir das enzimas ciclooxigenases (COX) (MELGAÇO et al., 2010; RANG et al., 2004).
descritos dois tipos de ciclooxigenases: a COX-1 (ou constitutiva) e a COX-2 (ou induzida). A COX-1 é expressa na maioria dos tecidos e regula os processos celulares normais, como a produção de muco protetor gástrico, a inibição da secreção gástrica, a homeostase vascular, a agregação plaquetária e a manutenção da homeostase renal (MELGAÇO et al., 2010).
A COX-2 é normalmente pouco detectada nos tecidos e costuma ser ativada nos processos inflamatórios, participando da ativação de mastócitos, macrófagos e células endoteliais. Também está presente no nível basal, em certos tecidos, mas sua expressão é sobrerregulada em resposta a estímulos inflamatórios ou mitogênicos (NASSAR et al., 2005). A COX-2 tem sua expressão inibida pelo uso de anti-inflamatórios não-esteroides e glicocorticóides (motivo pelo qual os corticóides têm potencial anti-inflamatório) (RAHMAN et al., 2006).
No entanto, descobertas recentes demonstram que a COX-2 desempenha papel biológico mais complexo e mais amplo do que o mero envolvimento na inflamação e na dor (PESKAR, 2001). Entre esses papéis ocorrem no processo de cura de úlcera gástrica, no desenvolvimento renal, regulação da homeostase no sistema cardiovascular, ovulação e implantação dos óvulos (SCHMASSMANN et al., 1998; PARENTE E PERRETTI, 2003). Mais recentemente, uma nova isoforma da enzima COX, a COX-3, tem sido relatada (CHANDRASEKHARAN et al., 2002), a qual é uma variante da enzima COX-1 (COX-1b), mas carece completamente das atividades normais da COX, que levam à produção de eicosanóides (BOTTING; AYOUB, 2005). A COX-3 parece ser expressa no cérebro e está envolvida no mecanismo de ação do paracetamol (KIS et al., 2005).
No desenvolvimento das úlceras gástricas, associadas ao uso de anti-inflamatórios não-esteróides (AINES), a inibição da COX-1 está ligada à diminuição do fluxo sanguíneo da mucosa, enquanto a inibição da COX-2 está relacionada com o aumento da aderência de leucócitos ao endotélio vascular local (WALLACE et al., 2000). Essas lesões estão relacionadas com aumento nos marcadores de infiltração de neutrófilos e intensa geração de radicais livres (SULEYMAN et al., 2009).
inibidores seletivos de COX-2 apresenta pouca ou nenhuma toxidade gástrica. A inibição da COX-1 e COX- 2, ao mesmo tempo, por drogas seletivas diferentes produz, porém, grandes lesões gástricas, com características semelhantes àquelas produzidas pelos AINES tradicionais não-seletivos. Esses achados sugerem que ambos os tipos de COX devem estar suprimidos para que ocorram as lesões gástricas características dos AINEs (anti-inflamatórios não-esteroidais) (WALLACE et al., 2000; TANAKA et al., 2001; TANAKA et al., 2002).
O papel da COX-2 na cicatrização de úlceras permaneceu debatido, ao longo dos anos, sendo ainda hoje inconclusivo. A cicatrização de úlceras é um processo ativo e complicado de reconstrução da arquitetura da mucosa, envolvendo o preenchimento do defeito da mucosa com proliferação e migração de células epiteliais e componentes conjuntivos (PERINI et al., 2003). Já as prostaglandinas desempenham um papel fundamental no desencadeamento da proliferação celular e promoção de angiogênese, juntamente com várias outras funções necessárias para restaurarem a integridade da mucosa. Portanto, as enzimas COX-1 e COX-2, sendo os arquitetos da síntese de prostaglandinas, tornam-se um alvo óbvio para as modalidades de tratamento de úlcera gástrica e continuam a prender a atenção de pesquisadores e clínicos.
tecido de granulação na úlcera gástrica crônica. Estas observações levaram à noção de que a inibição de COX-2 não está associada com os danos gástricos em mucosa normal, mas pode ser prejudicial quando a defesa da mucosa gástrica for prejudicada (SCHMASSMANN et al., 1998).
A visão recente é ainda apoiada nas pesquisas, que sugerem ser a COX-2 mais expressa durante a cicatrização de lesões gástricas, enquanto inibidores COX-2 específicos causam um atraso na cicatrização de úlceras em ratos, destacando o papel fundamental desta isoenzima na cura da úlcera gástrica (TSUJI et al., 2002; MOTILVA et al., 2005). Não podemos descartar também a participação de outras citocinas na modulação da úlcera gástrica, como o TNF-α, IL-1, IL-6, o fator de transcrição NFB e o Óxido Nítrico.
O fator de necrose tumoral-α (TNF-α) é uma citocina pró-inflamatória produzida por macrófagos, envolvida na patogênese de diversas doenças inflamatórias, assim como na resposta imunomediada a diversas infecções e processos inflamatórios (GOMES et al., 2012) O TNF-α é uma citocina com diversas funções imunológicas. Foi inicialmente identificado como um polipeptídio produzido por macrófagos durante infecções, doenças, cânceres, situações estas que contribuem para o desenvolvimento de caquexia. É também caracterizado por sua capacidade de induzir a necrose em células tumorais, de onde advém o nome fator de necrose tumoral (ROSE et al., 2004; PRADO et al., 2009).
No processo de atividade pró-inflamatória, entre as diferentes citocinas que são produzidas, o fator de necrose tumoral (TNF-α) se destaca, por ser um modelo de citocinas pró-inflamatórias com efeitos múltiplos sobre os sistemas imune inato, adaptativo, bem como no endotélio vascular e na microcirculação (SHAH; MAYER, 2010; SANTOS-JUNIOR, 2011). O fator de necrose tumoral estimula a fase de inflamação aguda, assim como a apoptose. Também aumenta a produção de outras citocinas, de pequenos peptídios, a secreção de elastase e colagenase, incrementa as propriedades de adesão molecular ao endotélio vascular e promove a acumulação de leucócitos no tecido (DANESE et al., 2005). Estas ações múltiplas definem a característica pleiotrópica do TNF-α, transformando-o em um alvo específico para o tratamento de doenças inflamatórias do trato gastrintestinal (SHIMIZU et al, 2000).
adição a seus efeitos pró-inflamatórios, o TNF-α também é uma citocina apoptótica (TUNG et al., 2011). A perda de controle da resposta inflamatória gástrica pode levar a um recrutamento de leucócitos inadequado para a mucosa do estômago e, por sua vez, para a lesão da mucosa gástrica. Ademais, o TNF-α se tem revelado por desempenhar um papel crucial na regulação da resposta imune e na promoção da liberação de outros mediadores pró-inflamatórios (HOLZER, 2001; PAVLICK et al., 2002).
Da mesma forma, a inibição da reação inflamatória diminui a geração de excesso de citoquinas pró-inflamatórias, como o TNF-α e iNOS derivada do NO, mediadores que realizam a defesa da mucosa gástrica e promovem a cicatrização da úlcera (SHIMIZU et al., 2000;. HOLZER, 2001).
A interleucina 1 (IL-1) é produzida por monócitos e macrófagos, tendo como principal atividade a de ser mediadora da inflamação associada ao TNF-α, de quem partilha muitas propriedades biológicas. Sua ação mais importante na inflamação se deve aos efeitos no endotélio, leucócitos e fibroblastos, bem como a indução das reações da fase aguda (ABBAS; LICHTMANN, 2005). No endotélio, a IL-1 induz várias mudanças, a maioria relacionada ao nível de transcrição de gene para síntese de: moléculas de adesão endotelial, atua como mediador químico para citocinas, fator de crescimento, óxido nítrico; aumenta a produção de enzimas associadas à remodelação de células da matriz; amplia a superfície trombogênica do endotélio e, quando associada ao TNF-α induz a resposta da fase aguda à infecção ou agressão tecidual (ABBAS; LICHTMANN, 2005). .
A família da IL-1 tem três membros muito bem estudados: dois agonistas - IL-1α e IL-1 - e o antagonista IL-1Ra. A IL-1Ra inibe a ação inflamatória induzida pela IL-1, ao bloquear a ligação de IL-1 ao receptor tipo I da IL-1 (IL-1RI) (DINARELLO, 1997; ARMAN et al., 2008). A interleucina 1, antagonista do receptor IL-1Ra, é uma molécula secretada, que se liga ao receptor 1, com avidez igual ou próxima daquela do agonista do receptor de IL-1. Destes agonistas, o IL-1 é uma citocina pró-inflamatória com vários efeitos biológicos, atuando como inibidor potente da secreção de ácido gástrico (SONIS, 2004; YEOH et al., 2008).
El-Omar et al. (2000) demonstram que as citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-1 (IL-1B -31 C +, IL-1B -511 e IL-1RN ) foram associadas a um aumento significativo, com risco de uma resposta crônica hipocloridrica na infecção por H. pylori e câncer gástrico, em uma população caucasiana, presumivelmente por alteração dos níveis de
IL-1 no estômago
O fator de necrose tumoral alfa e a interleucina 6 ( IL-6) são citocinas responsáveis pela eclosão de diversas alterações clínicas na sepse, como a febre ou hipotermia, as alterações funcionais, como oligúria, taquipnéia, hipoxemia, taquicardia, hipotensão, acidose láctica e coagulopatia, entre outras. A expressão de IL-11 aberrante em epitélio gástrico pode levar a desajuste, dessa forma interrompendo a sinalização e a expressão de genes proliferativos citoprotectores e a ruptura da regulação do equilíbrio proliferativo/apoptose, que pode predispor à carcinogênese (MEEGAN et al., 2008). A suprarregulação de genes pelo NFkB pode resultar também na produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e interleucinas IL-1 e IL-6 (MEEGAN et al., 2008; SONIS, 2004).
O NF-kB é um importante regulador da atividade de citocinas e outras defesas biológicas. É o fator de transcrição que tem sido implicado a desempenhar um papel de guardião, na patogênese de doenças inflamatórias (SONIS, 2008 ). Trata-se de um heterodímero de subunidades p50 e p65/RelA ou p52, no citoplasma das células. O heterodímero p65/p50 é considerado como sendo a forma clássica e, no seu estado inativo, é ligado aos membros da classe dos inibidores kB (IkB) de proteínas que inibem a activação do NF-kB (SONIS, 2004; SONIS, 2008; MEEGAN et al., 2008).
Por estimulação de um número de fatores de perturbação extracelulares, o dímero de NF-kB-IkB é sequencialmente fosforilado e ubiquinado por ativação de IKK (IkB quinase) e ubiquitina ligase. A forma ubiquinada é então degradada pelo proteosoma 26S. O NF-kB, em seguida, move-se a partir do citoplasma para o núcleo, onde pode ativar uma grande variedade de genes que desempenham um papel significativo na mucosa lesionada.
A ativação de NF-kB é induzida por uma variedade de agentes, incluindo bactérias, vírus, citocinas, estresse oxidativo, e eliminadores de radicais livres. A radiação ionizante e a quimioterapia estomatotóxica também são reconhecidas como ativadoras potentes e consistentes de NF-kB (SONIS, 2002).
lesão tecidual (FRANCISCO et al., 2006). A mesma é mediadora central da resposta de fase aguda e a principal citocina pró-coagulante, pois determina a produção e elevação das concentrações plasmáticas estimuladas pelo fígado de fibrinogênio, proteína amilóide A (SAA) e, em especial, da PCR (YUDKIN et al., 1999; VOLP et al., 2010)
Alguns estudos têm indicado que a infecção pelo H. pylori induz inflamação por vários mecanismos, entre eles o contato direto com as células epiteliais, a estimulação e a liberação de citocinas. Pacientes infectados pelo H. pylori apresentam altos níveis de expressão e produção de IL1-B, IL-6, IL-8 e TNF-α (EL-OMAR et al., 2000 ; LADEIRA et al., 2003).
Vários estudos relatam que o H. pylori ativa o gene NF-kB de células epiteliais da mucosa gástrica in vivo e in vitro. Este gene codifica um fator de transcrição que ativa a produção de interleucinas. A translocação nuclear de NF-kB é seguida do aumento da expressão de IL-8 (NAITO; YOSHIKAWA, 2002). A IL-8, potente ativadora de neutrófilos, tem seu nível de expressão gênica relacionado à intensidade da gastrite. In vitro, o H. pylori estimula a liberação de IL-8, e estes eventos requerem interação entre a bactéria e as células epiteliais da mucosa gástrica, que, através deste mecanismo, estimulam a quimiotaxia de neutrófilos (LADEIRA et al., 2003).
Vários trabalhos destacam a importância da expressão de interleucina-6 (IL-6) e da cicloxigenase-2 (Cox-2) na inibição de apoptose, em células da mucosa gástrica de pacientes infectados por H. pylori (LIN et al., 2001). Esta redução da morte celular por apoptose, acompanhada por hiperproliferação, pode levar ao acúmulo de mutações, contribuindo para a gênese do câncer gástrico (ISRAEL; PEEK, 2001).
1.6 Helicobacter pylori
Este agente é encontrado na camada de muco do estômago e em grupos acima das junções intercelulares do epitélio, e seu potencial patogênico também está relacionado à urease, mucinase etc. (COTRAN et al, 2000; MOBLEY et al, 2001; MURRAY et al, 2007). Os estudos epidemiológicos relacionados a esse tipo de infecção sugerem a disseminação oro-fecal como importante meio de transmissão e a prevalência varia entre 25 e 90%, aumentando com a idade. O H. pylori afeta 60% da população mundial e é reconhecido como o agente mais importante para a gastrite crônica, além de estar presente em 90% das úlceras duodenais e 70% das úlceras gástricas ( CAVERNA, 1997; CHEHTER et al., 2007). A infecção por H.pylori é considerada como um dos fatores mais importantes na patogênese de várias doenças gastrointestinais, no entanto, a maioria dos pacientes infectados permanece portadora assintomática por toda a vida e apenas 20% podem evoluir para uma doença gastrointestinal mais grave durante suas vidas (VINAGRE et al., 2011). A grande variabilidade nas manifestações clínicas de H.pylori está associada a vários fatores, incluindo fatores de virulência da bactéria, fatores ambientais e fatores genéticos ou uma combinação (DUNN et al., 1997; KUSTERS et al., 2006). Entre os fatores de virulência da bactéria estão as citotoxinas vacA e cagA, as quais estão associadas com patogenicidade bacteriana. Estudos realizados em vários países têm mostrado que os genes vacA do tipo s1m1 e cagA-positivo estão associados à formação de úlcera péptica grave (NOGUEIRA et al., 2001; DIXON et al., 1997).
O H. pylori parece ser capaz de iniciar e manter um estado crônico de lesão da mucosa gástrica. Pacientes com gastrite crônica e H. pylori geralmente melhoram ao serem tratados com agentes antimicrobianos, sendo as recorrências associadas ao reaparecimento desse microrganismo (COTRAN et al., 2000; MOBLEY et al., 2001).
1.7 Farmacoterapia da úlcera péptica
Os fármacos eficazes no tratamento da úlcera péptica devem basicamente agir quer reduzindo os fatores agressivos na mucosa gastroduodenal, quer aumentando a resistência da mucosa contra eles. O tratamento clínico da doença ulcerosa péptica mudou muito, desde 1970. Os avanços incluem a introdução de antagonistas de receptores H2, inibidores de bomba de próton, terapias de erradicação do Helicobacter pylori e abordagens endoscópicas para o tratamento de úlcera hemorrágica (WANG et al., 2010).
O uso generalizado de terapias anti-secretoras eficazes, incluindo inibidores da bomba de prótons, e de reconhecimento e sucesso da erradicação da infecção por H. pylori fizeram da úlcera péptica uma doença que pode ser curada com tratamento farmacológico, sem a necessidade de intervenção (VERMA; GIAFFER, 2002). Essa terapia tinha sido a forma dominante de terapia definitiva, mas agora está reservada para emergentes, com risco de vida ou em complicações da doença ulcerosa péptica, como sangramento, perfuração e obstrução.
A introdução de antagonistas dos receptores H2 e inibidores da bomba de prótons tem sido associada com um aumento na taxa de cura de úlceras, a despeito do conhecimento de que o uso prolongado destes medicamentos provoca efeitos secundários graves, tais como a hipergastrinemia, definida como um nível de gastrina sérica acima da faixa normal, e reduziu o pH no lúmen gástrico (ORLANDO et al., 2007). O sucesso dos tratamentos farmacológicos para evitarem ou curarem lesões ulcerativas não depende apenas de bloquear a secreção de ácido, mas também aumentando fatores de proteção da mucosa, incluindo as prostaglandinas, fatores de crescimento, somatostatina, óxido nítrico (NO) e grupos sulfidrilicos não-protéicos (SHs) (TSUKIMI et al., 2001). Dentre esses compostos, tem-se também os inibidores do receptor H2 da histamina.
Pacientes em uso de ranitidina podem experimentar cefaléia, tonteira, cansaço, irritabilidade, rash, constipação, diarréia, trombocitopenia e elevação de transaminases. Esses achados, porém, são pouco freqüentes e a droga pode ser usada com segurança (RUDOLPH et al., 2001).
Os fármacos IBP (Inibidores da bomba de prótons) são substâncias benzimidazólicas que inibem seletiva e irreversilvelmente a bomba de prótons H+K+ ATPase, na membrana da célula parietal. A secreção gástrica ácida é suprimida em resposta a todos os agentes estimulantes, até que novas moléculas da bomba sejam sintetizadas. A potente ação dos IBP, além de elevar o pH gástrico, também resulta em redução do volume intragástrico de 24 horas, facilitando o esvaziamento gástrico e reduzindo o volume do refluxo (GUIMARÃES et al., 2006). Atualmente, os IBP em uso clínico no mundo são: omeprazol, lansoprazom, pantoprazol, rabeprazol e esomeprazol. Dentre esses, o esomeprazol é o que mais reduz a acidez intragástrica. Apenas o omeprazol e o lanzoprazol são aprovados pela FDA, para uso em crianças. Para menores de 1 ano, nenhum é aprovado (MINER et al., 2003).
Existe, agora, um consenso mundial de que o tratamento de primeira linha de infecção por H. pylori deve ser a terapia tripla com IBP, duas vezes ao dia, mais 500 mg de claritromicina, duas vezes ao dia, e/ou amoxicilina, 1 g duas vezes por dia, ou metronidazol, 500 mg duas vezes por dia, durante 7 a 14 dias (MALFERTHEINER et al., 2002).
1.8 Modelos animais de indução aguda de lesão gástrica
Os modelos experimentais em úlcera gástrica são experimentos clássicos na Farmacologia, que vêm sendo utilizados durante décadas, e bem consolidados em várias publicações. Diferentes pesquisadores desenvolveram variados métodos de indução da úlcera. Os principais são os seguintes: Administração de agente necrosante, etanol absoluto, soluções hiperosmóticas, HCl e NaOH (ROBERT et al., 1979) ou etanol acidificado (MIZUI; DOTEUCHI, 1986), por uma droga antiinflamatória não-esteroidal (SZABO et al., 1985), por estresse (TAKAGI; KASUYA; WATANABE, 1964; TAKAGI; OKABE, 1968), por imobilização a frio (SENAY; LEVINE, 1967), por isquemia e reperfusão (UEDA et al., 1989) e por ligadura do piloro (SHAY et al., 1945).
