HBsAg 90'
Código: 60454002 Formato: 3 x 12 testes
B
Utilização “In Vitro“
O kit ImmunoComb® II HBsAg 90’ é um teste para a
determinação qualitativa do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HbsAg) em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit.
Introdução
O vírus da hepatite B (HBV) pertence a uma nova família de vírus de DNA, chamada Hepadnaviridae. Ele apresenta um hepatotropismo evidente e um único meio de replicação através do mecanismo de transcrição reversa. O viríon completo ou partícula de Dane, consiste em uma molécula de DNA circular protegida por um capsídeo nuclear / antígeno de core (HBcAg), e envolvido por um envelope de lipoproteína, que é o antígeno de superfície (HBsAg). O HBsAg também é encontrado no soro como partículas ou filamentos esféricos, incompletos e não infecciosos. Um pequeno componente do nucleocapsídeo do HBV, o antígeno HBe (HBeAg), também é detectável no sangue durante a fase replicativa do vírus.
O vírus da hepatite B é um vírus amplamente presente, com distribuição global. As principais vias de transmissão do vírus são: horizontal, através de contaminação sexual ou parenteral, e vertical, com a transmissão pré-natal da mãe infectada para o feto.
As conseqüências clínicas da infecção por HBV variam de totalmente imperceptíveis (70% dos casos) à hepatite aguda com icterícia. A maioria dos pacientes se recupera totalmente dentro de seis meses após o início da doença. Uma pequena proporção da população infectada (< 1,5%) pode desenvolver hepatite fulminante, frequentemente com resultado fatal. Em uma proporção substancial (até 10%) dos pacientes adultos, o HBV pode persistir, progredindo eventualmente para hepatite crônica com desenvolvimento de cirrose e hepatocarcinoma. Os portadores de hepatite B crônica (200 milhões ao redor do mundo) formam o principal reservatório do vírus e contribuem para a disseminação da doença.
Em um caso típico de infecção aguda por HBV, o HBsAg, frequentemente acompanhado por HBeAg, aparece no sangue entre 2 e 6 semanas antes da manifestação dos
sintomas ou evidência bioquímica da hepatite e, atinge o nível máximo durante a fase aguda da doença. A persistência de HBsAg no soro por mais de 6 meses reflete o estado crônico do hospedeiro do HBV. Portanto, a triagem para HBsAg permite a identificação de pacientes infectados com HBV e auxilia no diagnóstico e prognóstico da doença.
Princípio do Teste
O teste ImmunoComb® II HBsAg 90’ é um ensaio
imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio sanduíche. A fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”). Cada dente é sensibilizado em duas posições: Ponto superior – albumina de soro bovino biotinilada (Controle Interno).
Ponto inferior – anticorpos monoclonais para HbsAg.
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades. As fileiras de B-F contem reagentes necessários para o ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileiracom incubação em cada etapa.
Para iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são adicionadas nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. Seguindo esta etapa, adicionar 20 μl de diluente de amostra nas cavidades da fileira A. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. O HBsAg, se presente na amostra, será capturado pelos anticorpos anti-HBs no ponto inferior dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, o HBsAg capturado nos dentes reagirá com anticorpos anti-Hbs biotinilados. Na fileira D, o complexo anticorpo/antígeno biotinilado nos pontos inferiores dos dentes, e a albumina de soro bovino biotinilada dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com avidina marcada com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados serão removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.
HBsAg α -Hbs biotinilado Substrato Cromogênico B B B avidina - AP
Captura de HBsAg; 60 min/ 37oC
Ligação do anti-Hbs biotinilado; 10 min/37oC
Reação enzimática de cor; 10 min/37o
C
Ligação de avidina –FA; 5 min/37oC B AP AV AP AP AVAP B AP AVAP
Figura 1. Princípio do Teste
O kit inclui um Controle Positivo (HBsAg) e um Controle Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar somente um ponto superior. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente.
Conteúdo do Kit Pentes
O kit contem 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas:
Ponto inferior – anticorpos monoclonais para HbsAg.
Controle Interno 54 54 54 54 54 54 54 54 54 54 54 54
ImmunoComb® II
. Anti-HBs Figura 2. Pente
Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante.
Placas Reveladoras
O kit contem 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio.
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contem todos os reagentes necessários para o teste, exceto a fileira A. Um frasco contendo diluente de amostra, que é fornecido com o kit , é imediatamente adicionado na fileira A antes do uso. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada.
O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Vazia
Fileira B Solução de lavagem
Fileira C Anticorpo de cabra biotinilado para HBsAg Fileira D Avidina modificada conjugada a fosfatase
alcalina
Fileira E Solução de lavagem
Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT)
Figura 3: Placa Reveladora
Controle Positivo
1frasco (tampa vermelha) de 1,5 ml de plasma humano diluído inativado pelo calor, negativo para HbsAg, enriquecido com 50 ng/mL de HBsAg recombinante.
Controle Negativo
1frasco (tampa verde) de 1,5 mL de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para HBsAg.
Perfurador
Para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora.
Diluente de Amostra
1frasco (tampa branca) de 2 ml de diluente de amostra.
Segurança e Precauções
• Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.
• Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para HBsAg, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes.
• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos pelo laboratório, para trabalhar com soro ou plasma.
• Não pipetar com a boca.
• Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante.
• Não misturar reagentes de lotes diferentes. • Não usar o kit após o vencimento.
Armazenamento e Estabilidade do Kit
• Kit é fornecido a 2-8º C. Durante o transporte o kit pode suportar temperaturas <30º C por curtos períodos de tempo não excedendo um total 48 horas.
• Os controles internos indicam que o kit não foi afetado durante o transporte.
• Armazenar o kit na embalagem original a 2-8ºC. • Não congelar o kit.
• Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados a 2-8ºC.
• A performance do kit após a primeira utilização é estável até à data de validade do mesmo, quando armazenado a 2-8ºC.
•Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser usados mais do que três vezes.
Manipulação de Amostras
• Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação.
• As amostras podem ser armazenadas por 72 horas de 2 - 8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 72 horas, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. • Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas
a 10.000 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
• Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio.
Procedimento do Teste
Material Necessário
• Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para
dispensar 100 μL e 20 μL.
• Tesoura.
• Cronômetro ou relógio de laboratório.
Preparando o Teste
Preparando a Placa Reveladora
1.
Incubar a Placa Reveladora
em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos.2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente a ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste.
3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando indicado nas instruções de uso. Preparando o Pente
Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do
teste, não tocar nos dentes do pente.
1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente.
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente:
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “54” do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados.
c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a
embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar
bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para
manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a 2–8ºC para uso posterior.
54 54 54 54 54 54 54 54 54 54 54 54
ImmunoComb® II
Figura 4. Quebrando o Pente
Preparando os Componentes
Incubar o diluente de amostra, Solução Controle Positivo, Solução Controle Negativo e as amostras a serem testadas a 37ºC por 15 minutos.
Instruções do Teste
Nota:• Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem
devem ser realizadas à temperatura ambiente (22 – 26ºC).
• O protocolo descrito abaixo resulta em um limite de detecção de 0.4 a 0.5 ng/ml.
Captura do Antígeno (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 100 μL de amostra. Perfurar a cobertura de
alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Adicionar nesta cavidade 20 μl de diluente de amostra e
homogeneizar enchendo e esvaziando repetidamente a
ponteira com a solução. Descartar a ponteira da pipeta. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um
Controle Positivo e um Controle Negativo fornecido no kit.
• Para bons resultados: Incubar a Placa Reveladora com as amostras e o diluente por um tempo adicional de 15 minutos a 37ºC.
3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles.
Homogeneizar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades
várias vezes.
b) Incubar o Pente na fileira A por 60 minutos a 37ºC. Ajustar o cronômetro. Após 30 minutos de incubação homogeneizar como na etapa 3a. Homogeneizar um tempo adicional durante a incubação. Próximo ao final dos 60 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 60 minutos, retirar o Pente da fileira A.
Absorver o líquido residual das pontas dos dentes em
papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes.
Primeira Lavagem (Fileira B)
4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B.
Homogeneizar: Retirar e inserir o Pente vigorosamente
nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a homogeneização várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c.
Ligação do anti-Hbs biotinilado (Fileira C)
5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C.
Homogeneizar como no passo 3a. Incubar a Placa
Reveladora com o pente por 10 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar a cobertura da fileira D. Homogeneizar um tempo adicional durante a incubação.
Após 10 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido
residual.
Ligação de Avidina modificada/Fosfatase Alcalina (Fileira D)
6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Homogeneizar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 5 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 5 minutos, retirar o Pente a absorver o
líquido residual.
Segunda Lavagem (Fileira E)
7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Homogeneizar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F)
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F.
Homogeneizar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente
por 10 minutos exatos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Misturar um tempo adicional durante a incubação. Após 10 minutos retirar o Pente.
Interrupção da Reação (Fileira E)
9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre.
Descarte do resíduo
Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, papel absorvente e luvas usadas, como resíduo bioinfectante.
Armazenamento da parte não utilizada do kit
Placa ReveladoraAs cavidades da Placa Reveladora que não forem utilizadas podem ser guardadas para uso posterior:
• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada.
Outros materiais do kit:
• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso para a caixa original do kit.
Armazenar a 2-8ºC.
Resultados dos Testes
Validação
Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5).
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente
do Pente.
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior
(Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior
(Controle interno).
Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.
Controle
Positivo Controle Negativo ResultadosInválidos
Figura 5. Validação dos testes.
Interpretação dos Resultados
Documentação dos resultados
Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior.
Limitações
Resultados positivos do teste ImmunoComb® II HBsAg 90´
indicarão a presença de antígeno de superfície da hepatite B. Entretanto, como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente.
Características de Desempenho*
A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb®
II HBsAg 90´ foram avaliadas em 203 amostras séricas, em
comparação com o sistema Axsym Abbott como ensaio de referência. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.
Tabela 1. Resultados dos testes
As seguintes características agregadas ao desempenho foram calculadas:
• Sensibilidade – 99% • Especificidade – 100%
* Informação detalhada disponível mediante solicitação.
Bibliografia
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Registro e Distribuição:
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CONSERVAR ENTRE 2-8ºC
Lote Vide Embalagem
Data de Validade Vide Embalagem
SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro
Versão: 60454002/B8/OR
(05/2010)
ImmunoComb® II HBsAg 90´
Ensaio de
Referência Positivo Negativo
Positivo 112 1
Negativo 0 90
60454002/B8/OR 5
Resumo dos Principais Procedimentos do Teste
1 2 3 4
Pré-incubação da Placa Reveladora:
45 minutos a 37oC Aspirar as amostras e controles
Adicionar amostras e controles na fileira A. Adicionar diluente de amostra. Misturar.
Retirar o pente da embalagem.
5 6 7 8
Inserir o Pente e misturar na fileira
A. Incubar a 37oC. Abrir a fileira B. Absorver o líquido acumulado nos dentes. Inserir o Pente na fileira B e agitar. Incubar.
9 10
Após misturar/agitar & incubar nas fileiras C, D e E …
Reação de cor na fileira F. Resultados
Resumo do Procedimento de Teste
As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb® II HbsAg 90´.
(Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo)
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos.
2. Dispensar 100 μL de cada amostra e controle nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar.
3. Adicionar 20 μL de diluente de amostra nas cavidades da fileira A e misturar. 4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1.
Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste
Etapa Fileira Proceder como a seguir
Captura do Antígeno A Misturar; incubar por 60 minutos a 37ºC (misturar após 30 minutos); absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação de anti-HBs biotinilado C Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC;
absorver. Ligação da avidina modificada/
fosfatase alcalina
D Misturar; incubar por 5 minutos a 37ºC; absorver.
Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC. Interrupção da reação E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre.
1
