HBsAg
Código: 60451002 Versão: 451/P9 Formato:3 x 12 testes
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O kit ImmunoComb® II HBsAg é um teste para a detecção
qualitativa do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HbsAg) em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit.
Introdução
O vírus da hepatite B (HBV) pertence a uma nova família de vírus de DNA, chamada Hepadnaviridae. Ele apresenta um hepatotropismo evidente e um único meio de replicação através do mecanismo de transcrição reversa. O viríon completo ou partícula de Dane, consiste em uma molécula de DNA circular protegida por um capsídeo nuclear / antígeno de core (HBcAg), e envolvido por uma lipoproteína de envelope, que é o antígeno de superfície (HBsAg). O HBsAg também é encontrado no soro como partículas ou filamentos esféricos, incompletos e não infecciosos. Um pequeno componente do nucleocapsídeo do HBV, o antígeno HBe (HBeAg), também é detectável no sangue durante a fase replicativa do vírus.
O vírus da hepatite B é um vírus amplamente presente, com distribuição global. As principais vias de transmissão do vírus são: horizontal, através de contaminação sexual ou parenteral; e vertical, com a transmissão pré-natal da mãe infectada para o feto.
As conseqüências clínicas da infecção por HBV variam de totalmente imperceptíveis (70% dos casos) a hepatite aguda com icterícia. A maioria dos pacientes se recupera totalmente dentro de seis meses após o início da doença. Uma pequena proporção da população infectada (< 1,5%) pode desenvolver hepatite fulminante, freqüentemente com resultado fatal. Em uma proporção substancial (até 10%) dos pacientes adultos, o HBV pode persistir, progredindo eventualmente para hepatite crônica com desenvolvimento de cirrose e hepatocarcinoma.
Os portadores de hepatite B crônica (200 milhões ao redor do mundo) formam o principal reservatório do vírus e contribuem para a disseminação da doença.
Em um caso típico de infecção aguda por HBV, o HBsAg, freqüentemente acompanhado por HBeAg, aparece no sangue entre 2 e 6 semanas antes da manifestação dos sintomas ou evidência bioquímica da hepatite e, atinge o nível máximo durante a fase aguda da doença. A persistência de HBsAg no soro por mais de 6 meses reflete o estado crônico do hospedeiro do HBV. Portanto, a triagem para HBsAg permite a identificação de pacientes infectados com HBV e auxilia no diagnóstico e prognóstico da doença.
Princípio do Teste
O teste ImmunoComb® II HBsAg é um ensaio imunoenzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio de sanduíche. A fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”).
Cada dente é sensibilizado em duas posições:
Ponto superior – soro albumina bovina biotinilada (Controle Interno).
Ponto inferior – anticorpos monoclonais para HbsAg.
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileiracom incubação em cada etapa.
Para iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são adicionados ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. O HBsAg, se presente na amostra, será capturado pelos anticorpos anti-HBs no ponto inferior dos dentes do Pente (Figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, o HBsAg capturado nos dentes reagirá com anticorpos anti-Hbs biotinilados. Na fileira D, o complexo anticorpo / antígeno biotinilado dos pontos inferiores dos dentes, e a albumina bovina sérica biotinilada dos pontos superiores (Controle Interno), reagirão com estreptavidina marcada com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados serão removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.
Figura 1. Princípio do Teste
O kit inclui um Controle Positivo (HBsAg) e um Controle Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto bem claro. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente.
Materiais Fornecidos Pentes
O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2).
Cada dente está sensibilizado com duas áreas reativas:
Ponto superior – soro albumina bovina biotinilada (Controle Interno).
Ponto inferior – anticorpos monoclonais para HbsAg.
Figura 2. Pente
Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante.
Placas Reveladoras
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada.
O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Solução de lavagem
Fileira C Anticorpo de cabra biotinilado para HbsAg Fileira D Estreptavidina marcada com fosfatase alcalina Fileira E Solução de lavagem
Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT)
Figura 3. Placa Reveladora
Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 1,5 ml de
plasma humano diluído inativado pelo calor, negativo para HbsAg, enriquecido com 50 ng/mL de HbsAg recombinante.
Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 1,5 mL de plasma
humano diluído, inativado pelo calor, negativo para HBsAg.
Perfurador – para a perfuração da folha de alumínio que cobre as
cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções
• Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.
• Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para HbsAg, anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes.
• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. • Não pipetar com a boca.
• Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante.
• Não misturar reagentes de lotes diferentes. • Não usar o kit após o vencimento. Armazemamento do Kit
Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 – 8ºC. Nestas condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do rótulo. Não congelar o kit.
Manipulação de Amostras
Tanto o soro como o plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 – 8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a –20 ºC ou inferior.
Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante.
Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Procedimento do Teste
Material Necessário
• Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 75 µL.
• Tesoura.
• Cronômetro ou relógio de laboratório.
Preparando o Teste
Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente.
Preparando a Placa Reveladora
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos. Trazer todos os outros componentes (Pentes, controles e amostras) à temperatura ambiente.
2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora.
Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora.
Furar usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador. Preparando o Pente
Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste,
não tocar nos dentes do pente.
1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente.
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente:
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “51” do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a
tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de pares de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de
alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem,
por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior.
Figura 4. Quebrando o Pente
Instruções do Teste Nota:
• Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem
devem ser realizadas à temperatura ambiente (22 – 26ºC). • O protocolo descrito abaixo resulta em um limite de detecção
de 0.5 ng/ml. O “Procedimento de Incubação Curta” descrito posteriormente utiliza tempos de incubação reduzidos, resultados nos limites de detecção de 2,5 - 5 ng/mL.
Captura do Antígeno (Fileira A da Placa Reveladora)
1. Pipetar 75 µL de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e
esvaziando a ponteira com a solução repetidamente. Descartar a ponteira da pipeta.
2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um Controle Positivo e um Controle Negativo fornecidos no kit. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.
3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas
cavidades da fileira A contendo as amostras e controles.
Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias
vezes.
b) Deixar o Pente na fileira A por 120 minutos a 37ºC. Ajustar
o cronômetro. Próximo ao final dos 120 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário.
c) Ao final dos 120 minutos, retirar o Pente da fileira A.
Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em
papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes.
Primeira Lavagem (Fileira B)
4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e
inserir o Pente vigorosamente nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como
no passo 3c.
5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no
passo 3a. Incubar a Placa Reveladora com o pente por 30 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as
coberturas da fileira D. Após 30 minutos, retirar o Pente e
absorver o líquido residual.
Ligação de Estreptavidina/ Fosfatase Alcalina (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a
Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E. Após
20 minutos, retirar o Pente a absorver o líquido residual.
Segunda Lavagem (Fileira E)
7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar
repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.
Reação de Cor (Fileira F)
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Agitar. Incubar a
Placa Reveladora com o Pente por 10 minutos exatos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o
Pente.
Reação de Parada (Fileira E)
9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre.
Descarte do lixo
Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, papel absorvente e luvas usadas, como lixo bioinfectante.
Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora
Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso posterior:
• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada.
Outros materiais do kit:
• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit.
Armazenar de 2 – 8ºC. Resultados dos Testes
Validação
Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5).
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do
Pente.
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior
(Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados.
3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior
(Controle interno).
Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestadas.
Controle Positivo
Controle
Negativo ResultadosInválidos
Figura 5. Validação dos testes
Interpretação dos Resultados
Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada
amostra com o ponto inferior no dente do Controle Negativo
(Figura 6).
• Um ponto com intensidade maior que o ponto do Controle
Negativo é considerado um resultado positivo, tendo uma concentração de HBsAg ≥ 0,5 ng/mL.
• Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor ou igual a do controle negativo é considerado como resultado negativo. Resultado Negativo Controle Negativo Resultado Positivo
<
<
<
<
Figura 6. Resultado dos Testes
Documentação dos resultados
Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior.
Procedimento de Incubação Reduzida
A duração do teste pode ser reduzida pela realização da incubação com tempo reduzido nas fileiras A e C. Este procedimento resultará em um limite de detecção de 2.5 - 5 ng/mL.
Instruções do Teste
Realizar os procedimentos exatamente como descrito no ítem “Procedimento do Teste”, exceto para os tempos de incubação, que estão resumidos abaixo:
Fileira A 30 minutos Fileira B 02 minutos Fileira C 20 minutos Fileira D 20 minutos Fileira E 02 minutos Fileira F 10 minutos Fileira E 01 minuto Resultados do Teste Validação
Os resultados do procedimento reduzido devem ser validados exatamente como descrito no procedimento de teste padrão. Interpretação dos Resultados
Comparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada
amostra com o ponto inferior no dente do Controle Negativo
(Figura 6).
• Um ponto com intensidade maior que a do Controle
Negativo é considerado um resultado positivo, tendo uma
concentração de HBsAg > 2,5 - 5 ng/mL.
• Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor ou igual a do controle negativo é considerado como resultado negativo.
Limitações
Resultados positivos do teste ImmunoComb
II HbsAg indicarão
a presença de antígeno de superfície da hepatite B. Entretanto, como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente.
Características de Desempenho*
A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb
II
HBsAg foram avaliadas em um painel de amostras de soro, em
comparação com um radioimunoensaio de referência. O painel incluiu 196 amostras positivas de HbsAg de pacientes com infecção aguda ou crônica por HBV e 248 amostras negativas de HbsAg.
Os resultados estão resumidos na Tabela 1.
Tabela 1. Resultados dos testes
** Protocolo de incubação longa.
Uma avaliação adicional realizada em um painel Francês da ADM mostrou que os resultados cumpriam com as especificações da ADM na França, que requer um limite de 0,5 ng/mL de HbsAg em amostras de soro.
* Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia
Follet EAC. 1998. Diagnosis of hepatitis B infection. In: Hugh Y
Mc Millan A, eds. Immunological diagnosis of sexually transmitted diseases. Marcel Dekker, New York. Pgs 433-450.
Herrera JL. 1994. Serological Diagnosis of viral hapatitis . S Med
J:87:677-684.
Hollinger FB. 1991. Hepatits B vírus. In: Viral Hepatitis (Hollinger
FB, Purcel RH, Robinson WS, Gerin JL. Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp 73-138.
Kiyasu PK, Caldwell SH. 1993. Diagnosis and treatment of the
major hepatotropic viruses. Am J Méd Sci 306:248-261.
Krugman S. Overby LR, Mushavar IK, Ling C-M, Frosner GG, Deinhart F. 1979. Viral hepatitis, type B: studies on natural history
and prevention re-examined. N Engl J. Méd 300:101-106.
Ogra PL, Beutner KR, 1981. Hepatitis viruses. In: Milgrom F.
Abeyounis CJ, Kano K. eds. Principles of immunological diagnosis in medicine. Lea & Febiger, Philadelphia, pp. 247-259.
Robinson WS. 1991. Hepadnavindae and their replication. In:
Viral hepatitis (Hollinger FB, Purcell, RHRobinson WS, Gerin JL. Ticehurst J, eds.) Raven Press, New York, pp 39-71.
Swenson PD. 1991. Hepatitis viruses. In: Balows A . Hauster WJ.
Hemmann KL, Isenberg HD. Shadomy HJ, eds. Manual of Clinical Microbiology, Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 959-983. Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne 70650 - ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA.
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Atendimento ao consumidor
SAC: (11) 5589-4622 FAX: (11) 5581-3279 e-mail: orgenics@uol.com.br
Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro"
Registro ANVISA nº 10348680009
Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva CRF-SP 13020
CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC
Resumo dos Principais Procedimentos do Teste
Resumo do Procedimento de Teste
As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb
II HBsAg. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo)
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos.
2. Dispensar 75 µL de cada amostra e controle nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar.
3. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1.
Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste
Etapa Fileira Proceder como a seguir
Captura de Antígeno A Misturar; incubar por 2 horas a 37ºC; absorver.
Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver.
Ligação de anti-Hbs biotinilado C Misturar; incubar por 30 minutos a 37ºC;
absorver. Ligação de estreptavidina /
fosfatase alcalina
D Agitar; incubar por 20 minutos a 37ºC; absorver.
Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver.
Reação da cor F Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC.
