UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
VALOR PROGNÓSTICO DOS SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÕES
HISTOPATOLÓGICAS EM CARCINOMAS DE CÉLULAS
ESCAMOSAS DE LÍNGUA E ASSOALHO DE BOCA:
ESTUDO DE CONCORDÂNCIA INTER E INTRAOBSERVADOR
MARTHA BONEL RIBAS MOREIRA
Niterói 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
VALOR PROGNÓSTICO DOS SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÕES
HISTOPATOLÓGICAS EM CARCINOMAS DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE LÍNGUA E ASSOALHO DE BOCA: ESTUDO DE CONCORDÂNCIA INTER E
INTRAOBSERVADOR
MARTHA BONEL RIBAS MOREIRA
Área de Concentração: Clínica Odontológica
Orientadora: Profª Drª Simone Chaves de Queiroz Lourenço Coorientadora: Profª Drª Luisa Aguirre Buexm
Niterói 2018
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
BANCA EXAMINADORA
Profª Drª Simone Chaves de Queiroz Lourenço
Instituição: Faculdade de Odontologia. Universidade Federal Fluminense Decisão: Assinatura:
Profª Drª Luciana Wernersbach Pinto
Instituição: Divisão de Patologia. Instituto Nacional de Câncer Decisão: Assinatura:
Prof. Dr. Mário José Romañach Gonzalez Sobrinho
Instituição: Faculdade de Odontologia. Universidade Federal do Rio de Janeiro Decisão: Assinatura:
Profª Drª Luisa Aguirre Buexm
Instituição: Centro de Pesquisas. Instituto Nacional de Câncer Decisão: Assinatura:
Profª Drª Daniela Otero da Costa Carvalho
Instituição: Faculdade de Odontologia. Universidade Salgado de Oliveira Decisão: Assinatura:
Prof. Dr. Rodrigo Figueiredo de Brito Resende
Instituição: Faculdade de Odontologia. Universidade Federal Fluminense Decisão: Assinatura:
DEDICATÓRIA
Ao meu filho Rafael, Meu grande e eterno amor.
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai Hélcio aos seus ensinamentos que moldaram a pessoa que sou hoje. Espero que esteja em paz e se alegre com minhas novas conquistas e à minha mãe Lélia por toda sua dedicação ao longo da sua vida pelos seus filhos.
Ao meu tio Luiz Carlos Moreira, meu padrinho que é um exemplo de ser humano, que Deus permitiu que nos reencontrássemos nesta jornada da vida, despertando em mim o desejo pelo saber que é um de seus dons. Como meu padrinho e pai atual você foi indispensável para esta conquista, minha eterna gratidão a você e à minha tia Andrea por me incentivarem nesta caminhada acadêmica.
Ao meu irmão Mauricio, pelo companheirismo deste momento, por estar sempre torcendo pelas minhas vitórias e por ter me presenteado com a linda Lara.
À minha Tia Helenice, por ser essa mulher de fé inabalável que representa uma verdadeira fortaleza. Tornou-se meu porto seguro com tanto carinho e amor que dedicou a mim. Sem seus conselhos e palavras seria incapaz de prosseguir.
Ao meu namorado Sérgio que tem acompanhado meus desafios diários Aos meus amigos Priscila, Letícia, Fernando e Adriana que, por incontáveis vezes me acolheram e pacientemente me ouviram. Desejo desfrutar de muitos momentos felizes ao lado de vocês.
Agradeço ao PPGO-UFF que proporcionou meu aprimoramento profissional e científico.
Ao meu ex-chefe e amigo Paulo André de Barros Corrêa, do Instituto de Pesquisas da Marinha, o primeiro incentivador desta jornada que com seu apoio este projeto se tornou mais fácil de acontecer. Agradeço pela confiança e por todos os seus conselhos nos quais tento segui-los. Nitidamente uma pessoa diferenciada que agrega valores em todos os aspectos.
Aos meus amigos do Instituto de Pesquisas da Marinha Ana Paula de Falco, Carla Martins, Márcio de Melo e Renata Alves pelo apoio, incentivo e orientações na realização do Mestrado.
À minha orientadora Simone, exemplo de profissional, mãe, esposa, filha, irmã, amiga; tão admirável que se tornou referência na minha vida. Bê e Jhonny são privilegiados de ter você como mãe. Ética e sempre em busca da excelência, agradeço pela oportunidade de realizar este trabalho junto com o seu seleto grupo de pesquisa,
pela paciência, pela tranquilidade que transmitiu seus conhecimentos ao longo de toda nossa pesquisa e por tudo que você representou para mim neste período. A você, minha eterna gratidão.
À minha coorientadora, Luisa, a pequena grande notável. Outro exemplo de dedicação. Imensurável sua capacidade de querer buscar a perfeição em tudo que faz, desde o trato com seus pacientes até na bancada dos seus experimentos. Você despertou em mim uma inquietude científica que vejo como uma das suas principais características. Seu convívio e amizade se tornaram indispensáveis na minha vida. Também externo a você, minha eterna gratidão.
Às amigas do Laboratório de Biotecnologia Aplicada – Setor de Histologia (LABA) especialmente à Ana Flávia Schueller e Adriana Terezinha Novellino pessoas iluminadas que tornaram toda essa trajetória mais leve. Profissionais dedicadas em que me espelho para aprimorar meus conhecimentos científicos. Particularmente a você Adriana, agradeço aos momentos que, para o desenvolvimento desta pesquisa, pude desfrutar do seu talento de ensinar e por ter participado deste estudo.
À Professora Doutora Fabiana Resende, da DIPAT, pela sua contribuição ao participar desta pesquisa
À Priscila Valverde, em nome de toda a equipe da DIPAT toda a colaboração e dedicação ao longo deste trabalho.
RESUMO
MOREIRA MBR. Valor prognóstico dos sistemas de classificações histopatológicas em carcinomas de células escamosas de língua e assoalho de boca: estudo de concordância inter e intraobservador [dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2018.
Realizar uma análise comparativa do valor prognóstico e reprodutibilidade entre a gradação histopatológica da Organização Mundial de Saúde (OMS), a Avaliação Histopatológica de Risco (AHR) e o Modelo Botão e Profundidade de Invasão (BP) em carcinoma de células escamosas (CCE) de língua e assoalho de boca. Foram avaliados 308 casos CCE de língua e assoalho de boca diagnosticados e tratados cirurgicamente no Instituto Nacional de Câncer (INCA), contendo os dados sociodemográficos, clínico-patológicos e de seguimento. As lâminas coradas em hematoxilina e eosina (HE) contendo recortes dos tumores foram avaliadas microscopicamente para a aplicação dos três sistemas classificações. Foram selecionados aleatoriamente 15% dos casos para a verificação da concordância interobservador entre dois patologistas convidados e 30% para análise intraobservador. A análise estatística foi realizada por meio do teste exato de Fisher ou qui-quadrado, para avaliação inter e intraobservador, o teste de Cohen e com valores de Kappa, para análise de sobrevida, o método de Kaplan-Meier, o teste
log-rank e o modelo de risco proporcional de Cox. Homens brancos, com idade entre
41-60 anos, etilistas e tabagistas foram os mais afetados. Predominaram tumores em estadiamento clínico II e patológico IV, moderadamente diferenciados (87,3%) pela gradação da OMS, classificados como de risco intermediário (50,6%) pela AHR e alto risco (52,6%) pelo Modelo BP. Sessenta e dois casos de progressão da doença, 82 casos de recidiva foram identificados e 187 pacientes vieram à óbito. Foram observadas associações entre tumores moderadamente diferenciado pela OMS e tabagismo (p=0,027), AHR de alto risco com tumores em estadiamento patológico avançado (p<0,0001) e tratamento adjuvante (p<0,0001), e Modelo BP de alto risco com baixa escolaridade (p = 0,026), progressão da doença (p=0,005) e óbito (p<0,0001). Na análise intra e interobservador a classificação da OMS apresentou leve concordância enquanto a AHR e o Modelo BP apresentaram concordância moderada e substancial. A sobrevida global (SG) foi de 51,3%. Tiveram uma SG menor os pacientes de alto risco para a AHR (p<0.0001) e para o Modelo BP (p=0.001). Já a sobrevida livre de doença (SLD) foi de 69.8%. O grupo de pacientes classificados como de alto risco para AHR (p=0,019) e Modelo BP (p=0,002) apresentaram SLD menor. Dos sistemas de classificação avaliados, a AHR demonstrou valor prognóstico independente para SG e o Modelo BP para a SLD. O Modelo BP é uma ferramenta prognóstica promissora para a identificação de casos agressivos de CCE de boca, dessa forma evidenciando seu potencial na utilização da rotina clínica diagnóstica.
Palavras-chave: carcinoma de células escamosas de boca, botão tumoral; sistema de
ABSTRACT
MOREIRA MBR. Prognostic value of histopathological grading systems in tongue and floor of mouth squamous cell carcinoma: study of inter- and intraobserver agreement. [dissertation]. Niterói: Federal Fluminense University, Dental School; 2018.
To perform a comparative analysis to investigate the prognostic value and clinical reproducibility between the histopathological grading of the World Health Organization (WHO), the Histopathological Risk Assessment (AHR) and the Budding and Depth of invasion (BP) model. A total of 308 cases of the tongue and floor of mouth squamous cell carcinoma (SCC) were diagnosed and surgically treated at the Brazilian National Cancer Institute (INCA), containing socio-demographic, clinical and pathological data and follow-up. Slides containing cuts of hematoxylin and eosin (HE) stained tumors were evaluated for the application of the three classifications. Fifteen percent of the cases were randomly selected to verify interobserver agreement between two invited pathologists and 30% for intraobserver analysis. Statistical analysis was performed using Fisher's exact test for the chi-square test, for inter- and intraobserver evaluation of the Cohen test with Kappa value, and for Kaplan-Meier survival method, log-rank test and Cox's proportional hazard model. White males, aged between 41-60 years, alcohol-drinkers and smokers were most affected. Predominated tumors in clinical stage II and pathological IV, moderately-differentiated (87.3%) by WHO grading, classified as intermediate-risk (50.6%) by AHR and high-risk (52.6%) by BP model. Sixty-two were identified cases of disease progression, 82 cases of recurrence and 187 came to death. Associations between moderately-differentiated tumors by WHO and tobacco-used (p=0.027), high-risk for AHR with tumors in advanced pathological stage (p<0.0001) and adjuvant treatment (p <0.0001), and high-risk by BD model with low academic background (p=0.026), disease progression (p=0.005) and death (p<0.0001) were observed. In the intra- and interobserver analysis, the WHO grading presented a slight concordance while the AHR and the BD Model presented moderate and substantial agreement, respectively. Overall survival (OS) was 51.3%. Patients at high-risk for AHR (p<0.0001) and BD (p=0.001) had lower OS. The disease-free survival (DFS) was 69.8%. The group of patients classified as high-risk for AHR (p=0.019) and BD model (p=0.002) had lower DFS. From the classification systems evaluated, AHR demonstrated independent prognostic value for OS and BD model for DFS. The BD model is a promising prognostic tool for the identification of aggressive cases of oral SCC, evidencing its potential in the diagnostic routine.
Keywords: oral squamous cell carcinoma; tumor budding; histopathological grading
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AHR - Avaliação Histopatológica de Risco B - Botão (Budding)
CCE - Carcinoma de Células Escamosas
CCEB - Carcinoma de Células Escamosas de Boca D - Profundidade de invasão (Depth Invasion) DIPAT - Divisão de Patologia
HE - Hematoxilina & Eosina
INCA - Instituto Nacional de Câncer OMS - Organização Mundial de Saúde SCC - Squamous Cell Carcinoma TNM - Tumor, Nódulo e Metástase
TFMSCC - Tongue and Floor of Mouth Squamous Cell Carcinoma UFF - Universidade Federal Fluminense
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO...11
2 - METODOLOGIA...14
2.1 - População de Estudo...14
2.2 - Análise Histopatológica...15
2.2.1 - Gradação histopatológica proposta pela OMS...15
2.2.2 - Avaliação Histopatológica de Risco (AHR)...16
2.2.3 - Modelo BP (botão tumoral e profundidade de invasão)...19
2.3 - Digitalização das Lâminas...21
2.4 - Concordância Interobservador e Intraobservador...21
2.5 - Tratamento Estatístico...22 3 - ARTIGO PRODUZIDO...24 4 - CONCLUSÕES...45 5 - ANEXOS...46 5.1 - Anexo A...46 5.2 - Anexo B...49
1 - INTRODUÇÃO
O câncer de boca é o sexto tipo de câncer mais frequente em todo o mundo, sendo responsável por 3-5% de todas as neoplasias malignas em ambos sexos (FERLAY et al., 2015).
Estima-se que o câncer de boca seja o quinto câncer mais incidente entre os homens e o décimo segundo entre as mulheres no Brasil para o ano de 2018 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).
Os principais fatores de risco para o câncer de boca são o tabagismo e o etilismo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).
Mais de 90% de todos os cânceres de boca são classificados como carcinoma de células escamosas (CCE) (EL-NAGGAR et al., 2017). A língua seguida do assoalho de boca são os locais mais acometidos por este tipo tumoral (HONORATO et al., 2009).
O prognóstico e evolução clínica dos pacientes diagnosticados com CCE de boca dependem principalmente do estádio da doença, contudo, o sistema de estadiamento TNM (tumor, linfonodos e metástase) amplamente adotado para caracterizar os tumores, propor a terapia mais adequada e estimar a sobrevida dos pacientes, não permite um prognóstico preciso, pois se observa que tumores do mesmo estádio podem apresentar diferentes graus de agressividade (PATEL & SHAH, 2005).
Ao longo dos anos, as revisões do sistema de estadiamento TNM têm sido baseadas para melhor compreender a história natural dos tumores, nos diferentes sítios e são auxiliadas pelos avanços tecnológicos, que permitem aos clínicos avaliar melhor a extensão dos tumores (PATEL & SHAH, 2005). Com isso, segue a busca por fatores prognósticos fidedignos para carcinoma de células escamosas de boca (CCEB) que possam ajudar a identificar os diferentes grupos de risco (BETTENDORF
et al., 2004).
Apesar de existirem estratégias terapêuticas avançadas, a taxa de sobrevida em cinco anos do CCEB não aumentou nestas últimas quatro décadas, permanecendo em torno de 50% (VOKES et al., 1993; CASIGLIA & WOO, 2001; BETTENDORF et al., 2004). No entanto, WÜNSCH-FILHO (2002) indica que as
12 neoplasias localizadas na língua possuem um pior prognóstico, com um índice de sobrevida em cinco anos de 15% (WÜNSCH-FILHO, 2002).
As classificações histopatológicas para o CCEB surgiram na tentativa de explicar o comportamento biológico discrepante de tumores com características clínicas semelhantes (LOURENÇO et al., 2007) e servem como fatores prognósticos suplementares confiáveis (PATEL & SHAH, 2005; LOURENÇO et al., 2007).
As classificações histopatológicas multifatoriais, que procuram associar mais de um parâmetro microscópico, atribuindo um escore final ao paciente, parecem ser uma interessante estratégia, apresentando uma associação com o desfecho do paciente. Em geral, os principais critérios usados para avaliar o sucesso do tratamento são a ocorrência de óbito, quer seja relacionado ao câncer ou a outras causas, e a presença de recorrência, sendo então analisado o tempo de sobrevida do paciente em relação a esses dois eventos (CARVALHO et al., 2004; WARNAKULASURIYA, 2009). A classificação histopatológica de malignidade proposta pela OMS, em 2017, baseou-se no grau de diferenciação celular e permite o agrupamento desta neoplasia maligna em três categorias. Os CCEB podem ser classificados em pouco diferenciados, moderadamente diferenciados e bem diferenciados (EL-NAGGAR et
al., 2017).
BRANDWEIN-GENSLER et al., em 2005, propuseram uma avaliação histopatológica de risco (AHR) para o CCEB fortemente preditiva de recorrência local e sobrevida total. A AHR avalia padrão de invasão, resposta linfocitária e invasão perineural, atribuindo diferentes pontuações a cada característica e classificando os pacientes em baixo, intermediário e alto risco, conforme o resultado do escore recebido. Segundo a classificação, apenas os pacientes de alto risco se beneficiariam de radioterapia adjuvante (BRANDWEIN- GENSLER et al., 2005).
Recentemente, ALMAGUSH et al., 2014, introduziram o Modelo BP (Botão Tumoral e Profundidade de Invasão) em CCE de cabeça e pescoço, que é uma classificação histopatológica baseada em dois parâmetros: botão tumoral (B) e profundidade de invasão (P) que é medido em milímetros. O botão tumoral se caracteriza por apresentar uma única célula tumoral ou um grupamento de até 5 células tumorais presente no estroma na frente invasão tumoral. O ponto de corte para o botão tumoral foi fixado em 5 botões de células epiteliais neoplásicas contendo até 5 células em cada botão (>5 = baixo risco; ≤5 = alto risco) e para a profundidade de invasão foi de 4 mm (>4 mm = baixo risco; ≤4 mm = alto risco). Por fim, os resultados
B e P foram combinados em um Modelo BP para estabelecer o escore de risco BP, que contempla as categorias de baixo, intermediário e alto risco. Os autores reportaram que a presença do modelo BP na frente de invasão do tumor é um promissor fator prognóstico nos CCE de cabeça e pescoço. O botão tumoral demonstra características preditivas associadas com o escore de alto risco para a recorrência locorregional e baixa sobrevida em pacientes com CCE. O botão representa duas características principais de malignidade: a perda de adesão celular e invasão tumoral ativa (SAWAZAKI- CALONE et al., 2015). Tem sido sugerido que a sua presença é uma característica da agressividade do tumor e foi estudado inicialmente em câncer colorretal (ALMAGUSH et al., 2014).
Pretende-se estabelecer a importância prognóstica e a aplicabilidade na rotina diagnóstica das classificações histopatológicas avaliadas para o CCE de língua e assoalho de boca. Considerando as limitações quanto ao tratamento e controle do CCEB, justificam-se estudos como este que busquem ferramentas indicadoras do prognóstico dessa doença, como as classificações histopatológicas, para que possam diminuir a mortalidade de pacientes diagnosticados com câncer de boca.
O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise comparativa do valor prognóstico e reprodutibilidade entre a gradação histopatológica da Organização Mundial de Saúde (OMS), a Avaliação Histopatológica de Risco (AHR) e o Modelo Botão e Profundidade de Invasão (BP) em carcinoma de células escamosas (CCE) de língua e assoalho de boca, tratados cirurgicamente no Instituto Nacional de Câncer no período de 1999 a 2007.
14 2 - METODOLOGIA
2.1 - População de Estudo
Estudo retrospectivo, observacional e descritivo composto por 308 pacientes com carcinoma de células escamosas de língua e/ou assoalho de boca diagnosticados entre 01 de janeiro de 1999 a 31 de dezembro de 2007 no Instituto Nacional de Câncer (INCA).
Esse estudo foi desenvolvido em colaboração entre o Instituto Nacional de Câncer (INCA) e o Programa de Pós-graduação de Odontologia (PPGO) da UFF.
Foram incluídos apenas tumores primários, cujo tratamento inicial foi cirúrgico, com margens livres de tumor e submetidos a esvaziamento cervical no momento da ressecção do tumor. Foram incluídos somente os tumores localizados em língua e/ou assoalho de boca e cujos blocos e/ou lâminas estejam disponíveis no arquivo da Divisão de Patologia (DIPAT) do INCA.
Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA sob o número de registro 125/10 (Anexo A).
A partir dos prontuários e dos laudos histopatológicos foram coletados os dados clínico-patológicos e de sobrevida dos pacientes (Tabela 1) inseridos em fichas de coleta de dados (Anexo B) e posteriormente armazenados em um banco de dados.
Tabela 1: Dados coletados dos pacientes.
DADOS COLETADOS
Dados demográficos Idade do paciente ao diagnóstico
Sexo do paciente Tabagismo Etilismo
Dados clínicos Localiação anatômica
cTNM – Estádio
Tratamento e data do tratamento
Dados histopatológicos
(macroscópicos e microscópicos)
pTNM – Estádio Espessura
Localização do tumor na macroscopia Margens
Gradação histopatológica
Dados de seguimento Data e local da recorrência (quando
presente)
Data do último acompanhamento Data do óbito
2.2 - Análise Histopatológica
As lâminas coradas em HE de cada caso foram recuperadas dos arquivos da DIPAT do INCA e examinadas ao microscópio de luz Nikon® Eclipse E200 por dois observadores inicialmente (SQCL e MBRM) para a aplicação das classificações histopatológicas da OMS, da AHR e Modelo BP de acordo com seus respectivos critérios.
2.2.1 - Gradação histopatológica proposta pela OMS
Para o emprego da classificação proposta pela OMS (EL-NAGGAR et al., 2017) o critério utilizado foi o grau de diferenciação celular.
Os CCEB bem diferenciados foram assim denominados quando sua arquitetura tecidual se assemelha a um padrão normal de epitélio escamoso. Os CCE moderadamente diferenciados apresentaram certo grau de pleomorfismo nuclear, atividade mitótica e pouca ceratinização. Já aqueles que se mostraram pouco diferenciados, se caracterizaram pelo predomínio de células imaturas, numerosas mitoses típicas e atípicas, bem como mínima ceratinização (EL-NAGGAR et al., 2017). A gradação histopatológica proposta pela OMS pode ser visualizada na tabela e na figura a seguir (Tabela 2 e Figura 1).
Tabela 2: Gradação histopatológica proposta pela OMS, baseada na diferenciação celular (EL-NAGGAR et al., 2017).
(Adaptado de EL-NAGGAR et al., 2017)
BEM DIFERENCIADO MODERADAMENTE DIFERENCIADO POUCO DIFERENCIADO Semelhança com o epitélio
de origem Muita Presente Pouca
Ceratinização Abundante Presente Mínima
Pleomorfismo celular e
nuclear Presente Evidente Predomina
Atividade mitótica (mitoses
16 Figura 1:Gradação histopatológica da OMS A Bem diferenciado; B Moderadamente diferenciado; C Pouco diferenciado (BARNES et al., 2005).
2.2.2 - Avaliação Histopatológica de Risco (AHR)
Para a aplicação da AHR proposta por BRANDWEIN-GENSLER et al. (2005) foram observados os seguintes parâmetros histopatológicos: padrão de invasão, o infiltrado linfocitário e a invasão perineural.
O padrão de invasão, foi definido pelas características infiltrativas do tumor, foi analisado na interface entre o epitélio tumoral e o tecido conjuntivo do hospedeiro, conforme descrito por BRYNE et al. (1992) e adaptado por BRANDWEIN- GENSLER
et al. (2005), recebendo mais um grau, o quinto (Grau 5), obedecendo aos seguintes
critérios: Padrão 1 - invasão compressiva, bem delineada; Padrão 2 - invasão através de cordões sólidos, bandas ou feixes em forma de dedos e ilhas tumorais grandes separadas; Padrão 3 - células infiltrando em pequenos grupos ou cordões, contendo mais do que 15 células; Padrão 4 - crescimento ou invasão difusa com dissociação celular acentuada, em pequenos grupos celulares com menos do que 15 células, e/ou células soltas, cordões de células tumorais, contendo apenas uma célula, independentemente do tamanho da ilha tumoral; Padrão 5 - padrão de invasão altamente disperso, definido por satélites tumorais de qualquer tamanho com distância de 1 mm ou mais do tecido normal interposto na interface tumor/hospedeiro. Os padrões 1, 2 ou 3 receberam zero ponto na avaliação histopatológica de risco, enquanto o padrão 4 recebeu um ponto e o padrão 5, três pontos (Figura 2).
Figura 2: Padrão de invasão tumoral A Padrão 1: frente ampla de invasão; B Padrão 2: padrão “semelhante a dedos”; C Padrão 2: pleomorfismo nuclear, apesar do padrão de invasão inócuo; D Padrão 3: ilhas na periferia tumoral com mais de 15 células; E Padrão 4: cordões de células tumorais infiltrando o tecido conjuntivo; F Padrão 4: invasão em células únicas; G Padrão 4: pequenas ilhas com menos de 15 células; H Padrão 5: ilha(s) tumorais com mais de 1 mm de tecido sadio em todo seu redor (Adaptado de BRANDWEIN- GENSLER et al., 2005).
18 O infiltrado linfocitário na interface tumor-hospedeiro foi classificado como uma variável de três níveis. O Padrão 1 foi assinalado quando o infiltrado linfocitário estava presente de forma contínua e densa. O Padrão 2 quando focos de infiltrado linfocitário denso estavam presentes na interface, mas de forma descontínua, sendo que a presença de qualquer foco inflamatório qualifica o tumor nesse nível. O Padrão 3 significa resposta limitada, sem formar focos de infiltrado ou ausência de resposta linfocitária segundo a proposta de BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005 (Figura 3 A, B e C).
Figura 3: Infiltrado Linfocitário A Padrão 1: rima densa de tecido linfóide na interface; B Padrão 2: agregados de infiltrado linfóide presente na interface (L), mas o infiltrado se mostrava descontínuo (*); C Padrão 3: resposta linfocitária limitada, sem a formação de agregados linfóides; D Invasão perineural de um nervo grande (maior do que 1 mm) (Adaptado de BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005).
A invasão perineural foi definida como o CCEB em estreita relação com o nervo ou dentro do nervo, sendo classificada como envolvendo grandes nervos (diâmetro maior ou igual a um milímetro) ou pequenos nervos (diâmetro menor do que um milímetro). Quando o tumor estava apenas adjacente ao nervo, não foi considerado invasão perineural (Figura 3 D).
Aos três parâmetros, conforme foi definido, foram atribuídos escores, o que resulta numa classificação do paciente em três níveis de risco: baixo, intermediário e alto (Tabela 3).
Tabela 3: Avaliação histopatológica de risco para o carcinoma de células escamosas de boca (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005).
Variável / Pontos 0 1 3
Pior padrão de invasão
Padrão 1: tumor invadindo amplamente o tecido; Padrão 2: tumor invade em forma de dedos; ou
Padrão3: ilhas de tumor com mais de 15 células
Padrão 4: ilhas de tumor com menos de 15 células
Padrão 5: 1 mm ou mais de tecido normal entre ilhas satélites tumorais e a
interface
Infiltrado linfocitário Contínuo e denso
Grandes agregados, descontínuos ou qualquer
foco de infiltrado
Pouco (sem formar agregados) ou nenhum
Invasão perineural Nenhum Pequenos nervos
(diâmetro <1mm) Grandes nervos ( 1mm)
Pontuação de Risco
(Soma dos Pontos) Risco de recorrência local
Probabilidade de sobrevida total
Indicação para radioterapia
0 Baixo Boa Não
1 ou 2 Intermediário Intermediário Não
3 a 9 Alto Pobre Sempre
(Adaptado de BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005)
2.2.3 - Modelo BP (botão tumoral e profundidade de invasão)
Para a aplicação do Modelo BP proposto por ALMAGUSH et al. (2014) foram observados os seguintes parâmetros: botão tumoral (B) e profundidade de invasão do tumor (D) que é medido em milímetros (ALMAGUSH et al., 2014).
Para avaliação do botão tumoral o ponto de corte foi fixado em 5 botões com até 5 células epiteliais neoplásicas em cada (<5 = baixo risco; ≥5 = alto risco) observados na frente de invasão e para a profundidade de invasão foi de 4 mm (<4 mm = baixo risco; ≥4 mm = alto risco) (Tabela 4 e Figura 4).
Tabela 4: Modelo BP (botão tumoral e profundidade de invasão tumoral). BOTÃO TUMORAL E PROFUNDIDADE DE INVASÃO TUMORAL Baixo risco Profundidade de invasão <4 mm e Botão tumoral BP
está ausente ou <5 botões.
Risco intermediário 1. Profundidade de invasão é <4mm, mas o tumor BP
20 2. Tumor BP contendo menos de 5 botões na frente de
invasão, mas com profundidade de invasão >4mm.
Alto risco Profundidade de invasão >4 mm e tumor BP com mais
de 5 botões na frente de invasão.
(Adaptado de SAWAZAKI-CALONE et al., 2015)
ou <5 botões; C Profundidade de invasão é <4 mm; D Tumor BP é formado por 5 ou mais botões (setas); E Profundidade de invasão ≥4 mm; F Tumor BP contém menos do que 5 botões (setas) na frente de invasão; G Tumor mostrando profundidade de invasão ≥4 mm; H Tumor BP ≥5 botões na frente de invasão (Fotomicrografias cedidas gentilmente pelo Prof. Dr. Ricardo Coletta).
Foram analisadas todas as lâminas contendo tumor separadas de cada caso. Para os critérios diferenciação celular, padrão de invasão e infiltrado linfocitário foram considerados os piores padrões presentes em quaisquer lâminas analisadas. Para o critério invasão perineural foi considerada a presença ou ausência em todas as lâminas analisadas. Quando presente, a classificação foi realizada pelo tamanho do nervo invadido. Para o critério botão tumoral foi considerado baixo risco (<5 botões de células na frente de invasão do tumor) ou alto risco (≥5 células na frente de invasão).
2.3 - Digitalização das Lâminas
Para estabelecer a profundidade de invasão do Modelo BP, foi digitalizada uma lâmina de cada caso, previamente selecionada, pela qualidade de inclusão e maior espessura tumoral. A profundidade de invasão tumoral foi obtida em análise microscópica avaliando desde a superfície do tumor até o ponto mais profundo da invasão tumoral (SEKI et al., 2016). Essa medida foi obtida utilizando uma ferramenta de régua a partir da análise das imagens digitalizadas na plataforma de varredura digital APERIO® ScanScopeSC e as imagens foram armazenadas em um sistema de gerenciamento e banco de dados. O sistema usa um servidor seguro com uma base de dados relacional, para armazenar dados relevantes de cada imagem. Ele permite baseado na Internet à visualização, zoom e gravação num banco de dados. Dessa forma, cada lâmina foi analisada nesse sistema para definir a medida da profundidade de invasão do Modelo BP.
2.4 - Concordância Interobservador e Intraobservador
As lâminas coradas em HE foram examinadas ao microscópio de luz Nikon®
Eclipse E200, por dois observadores inicialmente (SQCL e MBRM).
Em seguida, um módulo de ensino da OMS, AHR e Modelo BP foi desenvolvido pelos autores desse trabalho e distribuído material impresso com as
22 tabelas das classificações e espaço para anotação dos critérios avaliados, para cada caso, aos outros dois patologistas convidados. Entre os patologistas convidados, um patologista é médico e o outro é patologista bucal, vinculados a diferentes centros e instituições.
Para a avaliação interobservador, 15% do total de casos (n=46) foram selecionadas aleatoriamente da população inicial do estudo e repassadas aos patologistas convidados (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2010). Para a avaliação interobservador, os patologistas interpretaram as lâminas de forma independente, avaliando cada critério da OMS, da AHR e do Modelo BP. Para a profundidade de invasão foi estabelecida uma medida única aplicando o sistema previamente descrito. A reprodutibilidade intraobservador será avaliada em 30% do total de casos (n=89) por um patologista (SCQL), onde os casos serão recodificados e revistos após dois meses (SAWAZAKI-CALONE et al., 2015).
2.5 - Tratamento Estatístico
As análises estatísticas foram realizadas através do programa SPSS® (Statistical Package for Social Sciences), versão 20.0 para Windows.
As informações sociodemográficas, clínico-patológicas e de acompanhamento dos pacientes com CCEB foram registradas nas fichas de coleta (Anexo B), armazenadas em uma planilha do Microsoft Excel® e em um banco de dados elaborado no software Epi Info versão 3.5.1 for Windows. A análise descritiva das características sociodemográficas e clínico-patológicas foi realizada por meio de medidas de tendência central (média e mediana) e de dispersão (desvio padrão, valores mínimo e máximo) para as variáveis quantitativas e frequências absoluta e relativa para as variáveis qualitativas.
Para avaliar a associação entre as variáveis sociodemográficas e clínico- patológicas com o desfecho de interesse, classificações histopatológicas (OMS, AHR e Modelo BP) no contexto do CCEB foi realizado o teste do Qui-quadrado e, quando necessário, o teste exato de Fisher. As decisões estatísticas foram tomadas ao nível de significância de p<0,05.
Para avaliação interobservadores e intraobservadores foi aplicado o teste de
Cohen e foram calculados os valores Kappa para a concordância interobservadores
parâmetro que as compõem. Como regra, valores de Kappa <0,00: concordância ruim;
Kappa de 0,00 a 0,20: ligeira concordância; Kappa de 0,21 a 0,40: concordância justa; Kappa de 0,41 a 0,60: concordância moderada; Kappa de 0,61 a 0,80: concordância
substancial; e Kappa de 0,81 a 1,00: concordância excepcional. A maioria dos estatísticos prefere que os valores Kappa sejam maiores que 0,6 e na maioria das vezes superiores a 0,7 antes de reivindicar um bom nível de concordância (LEÃO et
al., 2017).
Foi feita a análise de sobrevida global e de sobrevida livre de doença, onde o tempo de seguimento utilizado para as análises de sobrevida foi feito em 60 meses. Uma avaliação exploratória inicial foi realizada utilizando-se o método de Kaplan- Meier com o objetivo de identificar possíveis diferenças entre as curvas para cada gradação. O teste de Log-Rank foi utilizado para comparação entre os grupos. Na análise univariada, por meio do modelo dos riscos proporcionais de Cox, as variáveis com p<0,20 foram selecionadas para o modelo múltiplo. Utilizando-se o método enter (Stepwise Forward), as variáveis previamente selecionadas foram introduzidas neste modelo, sendo a ordem de entrada definida pela significância estatística obtida na análise univariada. Foram retidas no modelo final apenas as variáveis que alcançaram significância estatística.
Para todas as análises, p-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significante.
24 3 - ARTIGO PRODUZIDO
Formatado nas normas do periódico “Journal of Oral Pathology and Medicine” ISSN: 1600-0714, 0904-2512
PROGNOSTIC VALUE OF HISTOPATHOLOGICAL GRADING SYSTEMS IN TONGUE AND FLOOR OF MOUTH SQUAMOUS CELL CARCINOMA:
STUDY OF INTER- AND INTRAOBSERVER AGREEMENT
Abstract
BACKGROUND: To assess the prognostic values of three histologic grading methods and evaluate their relationship with clinicopathologic features and survival in tongue and floor mouth squamous cell carcinoma (TFMSCC) and to correlate them with prognosis. METHODS: The slide of 308 patients with TFMSCC were evaluated according to the World Health Organization (WHO), Histopathologic Risk Assessment (HRA) and the Budding and Depth of invasion (BP) model systems. Statistical analysis was performed using Fisher’s exact or the chi-square test, for inter- and intraobserver evaluation the Cohen test, and for survival analysis the Kaplan-Meier method, log-rank test and Cox’s proportional hazard model. RESULTS: White-males, aged between 41-60 years, alcohol-drinkers and smokers were most affected. Predominated tumors moderately-differentiated (87.3%) by WHO grading, classified as intermediate-risk (50.6%) by AHR and high-risk (52.6%) by BP model. Eighty-two were identified cases of recurrence and 187 came to death. Associations between moderately-differentiated tumors by WHO and smoking (p=0.027), high-risk for AHR with tumors in advanced pathological stage (p<0.0001) and adjuvant treatment (p<0.0001), and high-risk by BD model with disease progression (p=0.005) and death (p<0.0001) were observed. Intra- and interobserver analysis, the WHO grading presented a slight concordance while the AHR and the BD Model presented moderate and substantial agreement, respectively. Patients at high-risk for AHR (p<0.0001) and BD (p=0.001) had lower overall survival (OS). Patients classified as high-risk for AHR (p=0.019) and BD model (p=0.002) had lower disease-free survival (DFS). CONCLUSION: HRA demonstrated the best results for OS and BP Model was the best for DFS prediction in TFMSCC and for intra- and interobserver analysis.
Keywords: oral squamous cell carcinoma; tumor budding; histopathological grading system; risk model; prognostic factor.
Introduction
Oral cancer is the sixth most frequent cancer in the world, accounting for 3-5% of all malignancies in both sexes. According dates from Brazilian National Cancer Institute (INCA), an estimated that oral cancer is the fifth most frequent cancer among men and the twelfth among women in Brazil for the year 2018 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018). Tobacco and alcohol are the main risk factors for its occurrence. More than 90% of all oral carcinomas are classified as squamous cell carcinoma (SCC) (EL- NAGGAR et al., 2017). The followed by the tongue and floor of mouth SCC are the sites most affected by this tumor type (HONORATO et al., 2009).
The prognosis and clinical evolution of patients diagnosed with cancer of the oral cavity depends mainly on the stage of the disease, TNM classification is a system for staging malignancy which measures 3 parameters of a cancer (T - size or extent of primary tumor; N - number of involved lymph nodes; M - presence or absence of metastases) widely adopted to characterize the tumors, propose the most appropriate therapy and estimate the survival of patients, does not allow an accurate prognosis, since it can be observed that tumors of the same stage can present different degrees of aggressiveness (PATEL & SHAH, 2005).
The histopathological classification of malignancy proposed by the WHO in 2017, was based on the degree of cell differentiation and allows the grouping of this malignant neoplasm in three categories. The oral SCC can be classified in low differentiated, moderately differentiated and well differentiated (EL-NAGGAR et al., 2017).
In 2005, BRANDWEIN-GENSLER et al., developed a novel Histological Risk Assessment (HRA) for oral SCC with strongly predictive of local recurrence and overall survival. HRA evaluates pattern of invasion, lymphocyte response and perineural invasion, assigning different scores to each characteristic and classifying the patients as low-, intermediate- and high-risk, according to the result of the received score. According to the classification, only high-risk patients would benefit from adjuvant radiotherapy, would benefit from adjuvant radiotherapy (BRANDWEIN-GENSLER et
al., 2005).
Recently, ALMAGUSH et al. (2014), introduced the BD Model in head and neck SCC, which is a histopathological classification based on two parameters: budding
26 the budding tumor was fixed in 5 clusters of neoplastic epithelial cells containing up to 5 cells in each cluster and for depth of invasion was 4 mm. Finally, results B and D were combined in a BD model to establish the risk-score, which includes the low-, intermediate-, and high-risk categories. The authors reported that the presence of the BD model on the forehead of tumor invasion is a promising prognostic factor in head and neck SCC. The budding tumor demonstrates predictive characteristics associated with the high-risk score for locoregional recurrence and low survival for patients with oral SCC. Budding represents two malignant features: cellular decohesion and active invasion. It has been suggested that its presence is a characteristic of the aggressiveness of the tumor and was initially studied and in colorectal cancer (ALMAGUSH et al., 2014).
Considering the limitations regarding the treatment and control of oral SCC, studies are needed that seek tools indicative of the prognosis of this disease, such as histopathological classifications, to reduce the mortality of patients diagnosed with oral SCC.
The aim of this study was to assess the prognostic values of three histologic grading methods and evaluate their relationship with clinicopathologic features and survival in tongue and floor mouth squamous cell carcinoma (TFMSCC) and to correlate them with prognosis.
Patients and Methods
Patients
Three hundred and eight patients with primary tongue and floor of mouth squamous cell carcinoma (TFMSCC) who were diagnosed and treated at Brazilian National Cancer Institute (INCA), Rio de Janeiro, Brazil, between 1999 and 2007 were involved in this retrospective cohort study. All the patients underwent resection of primary tumor with free margins followed by neck dissection. This study was approved by institutional ethics committee. Clinicopathological features were obtained from medical records and tumor registries and included age, gender, alcohol and tobacco use, tumor location, clinical and pathological stage, presence or absence of tumor recurrence and the survival dates of the patients.
The hematoxylin and eosin-stained slides from all cases were retrieved from the filing section of the Pathology Division (DIPAT) of INCA. The slides were categorized according the WHO grading system was applied to classify tumors into three categories: well-, moderately or poorly differentiated (EL-NAGGAR et al., 2017). Lymphocytic infiltrate, worst pattern of tumor invasion, and perineural invasion were evaluated as described in Histologic Risk Assessment (BRANDWEIN-GENSLER et
al., 2005). The BD Model was evaluated into two parameters, depth of invasion where
the measured from the surface of the tumor to the deepest point of invasive tumor and the cutoff point was 4 mm and the cut-off points for the number of tumor buds was fixed in five (low risk < 5 buds; high risk ≥ 5 buds) (ALMAGUSH et al., 2014; SEKI et al., 2016).
A single microscope was used to evaluate all the slides. Classifications were performed blindly and independently by one pathologist at two different times for intraobserver assessment. And for the interobserver evaluation, two other blind pathologies evaluated the selected cases. All the pathologists involved in this study were unaware of the patients' clinical information.
Statistical analysis
For statistical analysis, commercially available software (SPSS 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) was used. Descriptive statistics were used in a preliminary analysis of the relationship between baseline variables and outcome events. The association between clinicopathologic variables and prognostic factors was analyzed by chi-square and Fisher’s exact test. For the inter- and intra-observer evaluation, the Cohen test was applied and the kappa-value for the interobserver agreement were calculated in the WHO grading, HRA Risk Score and BD Model, as well as of each parameter that compose them. As a rule, Kappa values <0.00: poor agreement; Kappa from 0.00 to 0.20: slight agreement; Kappa from 0.21 to 0.40: fair agreement; Kappa from 0.41 to 0.60: moderate agreement; Kappa from 0.61 to 0.80: substantial agreement; and Kappa from 0.81 to 1.00: almost perfect agreement (LEÃO et al., 2017). Continuous variables were categorized to facilitate data analysis and presentation. Survival analysis was performed using the Kaplan-Meier method, and the log-rank test was used to compare curves and the Cox proportional hazards model to estimate variables with a significant independent prognostic role by means of a
28 backward stepwise elimination procedure. Tests were considered statistically significant when the p-value was <0.05.
RESULTS
This study population was composed predominantly of white (53.6%) males (78.2%), with age between 41 and 59 years old (55.8%). Most patients used tobacco (86.4%) and alcohol (80.8%) and presented with tongue tumors (54.9%) in clinical stage II (41.2%) and pathological stage IV (32.8%). Eighty-two (26.6%) cases with recurrences were identified, and most showed regional recurrence (11.4%) followed by local recurrence (11%), but most of the patients did not present disease progression (79.9%) or second primary tumor (84.4%). Moderately-differentiated tumors (87.3%) for WHO grading, intermediate-risk by the HRA Risk Score (50.6%) and high-risk by the BD Model (52.6%) were the most commonly found features. The majority of the patients were died (60.7%) (Supplementary table 1 and Figure 1).
Figure 1 : Hi st o p a th o lo g ical classif ica tio n s o f T FM S CC . W HO g rad in g : A W e d iff e re n tia te d , B M o d e rat e ly -d iff e ren tia te d a n d C P o o rl y -d iff e re n tia te d ; Hi sto log ical Ri sk A sse ssm e n t: D Low -ri sk, E In te rm e d iat e -ri sk a n d F Hi g h -ri sk; B u d d ing t u m o r a n d Dep th inva sion M o d e l: G L o w -ri sk, H In te rm e d iat e -ri sk a n d I Hi g h -ri sk.
30 The WHO grading system moderately-differentiated showed statistically significance associations with tobacco (p=0,027). According to HRA intermediate-risk, revealed statistically significance associations with low academic background (p=0.004), alcohol-used (p=0.015), tongue tumors (p=0.003), patients without disease progression (p=0.022) and without died (p=0.004). However, HRA high-risk patients presented association with tumors in advanced pathological stage (p<0.0001) and adjuvant treatment (p<0.0001). The patients with high-risk of BD Model revealed statistically significance associations with low academic background (p=0.026), tumors in initial clinical stage (p=0.012), tumors in advanced pathological stage (p<0.0001), patients having undergone adjuvant treatment (p=0.010), patients without disease progression (p=0.005) and without death (p<0.0001) (Table 1).
e 1 : Ab s olu te an d rela tiv e fr eq ue ncies o f ind e pe n de n t v ari ab les in rela tio n to sy ste m s W H O g rad ing , H R A R ic k Sco re a nd BD o d e l (No. = 3 0 8 ). A R IA B L E C A T E G O R Y W e ll N o . (% ) M o d e ra te ly N o . (% ) P o o rl y N o . (% ) p v a lu e L o w N o . (% ) In te rm e d ia te N o . (% ) H ig h N o . (% ) p v a lu e L o w N o . (% ) In te rm e d ia te N o . (% ) H ig h N o . (% ) p v a lu e Lo w ( ≤8 y ea rs ) 7 ( 2 .3 % ) 2 1 0 ( 6 9 .3 % ) 2 0 ( 6 .6 % ) 1 8 ( 5 .9 % ) 1 1 3 ( 3 7 .3 % ) 1 0 6 ( 3 5 .0 % ) 1 6 ( 5 .3 % ) 8 8 ( 2 9 .0 % ) 1 3 3 ( 4 3 .9 % ) H ig h ( >8 y e a rs ) 3 ( 1 .0 % ) 5 6 ( 1 8 .5 % ) 7 ( 2 .3 % ) 1 1 ( 3 .6 % ) 3 9 ( 1 2 .5 % ) 1 6 ( 5 .3 % ) 8 ( 2 .6 % ) 3 3 ( 1 0 .9 % ) 2 5 ( 8 .3 % ) Y e s a n d /o r e x 6 ( 2 .0 % ) 2 3 3 ( 7 5 .9 % ) 2 7 ( 8 .8 % ) 2 5 ( 8 .1 % ) 1 2 9 ( 4 2 .0 % ) 1 1 2 ( 3 6 .5 % ) 2 1 ( 6 .8 % ) 1 0 8 ( 3 5 .2 % ) 1 3 7 ( 4 4 .6 % ) No 4 ( 1 .3 % ) 3 5 ( 1 1 .4 % ) 2 ( 0 .7 % ) 4 ( 1 .3 % ) 2 6 ( 8 .5 % ) 1 1 ( 3 .6 % ) 3 ( 1 .0 % ) 1 4 ( 4 .6 % ) 2 4 ( 7 .8 % ) Y e s a n d /o r e x 6 ( 2 .0 % ) 2 2 2 ( 7 2 .5 % ) 2 1 ( 6 .9 % ) 2 0 ( 6 .5 % ) 1 2 0 ( 3 9 .2 % ) 1 0 9 ( 3 5 .6 % ) 1 8 ( 5 .9 % ) 1 0 5 ( 3 4 .3 % ) 1 2 6 ( 4 1 .2 % ) No 4 ( 1 .3 % ) 4 5 ( 1 4 .7 % ) 8 ( 2 .6 % ) 9 ( 2 .9 % ) 3 4 ( 1 1 .1 % ) 1 4 ( 4 .6 7 % ) 6 ( 2 .0 % ) 1 6 ( 5 .2 % ) 3 5 ( 1 1 .4 % ) F lo o r o f m o u th 2 ( 0 .6 % ) 5 4 ( 1 7 .5 % ) 6 ( 1 .9 % ) 7 ( 2 .3 % ) 3 1 ( 1 0 .1 % ) 2 4 ( 7 .8 % ) 7 ( 2 .3 % ) 2 8 ( 9 .1 % ) 2 7 ( 8 .8 % ) T o n g u e 7 ( 2 .3 % ) 1 4 5 ( 4 7 .1 % ) 1 7 ( 5 .5 % ) 1 7 ( 5 .5 % ) 9 8 ( 3 1 .8 % ) 5 4 ( 1 7 .5 % ) 1 3 ( 4 .2 % ) 6 9 ( 2 2 .4 % ) 8 7 ( 2 8 .2 % ) B o th 1 ( 0 .3 % ) 7 0 ( 2 2 .7 % ) 6 ( 1 .9 % ) 5 ( 1 .6 % ) 2 7 ( 8 .8 % ) 4 5 ( 1 4 .6 % ) 4 ( 1 .3 % ) 2 5 ( 8 .1 % ) 4 8 ( 1 5 .6 % ) In iti a l ( c T N M I a n d c T N M I I) 7 ( 2 .3 % ) 1 6 7 ( 5 4 .2 % ) 1 8 ( 5 .8 % ) 2 0 ( 6 .5 % ) 9 9 ( 3 2 .1 % ) 7 3 ( 2 3 .7 % ) 2 0 ( 6 .5 % ) 8 2 ( 2 6 .6 % ) 9 0 ( 2 9 .2 % ) A d va n c e d ( c T N M I II a n d c T N M I V ) 3 ( 1 .0 % ) 1 0 2 ( 3 3 .1 % ) 1 1 ( 3 .6 % ) 9 ( 2 .9 % ) 5 7 ( 1 8 .5 % ) 5 0 ( 1 6 .2 % ) 4 ( 1 .3 % ) 4 0 ( 1 3 .0 % ) 7 2 ( 2 3 .4 % ) In iti a l ( p T N M I a n d p T N M I I) 7 ( 2 .3 % ) 1 2 0 ( 3 9 .0 % ) 1 2 ( 3 .9 % ) 2 0 ( 6 .5 % ) 8 0 ( 2 6 .0 % ) 3 9 ( 1 2 .7 % ) 1 7 ( 5 .5 % ) 7 1 ( 2 3 .1 % ) 5 1 ( 1 6 .6 % ) A d va n c e d ( p T N M I II a n d p T N M I V ) 3 ( 1 .0 % ) 1 4 9 ( 4 8 .4 % ) 1 7 ( 5 .5 % ) 9 ( 2 .9 % ) 7 6 ( 2 4 .7 % ) 8 4 ( 2 7 .3 % ) 7 ( 2 .3 % ) 5 1 ( 1 6 .6 % ) 1 1 1 ( 3 6 .0 % ) Y e s 4 ( 1 .3 % ) 1 5 5 ( 5 0 .3 % ) 1 4 ( 4 .5 % ) 1 1 ( 3 .6 % ) 7 6 ( 2 4 .7 % ) 8 6 ( 2 7 .9 % ) 8 ( 2 .6 % ) 6 3 ( 2 0 .5 % ) 1 0 2 ( 3 3 .1 % ) No 6 ( 1 .9 % ) 1 1 4 ( 3 7 .0 % ) 1 5 ( 4 .9 % ) 1 8 ( 5 .8 % ) 8 0 ( 2 6 .0 % ) 3 7 ( 1 2 .0 % ) 1 6 ( 5 .2 % ) 5 9 ( 1 9 .2 % ) 6 0 ( 1 9 .5 % ) Y e s 1 ( 0 .3 % ) 5 2 ( 1 6 .9 % ) 9 ( 2 .9 % ) 3 ( 1 .0 % ) 2 5 ( 8 .1 % ) 3 4 ( 1 1 .0 % ) 3 ( 1 .0 % ) 1 5 ( 4 .9 % ) 4 4 ( 1 4 .3 % ) No 9 ( 2 .9 % ) 2 1 7 ( 7 0 .5 % ) 2 0 ( 6 .5 % ) 2 6 ( 8 .4 % ) 1 3 1 ( 4 2 .5 % ) 8 9 ( 2 8 .9 % ) 2 1 ( 6 .8 % ) 1 0 7 ( 3 4 .7 % ) 1 1 8 ( 3 8 .3 % ) Y e s 4 ( 1 .3 % ) 1 6 2 ( 5 2 .6 % ) 2 1 ( 6 .8 % ) 1 7 ( 5 .5 % ) 6 8 ( 2 2 .1 % ) 3 6 ( 1 1 .7 % ) 1 6 ( 5 .2 % ) 5 7 ( 1 8 .5 % ) 4 8 ( 1 5 .6 % ) No 6 ( 1 .9 % ) 1 0 7 ( 3 4 .7 % ) 8 ( 2 .6 % ) 1 2 ( 3 .9 % ) 8 8 ( 2 8 .6 % ) 8 7 ( 2 8 .2 % ) 8 ( 2 .6 % ) 6 5 ( 2 1 .1 % ) 1 1 4 ( 3 7 .0 % ) 0 .0 0 5 <0 .0 0 0 1 0 .0 1 0 0 .0 1 2 0 .2 3 3 <0 .0 0 0 1 D is e a s e g re s s io n D e a th T o b a c o o A lc o h o l u m o r S it e ic a l S ta g e th o lo g ic a l S ta g e A d ju v a n t re a tm e n t 0 .2 6 0 0 .3 6 3 0 .2 3 6 0 .1 7 5 H R A R is k S c o re 0 .0 2 7 0 .0 7 8 0 .7 7 8 0 .8 7 9 <0 .0 0 0 1 0 .0 2 2 0 .0 0 4 <0 .0 0 0 1 c a d e m ic c k g ro u n d 0 .5 7 9 B D M o d e l 0 .0 0 4 0 .1 6 2 0 .0 1 5 0 .0 0 3 W H O G ra d in g 0 .6 8 7 0 .1 3 5 0 .6 9 7 0 .0 2 6
32 In the analysis of intraobserver agreement, there was a significant association between the histopathological grading systems evaluated, where WHO grading (p=0.001), HRA Risk Score (p<0.0001) and BD Model (p<0.0001). However, the level of concordance for WHO grading system was slight (Kappa=0.168), for the HRA Risk Score was moderately (Kappa=0.449) and for the BD Model was considering substantial (Kappa=0.755) (Table 2).
In the interobserver analysis showed that between the main observer and the first observer had statistical significance for the classifications evaluated where WHO grading (p<0.001) and the level of agreement was moderate (Kappa=0.487), HRA Risk Score (p<0.0001) and agreement level moderate (Kappa=0.485), and for the BD Model (p<0.0001) and substantial agreement level (Kappa=0.722) (Table 3).
In the analysis of the main observer with the second observer, significant statistics were found for WHO grading (p=0.009) and for the BD model (p<0.0001). There was no significant association between the main observer and the second observer regarding HRA Risk Score (p=0.095). The level of significance was fair for the WHO grading (Kappa=0.315) and HRA Risk Score (Kappa=0.245), and slight for BD Model (Kappa=0.154) classifications evaluated (Table 3).
bl e 2 : A b so lut e a n d rela tiv e f req u e n cies a n d int rao b s e rv e r a g ree m e n t o f th e ind e p e n d e n t v a ri a b les o f W H O g rad ing , HR A Ri sk co re a n d B D M o d e l ( No. = 8 9 ).
34 The mean follow-up was 57.41 months (2.23-222.10 months). The overall survival (OS) was 51.3% and the disease-free survival (DFS) was 69.8%. By the end of this study, 187 patients (60.2%) came to death and 82 cases (26.6%) were recurrent. Patients with low academic background (p=0.044), classified as advanced pathologic stage (p<0.0001), that underwent adjuvant treatment (p=0.003) and those ranked as high- risk for HRA Risk Score (p<0.0001) and BD Model (p=0.001), presented with significantly lower OS (Figure 2).
Figure 2: OS curves of the population with TFMSCC by the Kaplan-Meier method in function of sociodemographic and clinical-pathological characteristics. The overall mean survival rates are variable, academic background, pathological stage, adjuvant treatment, HRA Risk Score and BD Model.
The variables evaluated according to the univariate analysis included in the Cox regression model were those that had p values ≤0.020. They were adjusted for age and clinical stage, and as a result, pathological stage (HR=3.44 [95% CI 2.18-5.43]
p<0.0001), adjuvant treatment (HR=1.69 [95% CI 1.09-2.62] p=0.019) and HRA Risk
Score (HR=2.11 [95% CI 1.14-3.92] p=0.001) were independent predictors of OS (Table 4).
Table 4: OS analysis: Evaluation of the risk of occurrence of death in the TFMSCC according to sociodemographic and clinical-pathological characteristics (No.= 308).
The population with advanced pathologic stage (p=0.014), those ranked as high-risk for HRA Risk Score (p=0.019) and BD Model (p=0.002), had a significantly lower DFS (Figure 3).
Figure 3: DFS curves of the population with TFMSCC by the Kaplan-Meier method in function of sociodemographic and clinical-pathological characteristics. The disease-free mean survival rates are variable, pathological stage, HRA Risk Score and BD Model.
After the univariate Cox regression, the variables included in the multivariate model were adjusted for age and clinical stage, where only BD Model (HR=2.69 [95%
VARIABLE CATEGORY HR (95% CI) p Value HR (95% CI) p Value
Female Reference Reference
Male 1.36 (0.93-1.97) -
High (>8 years) Reference Reference
Low (≤8 years) 1.46 (1.01-2.12)
-Initial (pTNM I and pTNM II) Reference Reference
Advanced (pTNM III and pTNM IV) 2.44 (1.88-3.32) 3.44 (2.18-5.43)
Yes Reference Reference
No 1.56 (1.15-2.10) 1.69 (1.09-2.62)
Well Reference Reference
Moderately 1.94 (0.72-5.25)
-Poorly 2.45 (0.83-7.17)
-Low risk Reference Reference
Intermediate risk 1.49 (0.81-2.72) 1.20 (0.65-2.21)
High risk 2.60 (1.41-4.76) 2.11 (1.14-3.92)
Low risk Reference Reference
Intermediate risk 1.44 (0.68-3.00)
-High risk 2.43 (1.18-5.00)
-* Adjusted for age and clinical stage.
HRA Risk Score
BD Model <0.0001 0.001 0.001 -WHO Grading Adjuvant Treatment 0.003 0.019 0.102 -Academic Background 0.044 -Pathological Stage <0.0001 <0.0001
OVERALL SURVIVAL Univariate Multivariate *
-36 CI 0.96-7.56] p=0.001) remained in the model, as an independent value variable in the analysis of DFS (Table 5).
Table 5: DFS analysis: Evaluation of the risk of occurrence of recurrence in the TFMSCC according to sociodemographic and clinical-pathological characteristics (No.= 308).
DISCUSSION
To investigate the prognostic value and the applicability in routine diagnosis among three histopathological grading systems; WHO Grading, HRA Risk Score and BD Model, our study evaluated its correlation with sociodemographic and clinical- pathological characteristics, and its intra and interobserver agreement. White male patients aged between 41 and 59 years predominated. Most patients used tobacco and alcohol and had localized tumors in tongue. The population profile of this study does not differ from that described in the literature (CAMISASCA et al., 2011; HONORATO et al., 2009; MARANGON JUNIOR et al., 2014; XIE et al., 2015).
The WHO grading itself recognizes the limitations in relation to the prognostic value, that most tumors are classified as moderately-differentiated, and as seen in our study and suggest that other factors be considered as a pattern of invasion and lymph node metastases (BARNES et al., 2005; BRANDWEIN-GENSLER et al., 2010; CAMISASCA et al., 2009; EL-NAGGAR et al., 2017; LINDENBLATT et al., 2012).
Several other histologic factors have been analyzed for this purpose, either solely or organized in a multiparameter grading system, as defined by Brandwein- Gensler (BRANDWEIN-GENSLER et al., 2005). Yet single histologic variables have
VARIABLE CATEGORY HR (95% CI) p Value HR (95% CI) p Value
White Reference Reference
Brown 0.57 (0.24-1.36) -
Black 1.49 (0.93-2.39)
-Initial (pTNM I and pTNM II) Reference Reference
Advanced (pTNM III and pTNM IV) 2.23 (1.17-4.24)
-Low risk Reference Reference
Intermediate risk 2.90 (0.89-9.37)
-High risk 4.10 (1.25-13.41)
-Low risk Reference Reference
Intermediate risk 1.14 (0.39-3.30) 1.15 (0.39-3.35)
High risk 2.61 (0.94-7.24) 2.69 (0.96-7.56)
Race 0.058
-DISEASE-FREE SURVIVAL Univariate Multivariate *
* Adjusted for age and clinical stage.
HRA Risk Score 0.019
-BD Model 0.002 0.001
-been disappointing prognosticators. Multiparameter histologic models are more successful than single prognosticators and have been advocated in Europe since the 1970s. A risk category was assigned by examining primary resection specimens and quantifying three significant histologic variables (1) worst tumor pattern of invasion (POI) at the advancing tumor edge, (2) perineural invasion (PNI), and (3) lymphocytic host response at the advancing tumor edge. This risk model classified patients into low-, intermediate-, and high-risk groups, which correlated significantly with local recurrence and overall survival. Validating the risk model in a new cohort can ultimately contribute to the development of new treatment paradigms (BRANDWEIN-GENSLER
et al., 2010). In this study, the adjusted multivariate analyses based on Cox regression
identified that HRA has a predictive value for OS, corroborating previous studies of this group (CAMISASCA et al., 2009; LINDENBLATT et al., 2012). The HRA risk score, first published in 2005, extends previous models and contains some unique features; there are several explanations for the improved performance of risk model (LI et al., 2013; LOURENÇO et al., 2007; SAWASAKI- CALONE et al., 2015).
Intriguingly, tumor budding, which usually resides ahead of the invasive front, has recently been suggested as a potential index of aggressiveness and poor prognosis for a number of cancer types (WANG et al., 2009; WANG et al., 2011). However, little is known about the prognostic value of tumor budding in patients with TFMSCC. In this study, we found that the 5-year survival was significantly reduced in patients exhibiting high-risk tumor budding compared with patients with low-risk budding. Our observations suggested that high-risk budding is an adverse prognostic factor for DFS in patients with TFMSCC, presenting a two-fold increased risk of recurrence when compared to patients classified as low-risk BD Model (HR=2.69 [95 %CI 0.96-7.56] p=0.001). This is in agreement with studies on other solid tumors (e.g., larynx and esophageal cancer, colorectal cancer) showing strong associations of tumor budding with a poor prognosis (ALMAGUSH et al., 2014; LEÃO et al., 2017; SEKI et al., 2016; WANG et al., 2009; WANG et al., 2011; XIE et al., 2015).
The WHO grading system is routinely used; however, it adds low to prognosis prediction and its application as a prognostic tool has been criticized over the years (ANNEROTH et al., 1987; BRYNE et al., 1989; HONORATO et al., 2009; SAWASAKI- CALONE et al., 2015). Although it was the most routinely used in the pathology ours results for WHO grading systems showed the association statistically significant
intra-38 This was in concordance with our work that all the three observers achieve moderately-differentiated at most of the tumors, main observer 87.3%, first observer 69.6% and second observer 73.9%. The use for single or combined parameters for the prognosis of oral SCC has been introduced in a number of previous studies (EL- NAGGAR et al., 2017; LEÃO et al., 2017; LI et al., 2013; SAWASAKI- CALONE et al., 2015).We agree that at real-time multi-headed microscope training sessions improve the reproducibility between pathologists applying the HRA Risk Score the level of agreement in our study between the main observer with himself (Kappa=0.449) and the first observer (Kappa=0.485) were considered moderate according Kappa test. However, in comparison with the second observer (Kappa=0.245) was considered fair agreement. In this study, in accordance with previous reports (HAYRES et al., 2010; TANAKA et
al., 2003; UENO et al., 2002; WANG et al., 2011), a good reproducibility for BD Model
evaluation was achieved based on the intra- and interobserver agreement studies (Kappa=0.755, 0.722 and 0.154, respectively).
An important advantage of budding tumor based index as prognostic indicator is the simplicity and reproducible measurement of the BD Model. It is readily adaptable to routine hematoxylin and eosin-stained slides based histopathological examination without the need for additional cost-demanding techniques. This feature is clinically important and may have therapeutic benefits for the patients with TFMSCC is one of the most significant prognostic factors for oral SCC (ALMAGUSH et al., 2014; LEÃO
et al., 2017; SEKI et al., 2016; WANG et al., 2011; XIE et al., 2015). Important
limitations were observed in this study like no one in previous studies describes how the depth of invasion is measured, so we decided to carry out a single measure that was used for all observers. HUANG et al. (2009) through a meta-analysis of reported studies established 4 mm the optimal cut-off point the depth of invasion (HUANG et
al., 2009). This research defined that measure corroborate with HUANG et al. (2009)
and other authors have also used this methodology to measure the depth of invasion (ALMAGUSH et al., 2014; ALMAGUSHSH et al., 2015). Despite the results, more studies are necessary to validate the BD Model for oral SCC (SAWASAKI- CALONE
et al., 2015).
For a histopathologic analysis to be feasible, it should be practical and reproducible, allowing its use on a large scale and in association with prognostic factors defined in the literature. After a short period of training, it was possible to apply all the classifications to the hematoxylin and eosin-stained slides. In this study, among all
grading systems evaluated, HRA Risk Score demonstrated the best results for OS and BD Model was the best for DFS prediction in TFMSCC and for intra- and interobserver analysis. There is a multiplicity of factors involved in the prognosis, as reflected by the results of the present study. Probably no single parameter can accurately predict outcome, although some emerged as independent prognostic factors on multivariate analysis.
Conflict of interest
None declared.
References
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