OBTENÇÃO DE MATRIZES DE COLÁGENO E SEROSA COM EXTRATO DE SEMENTE DE UVA
C. F. Garcia*, M. de Paula, V. C. A. Martins, A. M. G. Plepis
Instituto de Química de São Carlos - Universidade de São Paulo, São Carlos, Brasil Av. Trabalhador São-carlense, 400 - Parque Arnold Schimidt - CEP 13566-590 - São
Carlos, SP, Brasil - *e-mail: claudiogarcia@iqsc.usp.br
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo a obtenção de matrizes de colágeno e proantocianidina com potencial de uso como material hemostático. Para a obtenção das matrizes, serosa suína foi hidrolisada em meio básico com cloretos e sulfatos de Ca2+, K+ e Na+. Parte foi triturada a pH 6,0 e a outra solubilizada em ácido acético pH 3,5. As matrizes foram feitas misturando as duas partes na proporção 2:1, adicionando-se extrato a 0, 0,5 e 2%, sendo nomeadas SC, SCP05 e SCP2, respectivamente. Estas foram neutralizadas e caracterizadas por DSC, MEV e absorção em PBS. As temperaturas de desnaturação das matrizes com extrato foram próximas as da matriz SC, indicando que nessas concentrações a proantocianidina não reticula o colágeno. Observa-se um aumento na absorção de PBS, dependente da concentração de extrato. As fotomicrografias obtidas por MEV mostram morfologia porosa, com poros variando de 18 µm a 101 µm.
Palavras-chave: colágeno, serosa porcina, proantocianidina INTRODUÇÃO
A hemorragia é a perda de sangue em decorrência de um ferimento externo ou interno, sendo suas causas variadas e podem ir desde um corte até um traumatismo. Quando a hemorragia ocorre com muita perda de sangue pode levar a vítima a um estado de choque e posteriormente, a morte. O mecanismo primário de defesa do paciente para manter o sistema circulatório em alta pressão e impedir a perda de sangue após uma lesão na parede do vaso é denominada de hemostasia.
Apesar das constantes melhorias de técnicas cirúrgicas para contenção da hemorragia, sua prevenção, utilizando diversos métodos como medicamentos sistêmicos, materiais tópicos e ligaduras cirúrgicas, tem sido um grande campo de pesquisa na comunidade cirúrgica mundial(1,2).
Agentes hemostáticos absorvíveis tópicos podem ser utilizados para parar o sangramento e reter exsudados de feridas já que devem iniciar a agregação de
plaquetas, permitindo a coagulação sanguínea(3). Esses agentes podem reduzir a
perda de sangue evitando os efeitos colaterais da utilização de fármacos, transfusões de sangue além de diminuir o tempo para que ocorra a hemostasia. Com a remoção de exsudados os agentes hemostáticos podem ainda promover a cicatrização de feridas.
O colágeno é a proteína fibrosa mais abundante no corpo humano, correspondendo a 30% das proteínas totais, sendo responsável pelas principais características físicas dos tecidos que formam tendões, pele, vasos sanguíneos, intestino grosso e delgado, ossos, cartilagem e dentes. Essa proteína apresenta uma grande representatividade como biomaterial e sua extração a partir de constituintes animais tem se tornado crescente(4). Além de não ser carcinogênico e
não apresentar citotoxicidade e nem antigenicidade, o colágeno possui propriedades hemostáticas, capacidade de orientar a formação de tecidos em desenvolvimento, biodegradabilidade e capacidade de ser absorvido pelo organismo. Também possui característica de ser formulado em diferentes formas, como filmes, membranas, hidrogéis e esponjas(5).
As moléculas são passíveis de modificações que podem torná-lo mais adaptável a várias aplicações clínicas(6). O colágeno e seus derivados podem ser
submetidos à reações de reticulação, aumentando o tempo de degradação in vitro e alterando suas propriedades mecânicas(7).
O extrato de semente de uva é um subproduto da produção de vinhos e espumantes, sendo que o principal produto desse extrato é a proantocianidina. Esta substancia é um composto polifenólico e pertencem à categoria dos taninos condensados, que é conhecida por suas propriedades antioxidantes, antimicrobianas, bactericidas, anti-inflamatórias, antitumorais e antialérgicas. Além disso, pode ser utilizada como agente de reticulação dando estabilidade a ligações de hidrogênio e assim gerando estruturas de colágeno com menor biodegradabilidade(8).
Este trabalho tem como objetivo, a obtenção de matrizes de colágeno reticuladas com proantocianidina.
MATERIAIS E MÉTODOS
Serosa suína foi cortada e lavada com solução de NaCl 0,9% para a remoção contaminantes. Em seguida passou por hidrólise alcalina permanecendo numa solução contendo hidróxidos, cloretos e sulfatos de K+, Ca2+ e Na+ por um período de
72 h. Posteriormente, essa solução alcalina foi removida e a serosa passou por uma solução aquosa com os mesmos sais. Após o tratamento nessas soluções, todos os sais foram removidos da serosa por banhos em soluções de ácido bórico 3%, água desionizada e EDTA 0,3%. Lavou-se exaustivamente com água desionizada até aproximadamente pH 6,0. O material foi triturado até a obtenção de uma pasta homogênea, denominando-se esta preparação de pasta de serosa.
Uma parte da pasta de serosa foi separada e solubilizada em ácido acético de pH 3,5, depois foi homogeneizada para a obtenção do gel de colágeno.
Obtenção das matrizes
Foi feita uma mistura homogeneizando a pasta de serosa juntamente com o gel de colágeno na proporção 2:1 (em massa).
Em parte dessa mistura foi adicionado extrato de semente de uva em diferentes concentrações, calculadas a partir da massa seca da mistura serosa e gel. O extrato foi previamente solubilizado em mistura de etanol e água. Essa adição foi feita durante o processo de homogeneização, gerando assim, as matrizes:
- SC: serosa e colágeno.
- SCP05: serosa, colágeno e extrato de semente de uva na concentração de 0,5% - SCP2: serosa, colágeno e extrato de semente de uva na concentração de 2,0%
As matrizes foram liofilizadas durante 18 h, neutralizadas em solução alcalina durante 7 h e liofilizadas novamente durante 18 h.
Caracterização do Material
DSC (Calorimetria Exploratória Diferencial): foram utilizados aproximadamente 20 mg de matrizes úmidas em um suporte de alumínio hermético, sob fluxo de nitrogênio de 80 mL min-1, com razão de aquecimento de 10°C min-1 e variação de
temperatura de 5 – 120°C. O equipamento utilizado foi o DSC Mod 2010 (TA Instruments) com a temperatura de desnaturação do colágeno (Td) sendo calculada a partir do ponto médio da inflexão da curva DSC.
MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura): as análises por MEV da superfície e secção transversal das matrizes foram feitas com amostras fixadas com fita
adesiva de carbono em porta-amostras de alumínio e recobertas com uma fina camada de ouro (6 nm) e sendo utilizado um feixe de elétrons entre 10 e 20 keV em um equipamento LEO 440 (LEO Electron Microscopy Ltda), com um detector Oxford (Oxford Instruments Inc.). O tamanho médio dos poros foi estimado a partir das fotomicrografias medindo-se no mínimo 15 poros diferentes em cada matriz, com o auxílio do software UTHSCSA Image Tool®.
Cinética de absorção em Tampão PBS
As matrizes foram colocadas em frascos contendo tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4 e em intervalos de tempo específicos, foram retiradas. O excesso de solução das matrizes foi retirado com auxílio de um papel filtro com dimensões de 2 cm x 2 cm por um tempo aproximado de 5 s. As matrizes foram pesadas e retornadas aos frascos para novas tomadas de tempo. Em cada amostra o processo foi feito em quintuplicata e a quantidade de tampão absorvido pela matriz foi calculado pela média dos resultados encontrados usando a equação (A).
sendo, %sol. = percentual de solução absorvida pela esponja; mu = massa úmida e
ms = massa seca.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As matrizes obtidas estão mostradas na Figura 1 na qual se observa a presença do extrato de semente de uva por sua coloração rósea.
Figura 1: Fotografia digital das matrizes: (A) SC; (B) SCP05; (C) SCP2.
As curvas DSC para as matrizes mostram uma transição que aparece como uma descontinuidade na linha de base fornecendo a temperatura de desnaturação do colágeno. Essa desnaturação, no DSC, ocorre devido ao aquecimento e pode ser definida como a transição da hélice tripla para uma forma em que as ligações
intramoleculares são quebradas passando de uma estrutura altamente organizada a um estado aleatório, denominado de gelatina(10).
Nas curvas DSC observou-se que não ocorreu variação significativa na temperatura de desnaturação do colágeno presente nas matrizes, mesmo com a adição de 0,5 e 2 % em peso seco de extrato de semente de uva. As temperaturas de desnaturação das matrizes SCP05 e SCP2 foram de 56,7 e 56,8°C, observando-se um valor ligeiramente maior para a matriz observando-sem extrato (Tabela 1). Esobservando-ses resultados indicam que a proantocianidina nas concentrações de 0,5% e 2,0% não atua como agente reticulante do colágeno.
Tabela 1: Temperatura de desnaturação (Td, °C) do colágeno nas matrizes
Matriz Td (°C)
SC 59,3
SCP05 56,7
SCP2 56,8
A habilidade de uma matriz de reter água e eletrólitos é uma propriedade importante para avaliar sua eficácia como material hemostático, por isso o ensaio de absorção é imprescindível. Neste ensaio foi medida a absorção em PBS (Figura 2) observando-se um rápido intumescimento com uma estabilização da absorção para todas as matrizes em 30 min. A Figura 2 mostra que a matriz SCP2, ou seja, com 2% em extrato é que mais intumesce, chegando a 1810% em relação à massa inicial. A matriz SC intumesce por volta de 1370%, sendo a de menor intumescimento. É comum que uma matriz reticulada intumesça menos que a não reticulada(11), neste caso ocorre o inverso que pode ser explicado devido a grande
quantidade de hidroxilas na molécula da proantocianidina cuja presença nas matrizes as tornam mais hidrofílicas(12), aumentando a absorção de PBS. Isso
0 10 20 30 40 50 60 70 0 500 1000 1500 2000 % d e ab do rça o tempo (min)
Figura 2: Média do percentual de absorção em PBS pelas matrizes: () SC, () SCP05, () SCP2; em diferentes tempos.
A microscopia eletrônica de varredura permite definir a morfologia das microestruturas, tais como tamanho dos poros, distribuição, porosidade e interconectividade que são fatores preponderantes na interação das matrizes com meio fisiológico, promovendo ou não a absorção de líquidos fisiológicos, como o sangue.
Tabela 2: Tamanho de poros e desvio padrão (DP) para as matrizes
Matriz Tamanho de
poros ± DP (µm)
SC 34,2 ± 13,5
SCP05 50,2 ± 10,3
SCP2 77,5 ± 28,2
As fotomicrografias foram obtidas na superfície e secção transversal das matrizes. Essas fotomicrografias indicam matrizes porosas na superfície, com tamanho irregular de poros e na secção transversal, canais desorganizados. A Tabela 2 mostra que o tamanho de poros aumenta com a concentração de extrato, concordantemente com a capacidade de absorção das matrizes.
A matriz SCP2 apresentou maior tamanho de poros, entretanto com um grande desvio (77,5 ± 28,2 µm). Esse maior tamanho para os poros reflete a matriz com maior capacidade de absorção, sugerindo ser a matriz com maior potencial para agente hemostático.
Figura 3: Fotomicrografias da superficie de (A) SC, (B) SCP05, (C) SCP2, e secção transversal de (D) SC, (E)SCP05 e (F) SCP2, no aumento de 500x.
CONCLUSÃO
O extrato de semente de uva não atua como agente reticulante do colágeno, nas concentrações estudadas devido a não ter aumentando a temperatura de desnaturação das matrizes que é característico da reticulação. Diferentemente do esperado ocorreu um aumento do tamanho dos poros e da capacidade de absorção com aumento concentração de extrato, graças as características hidrofílicas da proantocianidina, indicando o possível uso da matriz como material hemostático.
AGRADECIMENTOS
C. F. Garcia agradece à FAPESP (processo n. 2015/15473-7) pela bolsa concedida
REFERENCIAS
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ABSTRACT
This study aimed to obtain collagen matrices with proanthocyanidin with potential use as hemostatic materials. In order to obtain the matrices, porcine intestinal serosa was
Part of it was crushed at pH 6,0 and part solubilized in acetic acid at pH=3,5. The matrices were prepared by mixing the two parts in a ratio of 2:1. Grape seed extract was added (0, 0,5 e 2%), and matrices were named as SC, SCP05 and SCP2, neutralized and characterized by DSC, SEM and PBS absorption. The denaturation temperatures of the matrices with grape seed extract were similar to SC matrix, indicating that in this case proanthocyanidin does not reticulate collagen. An increase of PBS absorption, dependent on the concentration of extract, is observed. SEM photomicrographs showed porous morphology, and pore diameters varied between 18 µm and 101 µm.
