ESTUDO DA MICROBIOTA FÚNGICA ANEMÓFILA DE UMA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA DE JUIZ DE FORA – MG
Josimar de Oliveira Mageste¹, Tatiana Caroline Dias Pereira²,Gabriel Araujo da Silva²,³, Rosângela Abreu Monteiro de Barros¹
RESUMO
Os fungos anemófilos são microrganismos encontrados regularmente no ar atmosférico e que podem causar incômodos como a deterioração de materiais, alergias, intoxicações e infecções. Na indústria de medicamentos, o controle dos fungos do ar é condição essencial para a garantia da qualidade do produto, bem como para a saúde das pessoas que trabalham no local. O objetivo desse trabalho foi de identificar e quantificar os fungos anemófilos presentes no interior e exterior de uma indústria farmacêutica. Os gêneros de fungos encontrados foram Cladosporium sp, Penicillium sp, Aspergillus sp, Helminthosporium sp, Dreschlera sp, Candida sp, Rhodotorula sp, Epicoccum sp, Alternaria sp, Sepedonium sp. e Mycelia sterilia. Quando comparados os resultados com outros trabalhos, verificou-se que os mesmos fungos foram isolados em trabalhos semelhantes, entretanto, não foi encontrado na literatura trabalhos sobre fungos anemófilos em indústria farmacêutica. Pode-se concluir que o nível de contaminação encontrado, não coloca em risco a qualidade dos medicamentos produzidos, nem a saúde das pessoas que trabalham nestes ambientes.
PALAVRAS-CHAVE: fungos anemófilos, controle de qualidade, indústria. ABSTRACT
The airborne fungi are microorganisms found regularly in the atmospheric air and that can cause uncomfortable as to deterioration of materials, allergies, intoxications and infections. In an industry of medicines, the control of the fungi of the air is essential condition for the warranty of the quality of the product, as well as for the people's health that you they work at the place. It was for considering this subject as fundamental that intended to the accomplishment of this work that had for objective to identify and to quantify the fungi present airborne in the interior and external of the industry and power like this to trace measures of control necessary case. The goods of fungi found in our work they were Cladosporium sp, Penicillium sp, Aspergillus sp, Helminthosporium sp, Dreschlera sp, Cândida sp, Rhodotorula sp, Epicoccum sp, Alternate sp, Sepedonium sp. and Mycelia sterilia. When we compared our results with other studies we could verify that the same fungi were isolated in similar works, in spite of we have not found in the literature works on airborne fungi in pharmaceutical industry. We could conclude that the level of contamination found it doesn't place in risk the quality of the produced medicines, nor the people's health that they work in these you adapt.
KEYWORDS: fungi airborne, quality control, industry.
1- Universidade Federal de Juiz de Fora, UFJF, Juiz de Fora,MG, Brasil. 2- Faculdade de Colíder, FACIDER, Colíder,MT ,Brasil.
3- Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Natal, RN, Brasil
Endereço para correspondência: Av. Senador Júlio Campos, 1036. Jardim Europa. Cep:78500-000. Colíder,MT. E-mail: josi_bio2@yahoo.com.br
INTRODUÇÃO
Os fungos são microrganismos ubíquos, encontrados amplamente disseminados no ar, solo e ambientes aquáticos. São seres vivos absortivos com organização celular e DNA delimitado por um envoltório nuclear. Os fungos que vivem no ar atmosférico são denominados anemófilos, sendo esse habitat o meio de dispersão mais utilizado e bem sucedido desses microrganismos. Assim, dificilmente pode existir ambiente livre de contaminação fúngica, pois esses têm o ar atmosférico como seu principal meio e suportam grandes variações de temperatura, umidade e pH. Sendo assim, são facilmente encontrados em ambientes internos (LACAZ et al., 2002).
Na indústria farmacêutica, assim como em outros tipos de indústria, como exemplo, a de alimentos, a preservação da qualidade do ar dos ambientes é ponto importante para a garantia asséptica dos medicamentos que a indústria produz. A contaminação ambiental pode trazer várias consequências, principalmente quando esta ocorre no medicamento e este é administrado em pessoas com sistema imunológico alterado, pois poderá acarretar danos imprevisíveis, bem como em pessoas que trabalham neste ambiente, uma vez que, estes são produzidos em ambientes fechados. Portanto, a higiene industrial e um monitoramento microbiológico do ar, asseguram boas condições higiênico-sanitárias evitando contaminações aos consumidores de seus medicamentos e funcionários expostos (CORRÊA, 1998; KNEIFEL, CZECH e KOPP, 2001).
A contagem e caracterização dos fungos anemófilos assim como os fatores internos e externos que levam à formação dessa microbiota, são importantes para avaliar se os locais de produção do medicamento - onde também se expõe os funcionários, possuem microbiota fúngica equilibrada para evitar possíveis contaminações e patologias provocadas por fungos oportunistas (CORRÊA, 1998; KNEIFEL, CZECH e KOPP, 2001). Considerando a escassez de trabalhos sobre fungos anemófilos isolados em indústrias farmacêuticas e a considerável preocupação com a qualidade do ar onde são produzidos medicamentos, optou-se pela realização do presente estudo.
1. CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA
As empresas produtoras de medicamentos estão regulamentadas por diretrizes que tendem a garantir a minimização da contaminação microbiana através do gerenciamento microbiológico. Para o controle da contaminação de ambientes industriais,
é necessária uma compreensão do ecossistema, dos nichos que surgem e dos fatores que colaboram para a seleção e disseminação de microrganismos (EGUCHI, 2006).
A contaminação microbiológica varia com o tipo de contaminante e de produto que foi contaminado. O risco de se encontrar materiais contaminantes reside não só na construção das salas, mas também no sistema de tratamento e de circulação do ar e nos sistemas de utilidades (VENERANDA, 2004).
A prevenção da contaminação microbiana na área de produção segue uma linha de investigação que determinará os principais carreadores de microrganismos e os pontos críticos do processo, além de um estudo dos pontos vulneráveis na linha de produção (AMARAL, 2004).
De acordo com NBR ISO 14644-1 de 2005, a qualidade ambiental da sala limpa ou da operação pode ser influenciada por alguns fatores de risco, como exemplos: (1) fatores rotineiros de contaminação ambiental (fluxo de ar, partículas em suspensão no ar, liberação de gás, gases perigosos, microrganismos, vibrações, cargas eletrostáticas, contaminação molecular e outros); (2) fluxo de pessoal e de materiais; (3) serviços, manutenção e reparos; (4) procedimentos de limpeza; (5) paradas de emergência e planejadas; (6) expansão e modificações da instalação; (7) frequência de monitoramento dos resultados da limpeza.
Salas limpas são consideradas áreas com controle ambiental definido em termos de contaminação por partículas viáveis e não viáveis. Para se atingir um bom nível de qualidade microbiana nos produtos farmacêuticos, é fundamental conhecer as fontes e os mecanismos que podem ocasionar contaminação por microrganismos. Alguns fatores como o tipo de instalação, operação de manutenção, processos produtivos, presença e atividade de pessoal podem gerar contaminação e dispersão de partículas em salas limpas (NBR ISO 14644-1, 2005; BRASIL, 2003).
A qualidade dos produtos é assegurada pela garantia de que o processo de fabricação é realizado segundo normas específicas para a obtenção de produtos eficientes, seguros e que satisfaçam aos anseios e necessidades do consumidor (PINTO, KANEKA e OHARA, 2000).
Neste contexto, a Garantia da Qualidade é o conjunto de providências tomadas visando garantir que os medicamentos estejam dentro dos padrões de qualidade exigidos, de modo a serem utilizados para os fins propostos (BRASIL, 2003).
A capacidade do microrganismo em promover o processo de deterioração depende da sua capacidade em produzir enzimas adequadas, e o risco maior no caso de produtos
farmacêuticos e cosméticos reside na extrema versatilidade de caminhos bioquímicos dos microrganismos, possibilitando a síntese de enzimas degradativas. Consequências distintas, porém sempre problemáticas, advêm desta degradação enzimática por microrganismos, podendo ser a queda da potência do princípio ativo, redução da biodisponibilidade, formação de pigmentos e odores que tornam o produto inaceitável para o usuário. A atividade microbiana pode também resultar na produção de toxinas ou na degradação do próprio sistema conservante. Exemplos de conservantes susceptíveis à degradação são a clorexidina, cetrimida, compostos fenólicos e ácido benzoico, entre outros (PINTO, KANEKA e OHARA, 2000).
2. FUNGOS ANEMÓFILOS
Segundo Mezaari et al., 2003, os fungos são dispersos na natureza através do ar atmosférico, água, insetos, homem e outros animais. São denominados fungos anemófilos, os que são dispersos pelo ar atmosférico, possuindo capacidade de colonizar habitas e substratos de forma eficiente. São encontrados na forma de esporos que quando inalados podem causar algum tipo de patologia no homem.
Os fungos anemófilos podem ser encontrados em qualquer lugar que tenha condições para o seu desenvolvimento, portando a maioria deles não causam nenhum tipo de patologia no homem quando inalados por esse. Dos fungos encontrados no ar, 87% não causam nenhum tipo de doença no homem, 10% atuam como oportunistas e 3% são patogênicos (BROOKS et al, 1998).
Quando se tornam oportunistas ou patogênicos, podem causar reações alérgicas em humanos ou doenças e quando apresentam sua distribuição aumentada para outros locais, podem aumentar o número de micoses e alergias em humanos ou animais e doenças em plantas. A habilidade dos fungos em causar doença em humanos parece ser um fenômeno acidental, diagnosticado como infecções oportunistas, com raríssimas exceções, e estaria associada ao estado imunitário do indivíduo e a sua exposição ambiental (WANKE, LAZERA e NUCCI, 2000).
Fungos anemófilos podem causar varias doenças (alérgicas ou não) quando seus esporos são inalados pelo homem, trazendo principalmente complicações no trato respiratório como asmas e rinites entre outras. Sendo assim é importante caracterizar a microbiota fúngica do ambiente para permitir avanços nos diagnósticos e desenvolvimento dos métodos de abordagem dessas doenças (MEZZARI et al., 2003).
Devido à suscetibilidade relacionada às doenças causadas por fungos anemófilos explicam-se os estudos com esses fungos, pois as doenças causadas pelo ar interno já estão entre as principais causas de pedidos de afastamento do trabalho, tanto nos Estados Unidos quanto na Europa. Indivíduos de terceira idade passam até 90% do seu tempo em ambientes fechados (ZHANG, 2004), e os poluentes contidos no ar desses ambientes podem ser tóxicos, principalmente para indivíduos suscetíveis a derrame cerebral e doenças cardíacas (QUADROS et al., 2009).
3. FUNGOS COMO ALERGÊNICOS EM AMBIENTES FECHADOS
A incidência de alergias provocadas por fungos anemófilos tem sido bastante evidenciada na literatura médica, sendo os esporos inalados pelo ar, os principais responsáveis por estas afecções, podendo também desencadear doenças infecciosas como as otites, infecções urinárias, onicomicoses, infecções oculares, infecções do trato respiratório, irritações em mucosas e pele e até fungemias provocadas por exposição de indivíduos sensíveis aos propágulos e metabólicos toxigênicos desses fungos. Sendo assim, esses tipos de patologias são preocupantes, pois esses fungos estão dispersos abundantemente no meio ambiente (CARMO et al., 2007 apud SIDRIM e MOREIRA 1999; GRUMACH 2001; LOBATO, VARGAS e SILVEIRA, 2009).
Na literatura consultada sobre fungos anemófilos, Menezes, Carvalho e Trindade, 2006, relatam em seu trabalho quatro fungos importantes desencadeadores de alergias respiratórias encontrados em uma biblioteca: Aspergillus sp, Penicillium sp, Alternaria sp e Cladosporium sp. Em seu estudo os autores relatam a importância desses organismos relacionados com a imunoterapia das alergias por ele provocadas fato que pode ser comprovado pelos sintomas em pessoas com predisposição as alergias e que frequentavam a referida biblioteca. De acordo com os autores, o gênero Aspergillus sp é um dos principais fungos anemófilos do mundo e foi isolado em todas as exposições indicando sua presença na sala da biblioteca. Os alérgenos são principalmente proteínas estranhas ou glicoproteínas com massa molecular variando geralmente entre 5.000 e 170.000 Da. Esporos e micélio de fungos são considerados um dos principais aeroalergênicos (GAMBALE, PURCHIO e PAULA, 1983; MOHOVIC et. al., 1988).
4. FUNGOS CONTAMINANTES EM INDÚSTRIAS DE ALIMENTOS E MEDICAMENTOS Os fungos do ambiente são microrganismos importantes no campo da medicina, fitopatologia, indústria, além de serem ecologicamente importantes como decompositores.
Porém, também podem ser contaminantes de alimentos causando sua deterioração, redução no valor nutricional e alterando suas qualidades organolépticas tornando-se problema de saúde pública, pois alguns gêneros desses fungos são produtores de toxinas e micotoxinas (RAVE, EVERT e EICHHON, 2001).
Como os fungos podem ser dispersos pelo ar atmosférico, pode ocorrer contaminação das plantas, antes e após sua colheita, como também durante o processamento. Entre os principais gêneros detectados no Brasil, destacam- se: Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, Penicillium e Rhizopus. A presença destes fungos em fitoterápicos pode ser prejudicial à saúde humana, uma vez que estes podem causar micotoxicoses, quando introduzidos por via oral, ou outras doenças, quando inalados. (CORRÊA, 1998; KNEIFEL, CZECH e KOPP, 2001; LACAZ et al., 2002).
Em artigo de Vecchia e Castilhos-Fortes, 2007 onde os autores estudaram a contaminação fúngica em um alimento, observaram a presença fungos produtores de micotoxinas, especialmente dos gêneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium, provavelmente oriundos de contaminação pelo ambiente. As aflatoxinas, toxinas produzidas pelo gênero Aspergillus estão relacionadas com aproximadamente 35% dos casos de câncer em humanos principalmente nos casos de câncer hepático. Já o fungo Penicillium sp presente no ar e contaminante do alimento em estudo estava relacionado com a produção de micotoxinas responsáveis por efeitos neurotóxicos, imunológicos e alterações gastrointestinais em humanos.
5. MATERIAIS E MÉTODOS: CARACTERÍSTICAS GERAIS DA ÁREA ESTUDADA A indústria farmacêutica avaliada, localiza-se no município de Juiz de Fora – MG, numa área de 682 m2 sendo dividida em duas partes, uma administrativa e outra unidade fabril.
As duas partes ocupam apenas um andar, e está uma próxima a outra, ligadas por um túnel. Na parte administrativa estão localizados os setores de vendas, contabilidade, gerência recepção, refeitório e banheiros. Na unidade fabril, estão os setores de produção, almoxarifados, Laboratórios de Controle de Qualidade, Garantia da Qualidade, salas dos farmacêuticos, refeitório, banheiros e vestiários.
A indústria possui um total de 29 funcionários, sendo 4 na parte administrativa e os outros 25 atuam na unidade fabril.
Os funcionários da unidade fabril possuem vestimenta e calçados específicos para cada atividade, não sendo permitido o acesso com essas vestimentas fora do setor de
produção. Os funcionários dos setores controle de qualidade, garantia de qualidade, responsável técnico, almoxarifado e serviços gerais também possuem vestimentas específicas para suas atividades e outras para o acesso ao setor de produção quando necessário. O acesso dos funcionários da parte administrativa aos principais setores da unidade fabril (produção e laboratórios de controle de qualidade), só é realizado quando devidamente indispensável, e é controlado pelos responsáveis por cada setor. Em nenhum momento, é permitida a circulação de qualquer funcionário com vestimenta específica nas partes externas na indústria. Alem disso, todos os funcionários desses setores, possuem treinamento para evitar contaminações cruzadas de um setor para outro.
O setor em estudo (produção) é dividido em: 1 sala de quarentena, 1 sala de amostragem matéria prima, 3 salas de matéria prima liberada, 1 corredor,1 sala apoio, 1 sala de pesagem, 1 sala produção de líquidos, 1 sala envase de líquidos, 1 sala produção de sólidos, 1 sala envase de sólidos, 1 sala embalagem e 1 sala expedição.
A indústria está no mercado há aproximadamente 80 anos e atualmente produz dois medicamentos fitoterápicos (1 sólido e 1 líquido) destinados respectivamente a problemas respiratórios em crianças e cólicas de recém-nascidos. Possui alvará de licença para funcionamento e é fiscalizada anualmente por órgãos da Vigilância Sanitária. 6. PONTOS DE COLETA
Os pontos de coleta foram determinados no setor de produção, considerando as áreas críticas para a contaminação na produção dos produtos, como salas onde eles são manipulados e envasados, salas onde há maior número de concentração de pessoas durante o período de trabalho, locais onde há maior circulação de pessoas, e onde são armazenadas as matérias – primas e os produtos finais. Além disso, também foi coletado em ambiente externo, para possíveis comparações com ambientes internos.
Os pontos de coleta foram: sala de matéria – prima liberada, corredor, sala de pesagem, sala produção de líquidos, sala envase de líquidos, sala produção de sólidos, sala envase de sólidos, sala embalagem, sala expedição e pátio.
Todas as salas em estudo (exceto corredor e pátios) são climatizadas e possuem controle diário de temperatura e umidade. Foram realizadas 3 coletas no período de julho a agosto de 2009, com um intervalo de 15 dias uma da outra, sempre as segundas-feiras. Devido à programação de produção na indústria ser realizada semanalmente, e a
periodicidade de limpeza dessas salas (todas as sextas-feiras ou após uso de cada sala) as coletas não foram realizadas todas nas mesmas condições, pois haviam salas que estavam em uso e outras não.
Foi exposta uma placa de Petri contendo Agar Sabouraud Dextrose, em cada ponto determinado anteriormente. Este método baseia-se na sedimentação de esporos dos fungos anemófilos, sobre a placa em questão, colocada em posição horizontal.
As placas foram abertas dentro da sala por aproximadamente quinze minutos de acordo com Gambale et al. (1993). Após este período foi levado ao Laboratório de Micologia do Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia, no Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal de Juiz de Fora, MG para incubação.
As placas, após a exposição, foram mantidas por quatro dias em estufa a 28ºC. Após este período as colônias foram contadas, enumeradas e descritas. As placas de Petri de cada ambiente foram identificadas com: nome do meio utilizado, data de coleta e nome da sala em que foi coletado o material.
Cada fungo crescido na placa foi identificado com os seguintes números e iniciais: 1, 2 ou 3 (indicando o numero da coleta), letras (indicando as iniciais das salas amostradas) e outro número (indicando o número da colônia).
Um representante de cada colônia foi repicado para tubos contendo o meio Agar Sabouraud dextrose para perfeito isolamento. A partir da incubação nas mesmas condições iniciais, foi realizado o microcultivo e demais técnicas necessárias à identificação dos fungos crescidos. A identificação foi feita pelos métodos micológicos descritos por LACAZ, et al., 2002 e NEUFELD, 1999. Os fungos filamentosos que não apresentavam órgãos de frutificação que permitissem a sua identificação foram repicados para tubos contendo Agar batata e Agar fubá. Quando o estado de não esporulação persistiu nesses meios, foram então classificados como Mycelia sterilia.
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todas as salas, exceto pátio e corredor, foram controladas as temperaturas e umidades nos momentos das coletas, e verificou-se que ao obedecerem aos padrões de tolerância descritos pela indústria (Temperatura < 30ºC > 15ºC e Umidade < 80 % > 40%) as temperaturas e umidades não contribuíram para o aumento ou diminuição do crescimento dos fungos (Tabela 1).
TABELA 1 - Dados relativos à temperatura e umidade das salas onde foram realizadas as coletas Pontos de
coleta
1ª coleta 2ª coleta 3ª coleta
Temp. (ºC) Umid.(%) Temp. (ºC) Umid.(%) Temp. (ºC) Umid.(%)
Matéria – prima 20,0 66 22,8 66 22,9 70 Pesagem 22,5 66 21,8 61 23,7 62 Líquidos 19,0 45 19,7 51 25,2 58 Envase de Líquidos 20,0 71 19,5 60 22,3 62 Sólidos 22,0 61 21,0 58 22,0 61 Envase de Sólidos 21,2 76 20,3 64 21,4 59 Embalagem 23,3 69 22,8 54 25,2 66 Expedição 19,5 66 21,7 67 23,8 70
Cladosporium sp foi isolado nas 3 coletas e foi o fungo de maior incidência (65 UFC). Sendo que na segunda coleta o isolamento foi menor (10 UFC). Penicillium sp foi isolado nas três coletas, sendo que na primeira em menor quantidade (1 UFC) e na terceira em maior quantidade (8 UFC). Mycelia sterilia foi coletado nas três coletas mantendo uma média entre as três coletas. A levedura Rhodotorula sp é isolada nas 3 coletas, porém a maior incidência foi na última coleta (7 UFC). Leveduras do gênero Candida sp foram isoladas em todas as coletas, sendo que na segunda coleta ela apresentou menor incidência (3UFC) (Tabela 2).
TABELA 2 – Fungos encontrados na indústria de acordo com a coleta
Fungo encontrado 1ª coleta (nº de UFCs) 2ª coleta(nº de UFCs) 3ª coleta(nº de UFCs) Total(nº de UFCs)
Cladosporium sp 31 11 22 65 Penicillium sp 1 5 8 14 Mycelia sterilia 6 3 5 14 Rhodotorula sp 1 1 7 9 Rhizopus sp 0 0 7 7 Candida sp 3 1 3 7 Epicoccum sp 0 4 0 4 Dreschlera sp 3 0 0 3 Sepedonium sp 0 1 0 1 Aspergillus sp 1 0 0 1 Helminthosporium sp 1 0 0 1 Alteranaria sp 0 0 1 1 Total (UFC) 47 26 53 126
Fungo do gênero Rhizopus sp só foi isolado na última coleta assim como Alternaria sp. Crescimento de Epicoccum sp e Sepedonium sp só foram observado na segunda coleta. Já os fungos Helminthosporium sp e Dreschlera sp só foram observados na primeira coleta (Tabela 2).
Na primeira e terceira coletas, um maior número de UFC foi contado nas placas sendo que na terceira houve um ligeiro aumento em relação às anteriores, talvez explicado pela presença de um maior número de pessoas na Sala de Envase de Sólidos, local onde se verifica normalmente um contingente menor de pessoas (Tabela 3).
Foi detectado na segunda coleta, um número de UFC correspondente à quase metade das outras duas. Provavelmente devido à limpeza prévia realizada na sala de pesagem e à ausência de pessoal na sala de Envase de Sólidos, uma vez que naquela data estava sendo processado o envase de líquidos. Nas demais salas, esta redução talvez tenha sido devido à limpeza semanal realizada na sexta-feira (antes da coleta), que foi realizada sempre às segundas-feiras (Tabela 3).
Em todas as coletas foram encontradas também algumas colônias de bactérias nas placas e consequentemente nas lâminas. O crescimento bacteriano é justificado pelo fato de nos meios utilizados para o isolamento dos fungos não conter drogas antibacterianas.
Padrões de especificações para o interior da indústria:
• Contagem de UFCs após limpeza da sala ou ate 7 dias sem limpeza: Limite permitido: < 35 UFCs.
Limite de alerta: < 25 UFCs Limite de ação: < 30 UFCs
TABELA 3 – Número de Unidades formadoras de colônias (UFCs) nas salas
Sala 1ª coleta(nº de UFCs) 2ª coleta(nº de UFCs) 3ª coleta(nº de UFCs) Total(nº de UFCs)
MP Liberada 3 0 0 3 Corredor 5 1 12 19 Pesagem 3 0 1 4 Prod. Líq. 1 4 0 5 Env. Líq. 0 0 2 2 Prod. Sólid. 4 2 5 11 Env. Sólid. 4 1 10 15 Embalagem 1 2 6 9 Expedição 3 0 3 6 Pátio 25 16 14 55
• Contagem de UFCs durante o uso da sala: Permitido: < 50 UFCs
(Protocolo Validação Limpeza de Salas)
Os locais com maior crescimento fúngico foram o pátio e o corredor respectivamente. Isto pode ser explicado pelo fato de no pátio as placas ficarem expostas ao vento (importante disseminador de esporos fúngicos), o que pode ter contribuído significativamente para isto. E, além disso, haver maior número de pessoas em circulação, por ser um local de entrada e saída de produtos de transportadoras.
O corredor, local de deslocamento de pessoas, que trazem em suas vestimentas, propágulos fúngicos do ambiente, houve o desenvolvimento maior de fungos, porém em número muito inferior ao considerado no padrão de especificação (quando a sala está sendo usada (< 50 UFC)), descrito no “Protocolo de Validação Limpeza de Áreas”, seguido pela indústria para monitorar a microbiota fúngica dos ambientes internos.
Nas demais salas, houve crescimento menor em relação ao pátio e corredor, provavelmente pelo fato da circulação de pessoas com calçados e vestimentas específicas, número de pessoas, e sanitização adequada que atende o “Manual de Boas Práticas” proposto pela indústria.
A distribuição de fungos coletados no interior e exterior (pátio) da indústria. Em todos os pontos determinados foram colocadas placas de Petri com meio de cultura para coleta, porém em algumas salas não houve crescimento, provavelmente devido suas condições de uso e limpeza.
Dentre os fungos encontrados no interior e exterior da indústria, o de maior incidência foi o Cladosporium sp. Esse fungo pode ser encontrado comumente no solo e ar atmosférico comprovando seu potencial ubíquo, que pode contaminar ambientes internos e causar alergias respiratórias às pessoas quando em contato com concentrações eladas desses fungos (BERNADI e NASCIMENTO, 2005). Porém, Lacaz et al., 2002, relata que esse microrganismo é considerado como saprófita e está associado a casos de patologias raras, sendo uma delas a cladosporiose, uma micose no sistema nervoso central, desconhecendo-se porém a porta de entrada desse fungo e os diferentes fatores que interferem na exaltação da sua virulência e de sintomatologia parecida com a de um tumor cerebral. O gênero Cladosporium sp está associado às infecções do tipo feo-hifomicose sistêmica em indivíduos imunodeprimidos, causando
infecções no cérebro com raro envolvimento dos pulmões e outras partes do corpo, tendo como via de entrada a inalação pelo trato respiratório. Esse fungo demáceo anemófilo pode estar associado a casos de feo-hifomicose cutâneas e alergias
Depois do Cladosporium sp os fungos mais encontrados na indústria foram Mycelia sterilia e Penicillium sp sendo que Mycelia sterilia manteve uma média de UFC sendo distribuídos em quase todos os locais da indústria. Esse fungo pode estar associados a casos de feo-hifomicoses, sendo já registrado no Brasil, um caso de infecção, com úlcera do terço distal do antebraço esquerdo acompanhada de febrite ascendente (LACAZ et al., 2002).
Penicillium sp é um microrganismo encontrado facilmente em solos e matéria orgânica podendo contaminar o ar atmosférico. Esse fungo está associado a patologias relativamente raras, as penicilinoses, sendo encontrado na forma de infecções broncopulmonares e infecções no ouvido externo, endocardite e ceratite. Algumas espécies de Penicillium sp são também potentes produtores de micotoxinas. A ingestão de alimentos, ou medicamentos contaminados com este fungo pode provocar intoxicações graves e fatais em alguns animais, causando também distúrbios gastrointestinais e outros, no homem (LACAZ et al., 2002). Segundo Rocha, Soares e Corrêa, 2004 esses microrganismos podem provocar além de alergias, problemas graves em imunossuprimidos e riscos para quem manipula fitoterápicos contaminados, tendo em vista a possível inalação durante o processo de manipulação.
A levedura Rhodotorula sp foi o quarto fungo mais encontrado. Membros do gênero Rhodotorula são fungos anemófilos comuns mostrando uma ubiquidade notável. Até bem pouco tempo eram consideradas saprófitas não virulentas e contaminantes comuns. No entanto, durante as duas últimas décadas, têm emergido como patógenos oportunistas, principalmente em pacientes imunodeprimidos. Relatos de casos incluem fungemia, endocardite peritonite, meningite e ventriculites associada com a infecção de cateteres e outros dispositivos intravenosos a partir de fontes ambientais ou da microbiota humana (WALSH, GROOL e HEIMES, 2004).
Candida sp e Rhizopus sp foram fungos também isolados a partir das coletas realizadas na indústria. Espécies de Candida sp são encontradas habitualmente no trato gastrointestinal, genital e cutâneo de seres humanos (MALUCHE & SANTOS, 2008). Segundo Lacaz, et al., 2002 essa levedura esta associada as infecções oportunistas – candidíases - (lesões na pele e mucosas), e serve como indicador das condições higiênicas de fômites envolvidos em alguns processos industriais. Já as espécies de
Rhizopus sp, são associadas a patogenias em vasos sanguíneos, sistema nervoso central, trato gastrointestinal e pulmões. O fungo Rhizopus sp, por pertencer a classe dos zigomicetos, está associado também à casos de zigomicoses, sendo essas, micoses subcutâneas que pode ser causadas por fungos desse gênero, que geralmente manifestam-se como uma infiltração granulomatosa crônica da submucosa nasal, estendendo-se para o tecido subcutâneo e pele da face (TODANO, et al., 2005).
Espécies de Epicoccum sp, Dreschlera sp, Helminthosporium sp, Sepedonium sp, Alternaria sp e Aspergillus sp, foram encontradas com menor freqüência no interior da indústria, sendo que Epicoccum sp e Aspergillus sp só foram isolados no corredor; Dreschlera sp e Helminthosporium sp no pátio e Sepedonium sp e Alternaria sp na Sala Envase de Sólidos, comprovando novamente a incidência desses fungos nos locais de maior circulação de pessoas e materiais. Diversas espécies de fungos alergênicos foram isolados do ar atmosférico, caracterizadas e padronizados para aplicações em diagnóstico e imunoterapia. Estudos mostraram que as proteínas extraídas da biomassa de Dreschlera foram altamente positivas em reações cutâneas alérgicas. Esta é uma das espécies mais freqüentes encontradas em diversas regiões do Brasil, incluindo o estado de São Paulo. (GAMBALE, PUCHIO e PAULA, 1983; MOHOVIC et. al., 1988).
O Epicoccum é um fungo mitospórico dematiáceo, amplamente distribuído e geralmente isolado do ar, solo e alimentos. Pode ser encontrado também em alguns animais e produtos têxteis (Doctor Fungus). O Epicoccum sp sintetiza um polissacarídeo extracelular, chamado epiglucano. Os extratos Epicoccum sp utilizados em alergia e exibem variações na composição da proteína e potência alergênicos (BISH, et al, 2000)
Drechslera está associado a casos raros de meningencefalite fatal. Mas, em alguns casos de exposição prolongada a esse fungo, pode se observar quadros de obstrução nasal, com pansinusite, erosão óssea, abscesso cerebral e sinusite (LACAZ et al., 2002).
O Helminthosporium é um fungo anemófilo que pode causar as oculomicoses, que são micoses oculares provocadas por fungos, na maioria das vezes em indivíduos imunodeprimidos (LACAZ et al., 2002).
Espécies pertencentes ao gênero Alternaria, são microrganismos frequentemente encontrados como saprófitas ou parasitos de plantas. São considerados como fungos oportunistas por excelência, pois, têm sido isolados de lesões cutâneas, osteolíticas e onicomicoses em pacientes imunodeprimidos. Esse fungo também está associado a casos de feo-hifomicoses cutâneas e a inalação de seus esporos pode provocar quadros de asma e pneumonite (LACAZ et al., 2002).
Os Aspergillus são extremamente comuns ao ambiente, estão associados principalmente a casos de aspergiloses e são adquiridos de fontes exógenas, ao contrário de Candida. A aspergilose alérgica, doença causada por esse fungo, pode ocorrer como processo benigno e tornar-se grave à medida que o paciente envelhece ou seu sistema imune está debilitado, podendo evoluir para bronquiectasia e fibrose pulmonar. A aspergilose sistêmica pode tornar-se grave e fatal a menos que diagnosticada e tratada em sua fase inicial. (MURRAY, et al, 2002). Segundo Lacaz, et al., 2002, em relação ao aparelho respiratório, esse fungo também pode causar doenças como asma brônquica extrínseca, asma brônquica, eosinofilia pulmonar, aspergiloma intracavitário, alveolite alérgica e aspergilose invasiva. São considerados oportunistas por excelência.
Comparando-se a microbiota fúngica da indústria em estudo com artigos já publicados sobre fungos anemófilos, observou-se a ocorrência dos mesmos fungos encontrados. SOUZA, VIEIRA e ARAÚJO, 2008, descrevem em seu estudo o gênero Penicillium sp como o de maior prevalência (90,26%) em ambientes pesquisados; seguido dos fungos leveduriformes (72,23%) e dos gêneros Rhizopus sp (66,66%), Aspergillus spp (25%) e Acremonium spp (13,9%). Relatando a preocupação com a frequência de fungos anemófilos em ambientes fechados que comportam demanda variável de pessoas expostas a contaminações por esses fungos.
No trabalho de Cucé et al., 1993 foi relatado que os gêneros Mycelia sterilia. Cladosporium sp. e Penicillium sp. foram os fungos mais encontrados nos ambientes hospitalares pesquisados. Esses fungos anemófilos foram encontrados em determinadas condições de temperatura, umidade, variações sazonais, métodos de limpeza dos ambientes e fluxo de pessoas nos locais de estudo.
Já em estudo realizado por Menezes, Carvalho e Trindade, 2006 em Fortaleza, os fungos predominantes no ar da cidade de foram: Aspergillus, Penicillium, Curvularia, Cladosporium, Mycelia sterilia, Fusarium, Rhizopus, Drechslera, Absidia e Alternaria.
Apesar de não serem encontrados na mesma frequência de estudos anteriores com fungos anemófilos, podemos observar que os mesmos gêneros encontrados em nosso trabalho são os mesmos isolados nos trabalhos citados. Não pudemos fazer comparações quantitativas nem qualitativas, pois não encontramos na literatura, trabalhos realizados em indústrias farmacêuticas.
Os gêneros de fungos encontrados no estudo foram os mesmos encontrados em estudos similares, sendo o nível de contaminação ambiental por fungos no interior da indústria analisada, menor que o índice mínimo determinado pelo “Protocolo de Validação Limpeza de Ambientes” elaborado pela indústria de acordo com a RDC 210.
Os fungos isolados, apesar de serem na sua maioria inócuos aos seres humanos, podem ser responsáveis por alergias e intoxicações, além de poder causar deterioração de produtos, podendo comprometer a produção de medicamentos.
O baixo índice de contaminação encontrado pode ser pelo uso de vestimentas específicas, EPIs, treinamentos de funcionários, monitoramento, e higienização correta dos ambientes. A caracterização e identificação da microbiota fúngica anemófila, foi importante para comprovar a responsabilidade da indústria, no sentido do controle qualidade do medicamento produzido e da qualidade de vida dos funcionários, demonstrando o correto procedimento descrito no “Manual de Boas Práticas” seguido na indústria.
REFERÊNCIAS
AMARAL, F. D. Contaminação Microbiana em ambiente Industrial Farmacêutico. 2004. Revista Controle de Contaminação, São Paulo, ano 6, n. 57, p. 32-37.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS- ABNT. NBR ISO 14644-1: Salas limpas e ambientes controlados associados – Parte 1: Classificação da limpeza do ar, 2005.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS- ABNT: NBR ISO 14644-1: Salas limpas e ambientes controlados associados – Parte 5: Operações. 2005.
BERNADI, E; NASCIMENTO, J. S. 2005. Fungos Anemófilos na praia do Laranjal, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.72 (1):93-97.
BISH, V.; SINGHI, B.P.; ARORA, N.; SRIDHARA, S.; GAUR, S.N. 2000. Allergens of Epicoccum nigrum grown in different media for quality source material. Allergy. v. 55 (3): 274-80.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução de diretoria Colegiada- RDC n°210, de 05 de agosto de 2003, que trata das Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 14 de agosto de 2003.
BRASIL, Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Resolução RE n° 899, de 29 de mais de 2003. Diário Oficial da União 02.06.2003.
BROOKS, Geo S. et al. Microbiologia médica. 1998. 20.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 524p.
CARMO, E. S; BELÉM, F. L.; CATÃO, R. M. R.; LIMA, E. O.; SILVEIRA, I. L.; SOARES, L. H. M. 2001. Microbiota fúngica presente em diversos setores de
um hospital público em Campina Grande – PB. RBAC, vol. 39(3): 213-216.
CORRÊA, B. Micotoxinas humanas e micetismos. In: ZAITZ, C.; CAMPBELL, I.; MARQUES, S.A.; RUIZ, L.R.B.; SOUZA, V.M., eds. 1998. Compêndio de micologia médica. Rio de Janeiro: Medsi, cap. 27, p.339-346.
CUCÉ, L. C.; ANDRADE, F. A.; SALEBIAM, A.; VACCARI, E. M. H. 1993. Flora anemófila em ambiente hospitalar. Anais Brasileiros de Dermatologia, vol. 68 (4): 201-204.
EGUCHI, Silva Yuko.2006 Ativos antimicrobianos utilizados na indústria. Revista da Sociedade Brasileira de Controle de Contaminação, São Paulo, n.35-38.
GANBALE, W.; PURCHIO, A.; PAULA, C.R. 1983. Influência de fatores abióticos na dispersão aérea de fungos na cidade de São Paulo, Brasil. Rev. Microbiol. Vol. 14: 204-214.
GRUMACH, A. S. Alergia e imunologia na infância e na adolescência. 2001. São Paulo: Atheneu, p. 16-21.
KNEIFEL, W.; CZECH, E.; KOPP, B. 2001. Microbial contamination of medicinal plants – a review. Planta Méd., v.68: 5-15
LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS. J. E. C.; VASCCARI-HEINS, E. M.; MELO, N. T. Tratado de Micologia Médica. 2002. 9ª ed. São Paulo: SARVIER. 1104p.
LOBATO, C. R., VARGAS, V. S. & SILVEIRA, E. S., 2009 Sazonalidade e prevalência de fungos anemófilos em ambiente Hospitalar no Sul do Rio Grande do Sul. Rev. Fac. Ciênc. Méd. Sorocaba, v. 11 (2): 21 – 28.
MALUCHE, M. E.; SANTOS, J. I. 2008. Candida sp. e infecções hospitalares: aspectos epidemiológicos e laboratoriais Candida sp. and nosocomial infections: epidemiological and laboratory aspects. RBAC, vol. 40(1): 65-67.
MAGANHOTO, S. S.; MELO, I. S. 1999. REQUISITOS NUTRICIONAIS PARA O FUNGO ALTERNARIA ALTERNATA. Pesq. Agropec. Bras., Brasília, v.34 (3): 499-503.
MENEZES, E. A.; CARVALHO, P. G.; TRINDADE, E. C. P. M. 2006. Fungos anemófilos causando alergia respiratória em pacientes na cidade de Fortaleza, Ceará. J. Bras. Patol. Med. Lab., vol.40 (2): 79-84.
MEZZARI, A.; PERIN, C.; JÚNIOR, S. A. S.; BERN, L. A. G.; GESU, G. D. 2003. Os Fungos e sensibilização em indivíduos atópicos em Porto Alegre, RS. Revista Brasileira de Associação Médica. São Paulo. Vol. 49, n 3.
MOHOVIC, J., GAMBALE, W.; CROC J., Cutaneous Positively in Patients with Respiratory Allergens to 42 Allergenic Extracts of Air Bone Fungi Isolated in São Paulo, Brasil. 1998. Allergologia et Immunopathologia., v. 16: 397-340.
MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S.; KOBAYASHI, G. S; PFALLER, M. A. 2002. Microbiologia Médica. 3ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara, 762p.
NELFELD, P.M.. Manual de Micologia Médica – 1999. Técnicas básicas de diagnóstico.1ª. Edição, Editora PNCQ, Rio de Janeiro.
PINTO, T. de J. A.; KANEKO, T. M.; OHARA, M. T.2000. Controle Biológico da Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos. São Paulo: Atheneu. Cap.1, p 27-28.e p 53-72.
QUADROS, M. E.; LISBOA, E. M.; OLIVEIRA, V. L.; SCHIRMER, W. N. 2009. Qualidade do ar interno em ambientes Hospitalares. Rev. Tecnologia, Fortaleza, v.30 (1): 38-52. RAVEN, P. H.; EVERT, R. F.; EICHHORN, S. E. 2001. Biologia Vegetal. 6. ed. Rio de Janeiro: GUANABARA KOOGAN S.A.
ROCHA, L. de O.; SOARES, M. M. S. R.; CORRÊA, C. L. 2004. Análise da contaminação fúngica em amostras de Cassia acutifolia Delile (sene) e Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-Chile) comercializadas na cidade de Campinas, Brasil. Rev. Bras. Cienc. Farm. Braz. J. Pharm. Sci. vol. 40 (4)
SOUZA, E. F.; VIEIRA, K. V. M.; ARAÚJO, V.G. 2008. Isolamento e Identificação da Microbiota Fúngica Anemófila em Diversos Setores do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Estadual da Paraíba. ISSN 1983-4209–Vol. 2 (2): 131-149.
TADANO, T.; PAIM, N. P.; HUEB, M.; FONTES, C. J. F. 2005 Entomoftoromicose (zigomicose) causada por Conidiobolus coronatus em Mato Grosso (Brasil): relato de caso. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.38 (2): 188-190.
TORTORA, J.T.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.6 ed. Microbiologia. 6ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2000, 827p.
VECCHIA, A. D.; CASTILHO-FORTES, R. 2007.Contaminação fúngica em granola comercial. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 27(2): 324-327.
VENERANDA, N. 2004. RDC 210 traz novas exigências para BPE. Revista Controle de Contaminação, São Paulo, p. 10-15.
WALSH, T. J., GROLL, A., HEIMES, J. 2004. Infections due to emerging and uncommon medically important fungal pathogens. Clinical Microbiology and Infection. v.10 (1): 48–66.
WANKE, B.; LAZÉRA, M.S.; NUCCI, M. 2000. Fungal infections in the immunocompromised host. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v.95, p.153-158.
