REVISTA BRASILEIRA DE REUMATOLOGIA

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REVISTA BRASILEIRA DE

REUMATOLOGIA

Comunicação breve

Pacientes com lúpus eritematoso sistêmico e síndrome

antifosfolípide secundária possuem números reduzidos de

células B CD4+ CD25+ Foxp3+ (células Treg) e células B CD3–

CD19+ circulantes

Ester Rosári Raphaelli Dal Ben

a,

**_{*, Carine Hartmann do Prado}**

a

_,

Talita Siara Almeida Baptista

a

_{, Moisés Evandro Bauer}

a

_{, Henrique Luiz Staub}

b

a _{Laboratório de Imunosenescência, Instituto de Pesquisa Biomédica, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande} do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil

b _{Departamento de Reumatologia, Hospital São Lucas, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil}

i n f o r m a ç õ e s

Histórico do artigo:

Recebido em 20 de maio de 2013 Aceito em 16 de setembro de 2013

Palavras-chave:

Lúpus eritematoso sistêmico (LES) Síndrome antifosfolípide secundária (SAFS) Células Treg

Células B CD3– CD19+

r e s u m o

Introdução: A depleção de células T CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatórias (células Treg) foi

des-crita em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) e, recentemente, na síndrome antifosfolípide (SAF) primária; até o momento, o tópico não tinha sido estudado em pacien-tes com LES e com SAF secundária (LES/SAFS).

Objetivo: Quantificar linfócitos totais, células Treg, células T CD3+ _CD19– _{e células B CD3–}

CD19+ em pacientes com LES/SAF e em controles saudáveis.

Métodos: Subtipos celulares foram imunofenotipados utilizando anticorpos monoclonais

específicos (anti-CD3CY5, anti-CD4FITC, anti-CD25, anti-Foxp3, anti-CD19PE) e citometria de fluxo.

Resultados: Participaram do estudo 25 pacientes com LES/SAF (média de idade 43,5 anos,

96% mulheres, 96% da raça branca, duração média da doença 9,87 anos, SLEDAI médio 10±5,77) e 25 controles compatibilizados para idade e gênero. Foi constatado que os núme-ros de células Treg e de células B CD3– CD19+ estavam significativamente mais baixos em pacientes com LES/SAF, em comparação com controles (todos p<0,05). As células Treg e as células B CD3- CD19+ permaneceram numericamente baixas em seguida ao controle (AN-COVA) para percentual de linfócitos totais (p<0,05). Níveis decrescentes de células Treg e cé-lulas B CD3- CD19+ circulantes tiveram correlação com escores mais elevados de atividade lúpica (rs=-0,75, p<0,0001; rs=-0,46, p=0,021, respectivamente). Os números de células Treg e de células B CD3- CD19+ não diferiam significativamente em usuários ou não usuários de cloroquina, azatioprina e corticosteroides (todos p>0,05).

Conclusões: Nesse estudo preliminar, pacientes com LES e com SAF secundária

demons-traram depleção de células Treg e de células B CD3- CD19+; a redução numérica dos dois subtipos teve correlação com aumento de SLEDAI. A depleção de células Treg pode contri-buir para a lesão autoimune observada em pacientes com LES/SAFS. O número reduzido de

* Autor para correspondência.

E-mail: esterdalbem@ig.com.br (E.R.R. Dal Ben).

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Keywords:

Systemic lupus erythematosus Secondary antiphospholipid syndrome

Treg cells CD3–_CD19+_{B cells}

a b s t r a c t

Introduction: CD4+_CD25+_Foxp3+ _{regulatory T (Treg) cell depletion has been reported in}

sys-temic lupus erythematosus (SLE) and, recently, in primary antiphospholipid syndrome (APS); the issue has not been studied in SLE patients with secondary APS (SLE/APS) so far.

Objective: To quantify total lymphocytes, Treg cells, CD3+_CD19– _{T cells and CD3}–_CD19+_{B cells}

in SLE/APS patients and healthy controls.

Methods: Cell subtypes underwent immunophenotyping using specific monoclonal

antibod-ies (anti-CD3 CY5, anti-CD4 FITC, anti-CD25, anti-Foxp3, anti-CD19 PE) and flow cytometry.

Results: Twenty-five patients with SLE/APS (mean age 43.5 years, 96% females, 96%

cauca-sians, mean duration of disease 9.87 years, mean SLEDAI 10 ± 5.77) and 25 age and sex-matched controls entered the study. It was realized that the numbers of Treg and CD3–

CD19+_{B cells were significantly lower in SLE/APS patients than in controls (all p < 0.05). Treg}

and CD3–_CD19+_{B cells remained numerically low after controlling (ANCOVA) for percentage}

of total lymphocytes (p < 0.05). Decreasing levels of circulating Treg and CD3–_CD19+_{B cells}

correlated to higher scores of lupus activity (rs = -0.75, p < 0.0001; rs = -0.46, p = 0.021, re-spectively). Number of Treg cells and CD3–_CD19+_{B lymphocytes did not significantly differ}

in users or nonusers of chloroquine, azathioprine and corticosteroids (all p > 0.05).

Conclusions: In this preliminary study, patients with SLE and secondary APS showed

deple-tion of Treg and CD3–_CD19+_{B cells; decreasing numbers of both subtypes correlated to a}

higher SLEDAI. Treg cells depletion might contribute to the autoimmune lesion seen in patients with SLE/APS. The reduced number of CD3–_CD19+_{B cells seen in these patients}

deserves more studies in order to get further elucidation.

antiphospholipid syndrome have decreased numbers of circulating CD4+_CD25+_Foxp3+_{Treg and CD3}–_CD19+_{B cells}

células B CD3- CD19+ observado nesses pacientes está a merecer estudos objetivando um aprofundamento em sua elucidação.

Introdução

Lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença multiorgâ-nica caracterizada por desregulação imune; a perda da tole-rância a autoantígenos leva à formação de imunocomplexos.1 Dados recentes em modelos humanos e murinos de LES es-clareceram o papel dos interferons do tipo I (α/β) na iniciação e perpetuação da doença.2

Os indivíduos com LES são mais sensíveis à trombose, em comparação com a população geral; e a síndrome anti-fosfolípide (SAF) é fator de risco sobejamente conhecido para obstrução vascular nesses pacientes.3 _{O motivo pelo qual} pa-cientes com LES e SAF produzem anticorpos antifosfolipídio (aPL) patogênicos é tópico que vem sendo submetido a inten-so debate.

As células T CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatórias (células Treg) constituem um subgrupo tipicamente derivado ou induzível distinto de células T com propriedades imunossupressivas singulares. O comprometimento quantitativo ou funcional dos linfócitos Treg parece direcionar o sistema imune em di-reção à autoimunidade.4_{Frequentemente observa-se um}

de-sequilíbrio entre células T helper produtoras de IL-17 (Th17) e células Treg durante o curso do LES, com importante com-prometimento do subgrupo Treg.5_{Interessa saber que o} blo-queio das células Treg por células apresentadoras de antígeno produtoras de interferon-α pode contribuir para a diminuição da tolerância periférica em pacientes com LES.6

Uma disfunção de células Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ foi do-cumentada em vários transtornos autoimunes.7_{Em casos de} LES, muitos estudos demonstraram redução numérica nas cé-lulas Treg circulantes em pacientes com a doença ativa, mas os dados ainda são conflitantes.8

Por sua vez, os linfócitos B são células essenciais em LES; essas células estão ligadas à apresentação de antígeno, sínte-se de autoanticorpos e produção de citocinas. Interessa saber que um subgrupo distinto de células B demonstrou exercer efeitos imunossupressivos;9_{essas células B reguladoras e} produtoras de IL-10, sabidamente capazes de suprimir a dife-renciação das células T helper, parecem estar funcionalmente comprometidas em pacientes com LES.10

Considerando a importância da interação entre linfócitos T, células Treg e linfócitos B na imunopatogênese do LES (5-7; 9,10), propusemo-nos a quantificar originalmente os

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linfóci-tos totais, células Treg, células T CD3+ CD19- e células B CD3- CD19+ em uma pesquisa brasileira de pacientes com LES/SAF secundária (LES/SAFS) e de controles saudáveis.

Materiais e métodos

Esse estudo transversal incluiu pacientes com LES e história de SAF secundária de nossa Clínica Ambulatorial de Lúpus. Os diagnósticos clínico e laboratorial de LES tomaram por base os critérios do American College of Rheumatology, 1997;11 para o diagnóstico de SAF, utilizamos os critérios de Sidney, 2006.12 _{A atividade lúpica foi avaliada pelo índice de atividade} de doença para o lúpus eritematoso sistêmico, SLEDAI.13

Nossos critérios de exclusão foram: 1) idade abaixo dos 16 anos; 2) endocardite infecciosa ou outras infecções con-comitantes; 3) diabetes melito; 4) neoplasias (em curso ou pregressas); e 5) infecção pelo vírus da imunodeficiência hu-mana ou por Treponema pallidum. O grupo de controle foi for-mado por indivíduos saudáveis com mais de 16 anos de idade, compatibilizados por idade e gênero e não portadores de SAF, transtornos do tecido conjuntivo, neoplasias ou infecções em curso. Os dados clínicos e demográficos foram obtidos de revi-sões do prontuário médico e de entrevistas com pacientes ou suas famílias, em seguida à obtenção do consentimento in-formado. O estudo foi aprovado pela comissão de ética local.

Os subtipos celulares foram imunofenotipados com o uso dos anticorpos monoclonais específicos CD3CY5, anti--CD4FITC, anti-CD25, anti-Foxp3 e anti-CD19PE (Biosciences, San Jose, CA, EUA) e identificados por citometria de fluxo mul-ticolorida.14

A análise estatística quantitativa foi realizada usando o programa SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O nível de significância foi estabelecido em a=0,05 (bilateral). Os resulta-dos foram publicaresulta-dos na forma de média e desvio-padrão ou por frequências absolutas e relativas. A análise estatística foi efetuada pelos testes t de Student e de Mann-Whitney para variáveis contínuas, e pelo teste do qui-quadrado ou exato de Fisher para variáveis categóricas. Utilizamos o teste de Pear-son para correlação dos subtipos celulares circulatórios com SLEDAI. Fizemos uma análise de covariância (ANCOVA) para a avaliação das relações entre variáveis.

Resultados

Vinte e cinco pacientes com LES/SAF e 25 controles saudáveis ingressaram no estudo. Em nossa pesquisa de LES/SAF, houve grande predomínio de mulheres (96%) de meia-idade (média de idade 43,5 anos). Vinte e quatro pacientes (96%) perten-ciam à raça branca. A duração média da doença era de 9,87 anos e o escore SLEDAI médio foi de 10±5,77. No momento da avaliação, artrite (36%), úlceras orais (32%), erupção malar (24%), convulsões (16%), nefrite (12%) e leucopenia (8%) eram as manifestações mais frequentes de LES. Todos os pacientes apresentavam anticorpos antinucleares e 40% demonstraram positividade para anti-dsDNA. Foram observados baixos ní-veis de complemento em 8% dos pacientes.

Quanto aos aspectos clínicos da SAF, trombose venosa profunda (TVP) foi diagnosticada em 15 pacientes (60%), en-quanto morte fetal (assim considerada depois de 12 semanas de gestação) ocorreu em 6 pacientes (24%). Neurite óptica foi observada em 4 casos (16%). Derrames e abortos foram verifi-cados em 3 casos, cada (12%). Níveis moderados ou elevados de anticorpos anticardiolipina (aCL) foram detectados em 21 pacientes (84%), ao passo que o anticoagulante do lúpus esta-va presente em nove pacientes (36%). Catorze pacientes (56%) estavam em regime de anticoagulação oral com varfarina e o restante estava sendo medicado com aspirina em baixas do-ses.

Cloroquina, azatioprina e corticosteroides estavam sendo utilizados por 9 (36%), 5 (20%) e 16 pacientes (64%), respecti-vamente.

A tabela 1 compara os aspectos demográficos e os subgru-pos de linfócitos de pacientes com LES/SAF e controles. Os dois grupos demonstravam homogeneidade quanto à idade, ao gênero e à raça. O número médio de células Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ e de células B CD3– CD19+ estava significativa-mente mais baixo em pacientes com LES/SAF, em comparação com controles. O número médio de linfócitos totais, células T CD3+ CD19– e linfócitos T CD4+ _CD25+_{não diferiu} significati-vamente entre grupos.

Os pacientes com LES/SAF estavam mantendo um nú-mero significativamente mais baixo de células Treg em se-guida ao controle (ANCOVA) para o percentual de linfócitos

Tabela 1 – Dados demográficos e de subgrupos de linfócitos em 25 pacientes com lúpus eritematoso sistêmico/síndrome antifosfolípide secundária (LES/SAFS) e 25 controles saudáveis

LES/SAFS Controles p

(n = 25) (n = 25)

Média de idade (anos ± DP) 43,5 ± 12,84 43,80 ± 8,45 0,93a

Mulheres 24 (96%) 24 (96%) 1,00a

Raça branca 24 (96%) 24 (96%) 1,00a

Linfócitos totais 29,42 ± 4,57% 2227,86±528,83 células /μL 32,2 ± 2,49% 2523,60±528,83 células /μL 0,13b

Linfócitos T CD3+ CD19- 73,72 ± 8,34% 1522,52±527,20 células /μL 73,64 ± 7,70% 858,38±194,32 células /μL 0,100b

Linfócitos T CD4+ CD25+ 1,28 ± 0,89% 20,50±9,35 células /μL 1,81 ± 0,80% 45,68±20,19 células /μL 0,81b

Linfócitos T CD4+ CD25+ Foxp3+

0,74 ± 0,34% 21,61±12,70 células /μL 1,83 ± 0,77% 46,18±19,43 células /μL <0,0001b

Linfócitos B CD3– CD19+ 5,71 ± 2,66 % 136,34±92,68 células /μL 9,25 ± 3,00% 233,43±75,71 células /μL 0,006b

DP, desvio-padrão.

a_{Teste do qui-quadrado.}

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totais (F=28,50, p<0,0001). A expressão de FoxP3 em células CD4+CD25+, conforme estimativa pela intensidade média da fl uorescência, não diferiu em pacientes com LES/SAF e em controles (2660,55±1044,06 vs. 2470,65±1732,87; p=0,67, res-pectivamente). Pacientes com LES/SAF persistiram com um percentual signifi cativamente mais baixo de células B CD3– CD19+ em seguida ao controle para linfócitos totais (F=13,17; p=0,002).

A fi gura 1 ilustra a distribuição dos linfócitos totais, células Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ e linfócitos B CD3– CD19+ em paci-entes com LES/SAF, em comparação com controles.

A fi gura 2 ilustra o teste de Pearson para correlação de cé-lulas Treg e cécé-lulas B CD3- CD19+ circulantes com SLEDAI. Foi obtida uma correlação negativa signifi cativa de ambos os sub-tipos celulares com SLEDAI, indicando que menor número de células Treg e de células B CD3- CD19+ estava ligado a escores mais elevados de atividade lúpica.

Os níveis de células Treg circulantes não variou signifi cati-vamente entre usuários ou não usuários de cloroquina, aza-tioprina e corticosteroides (p=0,90; p=0,76 e p=0,29 no teste do qui-quadrado, respectivamente). Dentro dessa mesma linha, o número de células B CD3- CD19+ não diferiu signifi cativa-mente em usuários ou não usuários desses medicamentos (p=0,462; p=0,512 e p=0,341 no teste do qui-quadrado, respec-tivamente).

Ao compararmos seletivamente os subtipos celulares em 5 pacientes com LES/SAF inativo (SLEDAI <4) e 25 controles sau-dáveis, apenas a população de células B CD3- CD19+ perma-neceu reduzida no primeiro grupo (5,37±1,95% × 9,25±3,00%; p=0,003; teste t de Student).

Discussão

Uma série de relatos implicou redução de células Treg em pa-cientes com LES.15-17_{Até onde vai nosso conhecimento, esse}

estudo é o primeiro sobre células Treg e linfócitos B circulan-tes em paciencirculan-tes brasileiros com LES e SAF secundária. Nossa pesquisa envolveu predominantemente mulheres brancas de meia-idade com SLEDAI elevado e duração média da doen-ça de aproximadamente uma década. Artrite e úlceras orais foram os achados mais importantes no LES, enquanto TVP e anticorpos aCL foram as características essenciais de SAF.

Notamos redução no número de células B CD3- CD19+ circulantes em nossos pacientes com SLE/SAF, em compara-ção com controles. É importante citar que não foi observada associação de contagem das células B CD3- CD19+ com uso de cloroquina, azatioprina e esteroides. As razões para essa diminuição das células B em pacientes com LES/SAF são ne-bulosas, mas uma explicação poderia ser a de autoanticor-pos direcionados para linfócitos B, ou defeitos intrínsecos de subgrupos de células B. O fato da confi rmação da depleção de células B, mesmo nos 5 pacientes com LES inativo, poderia falar em favor dessa última razão. Podemos apenas avançar a hipótese de que a população com depleção de células B seja o

Figura 2 – Correlação do teste de Pearson de células Treg circulantes (A) e de células B CD3-CD19+ com atividade de lúpus avaliada pelo índice de atividade de doença para o lúpus eritematoso sistêmico (SLEDAI). *Teste t de Student Figura 1 – Distribuição gráfi ca de linfócitos totais (A),

Células Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ (B) e células B CD3– CD19+ (C) em controles e em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico/síndrome antifosfolipoide secundária (LES/SAF). *Teste t de Student. rs=-0.75, p<0.0001* rs=-0.46, p=0.021* %CD4 +CD2 5+ FO XP3 + %CD3 -CD1 9+ SLEDAI SLEDAI 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 A) B) % de linfócitos totais Controles Controles Controles LES/SAF LES/SAF LES/SAF

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subgrupo produtor de IL-10 com propriedades imunossupres-soras. É digno de nota que células B competentes parecem ser importantes na deflagração da atividade das células Treg, conforme ficou demonstrado em pacientes com imunodefici-ência variável comum.18

Observamos uma redução numérica de células Treg CD4+ CD25+ Foxp3+ circulantes em nossos pacientes com LES/SAF, em comparação com controles. Conforme ocorreu com o sub-tipo de linfócitos B, a depleção de células Treg foi conformada em seguida ao controle (ANCOVA) para contagem de linfóci-tos totais. Níveis decrescentes de células Treg circulantes, da mesma forma que o observado com o subgrupo CD3– CD19+, tiveram correlação com escores mais elevados de atividade da doença. Níveis reduzidos de células Treg foram associados com LES ativo,19,20 _{mas outros relatos}21,22_{questionaram esse} achado. Em nosso estudo, a depleção de células Treg pode ser representativa de um defeito intrínseco relacionado a LES/ SAF precedente, ou a uma atividade corrente de LES. Pacien-tes com LES inativo não exibiam redução de células Treg, o que favorece a segunda hipótese. É digno de nota que também não houve associação entre redução nas células Treg e uso de cloroquina, azatioprina ou esteroides em nossos pacientes.

Recentemente, nosso grupo relatou baixos níveis de célu-las Treg e também de célucélu-las B CD3- CD19+ circulantes em pacientes com SAF primária.23_{Esses dados, em combinação} com o presente estudo, implicam ocorrência de depleção dos dois subgrupos em populações com SAF, como um todo. Se essa suposição for confirmada, a redução nas células Treg pode comprometer um dos imunomecanismos conducentes a respostas aPL patogênicas em pacientes com SAF primária ou secundária. Não obstante, devemos ter em mente que a redução de células Treg em pacientes com LES/SAF parecia es-tar mais relacionada à atividade de LES do que com qualquer outro fator em particular.

Dados recentes permitiram definir que qualquer análise quantitativa de células Treg em pacientes com transtornos autoimunes deve ser examinada com alguma cautela. As cé-lulas Treg exibem formidável plasticidade e compreendem uma população heterogênea de células supressivas, células Treg não funcionais e células Treg produtoras de IL-17ª atu-ando como linfócitos T efetores. Assim, a simples contagem numérica de células Treg talvez não seja verdadeiramente re-presentativa de seu estado funcional.24

Devemos também mencionar outras limitações de nosso estudo. Embora a maioria dos nossos pacientes tenha exibido LES ativo, as manifestações trombóticas de SAF não eram cor-rentes; futuros estudos deverão investigar a função biológica das células Treg e dos linfócitos B durante o evento trombótico e também em uma análise longitudinal. Tendo em vista a pe-quena amostra, não pudemos subgrupar os pacientes por ca-racterísticas de LES/SAF ou por dose dos medicamentos. O pe-queno número de pacientes com LES inativo limitou a potência estatística do artigo. Do mesmo modo, a não comparação com pacientes com LES e sem SAF limitou nossas conclusões.

Até o momento, os tratamentos de LES e SAF têm sido fundamentados na imunossupressão e na anticoagulação, respectivamente. Está sendo tentada uma abordagem imu-nomodulatória direta que faz pender o equilíbrio em favor das células Treg, com a terapia com células Treg autólogas em pacientes com diabetes tipo 1;25_{essa intervenção poderia}

se mostrar promissora também para LES e SAF. Recentemen-te, constatou-se que as células Treg teriam a propriedade de prolongar o intervalo de remissão induzida por medicamen-tos cimedicamen-tostáticos convencionais em camundongos de lúpus (NZB×NZW) F1.26

Embora permaneçam ainda sem resposta muitas pergun-tas relacionadas à patogênese do LES e da SAF, é possível que a progressão da doença resulte de uma interrupção na auto-tolerância periférica dependente das células Treg. Nesse con-texto, a imunoterapia baseada em células Treg poderia ocupar um espaço na manutenção da remissão da doença nesse gru-po de pacientes.

Em conclusão, esse estudo preliminar demonstrou a ocor-rência da redução numérica de células Treg CD4+ CD25+ Foxp3 + e de linfócitos B CD3– CD19+ em pacientes brasileiros com LES e SAFS. Contagens celulares mais baixas foram ob-servadas em pacientes com maior atividade do LES. Estudos futuros deverão confirmar se a redução dos níveis de célu-las Treg está conectada à imunorreação anormal observada em pacientes com LES/SAF. O decréscimo das células B CD3– CD19+, observado nesses pacientes e possivelmente ligado à disfunção das células Treg, também justifica a realização de estudos em busca de maiores esclarecimentos.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

R E F E R Ê N C I A S

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