Ciclodextrinas como Plataforma de Desenvolvimento de Sistemas de Liberação Controlada de Inibidores de Urease: Uma Investigação Teórica

Coordenadoria do Curso de Química

Ciclodextrinas como Plataforma de

Desenvolvimento de Sistemas de Liberação

Controlada de Inibidores de Urease: Uma

Investigação Teórica

Sayron Reis

CICLODEXTRINAS COMO PLATAFORMA DE

DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO

CONTROLADA DE INIBIDORES DE UREASE: UMA

INVESTIGAÇÃO TEÓRICA

Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso,

apresentado no 1º semestre do ano de 2014 ao

Curso de Química, Grau Acadêmico Bacharelado,

da Universidade Federal de São João del-Rei,

como requisito parcial para obtenção do título

Bacharel em Química.

Autor: Sayron Reis

Docente Orientador: Clebio S. Nascimento Jr.

Modalidade do Trabalho: Pesquisa

O presente trabalho envolveu a aplicação de métodos quanto-mecânicos de estrutura eletrônica no estudo do processo de formação de complexos de inclusão do tipo hóspede/hospedeiro envolvendo compostos inibidores da urease (CIU’s), conhecidos como análogos de Biginelli, e ciclodextrinas (CDs). Como resultados importantes deste trabalho é possível destacar que após análises estruturais e energéticas envolvendo este processo, concluiu-se que a profundidade da inclusão da molécula hóspede na cavidade das CDs, o tamanho da cavidade das CDs, bem como o número de interações intermoleculares estabelecidas entre as moléculas hóspedes e hospedeiras, desempenham um papel fundamental na estabilidade dos complexos supramoleculares 2:1 formados. Além disso, pode-se comprovar a eficácia da metodologia sequencial PM3/DFT no estudo deste processo.

1.Introdução pág. 1 2. Objetivos pág. 6 3. Metodologia pág. 7 4. Resultados e discussão pág. 8 5. Conclusão pág. 16 6. Referências bibliográficas pág. 17

1

1. INTRODUÇÃO

1.1

–

A ureia como fertilizante

A demanda mundial por alimentos cresce a cada ano principalmente em decorrência do aumento da população. Um fato preocupante é o atendimento desta demanda por alimentos num cenário no qual os recursos, tais como água e área cultivável, estão cada vez mais escassos. De fato, a agricultura brasileira consume aproximadamente 65-70% da água utilizada no Brasil e esse percentual tende a aumentar proporcionalmente ao aumento da demanda por áreas cultivadas.1,2

Adicionalmente, os solos brasileiros possuem, em sua maioria, limitações de fertilidade natural devido a sua acidez, exigindo, portanto, um manejo tecnificado para garantir a produtividade agrícola. O manejo tecnificado inclui o plantio direto, o uso de corretivos do solo, o combate à erosão, além do uso intensivo de fertilizantes.3

Os fertilizantes desempenham um papel fundamental na produção de alimentos, garantindo alta produtividade e qualidade dos produtos agrícolas. Porém, mesmo em um país com vocação agrária como o Brasil, tem-se uma indústria brasileira de fertilizantes muito dependente de matérias-primas importadas. A existência desta dependência tornou-se ainda mais preocupante a partir de 2007/2008 quando houve um aumento em mais de 200% no preço de fertilizantes e suas matérias-primas. Isso ocorreu devido ao aumento da demanda desses produtos para atender principalmente às lavouras de cana-de-açúcar, tendo em vista a recuperação das cotações no mercado do açúcar e do álcool, além da demanda na produção de grãos para a produção de biodiesel.4

A ureia é o fertilizante nitrogenado sólido mais empregado no Brasil (aprox. 60% do total de fertilizantes nitrogenados comercializados) devido, entre outros fatores, ao baixo custo por unidade de nitrogênio (N), à facilidade de fabricação e ao custo final para o agricultor. Adicionalmente, a ureia apresenta menor atividade degradante às plantas, é compatível com um grande número de outros fertilizantes e defensivos agrícolas, possuindo alta absorção foliar.5 _{Porém, a principal desvantagem}

em relação ao uso da ureia como fertilizante é a possibilidade de grandes perdas de nitrogênio devido à ação da enzima urease, uma proteína encontrada em microrganismos, plantas e animais.6 _{À medida que a ureia vai sendo aplicada ao solo,}

esta sofre hidrólise enzimática liberando nitrogênio amoniacal, de acordo com as equações 1 e 2:

2

em pH ≤ 6,3 (1)

em pH > 6,3 (2)

A atividade da urease é cerca de trinta vezes menor em lavouras feitas sob plantio direto, ou seja, sem a presença de resíduos vegetais em comparação com lavouras feitas sob resíduos de cultura.6

De forma a contornar as perdas de nitrogênio pela ureia e, consequentemente melhorar a produção agrícola, algumas propostas tem sido relatadas na literatura, a citar: i) a modificação química da estrutura da ureia; ii) o uso de inibidores de urease, visando à redução/inibição da velocidade de hidrólise da ureia; iii) a produção de fertilizantes baseados em complexos de inclusão ou polímeros que permitem a liberação controlada da ureia; iv) uso de inibidores de nitrificação e etc. 7-10

1.2 – Inibidores da urease

O desenvolvimento de fertilizantes capazes de manter a estrutura da ureia quando esta é aplicada no solo tem sido uma busca constante de pesquisadores que atuam nessa área. Esses compostos são denominados inibidores da urease, os quais devem ser capazes de reduzir a velocidade de interconversão da ureia em amônia. O inibidor mais importante relatado na literatura é o tiofosfato de oxo-N-n-butiltriamida ou oxo-N-n-butiltriamida do ácido tiofosfórico (NBPT)11_{, apresentado na figura 1. Porém, o}

NBPT apresenta algumas desvantagens, tais como a perda de sua eficiência em função do armazenamento e da temperatura.

H

₃

C

(CH

₂

)

₃

NH

P

NH

₂

NH

₂

O

Figura 1. Estrutura do composto NBPT.

Estudos mostram que após 60 dias de armazenamento a uma temperatura de 25°C há uma perda de inibição da urease de 87%. Foi observado também que em

3

temperaturas mais elevadas, o composto NBPT perde parte de sua atividade inibitória.12,13 _{Nesse sentido, pesquisas vem sendo realizadas com o intuito de se obter}

novos inibidores da urease que sejam efetivos e que não agridam o meio ambiente. Neste contexto, visando contribuir para esta área estratégica de pesquisa governamental, uma rede de pesquisadores de diversas instituições (UFMG, UFV, UFSJ, UEL, EMBRAPA) tem atuado, desde o início de 2011, no projeto “Criação de uma Rede de Estudos para o Desenvolvimento de Novos Inibidores de Urease de Interesse Agrícola” sob coordenação do Prof. Dr. Ângelo de Fátima (DQ/UFMG), aprovado no edital CNPq 22/2010– REPENSA. Cabe ressaltar que o Prof. Clebio Soares Nascimento Júnior (UFSJ) e a Profa. Luciana Guimarães (UFSJ) estão envolvidos no desenvolvimento das etapas relacionadas à modelagem molecular de inibidores da urease do projeto REPENSA.

Algumas moléculas, as quais são produtos da reação da reação de Biginelli, vêm apresentando resultados promissores como inibidores da urease. A reação de Biginelli, representada esquematicamente na equação 3, se caracteriza por uma reação multicomponente, com altos rendimentos, cujos reagentes são aceto-acetato de etila, benzaldeído e ureia:

( (3)

O aldeído é o reagente com maior passividade a sofrer alterações em sua estrutura com o objetivo de gerar os diferentes análogos de Biginelli. Suas substituições em posições meta levam a um maior rendimento.14

Estudos experimentais de síntese e caracterização de diversos compostos análogos de Biginelli tem sido realizados pelo grupo de pesquisa do Prof. Dr. Ângelo de Fátima (UFMG). Vários compostos foram sintetizados (figura 2), sendo que alguns deles apresentaram atividades bastante promissoras na redução/inibição da ação da urease, tanto in vitro, quanto no solo. No entanto, tais moléculas possuem baixa solubilidade em diversos solventes polares. Para contornar esse problema, uma estratégia bastante viável é a obtenção de complexos de inclusão com moléculas “hospedeiras” apropriadas com o intuito de se melhorar a solubilidade e estabilidade dos compostos hóspedes.

4 Figura 2. Análogos de Biginelli previamente sintetizados com suas respectivas siglas

para identificação.

5 O OH HO OH O O OH HO OH O O OH OH OH O O O OH OH HO O OH OH HO O O OH HO HO O n

1.3 – Ciclodextrinas: Sistemas de liberação controlada

As ciclodextrinas (CDs) constituem interessantes macrociclos orgânicos do ponto de vista da Química Supramolecular.15 _{Especialmente na área de bioquímica e}

biomateriais, as CDs são consideradas importantes blocos construtores em estruturas supramoleculares devido a importantes aplicações e às suas características multi-funcionais, sua capacidade de auto-organização e bioadaptação.16,17

As CDs são oligossacarídeos cíclicos formados por unidades de D-glicose unidas por ligações covalentes

α

-(1,4), conforme apresentado na figura 3(a). A estrutura dessas moléculas possui a forma de uma seção de cone com as hidroxilas secundárias das posições C2 e C3 direcionadas para o lado mais largo da seção e as hidroxilas primárias em C6 voltadas para a parte mais estreita da seção (Figura 3b). A estrutura cíclica das CDs cria uma cavidade de dimensão variada (diâmetro ~5,7- 9,5Å) definida pelos oxigênios glicosídicos e hidrogênios nas posições C3 e C5. A dimensão da cavidade é função do número de unidades de D-glicose (n) na estrutura, de acordo com a figura 3(a), sendo n= 1, 2 e 3, a partir das cinco unidades de glicose apresentadas, as quais são conhecidas como

α-, β- e γ-CD, com 6, 7 e 8 unidades de

glicose ligadas,

respectivamente.18

(a)

Figura 3. (a) Estrutura geral de ciclodextrinas: α, β e γ-CD definidos por n = 1, 2 e 3,

respectivamente. (b) Representação esquemática da estrutura tridimensional de ciclodextrinas.

6

No que se refere à formação de compostos de inclusão do tipo hóspede-hospedeiro, as formulações com CDs podem acarretar em novos sistemas com propriedades físicas, químicas e biológicas melhoradas em comparação aos já existentes devido, especialmente, à proteção molecular adquirida pelo composto, que está inserido no sistema macromolecular. Dentre estas propriedades destacam-se: (i) Aumento da estabilidade das moléculas hóspedes inclusas contra hidrólise, oxidação e fotodecomposição; (ii) Aumento da solubilidade das moléculas inclusas em água; (iii) Liberação melhorada; (iv) Aumento da biodisponibilidade; (v) Prevenção da evaporação.19

2. OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi a aplicação de métodos semi-empíricos e da Teoria do Funcional de Densidade (DFT) no estudo do processo de formação de complexos de inclusão de alguns compostos inibidores da urease análogos de Biginelli (CIUs) previamente sintetizados e escolhidos para estudo (figura 4) com ,  e  -ciclodextrinas (CDs), na estequiometria 2:1, ou seja 2 CDs (espécie dimérica) para 1 análogo de Biginelli. O processo de inclusão é representado esquematicamente na figura 5. Nesse contexto, a compreensão do mecanismo e fatores que influenciam a formação de tais complexos supramoleculares, bem como de suas propriedades energéticas, é fundamental para o desenvolvimento e aplicação destes como novos sistemas mais eficazes do ponto de vista químico e biológico.

Figura 4. Compostos análogos de Biginelli selecionados para estudo em função de

7

CD CIU Complexo 2:1 (CD...CIU)

Figura 5. Representação esquemática do Modo de inclusão 2:1.

Os objetivos específicos do trabalho foram: (i) Análise estrutural e energética de alguns compostos inibidores da urease previamente sintetizados (hóspedes); (ii) Análise estrutural e energética das distintas ciclodextrinas (hospedeiros); (iii) Análise estrutural e energética dos complexos de inclusão formados pelos inibidores da urease com as CDs.

3. METODOLOGIA TEÓRICA

A previsão teórica adequada de estruturas, interações intermoleculares e elucidação de mecanismos de reações necessitam de níveis de teoria acurados, considerados hoje como o estado da arte em cálculos de estrutura eletrônica. Entretanto, cálculos nesses níveis para sistemas supramoleculares não são possíveis com a atual tecnologia computacional. Neste sentido, existem métodos e metodologias alternativas, utilizados na tentativa de manter um compromisso com a qualidade dos resultados em função tempo computacional. Um exemplo é a metodologia sequencial que têm sido usada nos últimos anos pelo Prof. Clebio Soares Nascimento Jr. em cálculos de estruturas supramoleculares à base de ciclodextrinas20-25_{, onde as}

geometrias e contribuições térmicas para as propriedades termodinâmicas são estimadas utilizando métodos semi-empíricos e a energia eletrônica obtida a partir cálculos no ponto utilizando a Teoria do Funcional de Densidade (DFT).

Nesse contexto, no presente trabalho a metodologia teórica utilizada na otimização de geometria e cálculo das frequências harmônicas das espécies foi a semi-empírica PM3. Com o intuito de se melhorar a qualidade da energia eletrônica nuclear (Eele-nuc) foram realizados cálculos no ponto utilizando a DFT com funcional

8

BLYP/6-31G(d,p). Propriedades termodinâmicas, como por exemplo, a entalpia da reação de formação do complexo molecular (Hr) foram calculadas na fase gasosa a

298K e 1 atm, com o auxílio das já conhecidas equações da Termodinâmica Estatística26 _{(equação 4):}

∆H

r

= ∆E

eletr.nucl.

+ ∆H

term. (4)

A variação da energia eletrônica-nuclear (Eele-nuc) e a contribuição térmica para

entalpia (

∆H

term), as quais são representadas nas equações (5) e (6) respectivamente,

foram calculadas pela variação das energias da formação do complexo molecular.

∆E

ele-nuc

=

∑

[E

ele-nuc

(produtos)] -

∑

[E

ele-nuc

(reagentes)] (5)

∆H

term

=

∑[

H (produtos)] -

∑[

H

(reagentes)] (6)

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As estruturas completamente otimizadas no nível semi-empírico PM3 e caracterizadas como mínimos verdadeiros na superfície de energia potencial (SEP), para os quatro análogos de Biginelli e para as ciclodextrinas (,  e ) estudadas são mostradas nas figuras 6 e 7, respectivamente. Como pode ser observado as estruturas se mostram muito similares no que diz respeito a suas conformações espaciais.

9

2A7 2B10

AB15 AB16

Figura 6. Estruturas otimizadas no nível semi-empírico PM3 para os CIU’s

10

-CD -CD

-CD

Figura 7. Estrutura para as ciclodextrinas estudadas.

Desta forma, após a obtenção das estruturas otimizadas, foram construídos os complexos de inclusão 2:1, com o intuito de serem obtidas a variação da energia de interação e a variação de entalpia para os mesmos.

Na tabela 1 são mostrados os valores da variação da energia de interação (E) de formação dos complexos supramoleculares 2:1, bem como os valores da entalpia (H) para os mesmos e o número de ligações de hidrogênio formadas entre as moléculas.

11 Tabela 1. Relação entre a variação da energia de interação (E), variação de entalpia (H) e o número de ligações de hidrogênio para os complexos de inclusão 2:1 calculados no nível BLYP/6-31G(d,p)//PM3.

Complexos ∆E/BLYP /kcal.mol-1 _{∆H/ kcal.mol}-1 _{Nº de ligações de Hidrogênio}

2A7 com 2αCD -9,9 -6,6 7 2A7 com 2βCD -11,4 -7,8 13 2A7 com 2CD -24,9 -21,8 17 2B10 com 2αCD -1,1 4,4 5 2B10 com 2βCD -11,3 -3,7 11 2B10 com 2CD -19,9 -12,7 13 AB15 com 2αCD -9,2 -6,6 8 AB15 com 2βCD -17,7 -14,1 11 AB15 com 2CD -15,3 -12,3 13 AB16 com 2αCD -10,4 -7,8 9 AB16 com 2βCD -4,6 -1,6 7 AB16 com 2CD -4,8 -2,0 8

De acordo com a tabela 1, os complexos formados entre as moléculas hóspedes e



-

CD tendem a ser, na média, energeticamente mais estáveis quando comparados aos complexos com a



e



-CD

. Essa observação pode ser entendida pelo fato da



-

CD apresentar uma cavidade maior, fazendo com que as moléculas hóspedes se acomodem mais facilmente com uma inclusão mais profunda e efetiva em comparação com as outras CDs (



e



)

, proporcionando um aumento no número de interações intermoleculares entre as hidroxilas secundárias das -CDs (interações hospedeira-hospedeira). Uma análise estrutural sistemática mostrou que o número de ligações de hidrogênio estabelecidas entre hóspedes e hospedeiras também desempenha um papel fundamental para o entendimento das diferentes estabilidades

12

dos complexos formados. A tabela 2 mostra o tipo de inclusão obtido em função dos complexos estudados.

Tabela 2. Relação entre o número de ligações de hidrogênio e o modo de inclusão

para todos os complexos 2:1.

Complexos Modo de inclusão

2A7 com -CD Semi-inclusão 2A7 com -CD Boa inclusão 2A7 com -CD Inclusão completa

2B10 com -CD Semi-inclusão 2B10 com -CD Boa inclusão 2B10 com -CD Semi-inclusão

AB15 com -CD Semi-inclusão AB15 com -CD Boa inclusão AB15 com -CD Boa inclusão

AB16 com -CD Semi-inclusão AB16 com -CD Semi-inclusão AB16 com -CD Boa inclusão

Desta forma, ao se analisar os parâmetros: profundidade da inclusão e o número de interações intermoleculares estabelecidas entre hóspedes e hospedeiras, pode-se explicar os valores obtidos para a energia de interação, Eeletr.nucl., e para a

entalpia, H, inclusive o fato de certos complexos serem mais estáveis ao se utilizar a α ou β CD em relação à -CD.

Para ilustrar essas afirmações, a figura 8 mostra as estruturas otimizadas no nível semi-empírico PM3 dos complexos 2:1 obtidos.

13

2A7 com



-

CD 2B10 com



-

CD

AB15 com-CD AB16com-CD

14

AB15 com



-

CD AB16 com



-

CD

15

AB15com



-

CD AB16 com



-

CD

Figura 8. Estruturas obtidas no nível semi-empírico PM3 para os complexos 2:1

formados.

Os resultados estruturais e energéticos apresentados até o momento foram para os complexos supramoleculares envolvendo a razão estequiométrica 2:1 (2 CDs/1 CIU). Como forma de comparação, serão apresentadas a seguir comparações entre a ordem de estabilidade com os complexos de inclusão 1:1 (1 CD para 1 CIU), os quais foram realizados em estudos prévios.27

Analisando-se e comparando os resultados obtidos, nota-se claramente duas distinções: (i) a tendência da ordem estabilidade energética dos complexos é diferente; nos complexos 2:1, a ordem energética decrescente é:



-

CD >



-

CD >



-

CD

; já

nos complexos 1:1 a ordem decrescente de estabilidade é



-

CD

>



-

CD

>



-

CD; (ii) a grande diferença no valor numérico das energias de interação e entalpia considerando as distintas razões estequiométricas.

Com relação à distinção na ordem de estabilidade dos complexos 1:1 em comparação aos complexos 2:1, este fato pode ser entendido da seguinte maneira: nos complexos 1:1 as interações intermoleculares ocorrem somente entre as moléculas hóspedes (CIUs) e as hospedeiras (CDs). Assim, quanto maior a CD, mais distante a molécula hóspede estará da hospedeira, fazendo com que as interações intermoleculares entre elas diminua, enfraquecendo consequentemente as poucas interações eletrostáticas estabelecidas. Já nos complexos 2:1 ocorre, além da interação (hóspede-hospedeira), também interações entre CDs

(hospedeira-16

hospedeira. Desta forma, mesmo havendo uma maior distância entre o hóspede e o hospedeira, a proximidade entre as ciclodextrinas causa um aumento significativo no número de interações intermoleculares estabelecidas para esses tipos de complexos.

Sendo assim, quanto maior a cavidade da ciclodextrina, maior será o número de ligações de hidrogênio formadas entre as mesmas. Esse fator altera, significativamente, a ordem de estabilidade e os valores das energias. Havendo uma maior interação nos complexos 2:1, estes se tornam mais estáveis. Para os complexos 1:1, os valores da energia variam dentro da faixa de -4,85 a 15,91 kcal/mol. Para os complexos 2:1 esses valores variam em uma faixa bem mais estável de -1,13 a -24,91 kcal/mol.

5. CONCLUSÃO

Após a realização deste trabalho pode-se comprovar a eficácia da metodologia sequencial PM3/DFT para se estudar o processo de formação de complexos de inclusão envolvendo compostos análogos de Biginelli e ciclodextrinas. Após análises sistemáticas estruturais e energéticas pode-se concluir que os parâmetros: (i) profundidade da inclusão, (ii) tamanho das CDs e o (iii) número de interações intermoleculares estabelecidas entre as moléculas hóspedes e hospedeiras, bem como as interações entre as moléculas hospedeiras, desempenham um papel fundamental na estabilidade dos complexos supramoleculares formados a base de CIUs e CDs, levando-nos, portanto, à obtenção de novos sistemas supramoleculares estáveis, promissores agentes de liberação controlada da ureia. Com base nos nossos resultados, concluímos que o complexo 2A7 com -CD se apresentou como o mais promissor para a inibição da enzima urease.

17

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- TUCCI, C.E.M.; HESPANHOL, I.; CORDEIRO-NETTO, O.M. Gestão da Água no Brasil. Brasília: UNESCO, 2001.

2- HESPANHOL, I.Bahia Análise & Dados 2003, 13, 411.

3- NICOLELLA, A.C.; DRAGONE, D.S.; BACHA, C.J.C. Revista de Economia e Sociologia Rural, 2005, 43, 81.

4- http://hotsites.cnps.embrapa.br/blogs/redefertbrasil/?link=noticias&noticia=94. Acessado em 13/06/2014.

5- YAMADA, T.; ABDALLA, S.R.S. Informações Agronômicas 2007, 117, 1.

6- CANTARELLA, H.; MARCELINO, R. 1º Simpósio sobre Informações Recentes para Otimização da Produção Agrícola. INPI, Piracicaba, 15-16 de março de

2006.

7- XIANG, Y.; JI-YUN, J.; PING, H.; MING-ZAO, L. Agricultural Sciences in China

2008, 7, 469.

8- ZAMAN, M.; NGUYEN, M.L.; BLENNERHASSETT, J.D.; QUIN, B.F.Biology and Fertility of Soils 2008, 44, 693.

9- ZHAO, G.; LIU, Y.; TIAN, Y.; SUN, Y.; CAO, Y. Journal of Polymer Research

2010, 17, 119.

10- CHIEN, S.H.; PROCHNOW, L.I.; CANTARELLA, H. Advances in Agronomy

2009, 102, 267.

11- MURPHY, T.L.; FERGUSON, R.B. Journal of Production Agriculture1997, 10, 271.

12- WATSON, C.J. Urease activity and inhibition – Principles and practice. The International Fertilizer Society Meeting, 28/11/2000. London, The International Fertilizer Society. Proceedings No. 454. 39p. 2000.

13- ANTISARI, L.V.; MARZADORI, C.; GIOACCHINI, P.; RICCI, S.; GESSA, C. Biology and Fertility of Soils, 1996, 22, 196.

14- http://www2.ufpel.edu.br/cic/2009/cd/pdf/CE/CE_00590.pdf. Acessado em 13/06/2014.

15- CRAGG, P.J.Supramolecular Chemistry: From Biological Inspiration to Biomedical Applications, Springer Science, 2010.

16- UEKAMA, K.; HIRAYAMA, F.; IRIE, T., Chemical Reviews 1998, 98, 2045. 17- SANSONE, F.; BALDINI, L.; CASNATI, A.; UNGARO, R.; New Journal of

Chemistry 2010, 34, 2715.

18

19- REKHARKY, M. V.; INOUE, Y., Chemical Reviews 1998, 98, 1875.

20- ANCONI, C. P. A.; NASCIMENTO JR., C. S.; DOS SANTOS, H. F.; DE ALMEIDA W. B., Journal of Physical Chemistry C 2012, 116, 18958.

21- PAIXÃO, N. M.; NASCIMENTO JR., C. S.; ANCONI, C. P. A.; DE ALMEIDA, W. B.; DOS SANTOS, H.F., COSTA, L. A. S. International Journal of Quantum Chemistry 2012, 112, 3403.

22- NASCIMENTO JR., C.S.; VENÂNCIO, M.F.; ANCONI, C.P.A.; LOPES, J.F.; ROCHA, W.R.; DOSSANTOS, H.F.; DE ALMEIDA W.B.,Journal of Polymer Science Part B 2011, 49, 1101.

23- ANCONI, C. P. A.; NASCIMENTO JR., C. S.; DOS SANTOS, H. F.; DE ALMEIDA W. B.,Journal of Physical Chemistry B 2009, 113, 9762.

24- NASCIMENTO JR., C.S.; DE SOUSA, F. B.; DE ALMEIDA,W. B.; SINISTERRA, R. D.,Journal of the American Chemical Society 2008, 130, 8426.

25- NASCIMENTO JR., C.S.; ANCONI, C.P.A.; DOS SANTOS, H.F.; DE ALMEIDA W.B., Journal of Brazilian Chemical Society 2008, 19, 1033.

26- D.A. McQuarrie, Statistical Thermodynamics, University Science Books, Mill Valley, 1973.

27- REIS, S. CICLODEXTRINAS COMO PLATAFORMA DE DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE INIBIDORES DE UREASE: UMA INVESTIGAÇÃO TEÓRICA. Resultados obtidos na iniciação científica, UFSJ, 2013.