Determinação dos genótipos do VHB por um método de sequenciação direta

Texto

(1)Universidade de Aveiro Departamento de Biologia 2011. Paula Cristina da Silva Determinação dos genótipos do VHB por um Costa método de sequenciação direta.

(2) Universidade de Aveiro Departamento de Biologia 2011. Paula Cristina da Silva Determinação dos genótipos do VHB por um método de sequenciação direta Costa. Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Biologia Molecular e Celular, realizada sob a orientação científica da Doutora Lucinda Queirós, Médica, Chefe de Serviço de Imunohemoterapia, Laboratório de Agentes Transmissíveis, CRSP-IPS, e da Professora Doutora Adelaide Almeida, Professora Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.

(3) Dedico este trabalho aos meus filhos Inês e Duarte, pelo sofrimento que lhes causou a minha ausência. Ao meu marido e aos meus pais por toda a compreensão, apoio e incentivo..

(4) o júri presidente. Prof. Dra. Maria de Lourdes Gomes Pereira Professora Associada do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro. Dra. Maria Lucinda de Magalhães Queirós Ribeiro Chefe de Serviço de Imunohemoterapia do Centro Regional de Sangue do Porto – Instituto Português do Sangue. Dr. Jorge Manuel Condeço Ribeiro Assistente Graduado de Saúde Pública do Centro Regional de Sangue do Porto – Instituto Português do Sangue. Prof. Dra. Adelaide Almeida Professora Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.

(5) agradecimentos. À Dra. Lucinda Queirós, pela oportunidade que me deu em realizar este trabalho, pelo incentivo, acompanhamento e orientação prestados durante todo o processo de realização do mesmo. À Professora Dra. Adelaide Almeida, pela disponibilidade, orientação e pelas sugestões que contribuíram para o aperfeiçoamento desta dissertação. Às minhas colegas Ana e Manuela, pela colaboração e acompanhamento no trabalho, pela partilha do saber, mas acima de tudo pela amizade e carinho que sempre demonstraram e que tão importante foi para mim. Aos meus colegas do sector, pelo apoio e compreensão demonstrados ao longo da realização deste trabalho. A todos os que de alguma forma contribuíram para que este trabalho se tornasse realidade..

(6) palavras-chave. Vírus da Hepatite B, genética, complicações, tratamento antiviral, sequenciação directa, mutações.. resumo. Em Portugal desconhece-se com precisão a prevalência da Hepatite B, no entanto, é considerado um país de endemicidade baixa a intermédia. A influência dos genótipos do Vírus da Hepatite B (VHB) na infecção crónica tem sido mais intensamente estudada em populações onde a prevalência da doença é alta. Dos trabalhos publicados com a determinação dos genótipos em Portugal, poucos caracterizam a população de indivíduos infectados pelo VHB. Actualmente existe um grande interesse em identificar os genótipos do VHB mais prevalentes uma vez que estes podem influenciar na gravidade da doença, designadamente na evolução para as formas mais graves como cirrose e o carcinoma hepatocelular, e também na resposta ao tratamento antivírico, como é sugerido por estudos recentes. Foi definido como objectivo principal deste trabalho determinar os genótipos do vírus da Hepatite B nas amostras de doentes com Hepatite B crónica enviadas para estudo ao Centro Regional de Sangue do Porto pelos hospitais da zona Norte, que possuem protocolo para estudos analíticos por biologia molecular. Adicionalmente e como objectivo secundário, determinaram-se também as mutações que conferem resistência aos fármacos actualmente utilizados na terapêutica. Os genótipos foram determinados por um método de sequenciação directa ® ® usando o teste TRUGENE HBV Genotyping comercializado pela SIEMENS . Os resultados obtidos indicam que o genótipo D é o mais predominante (62%) seguido do genótipo A (32%). A prevalência de mutações que conferem resistência aos fármacos foi de 13,4%. Todas as mutações determinadas conferem resistência à lamivudina sendo também observadas resistências para o entecavir e adefovir. A predominância dos genótipos do presente trabalho coincidiu com a observada em outros estudos idênticos realizados em Portugal bem como com o está referido para o Sul da Europa ou base mediterrânea, na literatura consultada..

(7) keywords. Hepatitis B virus, Genetics, complications, antiviral treatment, direct sequencing, mutations.. abstract. In Portugal, the exact prevalence of Hepatitis B is unknown; however it has a low to medium level of endemicity. The influence of the Hepatitis B virus (HBV) genotypes on chronic infection has been vastly studied in populations with high prevalence. Of all the studies published in Portugal regarding the determination of genotypes, very few focus on the HBV infected population. Nowadays, there is great interest in identifying the most prevalent genotypes of HBV, once these may have an influence on the illness severity, mainly on its evolution towards more severe forms, like cirrhosis and hepatocellular carcinoma, as well as on the response to the antiviral treatment, as suggested in recent studies. The main purpose of this study is to determine the HBV genotypes in chronic HBV patients samples sent to the Centro Regional de Sangue do Porto by hospitals in the North region that have a bio-molecular analytical studies protocol. In addition, it has also been determined the mutations which offer resistance to drugs used in current therapy. The genotypes were determined through a direct sequencing method using the ® TRUGENE HBV Genotyping test developed by SIEMENS. The results show that genotype D is the most predominant (62%), followed by genotype A (32%). The prevalence of mutations that offer resistance to drugs was 13,4%. All determined mutations offer resistance to lamivudina. Resistance to entecavir and adefovir was also been observed. The genotype predominance of this study coincides with that observed in similar studies conducted in Portugal and with what is referred to in the literature for Southern Europe or Mediterranean base..

(8) ÍNDICE. LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS. 1 – INTRODUÇÃO ………………………………………………………………………..…. 1. 1.1 – HEPATITE B ………………………………………………………….…….…... 1. 1.2 – EPIDEMIOLOGIA DA HEPATITE B ………………………………....…….…..... 2. 1.3 – VÍRUS DA HEPATITE B ……………………………………………………..…. 5. 1.3.1 - CARACTERIZAÇÃO DO VHB ….………………………………………. 5. 1.3.2 - REPLICAÇÃO E CICLO DE VIDA DO VHB ………………….………….. 7. 1.3.3 - VARIABILIDADE GENÉTICA DO VHB …………………………..………. 8. 1.3.3.1 – SUBTIPOS …………………………………………….…….. 8. 1.3.3.2 – GENÓTIPOS ……………………………………………....... 9. 1.3.4 – MUTAÇÕES NO GENOMA DO VHB ……………………….……...…... 12 1.3.4.1 - MUTAÇÕES NA REGIÃO S ………………………………….. 13. 1.3.4.2 - MUTAÇÕES NA REGIÃO PRÉ-CORE E CORE ……………..... 13. 1.3.4.3 - MUTAÇÕES NA REGIÃO X …………………………………. 13 1.3.4.4 - MUTAÇÕES NA REGIÃO P ………………………………..… 13. 1.4 – DIAGNÓSTICO ………………………………………………………………..... 14 1.5 - TRATAMENTO DOS DOENTES CRÓNICOS ………………………….………… 15 2 - OBJECTIVOS …………………………………….……………………………………... 20 3 – MATERIAIS E MÉTODOS ………………………..…………………………….…..... 21. 3.1 - IDENTIFICAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO E DA AMOSTRA ………….… 21 3.2 - METODOLOGIA …………………………………………………………..…….. 21. 3.2.1 - AMOSTRAS E CONTROLOS …………………………………….….….. 21. 3.2.2 - QUANTIFICAÇÃO DO ADN DO VHB ………………………………….. 21. 3.2.3 - GENOTIPAGEM DO VHB PELO TRUGENE ® HBV GENOTYPING ..….. 22. i.

(9) 4 – RESULTADOS ………………………………………………………………….……..… 28 4.1 - RESULTADOS DA DETERMINAÇÃO DOS GENÓTIPOS …………………......... 29 4.2 - COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS COM OUTROS ESTUDOS …………......... 33 4.3 - RESULTADOS DA DETERMINAÇÃO DAS MUTAÇÕES ………………….…..…. 35 5 – DISCUSSÃO ………………….………………………………………………………..... 38 6 – CONCLUSÕES ………………………………………………………………………..... 44 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………….……..….… 45. ii.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS. aa. Aminoácidos. AASLD. American Association for the study of liver diseases. ACD. Anticoagulante citrato dextrose. AcHBc. Anticorpo contra o antigénio do core do VHB. AcHBe. Anticorpo contra antigénio “e” do VHB. AcHBs. Anticorpo contra o antigénio de superfície do VHB. ADN. Ácido desoxirribonucleico. ADV. Adefovir. AgHBc. Antigénio do core do VHB. AgHBe. Antigénio “e” do VHB. AgHBs. Antigénio de superfície do VHB. ALT. Alanina aminotransferases. ARN. Ácido ribonucleico. ARNm. Ácido ribonucleico mensageiro. ASIS. Aplicação de sistema de informação de sangue. cccDNA. Covalently closed circular DNA. CCH. Carcinoma hepatocelular. CMV. Citomegalovírus. CRSP. Centro Regional de Sangue do Porto. CV. Carga vírica. ddATP. Didesoxiadenosina trifosfato.. ddCTP. Didesoxicitidina trifosfato.. ddGTP. Didesoxiguanosina trifosfato. ddNTPS. Didesoxinucleótidos trifosfato. ddTTP. Didesoxitimidina trifosfato.. DGS. Direcção Geral da Saúde. EASL. European Association for the Study of the Liver. ECDC. European Centre for Disease Prevention and Control. EDTA. Ácido etilenodiamino tetra-acético. ETV. Entecavir. Gene Pol. Gene da polimerase. Gene S. Gene do antigénio de superfície (AgHBs). IFNα. Interferão α. IgHB. Imunoglobulinas específicas contra o vírus da Hepatite B. IOB. Infecção Oculta pelo vírus da hepatite B iii.

(11) IPS. Instituto Português do Sangue. LdT. Telvibudina. LMV. Lamivudina. mL. Mililitro. nt. Nucleotídeos. OMS. Organização Mundial de Saúde. pb. Pares de bases. PCR. Reacção em Cadeia da Polimerase. pegIFNα. Interferão peguilado. PNV. Plano Nacional de Vacinação. PQ. Padrão de quantificação. RFLP. Restriction fragment length polymorphism analysis. rt. Transcriptase reversa. TDF. Tenofovir. UI. Unidades Internacionais. UI/mL. Unidades Internacionais/mililitro. VHB. Vírus da Hepatite B. VHC. Vírus da Hepatite C. VIH. Vírus da imunodeficiência Humana. µL. Microlitros. iv.

(12) LISTA DE FIGURAS. Figura 1.. Prevalência da infecção pelo VHB no mundo ………………………. Figura 2.. Número de casos de hepatite B notificados à Direcção Geral de. 2. Saúde por anos ……………………………………………………….... 4. Figura 3.. Esquema representativo da estrutura do VHB …………………….... 5. Figura 4.. Estrutura e organização do genoma do vírus da hepatite B (Clements et al 2010 …………………………………………………... 6. Figura 5.. Representação do ciclo replicativo VHB …………………………….. 7. Figura 6.. Distribuição geográfica dos genótipos e subgenótipos do VHB (Schaefer, 2007) …………………………………………………..….... Figura 7.. Esquema representativo do gene da polimerase (gene Pol) do VHB (Sablon and Shapiro, 2005) …………………………………….. Figura 8.. 11. 18. Distribuição das amostras pelas causas que justificaram a não determinação do genótipo do VHB …………………………………... 28. Figura 9.. Distribuição das idades dos doentes em estudo …………………… 29. Figura 10.. Distribuição por sexo dos doentes estudados ………………………. Figura 11.. Distribuição dos genótipos das amostras com genotipagem determinada pelo Trugene ® HBV Genotyping …………………….. Figura 12.. 31. Distribuição da carga vírica (CV) das amostras pelos genótipos A e D ……………………………………………………………………….. Figura 14.. 30. Distribuição das idades dos doentes estudados pelos genótipos A e D ……………………………………………………………………….. Figura 13.. 30. 32. Distribuição da homologia obtida na genotipagem das amostras para os genótipos A e D ………………………………………………. 32. Figura 15.. Distribuição da homologia obtida na genotipagem dos controlos positivos (CP) inseridos nas diferentes séries de testes realizados. Figura 16.. 33. Comparação dos IC 95% para a prevalência dos genótipos D em 4 estudos ………………………………………………………………..... 34. v.

(13) Figura 17.. Comparação dos IC 95% para a prevalência dos genótipos A em 4 estudos …………………………………………………………………. Figura 18.. Distribuição do total das amostras com resistências aos fármacos: lamivudina (LMV), entecavir (ETV) e adefovir (ADF) ….. Figura 19.. 34. 36. Distribuição do total das amostras com resistências aos fármacos lamivudina (LMV), entecavir (ETV) e adefovir (ADF), pelos genótipos A e D ………………………………………………………. Figura 20.. Distribuição da frequência das mutações observadas na amostra. Figura 21.. Associação da mutação e respectiva(s) resistência(s) ao(s) fármaco(s) …………………………………………………………….. 36 37. 37. vi.

(14) LISTA DE TABELAS. Tabela 1.. Aminoácidos que especificam os Subtipos do AgHBs do VHB…………... 9. Tabela 2.. Genótipos do VHB (Adaptado Stuyver et al. 2001) …………………...…... 10. Tabela 3.. Localização das mutações de resistência associadas aos análogos de nucleosídeos/nucleotídeos nos domínios do gene Pol do VHB (Poordad and Chee, 2010) ……………………………………………………………..... Tabela 4.. Resumo dos Processos envolvidos na determinação dos Genótipos do VHB pelo Trugene ® HBV Genotyping ……………………………………... Tabela 5.. 19. 23. Programa de ciclos utilizados na amplificação por PCR e sequenciação CLIP no termociclador Perkin Elmer 9600 (Bula nº 10469332 Bula nº 10469332 Rev.A, 2008-06) ………………………………………….……..... Tabela 6.. 25. Total de amostras com genotipagem do VHB realizadas no CRSP no período do estudo …………………………………………………………….. 28. Tabela 7.. Caracterização da amostra submetida a genotipagem do VHB …………. 29. Tabela 8.. Características dos doentes estudados por genótipos ……………..…….. 31. Tabela 9.. Características dos doentes com genótipo A e D que possuem mutações que conferem resistências aos fármacos ……………………… 35. vii.

(15) 2456789

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

(17) 2345678896

(18) 28 26484764 342984776856 6532264886 648508 766648!65526 3456 8282848 8258325 478 6286255266 76"#838$52%352353 5 478 487628464&98 62'(76454648 6766 7687826!3 7 88 )(76454644283*84678878 35377876+$ ,7#8 0-- "24 344.676+$56858/ 7 8 888 493448! 823 8 28235"9348! 2828482353 /62 7824 344.6764

(19) 48478 878 353778382 736 03!"24 344.6823 65622878/62 98235 78 .82/3 #6852582

(20) 43574&28478878 353778 23626465626 6 8!3488 3623764$56478 8235 888 3 36 78 4&284 862&/35424 344.624/ 436 85 8824 344.6629328235 6 825 18656228844853 88646!35678878848 26/34436342 8 3 8 267 64036 %356478437 8826/3443634784378822 88 2947828 34.678 845 5 26 2 86478&2364#685 -666782283207 7848 0 . 89:;<;=>?@=A?BCBD?E;@E;F=>EG?G=;H;. 52&58287 35673/85.68 6+$923564378298 888 6766 76 3 36784 82/

(21) 538"$4 6 257624826 %356 3 347627882 32 289 I537#838$3 2-"878 35377873/85.656437827 382 736 03!48289 I5376 25762"044885624 82362)( 8280(6 3/823620(2848539 888228320 . 0. . JKLMNO;89P289 I5373/85.68 6+$6 76 68Q#QRR,,,,#63R542R734848R#8334R8R 673/3576.

(22) 234567389 76

(23) 6

(24) 763343666333756

(25) 4633

(26) 4333733

(27) 3

(28) 5

(29) 4673

(30) 6

(31) 5

(32)

(33)

(34) 7

(35) 335

(36) 266566!563"#456 $66466% 4

(37) &67633'( 76

(38) 6

(39) 763343673$6&6373576735

(40) 734676433733

(41) 76 5

(42)

(43)

(44) )67

(45) *7

(46) 76456+

(47) 4376) 4

(48) 6) 4

(49) 6,57363 46% 4363

(50) 6

(51)

(52) 5 6643673373576733437465

(53)

(54)

(55) -333 76) 4

(56) 6.6

(57) 456234634567

(58) /0

(59) 36%(119226

(60) (1132 0466723 (1''5% 3 7

(61)

(62) 436!4

(63) 3 73

(64) !5

(65) 6 673(1'1767

(66) 3646636 ) 4

(67) 636$

(68) 467

(69) 36)272/) 4

(70) 362343#

(71) 473638433

(72) 672

(73) 4

(74) 56 6&67356

(75) 733 637356467

(76) 3(119#

(77) 73'(3

(78) 4'111116$63% 6

(79) 457:567

(80) ;034#56<3

(81) 4

(82) 34

(83) 7

(84) (9<886

(85) 5

(86) 8= 7

(87) 56

(88) /(056

(89)

(90) 4'111116$6353 7

(91) 7

(92) 4

(93) 34

(94) 73'9<(86

(95) /(1( 56

(96)

(97) 4'111116$635%#35

(98) 65

(99)

(100) 3&

(101) 65

(102) /'9956

(103)

(104) 4'1111157

(105) > 3

(106) 3&

(107) #3

(108) /199

(109) 4'111115%6

(110) 436&673

(111) #56

(112) #

(113) 46

(114) $346766 46-3!6- &3$ 4

(115) 3)!6%)3436!4

(116) 43#343676> 3603 637 9 3(11?5

(117) 6467

(118) 5

(119) (11=3'0 3 (119> 67

(120) 5

(121) 6467

(122) 5

(123) (11?%37:5673543533#

(124) 3 356333733 6" 4656 46366@68

(125) !63A

(126) 6%)5

(127) 463 6 37:565435337

(128) 64 763 637 463

(129) 4:6

(130) 733 7

(131) /(11=6(1195 #

(132)

(133) $346766BC7636) 66/)272(1'15% )8

(134) 4 6735

(135) 353<35

(136) 435

(137) 6 436:567603 63

(138) 36

(139) 5

(140) 73467

(141) 667337357673$6&663476%*3 7

(142) 43667

(143) 3'398

(144) 4-35

(145) 436%38

(146) 4 65

(147) 5 > 36 436:56 64663 63346 436633$6&6/'(9 5%D664733(1116

(148) 36% 3 7

(149) 3#35 67

(150) 6

(151) 6

(152) 7

(153) 74

(154) 732

(155) $4643#343 6 436:56763 637313 %, 7

(156) 3 7

(157) 34363&:5673'116'(1

(158) 467

(159) 4354!5

(160) 7

(161) ;03 8

(162) 4 6%) 7

(163) 3#35 67

(164) 34

(165) 3 356#5

(166) 6 433643 67

(167)

(168) 643%+ 3 7

(169) 43667

(170) 3767

(171) 43736 37

(172) 234

(173) A3

(174) 6736 3 7

(175) 8

(176) 4

(177) /2A85343(1113(119#

(178)

(179) $34676 6 436:567

(180) 066464 3431'0

(181) 434

(182) 6

(183) 7

(184) 3 7

(185) 3119

(186) E

(187) 6

(188) 7

(189) 3 7

(190) /2646

(191) 36% (11=5%8

(192) 34

(193) 4336666

(194) 7

(195) 43 67

(196) 7

(197) 64567

(198) 4334

(199) !5

(200) 3

(201) 35 6437

(202) ;07

(203) 767

(204) 437

(205) 2A8#

(206) 6646766(1193

(207) $346<3> 36. . 0.

(208) 23456789 6

(209)

(210) 9 6 9

(211) 66 44 3467! 23456789 6

(212) "543 # 6

(213) 694

(214) 4#4 6

(215) 946474 49 23 967#

(216) 460

(217) 34 7 4

(218) 6

(219) 62344963645

(220) 89 643 7 6

(221) 4. 96 23$5 %"&66

(222) 3 0'32

(223) 43(5

(224) 64

(225) 6

(226) 64 96)6439

(227) 6

(228) 4

(229) 4*+7 , 9 623456789 6

(230) 6 9#4 -. 247 %" 4356

(231) 6#

(232) 40/ 6467 049

(233)

(234) 6

(235)

(236) 6, 34 -. 14367

(237) 406+

(238) 4,10543 # 62434 9+43

(239) 4. 6

(240) 44426 4"9 # 6

(241) 45 9

(242) 6

(243) 9 3 9

(244) 436547494

(245) 4

(246) 4!55. 2

(247) 443 4356

(248) 966 3623456789 6

(249) %"4& 367446 49

(250) 89 6

(251) 344266966 3 6

(252) 2674

(253) 9

(254) 34263667$

(255) 4 36 4

(256)

(257) 6234549 5634 33436856 96-. 23 9 267# 36

(258) 4 93 7

(259) 6

(260) 49-6 STUVWUXYZ[ZU\[]^_^XYV[Z. NIKK NOKK NKKK JKK LKK IKK OKK K. NOPI. IJK. LKM. JKN. NNNI. MMP. JPQ. LJK. QRO. IKR. OJL. ONK NQQ. NNJ ML MR IO LI QP LR. `\[Z 9:;<=>?@A?'+43

(261) 4 6

(262) 44426 4"9 # 6

(263) 8, 34 -. 14367

(264) 406+

(265) 42 369 6 94B42BCCDDD2 3

(266) 662C6E62F39 4CG9H0

(267) # 6

(268) ?. . 0. . .

(269) 2346789

(270) . 23432 9 9

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

(272) 234567859 2

(273) 677859 85979 98397435 979 9 489 97953 7435 979 9279 97435 967435 3 9942 7 4 4875 743 9 4 74 37 79 !8 "449#9 4 3!894 $ 5 899 9%&'()*+,)-./*0+12-3)!8 74 479354 69 889&8979593989 5 : 6;<;8 467 74 47995744 69=9> ; 4?@5874 4?68 2AB94 9 9967859?6794 7749 : 6C<C74 74 4798394 6945D? 52AB 94 69 9 875 47 2AB7 7?93 : E453 9 74 47992

(274) 453 9 74397? 9 979 ? 9 : F74 4798394 69 859 49 9 G "4 679?679 7 5859 2&89H9 9949#9I"4 4 4394 646? 54 ?99 4 4I"4 4 !8 74 479394 69 8892AB 2AB799 4 69"4 889!8 "449# 39 99678594 77492AB 9 4 69 579?92

(275) 453 9 4 69F% 8 467 7435 93 4 4494 9453 9 % 453 9 743 7 79 5JK 9 G "4 4 439 4 8#8394 69385487495!8 758 8394 69 3959839 "4LM(-N)2O+48 59I"49839 "4 9 453 9 <979 ? 9 42

(276) 839 "474 4 P4875 9 A ; 9 >949 . W. 0. . QRSTUVWXYZ889 49#9I"4 4 439 4?68 9[ 9 BC5 3 959 \ .

(277) 23435789

(278) 9

(279) 9

(280) !"# $%&' ()*+*(,!"-()**(./0# # $%&,12-3.'4(52 # ! )*+*65## 2*"'#(-7"89:-5*# )*+*/;'*# )*+*6 <5#"#7-'#4(555<'-<*'# ' *(5 =-(#2#(2-#'> /02' 5# $%&8'* <*# #'*# '> 6'#(5*("'*(## (*!,'5*.# ;?/02' 5 !"86((56'!*# ;? 5('-5##;?- !'*5'*7)#,@ABCDEFGDHI@DAJEKI@LM@NDCMIOPQR;?./0;?8-5 '*5#S(*S!( '(S!((*T'# !"-(85-*((*'*U *'*!"6V =-W' (+#7-##5' 5* $%&#-'***5'*5 S# -5'*#2!"+((-('( # **5'*,9 ' '#X 'VUV4Y) V6Z[[\./ . . ]^_àbc38deadfdghbijklkm^mnkaden^mbhôk ]kghdpqhheprrsss3^gtduh3mqrèlksgr^vb_dfrqwoxmymn3_^tzvkl^t^mblk{. 0;?7-''5 5 ##'# 25 |?5'(2,|?5. ("'*(#(*"'(!"( |?842'+5("'*(# 2' 5!"/0 |?842'+58*'( *# *(56' # ''- S(# '!*# '#'2*!# ;?*'(*(!(/("'*(## (*!8'* '#(*"-(# 6'*'# ;?!"6( '* . . 0.

(281) 234564789 5

(282) 2 2

(283) 2989 9

(284) 95

(285) 9852 9755

(286) 93 5

(287) 989 9

(288) 95 36255382 25 6299 32 28998279 5 77492 25

(289) 935492325 9. 7532 82 9 3549 9

(290) 69 4

(291) 79 !223

(292) 9352 97529

(293) 93 659"#5 9

(294) 95362585 85$ 7327%9858235453575 69 985 2 975& 85$3#5 2732

(295) 9352359855 2827

(296) 58

(297) 9325

(298) 5 35

(299) 9689

(300) 2 679"#5'(9532)*+++, -././01023453657583890:9;<=5>308?02@6 49

(301) 79A767898223B7985$B2C 67989 26532

(302) 5262498582 79 4

(303) 79

(304) 58%789 8

(305) 9329

(306) 2 679"#597492 269969829747898282

(307) 2 9

(308) 9"#589 5672

(309) 9 285$

(310) 2 69385399C92624989829"D2 'E32

(311) FFGH I26853FFG,

(312) 5A9A7678982822353

(313) 9

(314) 9"D2 35$B975

(315) !235 4

(316) 89 J358277K379939'$J,24

(317) 892 972L'$L,942%!299C982

(318) 58"#58247

(319) 7D2 85$B53 782

(320) 9426232 2

(321) 75

(322) M85 $J2$L2 9

(323) 5C7989232*F42%2 2

(324) 75

(325) 95 5

(326) 5 4

(327) 82 2 79749 #589 5

(328) 8282*F**47

(329) 7D2 5

(330) 879'I)42

(331) 296FF*HI26853296FFG, 9C9822

(332)

(333) 5 89 5672

(334) 9 285$5796698955*F*F 9

(335) 2 82A9 2 5

(336) 879'N932

(337) 296 FFO, 27P478985$35 69 949

(338) 7923

(339) 2*9Q879 9 352 975B*FP*FF 879 'I26853296FFG, -././.-0R0ST6=5U?S0 0

(340) 727

(341) 973879"#5 9

(342) 9922

(343) 52327898289 2!K379 85$B92C7 K37982 872

(344) 232 822

(345) 73932 937B379 85 !26249

(346) 9M69. 779"#585$2 !9

(347) 5

(348) 737 97 A7 5 2

(349) 5675 VWXYZVW[YZV\XZ]ZV\[782377985 5

(350) ^25472

(351) 2 93

(352) 5296357375898B98982_F'^738296*++0HE32

(353) FFGH(B382%2 96FF_, `5

(354) B379 8273587 #557 5. 4265

(355) 9

(356) !257346

(357) 52C2

(358) 3585$ 537392 5 5

(359) 2 2322585 5 A7 5 823573938582822

(360) 73932 5a9b& A7 5

(361) 2 6932 9

(362) 2 2394923#52 5 553 932aVb2857 2 5 2 49

(363) 7427 5 A822

(364) 73932 aWb5a\b2aXb5a[b'c53 29FF_, 0. .

(365) 234056789 9

(366)

(367) 93 9 3 999 3 3 939 9

(368)

(369) 9! 9"#$

(370) 30 %"9 9

(371) 99&'%9(')*+,74005-&

(372)

(373) %99 39

(374) 3

(375)

(376) . 9 %"99"

(377) $

(378) 9"9 3 /"9 9 07939!

(379) 9"99411*" -" 9 %"92349 254 "994672849 29:;*<%4-*= 7177>-. ?@ABC@DEF&39!

(380) 9. "

(381) $

(382) 39 %"99&')9('). GHIJKLHDEMMD. GHIJKLHDENOD. +*2P4- & *2 4- +*24- P & *24- P . . 2 %"9Q3$ % 99 !$

(383) 9

(384) 9393

(385) 9 "39

(386) 9& 3RR

(387) 93 399 %"9 99" 9

(388) 9 "9 ')&$

(389) 9"9 39 %"9S

(390) " 9

(391) 9

(392) 3 999 97;"9. 7

(393) 9$

(394) 9

(395) 9339. 3 %"99 (') *T,9 097177>- EFUFUFMDVDWXYZ?[G\]D &3999.

(396) 9993" 3 39% 3 Q

(397) . Q

(398) 3

(399)

(400) 93"9(')35^_ 3

(401) 7

(402) 93%3,. Q

(403) 79(')$9

(404)

(405) 935 "97

(406) $

(407) 9&'*` 7177ab&371770-c

(408) 3 " 9"939 "99" 99 3"9 def "9d$9

(409) 9399(37+97gh9 98,73. 9 "9% 3

(410) 93%9 "9f "9e$99% 9 3 "

(411) 9e"9*8971770b_ i9 371747-. . 0.

(412) 3456789

(413) 44

(414) 679

(415) 6 7

(416) 4

(417) 657 467 76

(418) 9

(419) 567

(420)

(421) 69

(422)

(423) 6467

(424) 567664 6 6! 6"#0$ 6#% 6#&!#9'669($%110)*57669($%11 &( 3456789

(425) 4 64679567

(426) 4

(427) 667964

(428) 679

(429) 4!+,6%&(34 567

(430) 4$-$.69/%007689

(431) 4!79&6

(432) 679

(433) (356789

(434) 1 64679 662

(435) 6//79765

(436) 34#0!65

(437) 56789:;<

(438) 5676

(439) 646&

(440) 44 7

(441) 674/0%796

(442) 679

(443) (3456789

(444) 4=6> 64679 662

(445) 6/7976465

(446)

(447) 646(356789

(448) ?

(449) 4

(450) 9

(451) 4 56789

(452) 4 6 7462

(453) 6@79765

(454) 96 7

(455) 967

(456) 5676

(457) 646$7 4

(458) ,6

(459) 4 2

(460)

(461)

(462) 5676

(463) 6(356789

(464) > 64679

(465) 567

(466)

(467) !/% 79&6

(468) A 7462

(469) 6/@797

(470) 96 7"B

(471) 5676

(472) 6(399649

(473) 56789

(474) >4 646726

(475)

(476) 49

(477) 765

(478) 4"-7

(479) 4

(480) C64%6%6 66479646 6?56!#9'669($%110)9D

(481)

(482) 64E7#D66$%11 )>79D6$%11@&( FGHIJGKLM>6789

(483) 4

(484) ! 9

(485) #9'669($%110&( K K K K NIOPQRSTK NIOTUGK XOQRYZORTK[IK bTJRUI^G\IK XOQRYZORTK[TK VOQWK \]SI^_àRIKVGGWK VGGWK aTÎKVGGWK. . ? - 1 = . > . /%%0 /%00 /%00 /0% /%0% /%00 /% /%00. 11 11 11 /j /jj 11 /jj 11. 0 / / /% % / % /. 00 0/ 0/ 0/ 0/ 0/ 0j0 0/. cR\Q^RH]RdeTKYITY^f_RaGK B

(486) 96=

(487) $?4

(488) B

(489) 96$g 4,4 7$h7 #

(490) 6496g4 $-D 7$i

(491) #

(492) 6496g4 $-D 7$i

(493) $-

(494) 6 $3

(495) 744 466 96k76!3

(496) 95$=4 7D$l9m &n4

(497) 3 6796$h7 $op44 $=(q(? g -679 ?4

(498) #$?4 -679 ?67D$.72$=(q(?( ?4

(499) #$?4 -679. 34>6789

(500) 4 64679 49 , 2

(501) 56

(502) 5m m6!. 5&(356789

(503) ?4 467

(504) 79

(505) 7?4

(506) B

(507) 96$7

(508) B

(509) 96=

(510) $7h7 67g $

(511) 56789

(512) 6-7g4 $

(513) 56789

(514) 17

(515) 4=

(516) $g $n4

(517) 3 67966h7 (3 56789

(518) =7

(519) 364966#6g $

(520) 56789

(521) .7?4 -6796?4 r9 7$ 467

(522)

(523) 4667967

(524) 2

(525) 7567(356789

(526) >7

(527) 4=49

(528) 4q7

(529) 4$ .726?67D6

(530) 56789

(531) 7?4 -6796- 87 !9D

(532)

(533) 64E7 #D66$%11 )?sD$%11@)?6 $%11j&( 01. .

(534) 23456787869 757

(535) 564 87 74885 7564 7 575 7 755 56 77564 757 68 7 65 750!"88 564 #$0!%88 564 $0!&88 564 '50!(88564 )50!" 88 564 *+,- 574- 57 4 77564 788 7564 72$.5 /0185

(536) 5$233(4'8 $233&5+. 6789:;<=><?7@A:7B97CDE<8FE8:GH7I;<JE@<8FKLA7ME@<F<@9B8FKLA7ME@<JE<NOP<QRIS;FHF:T<UVVWX><. # 74 Y- 5 9

(537) 8 7564 7 585 Z 8Y- 8 8Y- 1868 5 8 48564 75 7 575[

(538) 7+\78 56457 575 ! 6

(539) 548 7 564 7

(540) 556457$ 535 .]# #])$5 564 5 68645 5886458 6

(541) 5Y- /.6415$233^5+# ! 6

(542) 5Y- 5564 . 586488 77 8555 68Y- 5645564 7/_865548 +$2334.6415$ 233^5+ #877 8Y- 7564 7 85 Y- [6 8457 8 7 6456785645 574885 8Y`57 65858 a6 88 56Y88 48/8 788b 7$233(5+\7 564 75'4a7 534567 856455748 75 Z78 ! 8Y- 68c7 8$ 5 686 87

(543) 556Y8768 546 8 8 8 78 56457+27457574 7 7485 564 $5 88Y- 564 '$5749877 8 88 8 4838575 657- 864 6 d5e /#5588864 648# 5/864 !55$ 56Y81594 856 784 8$5856 48385 577- 88 75/f 61548 +$0&&%5+) 57 $ 564 '8 758 56455645. . 00. .

(544) 34567897 5

(545) 4896 86 73 696 7 78963 69 794107 7 94. 564 4 7897 5

(546)

(547) 486!7 94"#7

(548) 46 47 4 78"45

(549) 56 77 $$%6879410&4'8647 9 746(4 7

(550) 7897 5865 87 37

(551) 684

(552) 78963 7)76!6544

(553) 7 78963 *7 9

(554) 46 !77897

(555) 78974. 564 4 7897 7437 7894

(556) 8+76 774 7 4

(557) 68 948 !74 7 ,-3 696647344 774 .856474896/7 7 7 0 78963 )4. 564"0 5

(558) 456 78 !+ 4 7

(559) 647 1 78 12 48 94

(560) /

(561) 776!65 78 6 4

(562) 7897

(563) 46 !778978 7897 5

(564) 78963 7)3

(565) 4794124)4994156 9475 4/ 4 7 76!6544

(566) 7 4 7 774 4 54 4 +654 7 944

(567) 4. 564 7!

(568) 4 6 86!6549647 68737878975

(569) 78963 )6 94794178

(570) 7 9 746(4 7

(571) 99647

(572) 1: 777 375646 6;85643444

(573) 94"#7 77 5437<4568484 3 34"#7 5

(574) 494!7.8564768!75"0 5

(575) 78963 )

(576) 47(776!6544

(577) 437 78"4 4

(578) 94"0 344 5 0 0=2

(579) 94"0 4797

(580) 684897>4? 4896 86 7 37!+567 7

(581) 251@ 7897 5

(582) 7 97 78963 6447847941: A

(583) 74"0 <9743.96547B6 97

(584) 7 9 77!77

(585)

(586) 7C 7 3 944 9494

(587) 789 5

(588) 9897!70 8 34567897 5

(589) 78963 75

(590) 344 5

(591) 78963 )7$ 34 79414$4 17 D D D EFGFHDIDJKLMNOPQDRSDTPRSJMDUSDVWXD D &4 Y96

(592) 4 544 4

(593) 94"#7 *737 7894

(594)

(595) !459 6

(596) 3 948974 5 8 6744897 64 8 965 4 78"4)7 7 48 57 797

(597) 76!654 434756

(598) 789 7

(599) 94"#7 7

(600) 9 78

(601) 4 * 7

(602) 377 + 74 74 37. #7 775964 5

(603) 445684"0 7<9743644896+65444394"0 +654494 4

(604) 94"0 465 896845

(605) 4689 "0 78 4 3"#7 79494

(606) 789 75

(607) 4 7B348 0 4 3"#7 45946 84 74 78

(608) 654 468!75"0 434756

(609) 789 7

(610) 94897 *3 74974 45946 4 69

(611) 764 8 965 79494

(612) 789 $ 7

(613) 481Z D D D 01. .

(614) 345464389

(615)