UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
MARIA TATIANA ALVES OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATO
AQUOSO E FRAÇÕES DERIVADAS DE SEMENTES DE
CUMARU [Amburana cearensis (ALLEMA) A. C. SMITH]
ASSOCIADAS À ANTIMICROBIANOS
NATAL/RN
2020
MARIA TATIANA ALVES OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATO
AQUOSO E FRAÇÕES DERIVADAS DE SEMENTES DE
CUMARU [Amburana cearensis (ALLEMA) A. C. SMITH]
ASSOCIADAS À ANTIMICROBIANOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica.
Orientador: Profa. Dra Adriana Ferreira Uchôa
NATAL/RN
2020
Dedico esta obra
AGRADECIMENTOS
À Deus todo poderoso, agradeço a minha vida, motivação e presença constante.
Aos meus pais: Cícero da Silva Oliveira e Maria das Dores Alves Oliveira, pelo amor infinito, compreensão, paciência, confiança e incentivo para realização deste trabalho.
Aos meus irmãos: Edvania, Evandro e Everaldo, por estarem sempre ao meu lado apoiando todas as minhas decisões. E de uma forma especial a minha irmã Patricia, que até mudou de estado para me acompanhar nessa jornada, por acreditar em mim e está sempre ao
meu lado.
Aos meus sobrinhos Mariah Alicy e Artur Gabriel, que com sorrisos inocentes me encorajaram a lutar e não desistir dos meus sonhos.
A minha orientadora professora Dra. Adriana Uchôa, obrigada por todos os ensinamentos, conversas, entusiasmo, preocupação, dedicação. É impossível deixar em papel o verdadeiro sentimento, mas digo: obrigada por ter aceitado ser minha orientadora e mestre.
Aos amigos que fiz em Natal meus queridos e amados Rayana, Geovanna e Igor tão importantes nessa trajetória. Obrigada por serem sempre presentes e dedicados. Obrigado por apoiarem meus sonhos e estarem sempre aptos a me ajudar. Amigos que vou levar para a vida
que fizeram a vida em Natal ser muito familiar.
Ao Prof. Dr. Henrique Douglas da Universidade Regional do Cariri (URCA), pela disponibilização do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM) para
realização de ensaios e parceria no desenvolvimento desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Elizeu Antunes da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), pela disponibilização do Laboratório Química e Função de Proteínas Bioativas
(LQFPB) para realização de ensaios e parceria no desenvolvimento desse trabalho.
A Profa. Dra. Raquel Cordeiro, pela disponibilização do Laboratório de Micologia do Instituiro de Medicina Tropical (IMT) para realização dos ensaios iniciais.
A CAPES, pela concessão da bolsa que propiciou desenvolvimento da pesquisa código 001.
A capacidade de sonhar sempre foi o grande segredo daqueles que mudaram o mundo. Os sonhos alimentam a alma e dão asas a inteligência. É no solo fértil da memória onde semeamos os sonhos que farão grande diferença em nossa existência. Os sonhadores mudaram a história da humanidade. Eles fizeram da derrota, o pódio para a vitória; das críticas, o palco, de onde receberam os aplausos. “Sonhos perseguidos com perseverança, sempre acabam em realidade”.
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATO
AQUOSO E FRAÇÕES DERIVADAS DE SEMENTES DE
CUMARU [Amburana cearensis (ALLEMA) A. C. SMITH]
ASSOCIADAS À ANTIMICROBIANOS
RESUMO
A família Fabaceae é conhecida por sua ampla importância econômica, suas espécies vegetais são bastante utilizadas para diversas finalidades. Dentre as leguminosas destaca-se a Amburana cearensis popularmente conhecida como imburana de cheiro ou cumaru, muito utilizada na medicina popular, o que desperta a busca por comprovações de seus componentes e propriedades farmacológicas. Neste contexto este trabalho teve como objetivo avaliar as atividades antimicrobianas e moduladoras, assim como caracterizar por cromatografia líquida e espectrometria de massa, o extrato bruto e frações obtidos de sementes de A. cearensis. O extrato aquoso obtido em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 8,0 foi fracionado sequencialmente em sulfato de amônio e submetido à caracterização pelo sistema Acquity UPLC (Waters), acoplado a um sistema de espectrometria de massas do tipo Quadrupolo/Tempo de Voo (QtoF, Waters). A atividade antimicrobiana foi averiguada por ensaio de microdiluição e as possíveis interações entre o extrato vegetal e os antibióticos penicilina, norfloxacino, gentamicina e antifúngico fluconazol, foram determinadas utilizando uma concentração sub-inibitória. As amostras na concentração de 128 µg/mL apresentaram atividade inibitória com possível efeito sinérgico quando associados aos antibióticos e ao antifúngico demonstrando significância com p<0,001 frente às bactérias Escherichia coli, Sthaphylococcus aureus e a levedura Candida albicans. Na caracterização foi possível identificar no extrato bruto e frações, vários compostos fenólicos, ácidos orgânicos e alguns polifenóis em modo de ionização positivo. Os resultados obtidos sugerem que o extrato aquoso e frações de A. cearensis apresentam compostos com capacidade de interagir e agir sinergicamente com antimicrobianos indicando seu potencial como alternativa para o desenvolvimento de novas formulações com ação antimicrobiana.
Palavras-chave: Amburana cearensis, Resistência bacteriana, Compostos fenólicos,
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF AQUEOUS EXTRACT AND
FRACTIONS FROM CUMARU SEED DERIVATIVES [Amburana
cearensis (ALLEMA) A. C. SMITH] ASSOCIATED WITH
ANTIMICROBIAL DRUGS
ABSTRACT
The Fabaceae family is well known for its broad economic importance and various purposes. Amburana cearensis, Fabaceae, popularly known as imburana or cumaru, is widely used in popular medicine, what sustain search for novel pharmacological agents from its components. In this context, this study aimed to evaluate the antimicrobial and modulating activities, as well as to characterize the crude extract and fractions obtained from A. cearensis seeds by liquid chromatography and mass spectrometry. The aqueous extract obtained in 50 mM sodium phosphate buffer pH 8.0 was sequentially fractionated in ammonium sulfate and subjected to characterization by Acquity UPLC system (Waters), coupled to quadrupole time of flight mass spectrometry (QtoF, Waters). Also, antimicrobial activity was verified by microdilution assay and the possible interactions between plant extract and antibiotics penicillin, norfloxacin, gentamicin and antifungal fluconazole, were determined using a subinhibitory concentration. Samples at 128 µg/mL showed inhibitory activity (p<0,05) with possible synergistic effect when associated with antibiotics and antifungal agent against Escherichia coli, Sthaphylococcus aureus and the yeast Candida albicans. It was possible to identify in the crude extract and fractions several phenolic compounds, organic acids, and some polyphenols in positive ionization mode. These results suggest that aqueous extract and fractions of A. cearensis may present compounds with the ability to interact and act synergistically with antimicrobial drugs, highlighting its potential as an alternative source for the development of new antimicrobial agents.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Amburana cearensis A - Árvore adulta B - Fruto. C -Sementes. . ... 12
Figura 02. Representação dos mecanismos de resistência a antibióticos. ... 15
Figura 03. Exemplares de sementes de A. cearensis utilizadas no estudo ... 20
Figura 04. Esquema de extração e fracionamento de A. cearensis ... 21
Figura 05. Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência ... 25
Figura 06. Ensaio de Concentração fungicida ... 30
Figura 07. SDS-PAGE (12%) do extrato bruto e frações proteicas de Amburana cearensis. M: marcador de peso molecular, E.B: Extrato Bruto, F1: Fração 0-30%; F2: Fração 30-60%; F3: Fração 60-90%) ... 32
Figura 08. Cromatograma UPLC/oa-TOF-MS do Extrato Bruto de Amburana cearensis ... 33
Figura 09. Cromatograma UPLC/oa-TOF-MS da Fração 1 de Amburana cearensis. ... 33
Figura 10. Cromatograma UPLC/oa-TOF-MS da Fração 2 de Amburana cearensis. ... 35
Figura 11. Cromatograma UPLC/oa-TOF-MS da Fração 3 de Amburana cearensis. ... 36
Figure 12: Principais estruturas correspondetes aos compostos identificados em A. cearensis A: EB;B:F1; C: F2;D:F3...38
Figura 13. Concentração Inibitória Mínima (CIM) do aminoglicosídeo (gentamicina) na presença e na ausência do extrato bruto e suas frações de Amburana cearensis em uma concentração CIM/8 (128 μg/mL), frente a S. aureus 10 e E. coli 06...41
Figura 14. Concentração Inibitória Mínima (CIM) da furoquinilona de segunda geração (norfloxacino) na presença e na ausência do extrato bruto e suas frações de A. cearensis em uma concentração CIM/8 (128 μg/mL), frente a S. aureus 10 e E. coli 06...44
Figura 15. Concentração Inibitória Mínima (CIM) do beta-lactâmico (penicilina) na presença e na ausência do extrato bruto e suas frações de Amburana cearensis em uma concentração CIM/8 (128 μg/mL), frente a S. aureus 10 e E. Coli 06...47
Figura 16. IC50 e Concentração Inibitória Mínima (CIM) em µg/mL do Extrato bruto e frações de A. cearensis contra Candida albicans CA INCQS 40,006... ... 50
Figura 17. IC50 e efeito modulador em µg/mL do Extrato bruto e frações de A. cearensis contra Candida albicans CA INCQS 40,006.. ... 53
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Origem bacteriana e perfil de resistência. ... 38 Tabela 02: Dosagem de proteínas e unidade de inibição para EB e frações de A.
cearensis...42 Tabela 03: Substâncias identificadas pelo UPLC-ESI-TOFMS/MS (QTOF) em modo positivo no Extrato Bruto de Amburana cearensis ... 45 Tabela 04: Substâncias identificadas pelo UPLC-ESI-TOFMS/MS (QTOF) em modo positivo na Fração 1 de Amburana cearensis ... 48 Tabela 05: Substâncias identificadas pelo UPLC-ESI-TOFMS/MS (QTOF) em modo positivo na Fração 2 de Amburana cearensis ... 51
LISTA DE QUADROS
Quadro 01: Origem bacteriana e perfil de resistência. ... 23 Quadro 02: Dosagem de proteínas e unidade de inibição para EB e frações de A. cearensis .34 Quadro 03: Concentrações fungicidas mínimas (CFM) para o EB e frações de A. cearensis combinado com Fluconazol...37
LISTA DAS PRINCIPAIS ABREVIATURAS/SIGLAS
ASD – ágar Sabouraud dextrose
ATCC ‒American Type Culture Collection ATR – Attenuated total reflectance
BHI (IHB) – Brain heart infusion
CCD – Cromatografia de Camada Delgada
CL50 – Concentração Letal capaz de matar 50% dos organismos
CIM – Concentração Inibitória Mínima CIM/8 ‒ Concentração subinibitória CFM – Concentração Fungicida Mínima DMSO – Dimetilsulfóxido
EB – Extrato Bruto
F1 – Fração 1, obtida com faixa de 0-30% de saturação de (NH4)2SO4
F2 – Fração 2, obtida com faixa de 30-60% de saturação de (NH4)2SO4
F3 – Fração 3, obtida com faixa de 60-90% de saturação de (NH4)2SO4
GMPc – Monofosfato cíclico de guanosina HCL – Ácido clorídrico
HIA (AIH) – Heart infusion Agar
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards OMS – Organização Mundial de Saúde
PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida PAL – Fenilalanina amônia-liase
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
TEMED – N´, N´, N´, N´, tetrametiletilenodiamina Tris –Tris (hidroximetil) aminometano
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO ... 10
1.1 Plantas de uso medicinal ... 10
1.2 Amburana cearensis ... 11
1.3 Inibidores de proteases e potencial farmacológico ...13
1.4 Microganismos, infecções e mecanismos de resistência ... 14
1.4.1 Bactérias ... 15
1.4.2 Fungos ... 17
1.5 Busca por novos fármacos ... 18
2 OBJETIVOS ... 20
2.1 Objetivo Geral ... 20
2.2 Objetivos Específicos ... 20
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 21
3.1 Obtenção das Sementes e Preparo da Farinha ... 21
3.2 Preparo do extrato bruto das sementes ... 21
3.3 Fracionamento das moléculas bioativas com sulfato de amônio ... 22
3.4 Ensaio antibacteriano e modulação antibiótica ... 23
3.4.1 Meios de cultura ... 23
3.4.2 Antibióticos e reagentes... 23
3.4.3 Cepas microbianas ... 23
3.4.4 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ... 24
3.4.5 Efeito modulador dos extratos e frações na atividade de antibióticos de uso clínico ... 25
3.4.6 Análise estatística ... 25
3.5 Ensaios antifúngicos e modulação do antifúngico ... 26
3.5.1 Cepas e meio de cultura ... 26
3.5.2 Drogas, reagentes e preparo das soluções ... 26
3.5.3 Determinação de IC50 e curva de viabilidade celular ... 26
3.5.4 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) ... 27
3.5.5 Avaliação do efeito modificador das amostras sobre ação do fluconazol ... 28
3.5.6 Análise estatística ... 29
3.6 Determinação da concentração das proteínas ... 29
3.7 Ensaio para detecção de inibidores de tripsina ... 29
3.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida descontínuo e desnaturantes (SDS-PAGE) ... 30
3.9 Análise cromatográfica dos EB e frações ... 30
3.10. Condições de aquisição do Espectrômetro de Massas de Alta resolução – ESI -XEVO-QToF ... 31
4 RESULTADOS ... 32
4.3 Caracterização do EB e frações de A. cearensis ... 37
4.3.1 Dosagem de proteínas totais pelo método de Bradford ... 37
4.3.2 Detecção de atividade inibidora de Tripsina ... 38
4.3.3 Análise das frações proteicas por eletroforese em gel de poliacrilamida ... 38
4.3.4 Caracterização por Acquity UPLC (Waters), acoplado a um espectrômetro de massas Quadrupolo / Tempo de Voo (QTOF, Waters). ... 39
5 DISCUSSÃO ... 54
6 CONCLUSÃO ... 59
1 INTRODUÇÃO
1.1 Plantas de uso medicinal
Desde a antiguidade o uso de plantas para o tratamento de doenças é uma prática comum na maioria dos países (FATEMEH, ZAHRA, HOSSEIN, 2018). A compreensão histórica sobre o uso de plantas para curar doenças, define características de uma prática milenar da medicina popular, que acompanha a humanidade desde seus tempos mais remotos. A este fato ainda pode-se destacar que uma quantidade significativa da população mundial, utiliza as plantas para fins medicinais como único recurso terapêutico (KIA; LORIGOOINI, AMINI-KHOEI, 2018).
Segundo dados divulgados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) 60% da população mundial dependem de fitoterapia e cerca de 80% da população dos países em desenvolvimento depende quase que totalmente dela, para suas necessidades básicas de saúde (KHAN e AHMAD, 2019). Cerca de 11% dos medicamentos considerados essenciais são produzidos tão somente por plantas, além disto, um amplo número de fármacos teve seu desenvolvimento a partir de fontes naturais (DA SILVA et al., 2010;TOMIOKA et al.,2019).
As plantas produzem substâncias que atuam como defesa contra o ataque de bactérias, fungos, plantas, insetos, nematóides, mamíferos e pássaros. A produção desse arsenal de moléculas bioativas fornece uma diversidade química que gera diferentes efeitos. Dentre estas podemos citar os alcalóides, terpenóides, glicosídeos cianogênicos, aminoácidos não proteicos e proteínas envolvidas na defesa e resistência de plantas a agentes bióticos e abióticos (KLIEBENSTEIN, 2012). Diversas proteínas de defesa vegetal têm sido relatadas por apresentarem atividades biológicas com potencial aplicação na saúde e agricultura, sendo, portanto, alvo de grande interesse em biotecnologia. Dentre essas proteínas os inibidores de proteases recebem especial atenção, pois são moléculas ativas contra patógenos (fitopatógenos e patógenos de importância médica) (UCHÔA et al., 2009), apresentam como principais alvos a parede celular do patógeno, a membrana plasmática ou ainda outros alvos como enzimas proteolíticas secretadas ou intracelulares (FERREIRA et al., 2007). Em plantas, os inibidores de proteases podem ser citados como um dos diversos tipos de componentes constitutivos de tecidos de reserva como sementes e tubérculos, mas podem ser expressos de forma induzida em resposta ao ataque de pragas e patógenos (PRASAD et al., 2010). Os inibidores de proteases podem inibir a atividade proteolítica de enzimas de
diferentes fontes por competir com o substrato pelo sítio ativo da enzima (VON POSER e MENTZ, 2003). Em sementes, participam de vários processos fisiológicos, atuando na regulação de enzimas endógenas e protegendo os tecidos contra o ataque de pragas e invasão de microrganismos (SELS et al., 2008).
A padronização e avaliação da aplicação de compostos ativos derivados de plantas estão ajudando no surgimento de uma nova era do sistema de saúde para tratar doenças humanas. A retomada do conhecimento tradicional e das plantas medicinais pode desempenhar um papel fundamental na exploração e descoberta de recursos naturais das plantas. Uma etapa importante na avaliação da qualidade de plantas medicinais é a verificação de sua eficácia e toxicidade (JAMSHIDI-KIA, LORIGOOINI, AMINI-KHOEI, 2018). As características antimicrobianas de substâncias originadas de plantas têm sido confirmadas por meio de várias pesquisas em todo o mundo que avaliam suas propriedades químico-farmacológicas. Essas características normalmente são estudadas, analisadas, avaliadas e confirmadas através de ensaios in vitro e in vivo.
1.2 Amburana cearensis
A. cearensis (Allemão) A.C. Smith pertence à família Fabaceae, essa por sua vez é constituída por aproximadamente 727 gêneros e 19 325 espécies, sendo considerada a terceira maior família de angiospermas. Sendo caracterizada no Brasil por mais ou menos 188 gêneros e 2 100 espécies, distribuída em quase todas as formações vegetais. A flora brasileira é tida como uma das mais ricas do mundo e a família Fabaceae umas das mais diversificada e representativa em todos os ecossistemas (LEWIS et.al.,2005; GOMES et al., 2018), reconhecida por suas características ecológicas e potencial econômico (GOMES et al., 2018).
As espécies vegetais que a compõem essa família são bastante utilizadas na alimentação, para fins medicinais, na indústria como corante e pesticida, na marcenaria para produção de móveis e para paisagismo e ornamentação de interiores. Pensando no lado ecológico, possui um valor estimado devido à capacidade de fixar nitrogênio, propiciam diversas estratégias para enriquecer fornecimento de nutrientes ao solo, o que as tornou precursoras em solo de fertilidade reduzida (DUTRA et al.,2008; YAHARA, et al., 2013).
Dentro do sistema de classificação de gênero a Amburana, essa é formada por apenas duas espécies, A. acreana Ducke e A. cearensis A. C. Smith, ambas possuem grande importância econômica e finalidade medicinal.
A. acreana apresenta-se na forma arborescente de alto fuste, ocorrendo em matas altas e fechadas, a A. cearensis apresentada na figura 01 assume a forma arbustiva de fuste curto, predominando em formações vegetais tropicais a subtropicais secas (CANUTO et.al., 2004). A. cearensis é conhecida popularmente por diversas designações, dentre elas destacam-se: imburana-de-cheiro, cerejeira e cumaru. Esta última denominação é considerada a mais famosa delas, constantemente ocorrer confusões com outra leguminosa homônima chamada Dipteryx odorata, ambas ricas em cumarina (MAIA, 2004).
Figura 01: A- Árvore adulta de Amburana cearensis. B- Fruto. C-Sementes. Adaptado de
https://www.arvores.brasil.nom.br/imbur1/index.htm (acesso em 03 de novembro de 2018).
O tamanho da semente pode variar de 12,55 a 17,55 mm e a sua largura de 8,35 mm a 11,50 mm, apresentando o hilo bem aparente, homócromo (sem a camada pulverulenta do endocarpo), que se localiza lateralmente, próximo à base da semente, numa região mais escura e mais protuberante. Incomumente pode apresentar duas sementes na porção terminal. Quanto cortado qualquer parte da planta, essa exala um cheiro característico de cumarina, devido a essa característica o nome na cultura popular é o Cumaru do Ceará ou Cumaru de cheiro (CUNHA; FERREIRA, 2003).
Devido utilização de A. cearensis para fins terapêuticos com base no conhecimento popular, tornou-se essencial à realização de estudos científicos que justificassem suas aplicações farmacológicas. Sendo assim, desde o início dos anos de 1980, estudos químicos e farmacológicos têm sido realizados, buscando estabelecer o aproveitamento desta planta. Devido esse destaque A. cearensis vem sendo estudada, baseando sua caracterização química e suas propriedades farmacológicas. Alguns relatos de atividade antibacteriana, associação sinérgica frente a bactérias e ação antifúngica já foram relatadas (FIGUEIREDO et al., 2013; SANTOS et al., 2010). O esclarecimento fitoquímico de A. cearensis está voltado ao estudo
da casca do caule, devido esta ser a parte mais utilizada medicinalmente. Foi demonstrado a presença de cumarina e compostos fenólicos, principalmente flavonoides como isocampferídio, o flavonoide majoritário; campferol; quercetina; 4’-metoxi-fisetina; afrormosina; 7-hidroxi-8,4’-dimetoxiisoflavona e os biflavonóides amburanina; ácido protocatecuico e ácido vanílico; glicosídeos fenólicos, como amburosídio e esteróides glicosilados bsitosterol e estigmasterol (SILVEIRA; PESSOA, 2005). Além disso, 24-metilenocicloartanol e 3,4-dimetoxi-cinamato de metila já foram relatados em estudos posteriores (CANUTO, 2007). Mesmo com algumas caracterizações divulgadas de A. cearensis ainda se fazem necessárias identificações de compostos de diferentes partes da planta, no intuito de elucidir as lacunas dos possíveis mecanismos de ação das respectivas atividades farmacológicas atribuídas a essa.
1.3 Inibidores de proteases e potencial farmacológico
As proteases são enzimas que apresentam uma infinidade de funções fisiológicas nos mais diversos tipos celulares, participando de defesa imunológica, renovação tecidual e digestão de alimentos (FEAR, 2007).
Proteases serínicas podem atuar como endoproteinases sendo classificadas em famílias e subfamílias. A subfamília SI.A compõe-se das tripsinas, quimotripsinas, elastases e colagenases serínicas. Estas enzimas contêm um conjunto de três coordenadas de aminoácidos compostos de histidina (His), aspartato (Asp) e serina (Ser) e estruturas tridimensionais semelhantes. Apesar das semelhanças essas enzimas possuem um resíduo catalítico único (BLOW, 1997).
Os inibidores de proteases nas plantas desenvolvem diversas funções fisiológicas, especialmente na resposta a fatores abióticos, no estresse biótico e na defesa contra ataque de insetos pragas (GOMES et al., 2005). Quando ocorre a ingestão desses inibidores pode ocorrer o comprometimento da digestão e absorção dos nutrientes essenciais, interferindo no crescimento e desenvolvimento do inseto, ou mesmo ocasionando-lhe a morte sendo assim associados ao controle de pragas (CRUZ et al., 2013).
A função defensiva dos inibidores de proteases aparenta não estar restrita a inibição das enzimas digestivas, sendo que as proteases atuam em diversos outros processos importantes como, por exemplo, a oogênese e metamorfose (MESQUITA-RODRIGUES et al., 2011). SUMIKAWA et al. (2010) sugerindo que a presença de domínios funcionais nos inibidores pode resultar em diferentes sinalizações e associação a atividades farmacológicas.
Um exemplo de inibidor de proteasse derivado de animais é a Bothrojaracina (BJC) um potente inibidor de trombina presente no veneno da Bothrops jararaca, que foi considerado como molécula anti-trombótica (ZINGALI et al., 2005), sendo considerado uma alternativa ao tratamento da trombose, já que esta é uma das principais causas de morte devido alterações fitopatológicas.
Vale destacar que inibidores de proteases encontrados em diferentes sementes foram considerados antifúngicos e seu mecanismo de ação determinado está relacionado diretamente a mecanismos já descritos em defesa de plantas (SANTOS et al., 2004; AHMAD et al., 2019; SAMIKSHA et al., 2019).
É importante destacar estudos de SANTOS et al., 2010 que demontrou ação antifúngica em frações ricas em proteínas e peptideos de Amburana cearencis, onde o efeito de inibição ocorreu frente ao fungos Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Candida albicans e Saccharomyces cerevisiae.Fortalecendo a perpecstiva desse estudo. A diversidade de atividades biológicas dos inibidores de proteases tem estimulado o estudo da sua presença em fontes variadas visando a uma futura utilização biotecnológica dos inibidores isolados e caracterizados.
1.4 Microrganismos, infecções e mecanismos de resistência
O corpo humano abriga uma diversidade de microrganismos, incluindo bactérias, vírus e fungos (MOISSL-EICHINGER et al., 2017). Esses microrganismos vivem com o hospedeiro de uma maneira simbiótica, porém essa relação pode ser afetada por vários fatores como: ambientais, pH, umidade, temperatura, idade do hospedeiro, sexo e local do corpo que habita (SAN-MIGUEL e GRICE, 2015).
Os processos que levam esses microrganismos a serem patogênicos, estão relacionados a fatores de virulências (CONTI, GUIMARÃES e PUPO, 2012). As doenças infecciosas representam uma das mais importantes causas de morte no mundo, com prevalência marcante nas regiões tropicais. Nos países em desenvolvimento o tratamento destas enfermidades é mais difícil, não só pela existência de microrganismos resistentes, mas também pela baixa renda da população que dificulta seu acesso ao atendimento médico e medicamentos apropriados. O número de microrganismo resistente tem aumentado descontroladamente gerando novas infecções que são resultantes de alterações ou evolução dos organismos já existentes, dificultando ainda mais o tratamento levando a um verdadeiro colapso no sistema de saúde, nas condições socioeconômicas, com isso a necessidade de
trabalhar politicas públicas para controle de infecções e investir em pesquisa de novas opções de antibióticos (KUETE et al, 2011; CDC, 2018).
O número de doenças infecciosas, provocadas por microrganismos como bactérias e fungos é alto e preocupante. Com essa incidência elevada à comunidade científica busca alternativas para combater à resistência antibiótica que tem se tornado cada vez mais frequentes frente à classe de fármacos de primeira escolha, vale salientar que, infecções ocasionadas por bactérias super-resistentes ou superbactérias levaram a uma regressão do que foi vivenciado na era pré-antibiótico (BAKER, 2015).
1.4.1 Bactérias
As bactérias são parte integral e inseparável da vida na terra. Elas são encontradas em qualquer lugar, revestem a pele, as mucosas e cobrem o trato intestinal dos homens e dos animais. Elas estão intrinsecamente ligadas à vida de organismos e aos amplos ambientes em que habitam (SANTOS, 2004). Os microrganismos que agem como patógenos distingue-se por sua ação e resposta nos diferentes tecidos de um mesmo hospedeiro. Existem avanços empolgantes nos estudos da relação função-estrutura para a maioria das moléculas bacterianas que possuem papel de relevante importância na doença infecciosa. Esses conhecimentos abrangem moléculas que fazem parte de estruturas tais com fimbrias, proteína M estreptocócica e toxinas. A reunião de técnicas moleculares, mutagênese, analise de epítopos e cristalografia por Raios X tem dado oportunidade de novas abordagens sobre a atribuição dessas moléculas na virulência (GOMES, 2013).
Os antibióticos são uma classe essencial de medicamento. Que surgiram pela necessidade de combater infecções letais, porém a eficiência dos antibióticos esta ameaçada, como vem sendo demonstrado em inúmeros estudos (SANTOS FILHO et al., 2002; FIGUEIREDO et al., 2009;ZANOL et al., 2010; NEVES et al., 2011; VEINOVIC e ANTIC STANKOVIK, 2018; POSADA-PERLAZA et al.,2019; GAJDÁCS e ALBERICIO, 2019; PEROVIC, CHUA et al., 2019 e MOREL et al., 2020). Há um aumento exorbitante de casos, não apenas de resistência a um fármaco, mas a muitos deles.
As bactérias possuem vários mecanismos pelos quais podem resistir aos efeitos dos antimicrobianos, que pode ocorrer de forma natural, quando de maneira ínsita a bactéria resiste ao antibiótico, ou adquirida que é gerada por características funcionais ou estruturais do microrganismo se opondo a ação antibiótica, não dependendo de um primeiro contato com o mesmo. Dentre os mecanismos de resistência das bactérias destaca-se alteração da estrutura
molecular dos antimicrobianos, produção de enzimas que inativam a droga, alteração das proteínas ligantes ou outros pontos-alvo nas paredes das células, alvos modificados da DNA-girase, mutações de permeabilidade e modificações ribossômicas (MUNITA et al., 2016; CDC, 2019) como mostra a Figura 02.
Figura 02: Representação dos mecanismos de resistência a antibióticos (Fonte: CDC, 2019) com
modificações.
As bactérias do gênero Staphylococcus destacam-se dentro das infecções hospitalares, pois esses microrganismos podem sobreviver em superfícies secas durante um longo período de tempo, mas são sensíveis às altas temperaturas, bem como a desinfetantes e soluções antissépticas. O S. aureus é uma das espécies bacterianas mais comuns, e é a mais virulenta do seu um grupo, porém também compõe a microbiota normal da pele e da mucosa. Algumas espécies de Staphylococcus são constantemente identificadas como agentes etiológicos de infecções oportunistas em muitos animais e também em humanos (NOSTRO et al., 2004; COUTINHO et al., 2009; GHOLAMI et al., 2019). S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus e S. haemolyticus são as espécies mais marcantes por acarretar infecções nos seres humanos a nível hospitalar. Além de promover tipos distintos de intoxicações. S. aureus é o patógeno mais corriqueiro em infecções purulentas, por exemplo em: furúnculo, carbúnculo, abscesso, miocardite, endocardite, pneumonia, meningite e artrite bacteriana (LIMA et.al.,2015).
Outra bactéria em destaque nas infecções hospitalares é a Escherichia coli, para qual já foi descrito na literatura surtos de contaminação hospitalar, como por exemplo, em um hospital comunitário de Los Angeles, no qual foi detectado E. coli culturas de sangue e escarro (BECKER et.al.,2019). E. coli isoladamente é responsável por entre 70% a 85% das infecções comunitárias ou hospitalares detectadas no trato urinário inferior, independente de região ou características físicas (PIRES et al., 2016).
1.4.2 Fungos
Os fungos fazem parte da microbiota humana, da qual a maior proporção é formada por leveduras do gênero Candida, que em algumas situações podem ocasionar infecções (SIQUEIRA e BILGE, 2004). Podendo habitar o trato gastrointestinal, sistema urogenital, pele e mucosa do trato respiratório de seres humanos. Em pacientes imunocomprometidos podem torna-se patogênicas (VIEIRA e SANTOS, 2017), depende da habilidade em modular a expressão dos fatores de virulência, em resposta a alterações locais associadas à competência do sistema imune do hospedeiro (ARENDRUP, 2013; BATAC E DENNING, 2017). A virulência vai depender de alguns fatores como: adesão às células do hospedeiro, formação de hifas, plasticidade fenotípica e produção de enzimas hidrolíticas, principalmente fosfolipases e proteases, esses fatores facilitam a invasão e colonização no tecido dos hospedeiros (FOTEDAR; AL-HEDAITHY, 2005; CORRÊA et.al., 2018), nestas circunstâncias, podem causar doença em praticamente todos os órgãos e tecidos, resultando em infecção superficial, invasiva e sistêmica (VIEIRA e SANTOS, 2017).
O gênero Candida compreende cerca de 200 espécies, sendo C. albicans a espécie mais patogênica e constantemente isolada das lesões de candidíase. Entretanto, outras espécies do complexo de Candidas patogênicas, as Candidas não-albicans (NAC), também podem ser elencadas como importantes patógenos humanos, como: C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei, são também freqüentemente identificadas em lesões e infecções fúngicas (Turner e Butler, 2014). Além disso, tem sido preconizado que a alta incidência de infecções causadas por espécies não albicans vem aumentando (SULLIVAN et al., 2004; ZIDA et al., 2017).
Algumas espécies de Candida sp. demonstram resistência intrínseca aos azóis, em especial ao fluconazol. Contudo, leveduras desse gênero, após exposição aos antifúngicos, conseguem manifestar resistência através de mecanismos moleculares como modificações na expressão das bombas de efluxo da droga bem como alteração da biossíntese do ergosterol (SANGLARD e ODDS, 2002; SILVA et al.,2016).
As bombas de efluxo são constituídas por proteínas que estão divididas em dois grupos que são baseados na estrutura e tipo de energia que utilizam para o transporte de várias moléculas. Destaca-se no primeiro grupo os transportadores que utilizam a degradação de ATP como fonte de energia, a esse grupo de proteínas dá-se o nome de família ABC (cassete de ligação de ATP). O segundo grupo é composto por transportadores cuja energia é obtida a partir de um gradiente de concentração de prótons presentes em membranas biológicas. Investiga-se que mutações em genes que estão envolvidos na regulação das bombas de efluxo podem levar à superexpressão destas, fato que ocorre em certos casos de resistência, onde a concentração de antifúngico no microrganismo e sua ação são alteradas pelo bombeamento ativo da droga do meio intracelular para o meio extracelular (JENSEN et.al., 2015).
1.5 Busca por novos fármacos
O uso excessivo e consumo inadequado de antimicrobianos contribuíram para o surgimento da resistência dos microrganismos aos fármacos de primeira escolha, tornando-se um grave problema de saúde pública mundial (GUPTA e BIRDI, 2017). O aumento contínuo e descontrolado dessa resistência, principalmente entre patógenos potencialmente perigosos, tem elevado a necessidade de novos fármacos, tanto para infecções adquiridas em hospitais quanto na comunidade, para assim obter tratamento eficaz contra infecções (BRITO e CORDEIRO, 2012; YANG et al.,2018).
Essa resistência tem se dispersado mais rapidamente que a inserção de novas substâncias. Não existia desde 1987 uma nova classe de antibióticos no mercado (VENTOLA, 2015), pois se investia nos estudos de substâncias que potencializavam os efeitos nas classes existentes como modificações estruturais (HOWARD; HOPWOOD; DAVIES, 2014). Em 2017 surge uma classe de antibiótico direcionado para LpxC da via biossintética de Lipídeo A em bactérias Gram-negativas sendo essa considerada uma estratégia promissora para o combate a infecções bacterianas por bactérias Gram-negativas (LEMAÍTRE et al, 2017).
Estratégias com base no controle do uso de antimicrobianos podem ser excelentes, para prevenir o surgimento de mais resistência. É por isso que determinações nacionais focadas no controle de uso desses fármacos são desenvolvidas, aperfeiçoada e executadas. Ainda seria viável dispor de informações bem próximas do real, sobre as alterações nos padrões brasileiros de prescrever os antimicrobianos e fazer uma relação com a evolução dos perfis de resistência de microrganismos provenientes de amostras ambulatoriais. Assim podendo ser desenvolvidas políticas baseadas em cada região, levando em consideração os
problemas particulares encontrados em diferentes locais do território nacional (BRITO e CORDEIRO, 2012; SARTELLI et al.,2016).
Combinações de múltiplas drogas estão sendo utilizadas no combate à disseminação de microrganismos patogênicos resistentes a antimicrobianos. Relatos indicam que diferentes combinações de fármacos testadas in vitro e aplicadas na clínica são comuns, é o caso da combinação de penicilina com a gentamicina. Essa combinação vem sendo utilizada também entre antimicrobianos e produtos naturais de origem vegetal que poderão alterar a ação dos fármacos, seja aumentando a sua atividade ou revertendo à resistência (COUTINHO et al, 2011; KSOURI et al., 2017).
Pesquisas com novas substâncias com efeito antimicrobiano podem contribuir significativamente no desenvolvimento do campo da saúde em nível mundial, encontrando fórmulas mais eficientes e com menos toxicidade na corrida contra a resistência de microrganismos patogênicos (SAÚDE-GUIMARÃES e FARIA, 2007; ANDRADE et al.,2019).
Diante desses fatos, pesquisas que buscam alternativas terapêuticas para a cura e prevenção de infecções vêm ganhando força todos os dias, na tentativa de encontrar medicamentos mais seguros, consequentemente com menos efeitos colaterais, capazes de superar a barreira que é a resistência aos fungos e bactérias patogênicas aos medicamentos disponíveis. O objetivo dessa pesquisa foi investigar os efeitos in vitro de extrato bruto e frações de A. cearensis na inibição de crescimento do fungo Candida albicans e bactérias Sthaphylococcus aureus e Escherichia coli, bem como a sua atividade na associação das amostras com antibióticos e antifúngico de primeira escolha.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a atividade antimicrobiana do Extrato Bruto e frações de sementes de Amburana cearensis e sua ação associada a antimicrobianos de uso clínico.
2.2 Objetivos Específicos
Obter o extrato bruto e frações de A. cearencis
Avaliar o espectro de ação e o grau de inibição do EB e frações de sementes de A. cearensis determinando a concentração inibitória mínima dos extratos sobre as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus;
Averiguar a eficácia do EB e frações de A. cearensis na associação com antibióticos selecionados frente a resistência bacteriana.
Determinar a concentração inibitória mínima do EB e frações de A. cearensis contra o fungo Candida albicans;
Investigar a concentração fungicida mínima do EB e frações de A. cearensis;
Verificar a eficácia do EB e frações de A. cearensis na associação com Fluconazol frente à resistência fúngica.
Analisar a atividade antitríptica e concentração preoteica de EB e frações de A. cearencis.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção das Sementes e Preparo da Farinha
As sementes de A. cearensis foram identificas e fornecidas pelo banco de sementes da Floresta Nacional (Flona) de Nísia Floresta, Unidade de Conservação (UC) gerida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), localizada no município de Nísia Floresta, estado do Rio Grande do Norte (RN) e da Rede de sementes de Caatinga (UNIVASF). Deve-se destacar que as sementes empregadas neste trabalho já estavam fora do prazo para uso em reflorestamento e o acesso ao patrimônio biológico está registrado no candastro do SISGEN com centidão N° A3104E7.
Figura 03: Exemplares de sementes de A. cearensis utilizadas no estudo (Fonte: arquivo pessoal da autora).
As sementes de A. cearensis foram descascadas e os cotilédones foram triturados em moinho multiuso TE-631/3 refrigerado, até a obtenção de uma farinha de granulação fina passada por uma malha de 40 mesh e seguida para preparação dos extratos.
3.2 Preparo do extrato bruto das sementes
A farinha das sementes foi submetida à extração por homogeneização com solução tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, na proporção de 1:10 (m / v), sob agitação constante por 4 h a 4 °C e em seguida a suspensão foi centrifugada a 10.000 xg por 30 minutos a 4 °C. O
precipitado foi descartado e o sobrenadante obtido foi filtrado e denominado extrato bruto (EB).
3.3 Fracionamento das moléculas bioativas com sulfato de amônio
O extrato bruto foi fracionado em três faixas de concentração de sulfato de amônio: 0-30%, 30-60% e 60-90% de saturação. Após cada etapa de precipitação, a amostra foi mantida a uma temperatura de 4 °C, por aproximadamente 16 horas e posteriormente foi centrifugada a 10000 xg durante 30 minutos, a 4 °C. Em seguida as frações foram ressuspendidas e dialisadas, por aproximadamente 20 horas, contra água destilada. Após diálise, as frações denominadas de acordo com a faixa de saturação (0-30%, 30-60% e 60-90% denominadas como F1, F2 e F3 respectivamente) foram liofilizadas e armazenadas a temperatura ambiente para os ensaios posteriores.
3.4 Ensaio antibacteriano e modulação antibiótica
3.4.1 Meios de cultura
Os meios de culturas utilizados foram: heart infusion agar - HIA (Difco Laboratories ltda) que foi preparado seguindo as especificações do fabricante e o meio de cultura em caldo brain heart infusion broth – BHI (Acumedia Manufacturers Inc) que foi preparado na concentração de 10 %. As cepas bacterianas foram mantidas sob refrigeração a 4 ºC e antes dos ensaios foram cultivadas em HIA, incubadas em estufa bacteriológica na temperatura a 37 ºC por um período de 24 horas.
3.4.2 Antibióticos e reagentes
Os antibióticos utilizados no ensaio foram: gentamicina, norfloxacina e penicilina (Sigma Co., St. Louis, USA). Os antibióticos foram diluídos em água destilada estéril na concentração de 1.024 μg / mL. 10 mg dos extratos e frações utilizados nos ensaios foram pesados e dissolvidos em 1 mL de dimetilsulfóxido-DMSO. Em seguida as soluções obtidas foram diluídas em água destilada estéril até concentração de 1.024 μg / mL. Para interpretação dos testes foi utilizado o reagente resazurina sódica (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO) como um indicativo colorimétrico do crescimento bacteriano por óxido-redução (SALES et al., 2014; SALVAT et al., 2001).
3.4.3 Cepas microbianas
Os isolados clínicos utilizados foram obtidos através do laboratório de micologia clínica da Universidade Federal da Paraíba - UFPB. As linhagens padrões utilizadas nos ensaios antimicrobianos foram: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923; e as linhagens multirresistentes: E. coli 06, S. aureus 10. Os perfis de susceptibilidade das bactérias multirresistente e sua origem estão descritos no quadro 1.
Bactérias Origem Perfil de Sensibilidade
Staphylococcus aureus – 10 Swab retal
Sensível: Tec
Resistente:
Amc, Amox, Amp, Asb, Azi, Ca, Cef, Cfo, Cip, Cla, Clin, Eri, Lev, Mox, Oxa, Pen.
Escherichia coli – 06 Cultura de urina
Sensível:
Ami, Cip, Etp, Imi, Lev, Mer, Nit.
Resistente:
Asb, Ca, Cef, Cfo, Cmp, Cro.
Quadro 01: Origem bacteriana e perfil de resistência.
Legenda: Amc- Amoxicilina + Ac. Clavulâmico, Ami- Amicacina, Amox– Amoxicilina, Amp – Ampicilina, Asb - Ampicilina + Sulbactam, Azi – Azitromicina, Ca - Cefadroxil; Cef – Cefalexina, Cfo- Cefoxitina, Cip –
Ciprofloxacino, Cip-Ciprofloxacina, Cla – Claritromicina, Clin –Clindamicina, Cmp- Cefepime, Cro-Ceftriaxona, Eri – Eritromicina, Etp- Ertapenem, Imi- imipeném, Lev-Levofloxacina, Mer- Meropenem, Mox –
Moxifloxacino, Nit-Nitrofurantoina, Oxa – Oxacilina, Pen – Penicilina, Ptz - Piperacilina, Tec-Teicoplanina Fonte: SANTOS, 2011 (laboratório de microbiologia da Universidade Federal de Paraíba-UFPB).
3.4.4 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A determinação da Concentração Inibitória Mínima - CIM foi executada conforme o método de microdiluição em caldo da CLSI (2008). Para a técnica foram preparados os inóculos a partir das culturas do crescimento de 24 horas. Uma alçada das cepas foi suspensa em solução salina a 0,9% e acompanhado o crescimento até a turvação da escala 0,5 de McFarland (1 x 105UFC / mL).
Foram preparadas soluções em microtubos (eppendorfs®) para volume de 1,5 mL de solução contendo 10% do inóculo bacteriano de 105unidades formadoras de colônia-UFC e o restante do volume foi completado com meio de cultura BHI (1350 μL). Subsequentemente 100 μL desta solução foram transferidos para poços de placa de microdiluição de 96 poços. Logo após foi feita a microdiluição seriada das amostras de 1:1 até o penúltimo poço, sendo o
último poço utilizado para o controle do crescimento microbiano. As concentrações variaram de 512 a 0,5 μg / mL. Em seguida as placas foram incubadas em estufa de crescimento microbiano por 24 horas a 37 ºC.
Para a determinação da CIM foram usados 20 μL da solução de resazurina (azul) como indicador de crescimento quando rezuzida a resorufina (rosa), sendo constatado o efeito inibitório quando o corante azul não sofre modificação para a cor rosa indicadora da reação da óxido-redução em temperatura ambiente num período de 2 horas. A mudança de coloração do azul para rosa é evidenciada como crescimento bacteriano (SALES et al., 2014; SALVAT et al.,2001). Os procedimentos foram realizados em triplicata e a CIM foi obtido através de uma média geométrica.
3.4.5 Efeito modulador dos extratos e frações na atividade de antibióticos de uso clínico Para verificar se os extratos brutos e suas frações modificariam a ação dos antibióticos frente às bactérias multirresistente, foi empregado o método proposto por Coutinho, Costa e Siqueira-Júnior (2008). As amostras foram avaliadas em concentração subinibitória mínima (CIM/8) para que não houvesse a inibição do crescimento por ação direta dos extratos.
Para os ensaios, foram preparados 1.500 μL da solução em microtubos (eppendorf®) com um volume correspondente a 10% do inóculo bacteriano (150 μL), o volume correspondente à concentração subinibitória mínina (CIM/8) dos compostos utilizados e meio de cultura BHI). Para o controle da modulação foram utilizados 1.350 μL de BHI e 150 μL de suspensão bacteriana. Logo em seguida, foram preenchidas as placas de microdiluição com 100 μL da solução. Posteriormente foram feitas diluições sucessivas com 100 μL dos antibióticos numa proporção de 1:1 até o penúltimo poço, o último poço foi utilizado para o controle do crescimento microbiano. Todos os procedimentos foram realizados em triplicata e a leitura realizada pelo método da resazurina descrito no item anterior.
3.4.6 Análise estatística
Os resultados dos ensaios foram obtidos em triplicata, e posteriormente foram calculadas as médias geométricas. As análises estatísticas foram realizadas através do teste duas vias ANOVA, tendo como dados centras as médias geométricas e os desvios Padrões das
médias. No teste de Bonferroni post hoc, p < 0,05 e p <0,0001 foram considerados significativos e p > 0,05 não significativos. Foi utilizado software GraphPad Prisma 5.0.
3.5 Ensaios antifúngicos e modulação do antifúngico
3.5.1 Cepas e meio de cultura
As cepas de Candida albicans utilizadas foram do tipo padrão e isolado, a partir da coleção de culturas da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), especificamente CA INCQS 40006 e CA URM 4125 padrão e isolado respectivamente. As cepas foram inoculadas em agar sabouraud dextrose (SDA, KASVI) e incubadas durante 24 h a 37 °C. Posteriormente, pequenas alíquotas da levedura foram transportadas para tubos de ensaio, cada um contendo 3 mL de solução salina estéril (0,9%). A concentração de inóculo foi padronizada por comparação com a escala de 0,5 McFarland (NCCLS, 2002). Sabouraud dextrose (SDB, HIMEDIA), em concentração dobrada, foi utilizado no ensaio de microdiluição.
3.5.2 Drogas, reagentes e preparo das soluções
O dimetil sulfóxido (DMSO, Merck, Alemanha) foi utilizado para fluidificar os extratos brutos e frações, enquanto o fluconazol antifúngico (Cápsula; Prati donaduzzi, Brasil) foi diluído em água e usado como medicamento de referência. As soluções das amostras testadas foram preparadas na concentração inicial de 150 mg / mL em DMSO. Para obtenção da concentração desejada para os ensaios, as amostras dissolvidas em DMSO foram diluídas em água destilada estéril até chegar à concentração desejada de 16.384 μg / mL, de tal forma que a concentração de DMSO não exercesse atividade sobre as células testadas (Stoppa et al., 2009). Foi realizado ensaio controle para verificar que o DMSO não teve efeito na atividade demosntrada.
Para determinação da concentração capaz de inibir 50% do crescimento das leveduras (IC50) os extratos foram microdiluídos em caldo sabouraud dextrose em
microplacas de 96 poços. Cada poço foi preenchido com 100 μL de produto contendo 10% inóculo fúngico e 100 μL do extrato ou fração (16.384 μg / mL) ou fluconazol (referência antifúngica), na mesma concentração no primeiro poço, seguido de diluição em série. As concentrações nos poços variaram de 8 a 8.192 μg / mL. O último poço não continha nenhum produto ou droga e serviu como um controle de crescimento da levedura (Javadpour et al., 1996; Morais – Braga et al., 2016).
Também foram preparados controles para os diluentes dos extratos e frações testadas (com solução de cloreto de sódio a 0,9% em vez do inóculo). Todos os testes foram realizados em quadruplicatas. As placas de 96 poços foram incubadas a 37 °C por 24 h, posteriormente, lidos em um leitor espectrofotômetrico de microplacas (Thermoplate®) no comprimento de onda de 630 nm. Os resultados obtidos na leitura foram usados para construir a curva celular de viabilidade e determinar a IC50 das amostras de extrato bruto e frações de sementes de A.
cearensis.
3.5.4 Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
Para verificar a concentração fungicida mínima utilizou-se a ponta de uma haste estéril (palito de madeira) que foi inserida em cada poço da placa previamente testada (exceto para o controle de esterilidade). Em seguida a haste foi levada para uma placa de petri contendo agar sabouraud dextrose, com o auxílio de uma placa guia fixada na parte inferior da placa para verificações de subcultura de levedura e viabilidade celular. Após 24 h de incubação, as placas foram verificadas quanto à formação de colônias (Ernst Klepser, Ernst, Messer, & Pfaller, 1999, com modificações). A concentração na qual não houve crescimento de colônia fúngica foi considerada CFM dos extratos brutos e frações testadas.
Figura 05: Ensaio de subcultivo celular para determinação da concentração fungicida mínima (CFM) (FONTE:
arquivo pessoal da autora)
3.5.5 Avaliação do efeito modificador das amostras sobre ação do fluconazol
Prelimirnamente, a ação intrínseca do EB, frações e fluconazol no crescimento das leveduras foram verificados, para que, neste ensaio, o efeito da combinação das amostras ao medicamento de referência pudesse ser avaliado, assim verificando se a ação antifúngica do fluconazol foi ou não potencializada pelos extratos brutos e frações testadas. Por conseguinte, as amostras foram utilizadas em concentrações sub-inibitórias (CFM / 16), de acordo a metodologia utilizada por Coutinho, Costa e Siqueira-Júnior (2008) com pequenas modificações. Nessa abordagem quando as amostras aumentam o potencial de ação da droga antifúngica, o efeito verificado é considerado tipo sinérgico, se o efeito compromete o desempenho da droga, é verificado como efeito antagonista. As placas foram preenchidas com 100 μL de solução contendo meio caldo sabouraud dextrose, acrescido de inóculo e da amostra seguido de microdiluição com 100 μL de fluconazol na concentração de 16.384 μg / mL. A mistura foi adicionada ao primeiro poço de cada coluna da placa a ser submetido a diluições seriadas em concentrações do produto variaram de 8.192 a 8 μg / mL. O último poço foi destinado ao controle de crescimento fúngico. Controles de diluição para as amostras (onde solução salina substituiu o inóculo) e controles de esterilidade média foram efetuados. A IC50 do fluconazol também foi determinada para fins comparativos, e um controle de
realizada em um Aparelho espectrofotométrico de microplacas tipo leitor de ELISA (Thermoplate®).
3.5.6 Análise estatística
Os dados obtidos foram verificados quanto a sua distribuição normal usando ANOVA de duas vias (P < 0,05; * P < 0,1;****P < 0,0001) comparando os valores para cada concentração, ponto por ponto, com o teste post hoc de Bonferroni. Os valores de IC50 foram
obtidos por análise de regressão não linear com interpolação da curva padrão desconhecida obtida de ensaios de crescimento fúngico como função da concentração do extrato e expressa em μg / mL. Para análise estatística, o software GraphPad Prism, v. 5.0 foi utilizado.
3.6 Determinação da concentração das proteínas
As determinações da concentração de proteínas de EB e frações foram feitas segundo o método de Bradford (1976) e reação do ácido bicinconínico, BCA (SMITH et al., 1985), utilizando-se como padrão a albumina sérica bovina.
3.7 Ensaio para detecção de inibidores de tripsina
Para detecção de atividade anti-triptica nas amostras, 20 µL de uma solução de tripsina (0,3 ug/uL) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com o equivalente a 200 µL de extrato ou fração teste, 120 µL de HCl 2,5 mM e o volume final ajustado para 250 µL com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5. Após esse período a reação foi iniciada adicionando-se 500 µL de azocaseína. A reação se processou por mais 10 minutos nas mesmas condições de incubação. A reação foi interrompida com a adição de 250 µL de solução de ácido acético 30%. Os ensaios controles foram realizados na ausência da fração inibidora nas mesmas condições acima descritas (KAKADE, SIMONS e LIENER, 1969). Os ensaios foram realizados em
triplicata e provas em branco foram feitas. Após incubação as absorbâncias foram obtidas em espectrofotômetro a 405 nm.
3.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida descontínuo e desnaturantes (SDS-PAGE)
Para avaliar o perfil proteico das amostras, as amostras (EB e frações) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em presença de SDS, de acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970). O gel de separação foi montado em sistema vertical (10 x 14 cm, com espaçadores de 0,75 mm) e preparado com 1,25 mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 1,25 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 2,425 mL de água destilada; 50 µL de SDS 10%; 5 µL de TEMED concentrado e 25 µL de persulfato de amônio 30%. O gel de concentração conteve 0,33 mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 625 µL de tampão Tris-HCl0,5 M pH 6,8; 1,5 mL de água destilada; 25 µL de SDS 10%; 5 µL de TEMED e 12,5 µL de persulfato de amônio. O tampão de corrida foi feito com Tris 25 mM; glicina 192 mM e SDS 10%. Uma vez diluída em tampão de amostra Tris-HCl 0,0625 M, SDS 2%, glicerol 10% v / v, 0,01% de azul de bromofenol e 1 mM de DTT, num volume de 20 µL, a alíquota foi aplicada no gel, o qual foi submetido a uma amperagem constante de 30 mA por aproximadamente 2 h. O gel foi corado em solução de coomassie blue R. Para determinar a massa molecular das proteínas, foram utilizados marcadores padrão de proteína.
3.9 Análise cromatográfica dos EB e frações
A identificação dos componentes químicos das amostras foi realizada por separação e detecção em um sistema Acquity UPLC (Waters), acoplado a um espectrômetro de massas do tipo Eletrospray Quadrupolo / Tempo de Voo (XEVO QtoF, Waters) pertencente a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA. As corridas cromatográficas foram realizadas em uma coluna Waters Acquity UPLC BEH C18 (150 x 2,1 milímetros, partículas de 1,7 µm), acoplada a um sistema binário de bombas para eluição das amostras com um fluxo de 0,4 mL / min, tendo como fases móveis; solvente A (água: ácido fórmico, 99,9% : 0,1%, v / v) e solvente B (acetonitrila:ácido fórmico, 99,9%:0,1%, v/v), sob um gradiente
variando de 2% a 95% B (15 min). Um volume de 5 µL das amostras foi aplicado na coluna via sistema de autoinjeçao.
Figura 06: Sistema de separação por cromatografia líquida de ultraperformance, Acquity UPLC
(Waters) (Fonte: arquivo pessoal da autora)
3.10. Condições de aquisição do Espectrômetro de Massas de Alta resolução – ESI -XEVO-QToF
As amostras foram detectadas por espectrometria de massas utilizando ionização por eletrospray (ESI) com os parâmetros descritos a seguir. A aquisição dos espectros no modo ESI - foi na faixa de 110-1180 Da, temperatura da fonte fixa a 120◦C, temperatura de dessolvatação 350◦C, fluxo do gás dessolvatação de 500 L / h, cone de extração de 0,5 V, voltagem capilar de 2,6 kV. O modo ESI+ foi adquirido na faixa de 110-1180 Da, com temperatura da fonte fixa de 120 °C , temperatura de dessolvatação 350 °C, fluxo do gás dessolvatação de 500 L / h e voltagem do capilar de 3,2 kV. Leucina e encefalina foram utilizadas como lock mass. O modo de aquisição foi MSE. O instrumento foi controlado pelo software Masslynx 4.1 (Waters Corporation).
4 RESULTADOS
4.1 Atividade antibacteriana e associação do EB e frações de A. cearensis com antibióticos
O EB e frações de A. cearensis foram submetidos à avaliação da atividade antibacteriana para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) frente às linhagens padrões de E. coli e S. aureus, comparativamente os resultados apresentaram a mesma CIM ≥1024 µg / mL o que significa que não houve relevância clínica.
Para avaliação da associação do antibiótico com o EB e frações de A. cearensis em uma concentração CIM / 8 de 128 μg / mL frente às linhagens multirresistentes de E. coli e S. aureus os antibióticos de escolha foram um aminoglicosídeo (gentamicina), uma fluroquinolona de segunda geração (norfloxacina) e um beta-lactâmico (penicilina).
Foi observado sinergismo para o antibiótico gentamicina, tanto na E. coli como para S. aureus na presença do EB como mostra a figura 08. A F1 e F3 também apresentaram sinergismo quando testadas frente a S. aureus (figura 08).
M é d ia G e o m é t r ic a d a C I M ( µ g /m L ) Sta ph ylo co cc us au reu s Es ch eri ch ia c oli 0 1 0 2 0 3 0 4 0 g e n ta m ic in a g e n ta m ic in a + E B . A . c e a r e n s is g e n ta m ic in a + F 1 . A . c e a r e n s is g e n ta m ic in a + F 2 . A . c e a r e n s is g e n ta m ic in a + F 3 . A . c e a r e n s is **** * ns * ** ns ns ns
Figura 07: Concentração inibitória mínima (CIM) do aminoglicosídeo (gentamicina) na presença e ausência de
EB e frações de A. cearensis na concentração de CIM/8 (128µg / mL) contra S. aureus e E. coli. Ns - não significativo. **** p <0,0001.
Quando o antibiótico de escolha foi norfloxacina foi verificado sinergismo para E. coli tanto no EB como nas suas frações F1, F2 e F3 como apresentado na figura 09. Para a bactéria S. aureus o EB e a F1 apresentaram sinergismo (figura 09).
M é d ia G e o m é t r ic a d a C I M ( µ g /m L ) Sta ph ylo co cc us au reu s Es ch eri ch ia c oli 0 1 2 3 4 5 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 n o r flo x a c in a n o r flo x a c in a + E . B A . c e a r e n s is n o r flo x a c in a + F 1 A . c e a r e n s is n o r flo x a c in a + F 2 A . c e a r e n s is n o r flo x a c in a + F 3 A . c e a r e n s is **** **** ns **** **** **** **** ns
Figura 08: Concentração inibitória mínima (CIM) de uma fluroquinolona de segunda geração (norfloxacino) na
presença e ausência de EB e frações de A. cearensis na concentração de CIM/8 (128µg / mL) contra S. aureus e
E. coli. Ns - não significativo. **** p <0,0001.
A ação da penicilina frente S. aureus foi sinergicamente favorecida na presença do EB e das frações F1, F2 e F3 como mostra a figura 10. Quanto à bactéria E. coli o efeito sinérgico foi observado apenas na presença do EB (figura 10).
M é d ia G e o m é t r ic a d a C I M ( µ g /m L ) Sta ph ylo co cc us au reu s Es ch eri ch ia c oli 0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 p e n ic ilin a p e n ic ilin a + E B A . c e a r e n s is p e n ic ilin a + F 1 . A . c e a r e n s is p e n ic ilin a + F 2 . A . c e a r e n s is p e n ic ilin a + F 3 . A . c e a r e n s is **** **** **** **** ns ns ns ****
Figura 09: Concentração inibitória mínima (CIM) de um betalactâmico (penicilina) na presença e ausência de
EB e frações de A. cearensis na concentração de CIM/8 (128µg / mL) contra S. aureus e E. coli. Ns - não significativo. **** p <0,0001.
4.2 Atividade antifúngica do EB e frações de A. cearensis e sua associação com fluconazol
Nesse estudo, o EB e as frações também foram testados frente a Candida albicans padrão, demonstrando uma redução mais significativa do crescimento do microrganismo na F3 de A. cearensis seguido de F2, posteriormente F1 e EB como mostra a figura 11A. Os valores de IC50 para C. albicans são mostrados no quadro 02, onde a concentração inibitória
mínima do fluconazol variou de 2,4 a 7,68 µg / mL. Quanto à modulação da atividade foi verificado um efeito sinérgico quando a F2 foi combinada ao fluconazol. Nos ensaios também foi observada uma atividade antagonista ao fluconazol na F1, no EB e na F3 como mostra a figura 11B.
Quando avaliada a atividade do EB e frações em C. albicans isolado, verificado uma redução do crescimento do microrganismo maior na F3 de A. cearensis, seguida da F2, F1, e o menor efeito no EB como mostra a figura 12A. O quadro 02 apresenta os valores de IC50.
Quanto à atividade combinada, foi verificado sinergismo mais evidente na F2. Também foi verificado antagonismo na F3 como mostra a figura 12B e os valores de IC50 no quadro 02.
Combinação avaliada IC50 (ug/mL) para C. albicans (Padrão)
IC50 (ug/mL) para C. albicans
(Isolado clínico) FCZ 2,4 7,68 EB de A. cearensis ˃2048 ˃2048 F1 de A. cearensis 1968,6 1138,4 F2 de A. cearensis 1173,3 1273,3 F3 de A. cearensis 123,5 45,6 EB de A. cearensis + FCZ 9,54 3,14 F1 de A. cearensis + FCZ 3,51 2,41 F2 de A. cearensis + FCZ 2,1 1,81 F3 de A. cearensis + FCZ 11,9 18,8
Qadro 02: IC50 (μg / mL) Valores da IC50 do extrato bruto e das frações de Amburana cearensis isoladas ou em
A C o n c e n t r a ç ã o (g / m L ) % C r e s c im e n to 0 8 16 32 64 128 256 512 102 4 204 8 409 6 819 2 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 F lu c o n a z o l 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s i s ( F 1 ) - C A 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s i s ( F 2 ) - C A 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s i s ( F 3 ) - C A 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s i s ( E B ) - C A 4 0 0 0 6 B C o n c e n t r a ç ã o (g /m L ) % C r e s c im e n to 0 8 16 32 64 128 256 512 102 4 204 8 409 6 819 2 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 F lu c o n a z o l 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s is ( F 1 ) - C A 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s is ( F 2 ) - C A 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s is ( F 3 ) - C A 4 0 0 0 6 A . c e a r e n s is ( E B ) - C A 4 0 0 0 6
Figura 10: Efeito isolado do Extrato Bruto e das frações de A. cearensis e em associação com flucaonazol sobre
o crescimento de C. albicans (padrão). A: Efeito de concentrações crescentes (0 a 8192 ug/mL) do extrato e frações isoladamente; B: Efeito de concentrações crescentes (0 a 8192 ug/mL) do extrato e frações combinados a
A C o n c e n t r a ç ã o (g / m L ) % C r e s c im e n to 0 8 16 32 64 12 8 25 6 51 2 10 24 20 48 40 96 81 92 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 F lu c o n a z o l 4 1 2 7 A . c e a r e n s is ( F 1 ) - C A 4 1 2 7 A . c e a r e n s is ( F 2 ) - C A 4 1 2 7 A . c e a r e n s is ( E B ) - C A 4 1 2 7 A . c e a r e n s is ( F 3 ) - C A 4 1 2 7 B C o n c e n t r a ç ã o (g / m L ) % C re s c im e n to 0 8 16 32 64 12 8 25 6 51 2 10 24 20 48 40 96 81 92 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 F lu c o n a z o l 4 1 2 7 A . c e a r e n s i s ( F 1 ) - C A 4 1 2 7 A . c e a r e n s i s ( F 2 ) - C A 4 1 2 7 A . c e a r e n s i s ( E B ) - C A 4 1 2 7 A . c e a r e n s i s ( F 3 ) - C A 4 1 2 7
Figura 11: Efeito isolado do extrato bruto e das frações de A. cearensis e em associação com flucaonazol sobre
o crescimento de C. albicans (Isolado). A: Efeito de concentrações crescentes (0 a 8192 ug/mL) do extrato e frações isoladamente; B: Efeito de concentrações crescentes (0 a 8192 ug/mL) do extrato e frações combinados a
Fluconazol.
A concentração fungicida mínima (CFM) para todas as amostras testadas isoladamente foi ≥ 16.384 µg / mL tanto para C. albicans isolado como para padrão. Os resultados de CFM
