Nitratos e Nitritos em Alimentos

(1)

Área Científica – Água e Alimentos

Correlação dos teores em vegetais com os teores no solo e nas

águas de rega

Ângela Maria de Moura Barroso

(2)

apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade do

Porto.

Orientação:

(3)

Bromatologia da FFUP e o Departamento de Engenharia

Química do ISEP

(4)

I Resumo

A segurança dos alimentos constitui uma preocupação cada vez maior. Este facto deve-se, em parte, ao contributo da actividade humana para as alterações ambientais que, por sua vez, podem provocar variações na composição dos alimentos. O uso intensivo de fertilizantes azotados apresenta, de um modo geral, benefícios para a produção agrícola, mas pode igualmente implicar efeitos negativos para o ambiente e a saúde humana. O ião nitrato é aparentemente não tóxico em níveis inferiores ao limite máximo de resíduo (LMR). No entanto, a possibilidade de transformação a nitrito e a compostos do tipo N-nitroso, os últimos com grande poder cancerígeno, exigem o estabelecimento e a revisão contínua desses limites. Em contraponto à visão tradicional negativa sobre os nitratos, estudos recentes vêm sugerir possíveis acções benéficas dos nitratos ingeridos na dieta alimentar, devido à sua contribuição para a defesa contra as bactérias patogénicas.

A região de Vila do Conde está classificada como uma zona vulnerável, atendendo às elevadas concentrações de nitratos encontradas nas águas e no solo, devido à intensa actividade agrícola que aí se pratica. Por esta razão, parece de todo o interesse determinar os teores de nitratos e nitritos em produtos hortícolas desta região de forma a avaliar a segurança dos mesmos.

A parte experimental deste estudo consistiu na determinação dos teores de nitratos e nitritos em amostras de águas de rega, solos e vegetais (grelos, couve portuguesa, couve galega, alface, espinafres, salsa e nabos) colhidas em diferentes locais da Freguesia de Modivas, Concelho de Vila do Conde, em Fevereiro de 2007, usando metodologias analíticas baseadas em técnicas espectrofotométricas. Para além do teor em nitratos e nitritos, nas amostras de água determinou-se também o pH e o teor de fosfatos; nas amostras de solo, o valor de pH e o teor de humidade. Foram analisadas 34 amostras de vegetais, 10 amostras de águas e 11 amostras de solos. Foram utilizados métodos analíticos descritos na literatura, nomeadamente métodos de referência.

(5)

A validação dos resultados incluiu o esudo da linearidade, precisão, exactidão e limites de detecção associados a cada método. Para os vegetais, efectuou-se uma redução prévia do nitrato a nitrito, em coluna de cádmio. O limite de detecção foi de 0,931 µg NO2-. No

que se refere à exactidão do método, obteve-se para os nitritos um valor de recuperação de 84 %, enquanto para os nitratos a percentagem de recuperação foi de 69 %.

Nos vegetais, os teores de nitratos variaram entre 54,2 e 1447 mg NO3-/kg para as

amostras de grelos; entre 41,4 e 939 mg/kg para as amostras de couve portuguesa; entre 40,9 e 1319 mg/kg para as amostras de couve galega; entre 797 e 1427 mg/kg para as amostras de espinafres; entre 9,1 e 2441 mg/kg para as amostras de salsa; e entre 234 e 654 mg /kg para as amostras de nabo. A amostra de alface analisada apresentou um teor de 1156 mg/kg. Não foram ultrapassados os valores limite estabelecidos para espinafres e para alface.

No que se refere aos teores de nitritos, estes variaram entre 1,1 e 57 mg NO2-/kg para as

amostras de grelos; entre 0,9 e 30 mg/kg para as amostras de couve portuguesa; entre 1,2 e 4,4 mg/kg para as amostras de couve galega; entre 5,2 e 13,8 mg/kg para as amostras de espinafres; entre 1,3 e 13,4 mg/kg para as amostras de salsa; e entre 1,1 e 1,4 mg/kg para as amostras de nabo. A amostra de alface analisada apresentou um teor de 2,6 mg/kg.

De um modo geral, os teores encontrados nas águas e nos solos são inferiores aos observados nos vegetais. No caso das águas de rega, recolhidas em poços, os teores em nitratos variaram entre 9,8 e 342 mg/L (média 114 mg NO3-/L). Em seis das dez

amostras foi ultrapassado o valor paramétrico fixado para as águas em 50 mg NO3-/L.

Relativamente aos nitritos, os teores variaram entre 0,001 e 0,061 mg/L (média 0,014 mg NO2-/L).

Nos solos, os teores em nitratos variaram entre 38 e 113 mg/kg de solo seco (média 72 mg NO3-/kg de solo seco), enquanto para os nitritos, os teores variaram entre 0,45 e 1,16

(6)

II Abstract

Food safety is becoming a matter of great concern. Partially this happens because human activity contributes to environmental changes that, in turn, may affect food composition. The intensive use of fertilizers is a useful tool for agriculture but may involve negative effects to the environment and human health.

Nitrate ion is apparently non toxic below maximum residue levels (MRL), however the possibility to be transformed to nitrite and to N-nitroso compounds, the last potent carcinogens, determines the need to establishing and constantly revising these limits. By contrast to this traditional negative role associated to nitrate, recent studies suggest a possible beneficial role to dietary nitrate, due to its contribution in the defence against pathogenic bacteria.

Vila do Conde Region is classified as a vulnerable area due to the high nitrate concentrations that may be found in water and soil samples, due to the intensive agricultural activity that characterizes this region. For this reason it is important to evaluate nitrate and nitrite levels in horticultural products grown in this area in order to assess their safety.

The experimental part of this study consisted in the determination of nitrate and nitrite levels in samples of irrigation water, soil and vegetables (different varieties of cabbage, lettuce, spinaches, parsley and turnip), collected in different locations of Modivas, Vila do Conde, northern Portugal, in February 2007, using analytical methodologies based on spectrophotometric techniques. Besides nitrate and nitrite levels, pH and phosphate values were determined in the water samples, while pH and moisture was evaluated in the case of soil samples. A total number of 34 vegetable, 10 water and 11 soil samples were analysed. Reference methods, previously described in the literature were used. Method validation included the experimental determination of certain analytical parameters such as linearity, precision, accuracy and detection limits for each method used. For vegetable samples, nitrate was previously reduced to nitrite before quantification. A detection limit of 0,931 g NO2- was achieved. In what concerns to

(7)

accuracy, a recovery value of 84 % was obtained for nitrite and of 69 %, in the case of nitrate.

In the vegetable samples, nitrate levels ranged between 54,2 and 1447 mg NO3-/kg for

sprouts; between 41,4 and 939 mg/kg for portuguese cabbage; between 40,9 and 1319 mg/kg for kale; between 797 and 1427 mg/kg for spinach; between 9,1 and 2441 mg/kg for parsley; and between 234 and 654 mg/kg for turnip. In the lettuce sample a level of 1156 mg/kg was present. The maximum residue levels established for nitrate in spinach and lettuce samples were not surpassed.

Regarding to nitrite values, these ranged between 1,1 and 57 mg NO2-/kg for sprouts;

between 0,9 and 30 mg/kg (10 mg/kg on average) for portuguese cabbage; between 1,2 and 4,4 mg/kg for kale; between 5,2 and 13,8 mg/kg for spinach; between 1,3 and 13,4 mg/kg for parsley; and between 1,1 and 1,4 mg/kg for turnip. In the lettuce sample a level of 2,6 mg/kg was present.

Nitrate concentrations found in water and soil samples were generally bellow those found in the vegetable samples. For irrigation water samples, collected in wells, nitrate concentrations ranged between 9,8 and 342 mg/L (114 mg NO3-/L on average). In six of

the ten samples analysed, the parametric value of 50 mg NO3-/L was exceeded. In what

concerns to nitrite, concentrations ranged between 0,001 and 0,061 mg/L (0,014 mg NO2-/L on average).

In soil samples, nitrate levels ranged between 38 and 113 mg/kg dry weight (72 mg NO3-/kg), while for nitrite, the concentrations ranged between 0,45 and 1,16 mg/kg dry

(8)

III Agradecimentos

Na realização deste trabalho de investigação, tive o apoio de algumas pessoas a quem quero agradecer, pois sem elas teria sido impossível realizá-lo.

Agradeço:

- À Prof. Doutora Beatriz Oliveira e à Doutora Manuela Correia, por todo o apoio, dedicação e empenho que me prestaram em todos os momentos e por me terem ajudado a ultrapassar todos os problemas que surgiram no decorrer deste trabalho;

- À Prof. Doutora Cristina Matos, por estar sempre disponível para dar uma ajuda e opinião acerca da investigação e por disponibilizar materiais e equipamentos do Grupo de Reacção e Análise Química do ISEP;

- Ao Prof. Doutor Joaquim Góis da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, pela preciosa colaboração na realização da análise estatística;

- À Mestre Fátima Barroso, pela colaboração no fornecimento das amostras de estudo;

- Ao laboratório onde trabalho, em especial à Drª Joana Vicente, por me ter proporcionado a realização de uma parte da minha investigação e às minhas colegas de trabalho pela ajuda e compreensão que sempre tiveram;

E também não menos importante, tenho que agradecer aos meus pais, à minha irmã e ao meu namorado Pedro, por toda a ajuda, o apoio e o tempo disponível que me prestaram ao longo deste trabalho, para que nunca desistisse deste objectivo apesar de todas as contrariedades.

(9)

IV Índice

I Resumo...I II Abstract...III III Agradecimentos...V IV Índice...VI V Índice de Figuras...VIII VI Índice de Tabelas...XII VII Lista de abreviaturas...XV

1 Introdução...1

1.1 O ciclo do azoto...3

1.2 Nitratos e nitritos na agricultura...7

1.3 Efeitos prejudiciais na saúde humana associados a nitratos e nitritos...15

1.4 Vantagens da utilização dos nitratos e nitritos...22

1.5 Métodos analíticos para a determinação de nitratos e nitritos...24

1.6 Processos de amostragem e de conservação das amostras...28

1.7 Enquadramento legal...29

1.8 Redução da contaminação por nitratos: prevenção e tratamento...32

1.9 Objectivos do estudo...33

2 Materiais e métodos...36

2.1 Amostragem e conservação das amostras...36

2.2 Reagentes e soluções...38

2.3 Materiais e equipamentos...41

2.4 Procedimentos experimentais...41

2.4.1 Amostras de vegetais: determinação de nitratos e nitritos...41

2.4.1.1 Determinação de nitritos em amostras de vegetais...42

(10)

2.4.2.1 Determinação de nitratos...49

2.4.2.2 Determinação de nitritos...50

2.4.2.3 Determinação do pH...51

2.4.2.4 Determinação de fosfatos...51

2.4.3 Amostras de Solo: determinação de nitratos, nitritos, pH e humidade...52

2.4.3.1 Determinação de nitratos...52

2.4.3.2 Determinação de nitritos...53

2.4.3.3 Determinação do valor de pH...54

2.4.3.4 Determinação do teor de humidade...54

3 Resultados e Discussão...55

3.1 Validação dos métodos analíticos utilizados...55

3.1.1 Determinação de nitratos e nitritos em amostras de vegetais...55

3.1.2 Parâmetros analisados nas amostras de águas de rega...59

3.1.2.1 Nitratos...59

3.1.2.2 Nitritos...60

3.1.2.3 Fosfatos...61

3.1.3 Parâmetros analisados nas amostras de solo...62

3.1.3.1 Nitratos...62

3.1.3.2 Nitritos...64

3.2 Resultados obtidos para as amostras analisadas...64

3.2.1 Teores de nitratos e nitritos para cada tipo de vegetal analisado...69

3.2.2 Resultados de nitratos e nitritos em vegetais agrupados de acordo com a proveniência das amostras ……….79

3.2.3 Resultados obtidos para nitratos e nitritos nas amostras de águas de rega analisadas...87

3.2.4 Resultados obtidos para a concentração de nitratos e nitritos nas amostras de solo analisadas...89

4 Conclusão...110 VIII Bibliografia...XV

(11)

V Índice de Figuras

Figura 1 – Ciclo do azoto e transformações biológicas no solo

[http://www.naturlink.pt]...3

Figura 2 – Processo de complexação da hemoglobina pelo ião nitrito [Mendes e outros, 2004]...16

Figura 3 – Esquema da possivel ligação entre nitratos e cancro gástrico [Miranda, 1993]...21

Figura 4 – Terreno agrícola em Modivas...35

Figura 5 – Cultivo de grelos em Modivas...35

Figura 6 – Cultivo de alfaces em Modivas...35

Figura 7 – Mapa da Região de Vila do Conde, com a localização das zonas de recolha das amostras em Modivas...38

Figura 8 – Balões com os padrões de diferentes concentrações...42

Figura 9 – a) Balões com as amostras e reagentes, prontos para a filtração; b) Processo de filtração das amostras; c) Aspecto após a filtração e d) Balões de 50 mL com a porção de filtrado antes da adição dos reagentes de desenvolvimento de cor...43

Figura 10 – Amostras após a reacção de desenvolvimento de cor, prontas para a leitura de absorvância para determinação de nitritos...44

Figura 11 – a) Coluna de cádmio; b) alimentação do filtrado à coluna; c) passagem do filtrado através da coluna e d) recolha em balão volumétrico de 50 mL...46

Figura 12 – Amostras prontas para a leitura de absorvância para a determinação de nitratos, após prévia conversão a nitritos...47

Figura 13 – Curvas de calibração obtidas com soluções padrão preparadas em dias diferentes usadas na quantificação de nitritos e nitratos nas amostras de vegetais....56

Figura 14 – Curva de calibração para nitratos em água...59

Figura 15 – Curva de calibração para os nitritos na água e no solo...60

Figura 16 – Curva de calibração para os fosfatos na água...61

Figura 17 – Curva de calibração usada para o doseamento de nitratos em amostras de solo...63

Figura 18 – Teores de nitrato nas diversas amostras de vegetais (mg NO3-/kg de matéria fresca)...67

(12)

Figura 19 – Teores de nitrito nas diversas amostras de vegetais (mg NO2-/kg de

matéria fresca)...68 Figura 20 – a) Teores de nitrato nas amostras de espinafres (mg NO3-/kg de matéria

fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de espinafres (mg NO2-/kg de matéria

fresca)...69 Figura 21 – Proveniência geográfica das amostras de espinafres analisadas com representação dos teores de nitratos e nitritos (mg/kg)...70 Figura 22 – a) Teores de nitrato nas amostras de salsa (mg NO3-/kg de matéria

fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de salsa (mg NO2-/kg de matéria fresca).. .72

Figura 23 – Proveniência geográfica das amostras de salsa analisadas com

representação dos teores de nitratos e nitritos (mg/kg)...73 Figura 24 – a) Teores de nitratos nas amostras de nabo (mg NO3-/kg de matéria

fresca); b) Teores de nitritos nas amostras de nabo (mg NO2-/kg de matéria fresca)..74

Figura 25 – Proveniência geográfica das amostras de nabo analisadas com

representação dos teores de nitratos e nitritos (mg/kg)...75 Figura 26 – a) Teores de nitrato nas amostras de grelo (mg NO3-/kg de matéria

fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de grelo (mg NO2-/kg de matéria fresca).. .76

Figura 27 – Proveniência geográfica das amostras de grelo analisadas com

representação dos teores de nitratos e nitritos (mg/kg)...76 Figura 28 – a) Teores de nitrato nas amostras de Couve Portuguesa (mg NO3-/kg de

matéria fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de Couve Portuguesa (mg NO2-/kg

de matéria fresca)...77 Figura 29 – Proveniência geográfica das amostras de couve portuguesa analisadas com representação dos teores de nitratos e nitritos (mg/kg)...78 Figura 30 – a)Teores de nitrato nas amostras de couve galega e nabiça (mg NO3-/kg

de matéria fresca); b)Teores de nitrito nas amostras de couve galega e nabiça

(mg NO2-/kg de matéria fresca)...79

Figura 31 – Proveniência geográfica das amostras de couve galega analisadas com representação dos teores de nitratos e nitritos (mg/kg)...79 Figura 32 – a) Teores de nitrato nas amostras de vegetais colhidas na zona 58

(mg NO3-/kg de matéria fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de vegetais colhidas

(13)

Figura 33 – a) Teores de nitrato nas amostras de vegetais colhidas na zona 31

na zona 31 (mg NO2-/kg de matéria fresca)...80

Figura 38 – a) Teores de nitrato nas amostras de vegetais colhidas na zona HA (mg NO3-/kg de matéria fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de vegetais colhidas

na zona HA (mg NO2-/kg de matéria fresca)...84

Figura 39 – a) Teores de nitrato nas amostras de vegetais colhidas na zona FB (mg NO3-/kg de matéria fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de vegetais colhidas na

zona FB (mg NO2-/kg de matéria fresca)...85

Figura 40 – a) Teores de nitrato nas amostras de vegetais colhidas na zona AF (mg NO3-/kg de matéria fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de vegetais colhidas

na zona AF (mg NO2-/kg de matéria fresca)...85

Figura 42 – a) Teores de nitrato nas amostras de vegetais colhidas na zona LU (mg NO3-/kg de matéria fresca); b) Teores de nitrito nas amostras de vegetais colhidas

na zona LU (mg NO2-/kg de matéria fresca)...87

Figura 43 – a)Teores de nitrato nas amostras de água de rega (mg NO3-/L); b) Teores

(14)

Figura 44 – a) Teores de nitrato nas amostras de solo analisadas (mg NO3-/kg

matéria seca); b) Teores de nitrito nas amostras de solo analisadas (mg NO2-/kg de

matéria seca)...89 Figura 45 – Teores de nitrato em cada zona para as diferentes matrizes...90 Figura 46 – Teores de nitrito em cada zona para as diferentes matrizes...90 Figura 47 – Projecção bidimensional das amostras em dois componentes principais.

...105

Figura 48 – Projecção bidimensional de parte dos resultados, nos dois primeiros componentes principais, que representam 68,4 % da variância total do sistema...107 Figura 49 – Projecção bidimensional de parte dos resultados, nos eixos 1 e 3, que representam 57,2 % da variância total do sistema...108

Figura 50 – Projecção bidimensional de parte dos resultados, nos eixos 1 e 4, que representam 53,2 % da variância total do sistema...109

(15)

VI Índice de Tabelas

Tabela 1 – Principais compostos de azoto e respectivo estado de oxidação

[Mendes e outros, 2004]...4 Tabela 2 – Teores de nitratos e nitritos descritos em frutos e vegetais...9 Tabela 3 – Quantidade máxima de azoto a aplicar às culturas [Diário da República – I Série – B Nº 159 – 12 de Julho de 2003 (3999-4000)]...10 Tabela 4 – Valores médios de nitratos nos vegetais em alguns países (mg/kg NO3-) [Tamme e outros, 2006; Thomson e outros, 2007]...11 Tabela 5 – Classificação dos vegetais de acordo com o seu teor em nitrato (mg/kg material fresca) [Santamaria, 2006]...12 Tabela 6 – Limites máximos de nitrato (mg/kg de material fresca) para o comércio de vegetais em alguns países europeus [Santamaria, 2006]...13 Tabela 7 – Nitrosaminas carcinogénicas e principais órgãos afectados em roedores [Miranda; 1993]...18 Tabela 8 – Técnicas analíticas empregues na determinação de nitratos e nitritos...26 Tabela 9 – Comparação de valores entre o Decreto-Lei actual e o precedente [Mendes e outros, 2004]...30 Tabela 10 – Teores máximos de certos contaminantes presentes nos géneros

alimentícios [Regulamento (CE) Nº 1881/2006 da Comissão]...31 Tabela 11 – Amostragem (34 vegetais, 10 águas e 11 solos)...37 Tabela 12 – Absorvância do padrão 2 em seis ensaios diferentes...57 Tabela 13 – Resultados do ensaio de recuperação após adição de 0,5 mg NO2- /kg a uma amostra de grelos...58 Tabela 14 – Resultados do ensaio de recuperação após adição de 110 mg NO3- /kg a uma amostra de couve-nabiça...58 Tabela 15 – Resultados do ensaio de recuperação após adição de 110 mg NO3- /kg a uma amostra de solo...64 Tabela 16 – Valores da média, desvio padrão e limites dos teores de nitratos e nitritos nas diferentes amostras de vegetais...91 Tabela 17 – Dados originais relativos aos teores de nitratos e nitritos nas amostras estudadas...93 Tabela 18 – Caracterização estatística básica considerando a totalidade dos valores.94

(16)

Tabela 19 - Caracterização estatística básica dos resultados obtidos para o teor de nitratos em cada uma das zonas estudadas...96 Tabela 20 - Caracterização estatística básica dos resultados obtidos para o teor de nitritos em cada uma das zonas estudadas...97 Tabela 21 – Caracterização estatística básica dos resultados obtidos agrupados de acordo com a matriz...98 Tabela 22 – Codificação das amostras atendendo ao local e à natureza da matriz...99 Tabela 23 – Análise de Variância (ANOVA) para determinar a influência dos locais de amostragem sobre os teores de nitratos das amostras de água, solo, couve

portuguesa e grelo...100 Tabela 24 – Análise de Variância (ANOVA) para determinar a influência dos locais de amostragem sobre os teores de nitritos das amostras de água, solo, couve

portuguesa e grelo...101 Tabela 25 – Análise de Variância (ANOVA) para determinar a influência do tipo de amostra sobre os teores de nitratos observados nos diferentes locais de amostragem.

...102

Tabela 26 – Análise de Variância (ANOVA) para determinar a influência do tipo de amostra sobre os teores de nitritos observados nos diferentes locais de amostragem.

...102

Tabela 27 – Codificação das variáveis utilizadas na análise multivariável dos dados analíticos...104 Tabela A.1 – Teores de nitratos e nitritos em vegetais da região de Vila do Conde (Modivas)...XXVII Tabela A.2 – Massa de amostra analisada e correspondentes valores de absorvância obtidos no doseamento de nitritos e nitratos nas amostras de vegetais da zona de Modivas...XXVIII Tabela A.3 – Valores de absorvância e respectivos valores médios, desvio padrão e coeficiente de variação obtidos na determinação de nitratos em vegetais...XXIX Tabela A.4 – Concentrações de nitratos, nitritos, fosfatos e pH em águas obtidas na região de Vila do Conde (Modivas)...XXX Tabela A.5 – Valores de Absorvância (220 nm) e (275 nm) das amostras de água da zona de Modivas para a análise de Nitratos...XXX

(17)

Tabela A.6 – Valores de Absorvância (540 nm) das amostras de água da zona de Modivas para a análise de Nitritos...XXX Tabela A.7 – Valores de Absorvância (470 nm) das amostras de água da zona de Modivas para a análise de fosfatos...XXXI Tabela A.8 – Concentração de nitratos e nitritos em solos obtidas na região de Vila do Conde (Modivas)...XXXI Tabela A.9 – Valores de Absorvância (420 nm) das amostras de solo da zona de Modivas para a análise de Nitratos...XXXII Tabela A.10 – Valores de Absorvância (540 nm) das amostras de solo da zona de Modivas para a análise de Nitritos...XXXII Tabela A.11 – Valores de Humidade (%) e de pH das amostras de solo da zona de Modivas...XXXIII Tabela A.12 – Dados sujeitos à análise em componentes principais e respectiva codificação...XXXIV Tabela A.13 – Representação das variáveis e das amostras no novo sistema de eixos por aplicação da análise em componentes principais...XXXV Tabela A. 14 – Subconjunto de dados sujeitos à análise em componentes principais.

...XXXVI Tabela A.15 – Representação das variáveis e dos indivíduos correspondentes à tabela A.14 no novo sistema de eixos por aplicação da análise em componentes principais. ...XXXVI

(18)

VII Lista de abreviaturas

Abs – Absorvância

AOAC – “Association of Official Analytical Chemists” CE – Comissão Europeia

CEE – Comunidade Económica Europeia cm – Centímetro

CV – Coeficiente de variação expresso em percentagem DL – Decreto-Lei

ADN – Ácido desoxirribonucleico DP – Desvio padrão

EPA – Agência de Protecção Ambiental

FAO – Organização para a Alimentação e a Agricultura das Nações Unidas (Food and Agriculture Organization of the United Nation)

Fev – Fevereiro

FIA – Análise por injecção em fluxo g – Grama

HbFeIINO – Ferro-nitrosil-hemoglobina

HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência ISO – “International Standard Organization” kg – Kilograma

L – Litro

Ld ou LOD – Limite de detecção LMR – Limite máximo de resíduo Lq ou LOQ – Limite de quantificação Mar – Março

mg – Miligrama mL – Mililitro

NED – dihidrocloreto de N-(1-naftil)etilenodiamina NO – Óxido nítrico

nm – Nanómetro O2 – Oxigénio

(19)

p.a. – “Pro analysis”

R2_{– Coeficiente de correlação quadrático}

ARN – Ácido ribonucleico rpm – Rotação por minuto ua – Unidades de absorvância UV – Ultravioleta

µg – Micrograma

VMA – Valor máximo admissível VMR – Valor máximo recomendável WHO – “World Health Organization”

(20)

1 Introdução

Há, actualmente, uma preocupação crescente com o tipo e a segurança dos alimentos da dieta. Para além do conhecimento de problemas de origem natural, como sejam, a contaminação microbiológica ou por micotoxinas, a actividade humana tem contribuído para a alteração da composição dos vários compartimentos ambientais implicando, dessa forma, a alteração da constituição normal dos alimentos. Se por um lado estes são benéficos e indispensáveis para a saúde humana, por outro podem funcionar como veículos de contaminação, se não forem produzidos com os níveis de qualidade e segurança adequados.

Entende-se por fertilizante qualquer substância que contenha um ou mais compostos azotados, utilizada no solo para favorecer o crescimento da vegetação. Pode incluir compostos sintetizados para esse fim, assim como resíduos de origem animal ou industrial. O uso intensivo de fertilizantes inorgânicos é uma das práticas agrícolas que maior impacto pode ter para o meio ambiente, nomeadamente através da sua influência no ciclo global dos nutrientes. A contaminação por nitratos e nitritos pode afectar apenas as águas superficiais ou atingir também as subterrâneas. Isto é, toda a água que se situa abaixo da superfície do solo, na zona de saturação e em contacto directo com o solo, ou o subsolo e os produtos hortícolas. Este tipo de contaminação deve-se normalmente às actividades agrícolas e à presença de esgotos domésticos. As águas mais contaminadas estão geralmente associadas a zonas com uma actividade hortícola intensa, devido à grande quantidade de fertilizantes utilizada [Gulis e outros, 2002; Mendes e outros, 2004].

Apesar do investimento na formação e esclarecimento dos agricultores acerca das boas práticas agrícolas, continua a observar-se a aplicação excessiva de fertilizantes azotados. Trata-se de uma prática muito enraizada nos pequenos agricultores do Norte de Portugal e, em especial, na região de Vila do Conde, onde os adubos estão facilmente acessíveis e, em quase todos os quintais, é usual lançar adubo para garantir o sucesso da plantação. Esta região constitui uma área importante de produção agrícola, caracterizada por parcelas de pequenas dimensões orientadas para o cultivo de hortícolas ao ar livre e em estufa.

(21)

A região de Vila do Conde, onde se localiza parte das bacias dos Rios Ave e Cávado, está classificada como uma zona vulnerável, devido às elevadas concentrações de nitratos nas águas e no solo dessa região, em consequência da intensa actividade agrícola. As principais culturas são hortícolas (batata, cenoura, couve, cebola, alface e tomate). Grande parte desta produção tem como destino o consumo próprio e a venda em mercados regionais. De notar que este tipo de produtos são de grande consumo diário, pois fazem parte da dieta tradicional Portuguesa, sendo habitualmente ingeridos na forma de sopa ou como acompanhamento do prato principal. Na zona rural de Vila do Conde muitas pessoas utilizam a água dos seus poços para regar e para cozinhar, pois não existe um sistema de abastecimento público de água. A informação de que esta água é imprópria para consumo não impede que a mesma seja utilizada, pois consideram que qualquer risco existente será eliminado pela fervura da água. No entanto, este facto não é verdadeiro quando se trata de nitratos e nitritos.

Apesar do ião nitrato, por si só, ser aparentemente não tóxico em níveis inferiores ao limite máximo de resíduo (LMR), a sua toxicidade, isto é a capacidade de produzir um efeito nocivo quando interage com um organismo vivo, parece ser agravada quando sofre redução a nitrito pelas bactérias do aparelho digestivo [Pinho e outros, 1998; Thomson e outros, 2007]. Por sua vez, os nitritos podem originar compostos do tipo N-nitroso que fazem parte das substâncias com maior poder cancerígeno conhecido, funcionando como indutores da doença num grande número de órgãos [Gulis e outros, 2002; Xia e outros, 2003; Mendes e outros, 2004; Thomson e outros, 2007].

Por outro lado, recentemente, tem sido sugerido, por alguns autores, uma acção benéfica para os nitratos. Este possível benefício deve-se à metabolização dos nitratos a óxido nítrico (NO), no estômago, contribuindo para a defesa contra as bactérias patogénicas [Gladwin, 2004]. É muito importante diminuir a exposição a compostos azotados, devido à sua acção prejudicial sobre a saúde humana, mas, ao mesmo tempo, é necessário assegurar uma ingestão suficiente destes compostos, com vista a usufruir da sua acção benéfica.

(22)

Considerando o que foi dito, pode-se então dizer que é de todo o interesse fazer a determinação dos teores de nitratos e nitritos em águas, solos e produtos hortícolas da referida região de Vila do Conde de forma a avaliar a segurança dos mesmos.

1.1 O ciclo do azoto

Para melhor se compreender o aparecimento e a transformação dos compostos azotados no meio ambiente é necessário conhecer o ciclo biogeoquímico do azoto. O azoto é um elemento fundamental no desenvolvimento das plantas e dos animais, devido à sua presença na constituição de muitas moléculas. Este elemento não metálico está presente na natureza sob a forma gasosa, encontrando-se as suas diferentes formas inter-relacionadas no ciclo do azoto [Mendes e outros, 2004] (Figura 1).

Figura 1 – Ciclo do azoto e transformações biológicas no solo [http://www.naturlink.pt]. Neste ciclo estão presentes muitos compostos indispensáveis à vida, assim como outras substâncias que podem ser consideradas poluentes. Os compostos presentes no ciclo do azoto estão descritos na tabela 1.

(23)

Tabela 1 – Principais compostos de azoto e respectivo estado de oxidação [Mendes e outros, 2004].

Compostos de azoto

Estado de oxidação

do N

Nome comum

N2O5 (gás) HNO3 (gás ou solução aquosa) Ca(NO3)2 (sólido) + 5 Anidrido nítrico Ácido nítrico Nitrato de cálcio NO2 (gás) N2O4 (gás) +4 Dióxido de azoto Peróxido de azoto HNO2 (gás ou solução

aquosa) +3 Ácido nitroso

NO (gás) +2 Óxido nítrico N2O (gás) +1 Óxido nitroso N2 (gás) 0 Azoto NH3 (gás) NH4+ (solução aquosa) -3 Amoníaco Ião amónio

No ciclo do azoto estão envolvidas algumas reacções biológicas, sendo as mais importantes as seguintes [Mendes e outros, 2004]:

1) Fixação do azoto atmosférico – redução do azoto molecular gasoso a amoníaco, ou ião amónio, em solução aquosa, por intermédio de enzimas;

N2 (ou N2O) NH3/NH4+

2) Assimilação do azoto amoniacal – o NH3 ou o NH4+ são assimilados pelos

organismos e transformados em produtos orgânicos azotados diversos; NH3/NH4+ N-orgânico

3) Nitrificação – oxidação de NH3 ou de NH4+ a nitritos (nitritação) ou oxidação

destes a nitratos (nitratação);

(24)

-4) Redução assimilativa dos nitratos – redução dos nitratos, assimilação destes pelo organismo e acumulação na biomassa (na forma de N-orgânico);

NO2-/NO3- N-orgânico

5) Amonificação – hidrólise dos compostos orgânicos azotados originando espécies mais reduzidas (NH3 ou NH4+);

N-orgânico NH3/NH4+

6) Desnitrificação – redução em condições anaeróbias dos nitratos, ocorrendo libertação de espécies azotadas gasosas como o azoto molecular ou óxidos de azoto;

NO2-/NO3- N2 (ou N2O)

7) Oxidação de azoto molecular a nitratos pelas descargas eléctricas atmosféricas. N2 (ou N2O) NO2-/NO3

-O maior reservatório de azoto está na forma de N2, que constitui 78% da atmosfera. A

tripla ligação entre os átomos de azoto faz com que seja uma molécula muito estável, tornando este gás praticamente inerte.

A fixação do azoto, ou seja, a redução de N2 a amónia é promovida por um pequeno

grupo de microrganismos. Neste grupo estão incluídas as bactérias de vida livre ou simbiontes, aeróbias ou anaeróbias, destacando-se as pertencentes aos géneros

Rhizobium e Bradyrhizobium, associados às raízes de leguminosas. Estas bactérias

possuem um sistema enzimático denominado nitrogenase que catalisa a redução do N2

[Barbosa e outros, 1999].

A amónia resultante da fixação microbiana do azoto é apenas uma pequena parte da existente na natureza, provindo a maior parte da decomposição microbiana de compostos orgânicos azotados. A redução de nitratos e nitritos, por plantas superiores e microrganismos, também constitui uma fonte de amónia [Barbosa e outros, 1999].

(25)

A escassez de azoto é um factor limitante na reprodução de muitos organismos no solo e em ambientes aquáticos. Esta limitação atinge também a cultura de vegetais e, portanto, restringe a produção total de alimentos mais do que qualquer outro elemento químico. No entanto, a correcção dos níveis de azoto no solo deve ter em consideração o aumento excessivo da sua concentração nos rios, lagos e outros ambientes aquáticos, sendo responsável por fenómenos de poluição, isto é de descarga no meio aquático, directa ou indirecta, de compostos azotados de origem agrícola, com resultados susceptíveis de pôr em perigo a saúde humana, afectar os recursos vivos e os ecossistemas aquáticos, danificar áreas aprazíveis ou interferir noutras utilizações legítimas da água [Barbosa e outros, 1999; Stryer, 1995].

Nos organismos, a amónia é incorporada nos aminoácidos que fazem parte de proteínas e originam outros compostos azotados. Pode ainda, através de bactérias quimiolitotróficas (bactérias que utilizam como fonte de energia compostos inorgânicos e como fonte de carbono o dióxido de carbono) sofrer oxidação a nitrato, num processo designado por nitrificação, e que é realizado exclusivamente por microrganismos [Barbosa e outros, 1999].

Os iões nitrito e nitrato resultam do processo de nitrificação, que se inicia com a formação de amónia e termina com a formação de nitrato que poderá ser absorvido pelas plantas. O nitrato resultante pode ser utilizado por plantas e microrganismos como fonte de azoto, mas uma parte dele é usada como aceitador final da cadeia de transporte de electrões, originando produtos gasosos (N2, N2O ou NO) que regressam à atmosfera.

Este processo é denominado por desnitrificação e resulta na perda do azoto combinado, que é a forma preferencialmente assimilável pelos organismos [Barbosa e outros, 1999]. Os nitratos e os nitritos são ambos muito solúveis em água, o que quer dizer que passam facilmente do solo para a água, e podem fixar-se nas plantas e legumes que foram previamente regados com águas contaminadas. Os nitratos mantêm-se durante muito tempo após a contaminação, não se verificando o mesmo com os nitritos que passam a nitratos com o decorrer do tempo. Portanto, a presença de nitritos indica uma contaminação recente e, pelo contrário, quando existem nitratos sem nitritos, isso indica

(26)

que a contaminação já aconteceu há algum tempo. O nitrato não apresenta reactividade, no entanto o nitrito é bastante reactivo [World Health Organization, 1998; Sousa e outros, 2005].

1.2 Nitratos e nitritos na agricultura

Como foi dito, os nitratos e nitritos ocorrem naturalmente em alimentos, tais como vegetais, frutas, cereais, peixe e leite como consequência do ciclo do azoto. A presença de nitrato nos alimentos resulta essencialmente do facto das plantas retirarem o azoto do solo na forma iónica. O uso de fertilizantes com azoto aumenta a concentração de nitratos no solo e, por isso, o teor de nitratos nas plantas tratadas com fertilizantes azotados é superior ao normal [Yordanov e outros, 2001; Thomson e outros, 2007].

Apesar dos nitratos serem constituintes azotados essenciais à formação da biomassa das plantas e animais, é importante referir que estes também constituem um poluente de grande importância, quer nas águas superficiais quer nas subterrâneas, usadas no fornecimento de água para consumo humano [Mendes e outros, 2004].

Os teores de nitrato na água potável variaram de acordo com vários factores, a origem, a estação do ano, a proximidade a terrenos aráveis e a utilização de fertilizantes nitrogenados. Na água de consumo, os teores de nitrato são usualmente abaixo dos 10 mg/L, na maioria dos países. Nas áreas agrícolas, esse valor excede muitas vezes os 50 mg/L [Dennis e Wilson, 2003].

A contaminação da água subterrânea por nitratos é um problema global e está quase sempre associada à agricultura intensiva. Este facto deve-se ao uso excessivo de fertilizantes com azoto na produção de vegetais [McLay e outros, 2001]. Esta contaminação afecta a saúde pública em muitas regiões agrícolas do mundo [Gulis e outros, 2002].

No que diz respeito à dieta humana, a principal fonte de nitrato e nitrito são os vegetais. No entanto a água de consumo também é uma fonte a considerar [Kelley e outros, 2003]. A quantidade de nitratos nos vegetais depende da taxa e tempo de aplicação do fertilizante, intensidade de luz, temperatura e características do solo [Thomson e outros, 2007]. Os

(27)

vegetais que crescem em locais aquecidos (estufas) têm teores elevados de nitratos em relação aos que crescem no exterior, por causa da baixa intensidade de luz e alta mineralização do azoto [Yordanov e outros, 2001; Thomson e outros, 2007]. Usualmente o teor de nitrito é muito mais baixo que o de nitrato. A acumulação de nitratos nas plantas varia também de acordo com a espécie e o genótipo da planta, factores de crescimento e fertilização química do solo [Duodu e outros, 1999; Ysart e outros, 1999]. Os teores de nitrato e nitrito variam em diferentes vegetais e frutas, de acordo com as espécies vegetais. O espinafre, brócolos, couve, aipo, alface e beterraba são produtos associados a teores elevados de nitrato (1000 – 2500 mg/kg) [Yordanov e outros, 2001]. Pelo contrário, a concentração de nitrito em vegetais frescos é geralmente baixa (entre 1 e 20 mg/kg, raramente excedendo os 100 mg/kg) [Thomson e outros, 2007].

A tabela 2 mostra alguns exemplos de teores de nitratos e nitritos em frutos e vegetais apresentados na bibliografia. A tabela 3 apresenta a quantidade máxima de azoto a aplicar às culturas, de acordo com a legislação portuguesa. Na tabela 4 podemos encontrar valores médios de nitratos determinados em alimentos de diferentes países. De um modo geral, os valores desta tabela são retirados de estudos em que se procedeu à análise de um elevado número de amostras de cada tipo de vegetal, por vezes, em número superior a mil amostras. Muitos destes estudos tiveram como objectivo estimar a ingestão de nitratos associada ao consumo de vegetais pela população dos diversos países.

Tabela 2 – Teores de nitratos e nitritos descritos em frutos e vegetais.

Vegetais/Frutos Concentração_{(mg NO} 3-/kg) Concentração (mg NO2-/kg) Referência Agrião 1197 1364 1366 - Thomson e outros, 2007 Ximenes e outros, 2000

(28)

Alface 1161 570 1100 1420 1776 3,04 0,4 Thomson e outros, 2007 Yordanov e outros, 2001 BSBCTA, 1990 Ximenes e outros, 2000 Castanheira e outros, 2004

Batata 40 0,66 Yordanov e outros, 2001

Berinjela 302 0,5 BSBCTA, 1990 Beterraba 557 1000 452 7469 1,54 Thomson e outros, 2007 Yordanov e outros, 2001 Ximenes e outros, 2000

Brócolo 464₅₆₆ 1,0 _{Ximenes e outros, 2000}BSBCTA, 1990;

Cebola verde 30 0,3 Yordanov e outros, 2001

Cenoura 123 72 27 0,82 0,6 Yordanov e outros, 2001 BSBCTA, 1990 Castanheira e outros, 2004 Couve 242 197 1,02 Thomson e outros, 2007 Yordanov e outros, 2001 Couve-Flor 254 1,1 BSBCTA, 1990 Espinafre 723 860 2000 2200 528 301 7,44 0,7 Thomson e outros, 2007 Yordanov e outros, 2001 Chung e outros, 2003 BSBCTA, 1990 Ximenes e outros, 2000 Castanheira e outros, 2004

Funcho 2,6 - Yordanov e outros, 2001

Morango 17,5 0,23 Yordanov e outros, 2001

Nabo 2098 Ximenes e outros, 2000

Pepino 59₂₄ 0,14_0,5 Yordanov e outros, 2001_{BSBCTA, 1990}

Rabanete ₁₄₆₂737 5,93 Yordanov e outros, 2001_{Ximenes e outros, 2000}

Repolho 784 0,5 BSBCTA, 1990

Salsa 3 - Yordanov e outros, 2001

Tomate ₁₅5 - _{Castanheira e outros, 2004}Yordanov e outros, 2001

(29)

Tabela 3 – Quantidade máxima de azoto a aplicar às culturas [Diário da República – I Série – B Nº 159 – 12 de Julho de 2003 (3999-4000)].

Vegetais kg (azoto por hectare) Hortícolas (ao ar livre) Alface 100

Alho comum 100 Batata 160 Cebola 120 Cenoura 150 Couve-brócolo 180 Couve-flor 180 Repolho 180 Feijão-verde 100 Hortícolas (forçadas) (Estufa) Alface 75 Feijão-verde 150 Melão 200 Pepino 180 Pimento 180 Tomate 220

(30)

Tabela 4 – Valores médios de nitratos nos vegetais em alguns países (mg/kg NO3-) [Tamme e outros, 2006; Thomson e outros, 2007] Nova Zelândia (1980) Nova Zelândia (2004) Review (Walker 1990) UK (1999) Dinamarca (1999) China (2002) Itália (2003) Coreia (2003) Estónia (2003-2004) Bélgica (1992-1993)

EUA Japão Eslovénia

Abóbora 3 55 639 174 Agrião 1364 Alface 450 1323 2330 1051 2440 1473 2430 2167 2782 1489 Alho francês 284 56 841 Batata 107 102 150 155 182 164 452 94 154 713 158 Cebola 235 48 23 55 59 Cenoura 48 274 97 316 148 278 193 264 Couve 542 275 712 338 333 1530 725 437 451 881 Couve-flor 287 Curgete 421 Espinafres 824 2470 1631 1783 1757 4259 2508 2297 965 3560 Nabo 307 Pepino 25 151 170 212 160 344 384 93 Rabanete 2600 1878 2136 1060 Salsa 966 Tomate 19 80 17 78 41 36 41

(31)

Segundo a pesquisa efectuada e como se pode ver pelas tabelas anteriores, as concentrações de nitratos variam de país para país e de vegetal para vegetal. Apesar da variação dos teores de nitratos para o mesmo tipo de vegetal nos diversos países, verifica-se que nos espinafres e nas alfaces estes valores são quase sempre elevados (acima de 1000 mg/kg), e no caso do tomate e da cebola são sempre inferiores a 100 mg/kg. Existem, portanto, certas espécies vegetais com mais tendência para apresentar elevados teores de nitratos do que outras, tal como é possível verificar na tabela 5.

Tabela 5 – Classificação dos vegetais de acordo com o seu teor em nitrato (mg/kg material fresca) [Santamaria, 2006].

Muito baixo (< 200) Baixo (200 – 500) Médio (500 – 1000) Elevado (1000 – 2500) Muito elevado (> 2500) Abóbora Alcachofra Alho Batata Batata doce Beringela Cebola Cogumelos Couves de Bruxelas Ervilhas Espargos Fava Feijão verde Melancia Melão Pimento Tomate Abóbora-menina Bróculos Cenoura Couve flor Pepino Couve Couve Sabóia Endro Nabo Aipo vermelho Alho Francês Couve chinesa Couve rábano Endívias Funcho Salsa Agrião Aipo Alface Alface-de-cordeiro Beterraba Cerefólio Espinafre Rabanete

São vários os factores que afectam a absorção e acumulação de nitratos nos tecidos vegetais, por exemplo, factores genéticos, factores ambientais (humidade atmosférica, humidade do solo, temperatura, irradiação, fotoperíodo) e factores agrícolas (quantidade e forma química dos fertilizantes, disponibilidade de outros nutrientes, utilização de herbicidas, etc.). No entanto, os factores que mais influenciam os teores em nitratos dos vegetais são a fertilização azotada e a intensidade luminosa [Santamaria, 2006].

(32)

De um modo geral, os vegetais que acumulam nitratos em maior quantidade pertencem às famílias das Brassicáceas ou Crucíferas que incluem, por exemplo, as couves, às Quenopodiáceas (beterraba, espinafre) e às Amarantáceas. Contudo, também as Asteráceas (alface) e as Apiáceas (aipo, salsa) incluem espécies com elevados teores em nitratos [Santamaria, 2006].

Dentro de uma mesma espécie, o teor em nitratos pode ser influenciado pelas características genéticas apresentadas por uma dada população (cultivar). Por outro lado, o teor em nitratos é diferente nas várias partes da planta e, de um modo geral, decresce na ordem seguinte: pecíolo > folha > caule > raiz > inflorescência > tubérculo > bolbo > fruto > semente [Santamaria, 2006].

Considerando que certas espécies vegetais podem apresentar teores em nitratos muito elevados, alguns países europeus definem teores máximos admissíveis a ser aplicados aos vegetais importados (tabela 6).

Tabela 6 – Limites máximos de nitrato (mg/kg de material fresca) para o comércio de vegetais em alguns países europeus [Santamaria, 2006].

Vegetal Áustria Bélgica Alemanha Holanda Suíça

Cenoura Beterraba Endívia (Verão) Endívia (Inverno) Couve Rabanete Aipo verde Aipo branco Alface-de-cordeiro 1500 4500 2500 3500 1500 2000 2000 5000 4000 3500 3000 2500 3500 2500 3500 3500 2500 2500 3500

Verifica-se que não existe homogeneidade de critérios no estabelecimento dos teores máximos de nitratos, nos diversos países. Por um lado, os vegetais que estão sujeitos a esta regulamentação não são os mesmos e, por outro, os valores limite indicados podem variar de país para país.

(33)

A grande solubilidade dos nitratos faz com que estes sejam facilmente absorvidos pelas plantas, no solo, no ambiente aquático e até mesmo incorporados na água. Apesar de existirem outras substâncias azotadas que as plantas podem utilizar no seu desenvolvimento, sabe-se que grande parte destas prefere consumir nitratos. Por este motivo estes são muito utilizados nos fertilizantes agrícolas [Gulis e outros, 2002; Mendes e outros, 2004].

Antes da produção de fertilizantes em grande escala, a quantidade de azoto retirado da atmosfera, por fixação natural, equivalia à quantidade devolvida pela desnitrificação. Actualmente, a produção de fertilizantes sintéticos (por fixação industrial do azoto molecular) é crescente, alterando este equilíbrio [Barbosa e outros, 1999].

Os teores em nitratos nas águas subterrâneas e superficiais têm vindo a aumentar e estão dependentes da quantidade de fertilizantes azotados aplicados ao solo e dos processos degradativos (aeróbios e oxidativas) dos resíduos industriais e agrícolas que são depositados no mesmo [Mendes e outros, 2004].

A presença de nitratos, como já referido, afecta o ambiente e a qualidade das águas, havendo um desenvolvimento excessivo de algas que se traduz na eutrofização. Esta consiste no enriquecimento das águas em compostos de azoto que, provocando uma aceleração do crescimento das algas e plantas superiores, ocasiona uma perturbação indesejável do equilíbrio dos organismos presentes na água e da qualidade das águas em causa [Mendes e outros, 2004].

Em condições oxidativas normais, na água, a conversão dos nitritos em nitratos é quase imediata. Portanto, a presença dos nitritos na água será apenas pontual e a sua acumulação, quando existente, deve-se a processos inibitórios da formação dos nitratos [Karagozler e outros, 2002; Mendes e outros, 2004; Tewari e outros, 2006].

Concluindo, a agricultura é um dos maiores contribuintes para alguns problemas ambientais, tais como a poluição da água por fertilizantes e pesticidas. A contaminação da água subterrânea pelo nitrato é um exemplo deste tipo de poluição e é considerado um problema ambiental bastante sério. A água de irrigação também pode contribuir para

(34)

a contaminação por nitratos, quando esta vem de poços com elevado nível de contaminação [Ramos e outros, 2002].

Actualmente, procuram-se alternativas à adubação química, devido aos seus inconvenientes. Estes devem-se não só ao processo industrial de obtenção ser dispendioso, pois requer altas temperaturas e pressões, mas também porque a sua aplicação origina poluição da água de lagos e rios, para onde vão os excessos de adubos, lixiviados pelas chuvas. O uso de bactérias que possam fazer a fixação biológica de azoto pode ser uma alternativa [Barbosa e outros, 1999].

Como os nitritos e nitratos têm sido implicados em vários efeitos adversos na saúde humana e no ambiente, tornam-se de grande interesse os estudos nessa área.

1.3 Efeitos prejudiciais na saúde humana associados a nitratos e

nitritos

A metahemoglobinémia infantil ou cianose (doença dos bebés azuis) é uma doença que se deve à ingestão de água ou alimentos ricos em nitratos (teores superiores a 50 mg/L). No entanto, o problema não está nos teores de nitratos mas sim nos nitritos. Estes resultam da redução dos nitratos pela enzima nitrato-redutase ou da oxidação do azoto amoniacal no estômago [Pinho e outros, 1998; Mendes e outros, 2004; Chen e outros, 2004; Saygili e outros, 2006; Thomson e outros, 2007].

Os nitritos associam-se à hemoglobina formando um complexo estável – metahemoglobina (Figura 2), o que torna difícil a conversão da carboxihemoglobina em oxihemoglobina, impedindo assim que a hemoglobina fixe o oxigénio. Este complexo pode sofrer hidrólise devido à actividade de uma enzima específica, a redutase da hemoglobina carboxilada. Como esta não atinge os níveis necessários nos mamíferos jovens pode ocorrer um bloqueio ao nível da reoxidação da carboxihemoglobina, o que pode originar a morte dos bebés por asfixia. Esta surge porque não ocorre a respiração celular e, consequentemente verifica-se a morte dos tecidos celulares por falta de oxigénio. Esta sensibilidade à ingestão de água com nitritos (e/ou nitratos) nos bebés deve-se ao grande poder de absorção face ao peso corporal, à presença de bactérias

(35)

redutoras de nitratos a nitritos no seu aparelho gastrointestinal superior, à grande facilidade de oxidação da hemoglobina fetal (que subsiste durante os primeiros meses de vida) e devido também, como já foi referido, ao recém-nascido não possuir as enzimas específicas capazes de reconverter a metahemoglobina em hemoglobina, ao contrário do adulto [Van Maanen e outros, 1994; Mendes e outros, 2004; Mata, 2004; Thomson e outros, 2007].

Enzima

NADH-Redutase da metahemoglobina

Redução química ou microbiana

Figura 2 – Processo de complexação da hemoglobina pelo ião nitrito [Mendes e outros, 2004].

Em adultos saudáveis, os nitratos e nitritos são absorvidos pelo tracto gastrointestinal, sendo o nitrato rapidamente excretado pela via renal, enquanto que os nitritos se combinam com a hemoglobina transformando-a em metahemoglobina, pelo processo de oxidação do ião ferroso a ião férrico no complexo porfirínico. A metahemoglobina-redutase, presente nos eritrócitos, converte-a em hemoglobina [Van Maanen e outros; 1994]. Os espinafres são um exemplo de alimentos que podem conter quantidades elevadas de nitratos quando adubados excessivamente com adubos azotados de cobertura, antes da colheita, para ficarem com uma coloração mais verde. Neste caso pode ocorrer um agravamento da situação referida anteriormente, pela redução dos nitratos a nitritos, visto este tipo de vegetal ser muito utilizado na sopa das crianças [Mendes e outros, 2004].

Ião Nitrato (NO3-)

presente na água

Hemoglobina Fe++_(Ferroso)

Ião Nitrito (NO2-)

Metahemoglobina Fe+++_(Férrico)

(36)

Além da “metahemoglobinémia infantil”, os riscos da ingestão destes compostos poderão ter outras consequências. Os humanos são expostos aos nitritos quando se alimentam, devido à conversão endógena dos nitratos em nitritos, aumentando portanto a sua toxicidade, e formando compostos N-nitroso (nitrosaminas e nitrosamidas), por reacção com aminas e amidas, derivadas das proteínas, por hidrólise. Estes compostos N-nitroso são considerados dos mais potentes cancerígenos conhecidos e podem, por isso, induzir cancro numa grande variedade de órgãos [Duodu e outros, 1999; Hughes e outros, 2001; Gulis e outros, 2002; Xia e outros, 2003; Mendes e outros, 2004; Thomson e outros, 2007]. Os efeitos hepatotóxicos e carcinogénicos foram relatados já em 1954 e 1956. Desde essa altura foram testados numerosos compostos N-nitroso e comprovado, em parte destes, um efeito cancerígeno [Pardi e outros, 1995; Hughes e outros, 2001].

Não existem evidências de carcinogénese, pelo consumo de nitratos em estudos epidemiológicos em humanos. Em relação aos nitritos, os estudos efectuados revelaram efeitos cancerígenos em animais, quando combinados com o consumo de aminas com a consequente formação de nitrosaminas [Walter, 1990]. As nitrosaminas (compostos N-Nitroso, formados em determinados alimentos pela reacção de agentes nitrosantes, derivados de nitrito ou óxido nítrico, com substâncias com um grupo amina) são consideradas dos carcinógenos mais potentes e versáteis, podendo produzir tumores em praticamente todos os órgãos.

As intoxicações por nitratos originam as seguintes manifestações clínicas: vómitos, gastrite, hemorragias digestivas, dor abdominal, metahemoglobinémia, cianose e hemólise. Foram observadas acções carcinogénicas em vários órgãos de cobaias [Reyes e outros; 1993]. Na tabela 7 estão esquematizadas as estruturas químicas de algumas nitrosaminas.

As nitrosaminas podem ser formadas durante o processamento de alimentos, mas também “in vivo”, no tracto gastrointestinal, pela nitrosação de aminas secundárias, as quais podem estar associadas a um alto risco de cancro hepático, gástrico e do esófago [Helse e outros, 1992].

Normalmente, os alimentos crus tais como vegetais, carnes, frutas, cereais e produtos lácteos, contêm baixos teores de nitrosaminas. No entanto, o processo de cura, onde se

(37)

adiciona nitrito e/ou nitrato, pode elevar bastante o nível de nitrosaminas [Atanasova e outros, 1997].

Tabela 7 – Nitrosaminas carcinogénicas e principais órgãos afectados em roedores [Miranda; 1993].

Composto Fórmula de estrutura Principais órgãos afectados em roedores

Dimetilnitrosamina Fígado, rins, pulmões

Dietilnitrosamina Fígado, pulmões, esófago

Dibutilnitrosamina Bexiga, fígado, pulmões

Nitrosopiperidina Fígado, esófago

Os compostos N-nitroso apresentam acção teratogénica e mutagénica em animais. Já foram observados efeitos carcinógenos em mais de 40 espécies animais, inclusivé no macaco. A indução de tumores pode ocorrer em diferentes órgãos, dependendo da estrutura química do composto, da dose, da via de exposição e da espécie animal. Embora não existam evidências directas da incidência de cancro em humanos em resultado da exposição a nitrosaminas, presume-se que o ser humano também seja sensível à sua acção tóxica. As nitrosaminas são absorvidas no tracto gastrointestinal e através da pele, sofrem biotransformação, essencial para exibirem acção cancerígena. O primeiro passo envolve a hidroxilação do carbono α do grupo alquilo, catalisada pela monoaminoxigenase de função mista (do citocromo P450), formando um aldeído ou

cetona e uma nitrosamina primária muito instável [Magee e Barnes, 1967]. Este composto pode dar origem a um ião diazónio que, por sua vez, pode alquilar sítios nucleofílicos de ADN, ARN e proteínas [Mirvish, 1975].

(38)

As concentrações elevadas de nitratos na água subterrânea têm sido relacionadas com a saúde pública, desde que essa água seja utilizada para consumo. No organismo o nitrato pode sofrer redução endógena para nitrito, com aparecimento dos compostos N-nitroso já referidos anteriormente. Estes compostos poderão estar associados ao cancro do tracto digestivo e urinário [Tewari e outros, 2006].

Existem alguns estudos que procuram estabelecer uma relação entre o teor de nitrato/nitrito e o cancro humano. Este papel ainda não está completamente esclarecido, mas as propriedades tóxicas do NO (óxido nítrico) e seus metabolitos (por exemplo o peroxinitrito) podem ter efeitos adversos. Por este motivo considera-se que a avaliação destes elementos no sangue, em pacientes com processos cancerígenos, pode ser recomendado para determinar uma estratégia óptima de terapia anti-tumoral individual depois do diagnóstico proposto [Timoshenko e outros, 2002].

Segundo outros estudos, as espécies reactivas de azoto (NO e peroxinitrito) podem ter funções benéficas para o organismo. No entanto, se se verificar uma produção desregulada destas espécies podem ocorrer efeitos adversos (por exemplo, erro celular ou até morte celular). Esta situação pode conduzir a condições de erro patológico tal como cancro e inflamação [Rassaf e outros, 2002; Yen e outros, 2003]. Recentemente, a atenção tem sido focada na associação entre a inflamação crónica e o risco de cancro [Yen e outros, 2003].

Estão descritos teores de nitrato/nitrito mais elevados em tumores mais avançados. Concentrações elevadas de nitritos em leucócitos são suspeitas de causar erros de alquilação por indução de nitrosaminas, ou seja, as nitrosaminas, como muitos carcinogénicos químicos, promovem mutagénese e carcinogénese devido a erros de alquilação [Saygili e outros, 2006].

Doses elevadas de nitratos (500 mg/dia) podem provocar inflamação nas mucosas intestinais de adultos. A dose máxima recomendada de nitratos é, portanto, aproximadamente 250 mg/dia, nos adultos [Mendes e outros, 2004].

(39)

Depois de estabelecida uma possível relação entre o nível de nitrato/nitrito e tumores, é de todo o interesse procurar perceber se esta relação apresenta alguma diferença em tumores malignos e benignos. O teor de nitratos e nitritos, como já foi referido em alguns estudos, está aumentado no soro e tecidos de pacientes com cancros malignos, quando comparado com pacientes com doença benigna. A avaliação do teor de nitrito e nitrato tem sido usada como um indicador de produção endógena de NO em sistemas biológicos, em vários processos patológicos. Estas espécies têm sido propostas como facilitadoras da carcinogénese. Estes resultados sugerem que a malignidade está associada com um nível aumentado de NO [Gonens e outros, 2006].

Foram efectuados estudos para investigar o efeito da supressão da glândula parótida no metabolismo dinâmico do nitrato e nitrito em porcos anões. A disfunção temporária das glândulas parótidas fez aumentar o nível sistémico do nitrato, sugerindo portanto que estas glândulas têm um papel importante no balanço de nitrato e nitrito em ambos, saliva e corpo. O nitrato salivar é rapidamente reduzido para nitrito pelo sistema enzimático nitrato redutase da bactéria comensal que vive na fenda epitelial da língua [Xia e outros, 2003; Gladwin, 2004]. Foram utilizados porcos anões como modelo para este estudo, devido à morfologia das suas glândulas salivares muito semelhante à dos humanos. O nitrito é um precursor de compostos N-nitroso, que podem estar relacionados com a carcinogénese gástrica/intestinal, ao reagirem com amidas e aminas no estômago para formar compostos carcinogénicos, como já foi referido anteriormente. No entanto, é de notar que o nitrato/nitrito salivar pode contribuir para a defesa dos humanos e animais contra agentes patogénicos orais e intestinais [Xia e outros, 2003]. A figura 3 mostra a possível ligação entre a ingestão de nitratos e o aparecimento de cancro gástrico.

Devido a todos estes riscos já referidos anteriormente, a OMS (Organização Mundial de Saúde), através da FAO (Organização para a Alimentação e Agricultura), recomenda que os nitratos e os nitritos não sejam adicionados à alimentação infantil [Turra, 1998]. Os nitritos podem ser detectados a partir de uma análise à urina. A prova para a detecção de nitritos é útil para o diagnóstico precoce das infecções da bexiga (cistite) [Strasinger, 2000].

(40)

A determinação dos teores de nitratos e nitritos pode também ser feita em eritrócitos e em soro [Karagozler e outros, 2002].

Figura 3 – Esquema da possivel ligação entre nitratos e cancro gástrico [Miranda, 1993].

A toxicidade dos nitritos é directa, pois são os responsáveis pela ocorrência da metahemoglobinémia. Os nitratos apresentam uma toxicidade específica muito inferior à dos nitritos, mas também são considerados tóxicos indirectos, pela sua conversão no

Dieta _PerniciosaAnemia Gastroenterostomia

Gastrite crónica _AtróficaGastrite Metaplasia Intestinal

Elevação do pH gástrico (>5)

Nitrito (Presente nos alimentos e utilizado como conservante)

Composto Nitrogenado Inibição pelo ácido

ascórbico Composto N-Nitroso Toxicidade, Mutagenicidade, carcinogenicidade Aumento da população bacteriana

(41)

organismo em nitritos e quando ingeridos em doses excessivas [Pinho e outros, 1998; Mendes e outros, 2004; Thomson e outros, 2007].

A exposição em excesso aos nitritos representa um potencial risco para os Humanos. Os indivíduos com taxa elevada de conversão de nitrato para nitrito estão mais sujeitos aos efeitos adversos da exposição aos nitritos [Thomson e outros, 2007].

1.4 Vantagens da utilização dos nitratos e nitritos

Os nitratos e nitritos podem ser utilizados, com vantagem, em produtos alimentares. Este facto permite o seu uso como aditivos na indústria alimentar. Aplicam-se nomeadamente em derivados de carne, tendo uma função conservante (agente antimicrobiano – inibe o crescimento bacteriano) e contribui para melhorar as características organolépticas – cor rosada, sabor típico e textura. O nitrato é, por isso, um aditivo permitido no queijo e em produtos de carne [Cassen, 1995; Pinho e outros 1998; Groten e outros, 2000; Gladwin, 2004; Thomosson e outros, 2007].

Enquanto nas carnes frescas, os teores de nitrato e nitrito estão situados abaixo dos 7 mg/kg e 0,4 mg/kg, respectivamente [Dennis e Wilson, 2003], nas carnes curadas esses valores são mais elevados, após a adição destes compostos como conservantes alimentares. O nitrito pode ser adicionado directamente ao alimento, ou ser obtido por redução do nitrato, promovida pela acção de bactérias redutoras. A adição de nitrato é um procedimento mais comum nos processos de cura longa [Judge e outros, 1989].

Contudo, os teores de nitrito utilizados como aditivos têm vindo a diminuir, com o objectivo de evitar a formação de nitrosaminas. No fabrico dos queijos, o nitrato de potássio é utilizado para evitar o designado “estufamento tardio”, que aparece duas a três semanas após o fabrico, devido à presença da bactéria Clostridium tyrobutyricum [Kyriarkidis e outros, 1997]. Esta é responsável pela alteração tanto do odor como do sabor dos queijos, retirando-lhes valor comercial [Dennis e Wilson, 2003].

A cor rosada das carnes deve-se ao facto de estar associada à conformação química e à concentração dos pigmentos heme, mais especificamente, da mioglobina. Esta é