A determinação analítica dos nitratos em alimentos, água, material biológico, plantas e solo pode ser feita através de diversos métodos, nomeadamente, colorimétricos, potenciométricos, com eléctrodos selectivos ou cromatográficos. Contudo, trata-se de uma determinação que pode estar sujeita a numerosas interferências. As diversas técnicas podem diferenciar-se quanto à determinação de nitratos e nitritos, que pode ocorrer de forma simultânea ou diferencial [Moorcroft e outros, 2001]. Como exemplo de técnicas que realizam a determinação de forma simultânea citam-se as técnicas de electroforese capilar. Em relação à determinação sequencial, esta baseia-se na detecção inicial do ião nitrito seguida da redução do ião nitrato a nitrito, para a sua quantificação posterior, sendo os valores de nitratos obtidos por diferença.
Existe uma grande variedade de agentes redutores que foram avaliados quanto à eficiência na redução do nitrato a nitrito. Os redutores à base de zinco [Su e outros, 1998], os de cobre-hidrazina [Hilton e Rigg, 1983] e os de cádmio coperizado, que serão referidos mais adiante [Van Staden, 1982]. Existe ainda uma outra técnica para reduzir nitrato a nitrito por foto-indução, que consiste no uso da radiação UV entre 200 e 300 nm, resultando na formação de nitrito e oxigénio. Esta técnica apresenta a vantagem de não utilizar substâncias tóxicas como o cádmio. No entanto, este agente redutor tem a desvantagem de reduzir de forma incompleta o nitrato ou levar à formação de amónia.
A extracção de nitrato e nitrito da matriz, tem sido realizada em meio aquoso, devido aos sais de nitrato e nitrito apresentarem, na sua maioria, alta solubilidade na água [Usher e Telling, 1975; Takeda e Fujiwara, 1993]. O método oficial usado para a quantificação de nitrito e nitrato (método ISO) recomenda a aplicação de metodologias analíticas espectrofotométricas [Pinho e outros, 1998]. Em termos de equivalência numérica, 1 mg de azoto (N) corresponde a 4,4 mg de nitrato (NO3-) [Mendes e outros, 2004]. Para se efectuar
a determinação dos nitratos em vegetais é necessário, primeiro proceder-se a uma extracção de uma porção de amostra, seguindo-se a precipitação de proteínas por adição de soluções de hexacianoferrato (II) de potássio e acetato de zinco. Segue-se a filtração e eliminação do precipitado. Posteriormente, efectua-se a redução de nitrato a nitrito, por contacto com cádmio metálico, sendo os nitratos doseados espectrofotometricamente na forma de nitrito [Mata, 2004; ISO 6635-1984].
O processo de clarificação do extracto com nitrato e/ou nitrito é importante, na medida em que, para alguns métodos analíticos, como é o caso da espectrofotometria, são necessários extractos límpidos. Já foram testados alguns reagentes, tais como o sulfato de alumínio e potássio [Follet e Ratcliff, 1963], o cloreto de cádmio mais cloreto de bário [Lara e outros, 1980] sendo o mais utilizado o acetato de zinco em associação com o hexacianoferrato de potássio (Reagente de Carrez) [Kazemzadeh e Ensafi, 2001].
A técnica analítica mais utilizada na determinação de nitrato e nitrito é a espectrofotometria, devido à sua simplicidade [Zatar e outros, 1999]. Existem, no entanto muitas outras técnicas usadas para a determinação destes iões, em diversas matrizes, como é visível na tabela 8.
Actualmente, muitos sistemas utilizados na determinação de nitratos e nitritos foram mecanizados, dando origem aos sistemas de Análise por Injecção em Fluxo (FIA –
Flow Injection Analysis). A mecanização e/ou automatização de procedimentos tem
sido proposta, como alternativa, aos procedimentos convencionais, quando se pretende analisar um grande número de amostras por unidade de tempo, minimizar o consumo de amostras e de reagentes, diminuir problemas de contaminação e melhorar a precisão dos resultados analíticos [Ensafi, 2001; Haghighi e outros, 2002].
O método recomendado pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists), para a determinação de nitratos e nitritos, baseia-se na reacção do nitrito com uma amina primária aromática, em meio ácido, para formar um sal de diazónio. Estes, por sua vez, reagem com um composto aromático, formando um azo-composto (reacção de Griess), capaz de absorver radiação na região do visível do espectro electromagnético [AOAC, 1997].
Tabela 8 – Técnicas analíticas empregues na determinação de nitratos e nitritos.
Técnica
Espécie
Referência
Espectrofotometria NO3-/NO2- Oliveira e outros, 1995;Zatar e outros, 1999; Mendes e outros, 2004 Quimioluminescência NO3-/NO2- Mikuska e Vecera, 2003 Espectrofotometria / FIA NO3-/NO2- Monser e outros, 2002;
Haghighi e Tavassoli, 2002
HPLC-UV NO3-/NO2- Butt e outros, 2001;
Connolly e Paull, 2001
HPLC-Quimioluminescência NO2- He e outros, 2000
HPLC-Fluorescência NO3-/NO2- Stalikas e outros, 2003 HPLC- condutimetria NO3-/NO2- Nozal e outros, 2000 HPLC-detecção electroquímica NO3-/NO2- Davis e outros, 2000
Potenciometria NO3- Mourzina e outros, 2003
Electroforese capilar NO3-/NO2- Miyado e outros, 2003
Fluorescência NO2- Huang e outros, 2000;
Wang e outros, 2000 Espectroscopia de absorção atómica NO3-/NO2- Silva e outros, 1986
Cromatografia iónica NO2- Mendes e outros, 2004;
Prusisz e outros, 2007
Colorimetria NO3-/NO2- Mendes e outros, 2004;
Mantovani e outros, 2005
O nitrato é determinado, como nitrito, após redução em coluna de cádmio poroso [AOAC; 1997]. Esta reacção apresenta-se como uma metodologia simples, rápida e precisa na determinação simultânea de nitrato e nitrito. Segundo este método, o nitrato é reduzido a nitrito por intermédio de uma mini-coluna de cádmio coperizado (3 mm de diâmetro interno).
Os nitritos são normalmente quantificados por colorimetria ou espectrofotometria de absorção molecular. Podem ainda ser doseados por cromatografia iónica ou por eléctrodos específicos. Para se efectuar a determinação de nitritos, tal como nos nitratos, primeiro é necessário proceder-se a uma extracção de uma porção de amostra, seguindo- se a precipitação de proteínas por adição de soluções de hexacianoferrato (II) de potássio e acetato de zinco, filtrando-se o precipitado. O método colorimétrico, utiliza
normalmente dois reagentes orgânicos, a p-Aminobenzenosulfanilamida (sulfanilamida) e o di-hidrocloreto de N-(1-naftil)etilenodiamina (NED). Em condições ácidas, o ião nitrito (NO2-) na forma de ácido nitroso (HNO2), reage com um grupo amina da
sulfanilamida, dando origem a um sal de um composto diazo que se combina com a NED para formar um composto rosa. A absorvância, devida à cor desenvolvida, é medida num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 538-540 nm [Mendes e outros, 2004; Mata, 2004; ISO 6635-1984].
A medida colorimétrica é a mais utilizada e aceite na análise de extractos vegetais devido à sua simplicidade, ao seu baixo custo e por apresentar uma precisão elevada
[Mantovani e outros, 2005].
A determinação de nitrato por colorimetria pode ser feita directa ou indirectamente. Na determinação directa é utilizado o ácido fenoldissulfónico ou o ácido salicílico. Na determinação indirecta o nitrato é reduzido a nitrito. A determinação indirecta do nitrato apresenta como vantagens, em relação à directa, maior sensibilidade, precisão e melhor selectividade, ou seja, é menos sujeita à interferência de outros iões. O método colorimétrico apresenta como desvantagens ser um método trabalhoso, necessitar de vários reagentes e expor o analista a riscos pelo contacto com o cádmio [Mantovani e outros, 2005].
No procedimento do ácido salicílico, após a extracção, é adicionado carvão activado para a obtenção de extractos incolores. Após agitação e repouso de 10 minutos, o material é filtrado com papel de filtro de filtragem lenta. As alíquotas de extracto recebem uma solução de ácido salicílico em ácido sulfúricoconcentrado e hidróxido de sódio e, em seguida, efectua-se a leitura da absorvância a 410 nm [Mantovani e outros, 2005].
O método colorimétrico indirecto pode promover a redução do nitrato a nitrito, em meio alcalino, pela passagem do extracto em coluna contendo cádmio poroso, com posterior quantificação do azoto na forma de nitrito. Existe outro procedimento colorimétrico de determinação indirecta do nitrato, no qual a redução do nitrato a nitrito é feita por uma mistura redutora com zinco. Neste procedimento, depois da extracção do nitrato e do tratamento dos extractos com carvão activado, as alíquotas de extracto são transferidas para tubos de ensaio com água destilada e solução de ácido acético. Após agitação
acrescenta-se sulfato de bário, zinco em pó e sulfato de manganês. Em seguida, adiciona-se um reagente cromogénico, preparado a partir da -naftilamina e ácido sulfanílico, dissolvidos em solução de ácido acético. O material é agitado vigorosamente, mantido em repouso por 10 minutos e filtrado, utilizando-se funis de vidro e papel de filtro de filtração lenta. A seguir, é feita a leitura espectrofotométrica da absorvância a 540 nm, no máximo 20 minutos após a filtração [Mantovani e outros, 2005].
No procedimento da destilação proposto por Bremner & Keeney (1965), o NO3- é
determinado por destilação dos extractos num microdestilador Kjeldahl e posterior titulação do destilado. No início foi indicado para solos, mas também pode ser utilizado em tecido vegetal e apresenta como vantagens em relação aos procedimentos colorimétricos, ser livre de interferentes e não sofrer influência da cor do extracto
[Mantovani e outros, 2005].
Relativamente aos procedimentos de extracção do ião nitrato, alguns não são no entanto eficientes para extractos de plantas. Os procedimentos do ácido salicílico e da mistura redutora contendo zinco são mais susceptíveis a interferentes e ao efeito da cor do extracto [Mantovani e outros, 2005].
Os procedimentos da coluna redutora contendo cádmio e o da destilação são os mais adequados para a quantificação de nitrato em tecido vegetal. Contudo, a simplicidade e o menor custo da destilação em relação à coluna redutora levam a que aquele seja o mais aconselhado [Mantovani e outros, 2005].