Avaliação microbiológica de refeições de sashimi de restaurantes da Região Norte de Portugal: perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp.

Avaliação Microbiológica de Refeições de Sashimi de

Restaurantes da Região Norte de Portugal

Perfil de Suscetibilidade Antimicrobiana de Staphylococcus spp.

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar

Ana Teresa Lopes Moura

Orientadora: Professora Doutora Cristina Saraiva Coorientadora: Professora Doutora Alexandra Esteves

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO

Avaliação Microbiológica de Refeições de Sashimi de

Restaurantes da Região Norte de Portugal

Perfil de Suscetibilidade Antimicrobiana de Staphylococcus spp.

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar

Ana Teresa Lopes Moura

Orientadora: Professora Doutora Cristina Saraiva Coorientadora: Professora Doutora Alexandra Esteves

Composição do Júri:

__________________________________________ __________________________________________ __________________________________________

Põe tudo o que és nas mais pequenas coisas que faças. Fernando Pessoa

i AGRADECIMENTOS

À Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro ficam os agradecimentos pelos meios concedidos ao desenvolvimento desta Dissertação de Mestrado.

À Professora Doutora Cristina Saraiva pela extrema boa disposição e amizade, pelo seu apoio e paciência em todos os momentos. À Professora Doutora Alexandra Esteves pela sua simpatia e amizade, pela preocupação e disponibilidade sempre presentes. Às duas, um imenso obrigado!

À Professora Doutora Conceição Fontes pela sua simpatia e enorme paciência, por toda a ajuda, dedicação e disponibilidade na concretização deste trabalho.

Ao Samuel Miguéis pela oportunidade que me ofereceu, pela confiança que depositou em mim ao longo de todo o trabalho, pelo conhecimento transmitido, por todas as chatices e pela amizade.

À D. Ana, ao Sr. Felisberto e à D. Fátima pela amizade e simpatia imensas, por todos os desabafos, pela boa disposição sem igual, pela ajuda na realização do trabalho laboratorial.

A todos os docentes do Mestrado em Segurança Alimentar, em especial ao Professor Doutor Luis Patarata, ao Professor Doutor António Silva e à Professora Doutora Madalena Vieira-Pinto por tudo o que me ensinaram.

Aos colegas e amigos, Rita Sousa, Davide Silva, Cristina Silva, Dirce Martins, Vanessa Silva, Carlos Marques, Kamila Soares, Rute Oliveira, Ana Isabel Teixeira e Margarida Borges por todos os bons momentos.

À Laura Pachón um agradecimento muito especial por se ter tornado uma amiga excecional, por ser um exemplo de força de vontade e de trabalho, por tudo de bom que partilhámos.

Ao Paulo pelo amor, pela incrível amizade, pela força e paciência, por acreditar em mim, por estar do meu lado em mais uma etapa tão importante.

Aos meus pais, um enorme obrigado pois sem o seu esforço, dedicação e amor nada disto seria possível. Ao meu irmão Miguel pelo seu apoio e amizade.

A todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuíram para a concretização deste trabalho, o meu mais sincero obrigado.

ii RESUMO

Sushi é o prato tradicional japonês com maior destaque nos novos hábitos alimentares dos portugueses. Não só pela curiosidade suscitada, mas principalmente pela associação a excelentes benefícios para a saúde, esta especialidade ganhou inúmeros apreciadores de norte a sul de Portugal.

O pescado cru é, porém, um veículo potencial na transmissão de diversos agentes patogénicos, respetivos metabolitos e toxinas, responsáveis por uma panóplia de doenças de origem alimentar. Um dos objetivos deste estudo consistiu em determinar a presença de Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus coagulase-positiva, entre outros, e analisar a microbiota deteriorativa das refeições de sashimi recolhidas pelo norte do país. Nas amostras analisadas observaram-se elevados teores de Enterobacteriaceae, microrganismos psicrotróficos, leveduras e de bactérias produtoras de H2S (valores médios entre 4,08 e 6,26 log UFC/g). Não foi detetada a presença de Salmonella spp. No entanto, a presença de Listeria monocytogenes e Staphylococcus coagulase-positiva destacou-se entre os microrganismos patogénicos pesquisados. Salvo raras exceções, os teores microbiológicos mais elevados foram observados nas amostras de sashimi recolhidas em estabelecimentos não típicos.

Foi avaliada a qualidade microbiológica das refeições de sashimi com base na comparação entre alguns parâmetros microbiológicos analisados e os valores guia propostos pela literatura. Nenhuma refeição de sashimi foi classificada como satisfatória, 15% das refeições de estabelecimentos não típicos classificaram-se como inaceitáveis e 55% das refeições de estabelecimentos típicos como não satisfatórias. Staphylococcus coagulase-positiva, L. monocytogenes e E. coli, Enterobacteriaceae, leveduras e microrganismos mesófilos a 30 °C foram os microrganismos que mais contribuíram para este cenário, o que é sugestivo de práticas de higiene inadequadas e falhas na conservação do pescado cru.

iii Numa segunda fase, foi estudado o perfil de suscetibilidade a agentes antimicrobianos de Staphylococcus spp.. O objetivo consistiu em detetar a presença de resistências entre os isolados Staphylococcus coagulase-positiva e coagulase-negativa, tirando ilações acerca da possibilidade do sashimi representar uma via de transmissão de microrganismos resistentes a antimicrobianos. O teste de suscetibilidade a agentes antimicrobianos revelou elevados níveis de resistência a β-lactâmicos, macrólidos e lincosamidas. A problemática da multirresistência foi observada em 25% dos isolados Staphylococcus coagulase-positiva e coagulase-negativa.

Palavras-Chave: Sashimi, qualidade microbiológica, suscetibilidade antimicrobiana, Staphylococcus spp..

iv ABSTRACT

Sushi is the traditional Japanese food with greater prominence in Portuguese eating habits. Not only for the raised curiosity, but also by the association with excellent health benefits, this oriental specialty has won countless lovers north to south of Portugal.

However, the raw fish is a potential vehicle in the transmission of many pathogens, its toxins and metabolites, responsible for a wide range of foodborne diseases. One purpose of this study was to determine the presence of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus cereus, coagulase-positive staphylococci, among others, and analyze the spoilage microbiota in sashimi meals collected in northern restaurants. Sashimi samples revealed high values of Enterobacteriaceae, psychrotrophic microorganisms, yeast and H2S-producing bacteria (mean values between 4.08 and 6.26 log UFC/g). Salmonella spp. was not detected but the presence of Listeria monocytogenes and coagulase-positive staphylococci stood out among other pathogens. With few exceptions, the highest microbial values were observed in sashimi samples from non-typical establishments.

The microbiological quality of sashimi meals was evaluated based on an assessment of some microbiological parameters and the guidelines proposed in the literature. No meal was classified as satisfactory, 15% of non-_{typical establishments’ meals were classified as} unacceptable and 55% of typical establishments’ meals were unsatisfactory. Coagulase-positive staphylococci, L. monocytogenes and E. coli, Enterobacteriaceae, yeast and mesophilic microorganisms at 30 °C were the microorganisms that contributed the most to this disclosure, which is suggestive of poor hygiene practices and failures in the conservation of the raw fish.

Furthermore, the antimicrobial susceptibility pattern of Staphylococcus spp. was investigated. The aim was to detect the presence of resistance among coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci and draw conclusions about the possibility of sashimi as a pathway of antimicrobial resistant microorganisms transmission. The antimicrobial susceptibility test showed high levels of resistance to β-lactams, macrolides and lincosamides. The problem about multidrug resistance was observed in 25% of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci.

v ÍNDICE GERAL AGRADECIMENTOS i RESUMO ii ABSTRACT iv ÍNDICE GERAL v ÍNDICE DE TABELAS ix ÍNDICE DE QUADROS x ÍNDICE DE GRÁFICOS x ÍNDICE DE FIGURAS x ABREVIATURAS E SIGLAS xi

CAPÍTULO I. ENQUADRAMENTO BIBLIOGRÁFICO 1

I.1. Sashimi, do Japão para o mundo 1

I.2. Segurança Alimentar e Pescado Cru 2

I.2.1. Deterioração e alterações post mortem do pescado 2

I.2.1.1. Propriedades intrínsecas do produto 2

I.2.1.2. Temperatura 3

I.2.1.3. Higiene na manipulação 3

I.2.2. Principais perigos biológicos associados a pescado 4

I.2.2.1. Bactérias 4

I.2.2.1.1. Microbiota patogénica 5

.1 Vibrio spp. 5 .2 Salmonella spp. 5 .3 Clostridium spp. 6 .3.1 Clostridium perfringens 7 .4 Escherichia coli 8 .5 Bacillus cereus 8 .6 Listeria monocytogenes 9 .7 Staphylococcus spp. 10

I.2.2.1.2. Microbiota deteriorativa 10

.1 Enterobacteriaceae 10

.2 Pseudomonas spp. 11

vi

.4 Bactérias do Ácido Láctico 12

.5 Bolores e Leveduras 12

I.2.2.2. Parasitas 13

I.2.2.3. Vírus 15

I.2.3. Critérios microbiológicos 17

I.3. Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. 19

CAPÍTULO II. COMPONENTE EXPERIMENTAL 23

II.1. Introdução e Objetivos 23

II.2. Material e Métodos 24

II.2.1. Amostragem 24

II.2.2. Preparação das amostras 25

II.2.3. Isolamento e contagem de microrganismos deteriorativos 26

II.2.3.1. Mesófilos e Psicrotróficos 26

II.2.3.2. Bolores e Leveduras 26

II.2.3.3. Bactérias do Ácido Láctico 26

II.2.3.4. Bactérias produtoras de H2S 27

II.2.3.5. Pseudomonas spp. 27

II.2.3.6. Enterobacteriaceae 27

II.2.4. Pesquisa e/ou contagem de microrganismos patogénicos 28

II.2.4.1. Isolamento e contagem de Bacillus cereus 28

II.2.4.2. Pesquisa de Clostridium spp. 29

II.2.4.3. Isolamento e contagem de Clostridium perfringens 29

II.2.4.4. Pesquisa de Vibrio spp. 29

II.2.4.5. Pesquisa de Salmonella spp. 30

II.2.4.6. Isolamento e contagem de Listeria spp. 31

II.2.4.7. Isolamento e contagem de Escherichia coli 31

II.2.4.8. Isolamento e contagem de Staphylococcus aureus e outras espécies 32

II.2.5. Provas de confirmação 32

II.2.5.1. Staphylococcus coagulase-positiva 32

II.2.5.2. Bacillus cereus 33

II.2.5.3. Clostridium perfringens 33

II.2.5.4. Salmonella spp. 33

vii II.3. Perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. 35

II.3.1. Genotipagem baseada em metodologia de PCR 35

II.3.1.1. Obtenção de DNA a partir de culturas puras 35

II.3.1.2. Reação de PCR 35

II.3.1.3. Eletroforese em gel de agarose 36

II.3.1.4.Análise dos fragmentos de DNA 36

II.3.2. Teste de suscetibilidade antimicrobiana 37

II.4. Análise de dados 38

CAPÍTULO III. RESULTADOS E DISCUSSÃO 41

III.1. Avaliação microbiológica das refeições de sashimi 41

III.1.1. Microbiota deteriorativa 42

III.1.2. Microbiota patogénica 45

III.1.3. Avaliação da qualidade microbiológica 48

III.2. Perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. 51

III.2.1. Tipagem dos isolados Staphylococcus spp. 51

III.2.2. Teste de suscetibilidade antimicrobiana 53

CAPÍTULO IV. CONCLUSÕES 60

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63

ANEXO A – Meios de cultura e Reagentes 76

ANEXO A1. Meio de cultura ASPW 76

ANEXO A2. Meio de cultura LIA 76

ANEXO A3. Meios de cultura VLS e VL2X 76

ANEXO A4. Meio de cultura TSAT 77

ANEXO A5. Meio de cultura SNA 77

ANEXO A6. Meio de cultura TSI salino 78

ANEXO A7. Meio de cultura TSYEA 78

ANEXO A8. Meio de cultura Chapman 78

ANEXO A9. Meio de cultura LS 78

ANEXO A10. Meio de cultura Ureia 79

ANEXO A11. Reagentes Voges-Proskauer 79

ANEXO A12. Reagentes Indol 80

ANEXO A13. Reagente de Kovacs 80

viii

ANEXO A15. Tampão Tris-EDTA 81

ANEXO B – Resultados da Avaliação Microbiológica 82

ANEXO B1. Microbiota deteriorativa 82

ix ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Valores de média e desvio padrão – expressos em log UFC/g – das contagens da

microbiota deteriorativa segundo o tipo de estabelecimento. 42

Tabela 2 – Valores de média e desvio padrão – expressos em log UFC/g – das contagens da

microbiota patogénica segundo o tipo de estabelecimento. 45

Tabela 3 – Pesquisa de microrganismos patogénicos segundo o tipo de estabelecimento. 46 Tabela 4 – Número (n) de isolados CPS e CNS por amostra de pescado recuperados após

purificação, e número de isolados considerados após RAPD-PCR. 51

Tabela 5 – Resultados do teste de suscetibilidade de Staphylococcus spp. aos agentes

antimicrobianos testados, expressos em percentagem. 53

Tabela 6 – Número (n) e percentagem de padrões de resistência dos isolados CPS e CNS. 57 Tabela 7 – Valores de média e desvio padrão das contagens de microrganismos mesófilos. 82 Tabela 8 – Valores de média e desvio padrão das contagens de microrganismos

psicrotróficos. 82

Tabela 9 – Valores de média e desvio padrão das contagens de bolores. 83 Tabela 10 – Valores de média e desvio padrão das contagens de leveduras. 83 Tabela 11 – Valores de média e desvio padrão das contagens de bactérias do ácido láctico. 84 Tabela 12 – Valores de média e desvio padrão das contagens de bactérias produtoras de H2S. 84 Tabela 13 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Pseudomonas spp.. 85 Tabela 14 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Enterobacteriaceae. 85 Tabela 15 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Staphylococcus

coagulase-positiva. 86

Tabela 16 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Listeria monocytogenes. 86 Tabela 17 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Escherichia coli. 87 Tabela 18 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Bacillus cereus. 87 Tabela 19 – Valores de média e desvio padrão das contagens de Clostridium perfringens. 88 Tabela 20 – Número (n) de amostras positivas de Vibrio spp.. 88 Tabela 21 – Número (n) de amostras positivas de Clostridium spp.. 89 Tabela 22 – Número (n) de amostras positivas de Salmonella spp.. 89 Tabela 23 – Número (n) de amostras positivas de Staphylococcus coagulase-positiva. 90 Tabela 24 – Número (n) de amostras positivas de Listeria monocytogenes. 90

x ÍNDICE DE QUADROS

Quadro 1 – Diretrizes da qualidade microbiológica das refeições de sashimi. 18 Quadro 2 – Resistências de espécies Staphylococcus a agentes antimicrobianos, descritas em

pescado e manipuladores de alimentos. 20

Quadro 3 – Extração de DNA de culturas bacterianas puras. 35

Quadro 4 – Componentes da mix da reação PCR. 36

Quadro 5 – Procedimento de difusão em agar com discos de antibióticos. 37

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Distribuição das espécies de pescado por tipo de estabelecimento. 24 Gráfico 2 – Avaliação da qualidade microbiológica das refeições de sashimi em função dos resultados analíticos obtidos para cada critério microbiológico. 48 Gráfico 3 – Percentagem de CPS de acordo com a classe de agentes antimicrobianos. 55 Gráfico 4 – Percentagem de CNS de acordo com a classe de agentes antimicrobianos. 56

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Fragmentos obtidos após amplificação de DNA por RADP-PCR de alguns

isolados Staphylococcus spp. 51

Figura 2 – Fragmentos obtidos após amplificação de DNA por RADP-PCR de alguns

isolados Staphylococcus spp. 52

Figura 3 – Fragmentos obtidos após amplificação de DNA por RADP-PCR de alguns

xi ABREVIATURAS E SIGLAS

°C Grau Celsius

APT Água peptonada tamponada ASPW Alkaline saline peptone water

aw Atividade da água

BAL Bactérias do ácido láctico BHI Brain heart infusion

BM Basal medium

BP Baird-Parker agar

CAC Codex Alimentarius Commission

CDC Centers for Disease Control and Prevention CFC Cetrimide, fucidin and cephaloridine agar CGA Chloramphenicol glucose agar

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CNS Coagulase-negative staphylococci

CO2 Dióxido de carbono

CPS Coagulase-positive staphylococci DECO Defesa do Consumidor

DNA Deoxyribonucleic acid DvPad Desvio padrão

ECDC European Centre for Disease Prevention and Control EFSA European Food Safety Authority

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations H2S Sulfureto de hidrogénio

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points

ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for Foods ISO International Organization for Standardization

LIA Lyngby iron agar

LM Luminous medium

LS Lactose sulfite medium

MKTTn Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth MRS de Man, Rogosa and Sharpe agar

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MYP Mannitol egg yolk polymyxin agar

NA Nutrient agar

NaCl Cloreto de sódio

NH3 Amoníaco

NoV Norovírus

NP Norma Portuguesa

ONPG o-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside OTMA Óxido de trimetilamina

xii PCR Polymerase chain reaction

RAPD Rapid amplified polymorphic DNA rpm Rotações por minuto

RTE Ready-to-eat

RVS Rappaport-Vassiliadis medium with soya SNA Saline nutrient agar

TBX Tryptone-bile-glucuronic agar TCS Sulfite-cycloserine agar TMA Trimetilamina

TSAT Triphenyl tetrazolium chloride soya tryptone agar TSI Triple sugar/iron agar

TSYEA Tryptone soya yeast extract agar UFC Unidades formadoras de colónias

VP Voges-Proskauer medium

VRBG Violet red bile glucose

WHO World and Health Organization XLD Xylose lysine deoxycholate agar

CAPÍTULO I

1 CAPÍTULO I. ENQUADRAMENTO BIBLIOGRÁFICO

I.1. Sashimi, do Japão para o mundo

O sushi teve a sua origem no início do século VIII d.C., como forma de conservar peixe em arroz ou sal, cresceu em popularidade e tornou-se o prato mais famoso do século XXI. A projeção e renome mundial alcançados pela gastronomia japonesa estão bem à vista, principalmente nos Estados Unidos e no Brasil, mas também na Europa e na Austrália. Nos milhares de restaurantes que servem sushi está o reflexo do estabelecimento da gastronomia japonesa nos hábitos alimentares das populações dos quatro cantos do mundo que, cada vez mais, procuram uma melhor qualidade de vida, numa perspetiva de saúde física e de equilíbrio mental (Matsumoto, 2007).

Sushi é, por definição, arroz avinagrado com uma cobertura ou recheio de peixe, crustáceos ou moluscos, vegetais ou ovo, crus, cozinhados ou marinados. Esta definição engloba todas as especialidades gastronómicas, desde a mais antiga, nare-sushi, até às variações de nigiri-sushi, maki-sushi, chirashi-sushi, oshi-sushi e temaki-sushi (Barber & Takemura, 2003). O sashimi é também figura de destaque na tradição japonesa, e considerado a entrada perfeita para uma refeição japonesa. Visualmente parecem simples fatias de peixe cru sem arroz, mas, na verdade, os detalhes como o corte dos vários tipos de peixe e moluscos, a combinação com outros ingredientes, e, especialmente, a apresentação e conjugação de cores no prato, elevam o sashimi a uma iguaria de excelência.

Salmão, atum, cavala, tilápia, arenque, enguia, robalo, perca, camarão, polvo, entre outros, estão entre a diversidade de peixes, moluscos e crustáceos usados como ingredientes nas variedades de sushi e sashimi. Uns mais que outros oferecem elevadas porções de constituintes químicos fundamentais para uma dieta saudável e equilibrada, nomeadamente ácidos gordos polinsaturados pertencentes à série ómega-3, vitaminas lipossolúveis, microelementos e aminoácidos essenciais (Mouritsen, 2009). O arroz é, além do peixe, a base da culinária japonesa, e, também, uma excelente e das mais importantes fontes de hidratos de carbono e proteínas na alimentação da população mundial, especialmente para indivíduos intolerantes ao glúten (de Carvalho, 2004). O sushi e o sashimi são baixos em calorias, proporcionam uma digestão fácil e agradável, previnem doenças cardiovasculares e uma série de doenças crónicas, e fortalecem o sistema imunitário (Barber & Takemura, 2003).

2 A qualidade dos ingredientes, o valor nutritivo, o equilíbrio de sabores, a textura e a beleza estética são essenciais à riqueza do sushi e do sashimi, e que, ao mesmo tempo, tornam estas especialidades japonesas tão peculiares.

I.2. Segurança Alimentar e Pescado Cru

I.2.1. Deterioração e alterações post mortem do pescado

O pescado é bastante perecível, e a perda de frescura e qualidade resulta da combinação entre atividades microbiológicas, fisiológicas e químicas envolvidas num complexo processo de deterioração. Após a captura, as alterações do pescado consistem normalmente no rigor mortis, no estabelecimento do estado de rigor mortis seguido de reações autolíticas, e, por fim, na degradação microbiológica (Ocaño-Higuera et al., 2009). A autólise está associada à ação de várias enzimas endógenas sobre os tecidos musculares do pescado. A degradação de nucleótidos, a proteólise, a oxidação lipídica e a desmetilação de óxido de trimetilamina (OTMA), e consequente formação de dimetilamina e formaldeído, estão entre os principais processos autolíticos que influenciam o grau de frescura do pescado (Nychas & Drosinos, 2010).

A atividade de Pseudomonas spp., Shewanella putrefaciens, Photobacterium phosphoreum, Aeromonas spp., Enterobacteriaceae, Vibrio spp., e bactérias do ácido láctico (BAL) altera consideravelmente as características sensoriais do pescado, sendo facilmente reconhecida pela produção de off-odours e off-flavours, descoloração dos olhos e guelras, produção de exsudados, e perda de textura muscular (Gram & Huss, 1996).

I.2.1.1. Propriedades intrínsecas do produto

As propriedades intrínsecas como o pH, a atividade da água (aw) e o potencial de oxidação-redução são essenciais no desenvolvimento de alterações post mortem e determinam a multiplicação de vários microrganismos presentes.

No entanto, a disponibilidade de compostos azotados não proteicos, péptidos, proteínas e lípidos, é o principal fator que potencia a atividade de bactérias deteriorativas. Assim, ocorrem a redução de OTMA a trimetilamina (TMA), a desaminação oxidativa de

3 aminoácidos e péptidos, a libertação de ácidos gordos e, consequentemente, a produção de diversos compostos voláteis tais como NH3, H2S, histamina, putrescina e cadaverina (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, ICMSF, 2005).

I.2.1.2. Temperatura

A temperatura é o fator extrínseco mais importante na determinação do tempo de vida útil do pescado, principalmente devido à taxa de crescimento e posteriores alterações microbiológicas. Por outro lado, a temperatura das águas de captura é fundamental na carga microbiana inicial (Nychas & Drosinos, 2010).

Após a captura, a cadeia de frio não deve ser interrompida; entre ‒2 e 0 °C o período de rigor mortis é prolongado, existindo assim a possibilidade de retardar o processo deteriorativo. É ainda de salientar a influência positiva da temperatura na concentração de histamina, o agente responsável por graves intoxicações alimentares; Torido, Takahashi, Kuda, e Kimura (2012) revelaram que, mesmo na presença de bactérias psicrófilas produtoras de histamina, a acumulação desta substância apenas se verificou após 5 dias sob temperaturas de refrigeração de 4 °C.

I.2.1.3. Higiene na manipulação

As boas práticas de higiene devem ser implementadas e mantidas desde a captura à comercialização do pescado, e daí até ao consumo. É mais que evidente a importância de um elevado nível de higiene pessoal, não descurando a adoção de programas de higienização eficazes de instalações, equipamentos e utensílios que contactem diretamente com o produto, que se caracterizam pela via de contaminação mais comum, especialmente na introdução de agentes patogénicos que facilmente comprometem a saúde e o bem-estar dos consumidores (ICMSF, 2005).

4 I.2.2. Principais perigos biológicos associados a pescado

O peixe, moluscos bivalves e crustáceos são importantes veículos de diversas bactérias e organismos de interesse para a saúde pública; por outro lado, a eventual presença desses perigos biológicos representa um ponto a considerar na determinação da qualidade higiénica do pescado.

De acordo com os últimos dados divulgados pela European Food Safety Authority (EFSA, 2014), peixe, moluscos bivalves e crustáceos ocupam o terceiro lugar como responsáveis por 9,2% dos surtos de doença de origem alimentar, tal como registado em anos anteriores.

I.2.2.1. Bactérias

A microbiota do pescado é fortemente influenciada pela temperatura, que sofrerá alterações consideráveis após captura, morte e acondicionamento do pescado (ICMSF, 2005).

No momento da captura, microrganismos psicrotróficos encontram-se associados a pescado proveniente de águas frias a temperadas, já que são capazes de se multiplicar a temperaturas abaixo de 7 °C, e cuja temperatura ótima de multiplicação está compreendida entre 20 e 30 °C. Em águas mais quentes, podem ser detetados níveis superiores de microrganismos mesófilos, dada a sua temperatura ótima de multiplicação ser de 37 °C, e a sua capacidade de multiplicação entre 20 e 45 °C (Jay, Loessner, & Golden, 2005).

Os microrganismos mesófilos e psicrotróficos são considerados microrganismos indicadores, quer na avaliação das condições ambientais do meio aquático envolvente, quer na determinação da carga microbiana total do pescado após a sua captura. Essa microbiota abrange microrganismos responsáveis pela deterioração e bactérias patogénicas, e permite tirar ilações acerca das boas práticas de higiene adotadas pelos manipuladores, como na conservação do pescado cru, seja fresco ou congelado (Huss, Reilly, & Embarek, 2000).

5 I.2.2.1.1. Microbiota patogénica

A microbiota patogénica presente no pescado no momento da sua captura é reflexo da população patogénica existente no ambiente aquático per se. A presença de bactérias não indígenas será resultado da contaminação do pescado durante a sua manipulação, ou devido a condições de conservação impróprias (Alasalvar, Shahidi, Miyashita, & Wanasundara, 2011).

.1 Vibrio spp.

O género Vibrio está amplamente distribuído nos diversos ambientes aquáticos cujas características se repercutem na presença e multiplicação destes microrganismos (Butt, Aldridge, & Sanders, 2004), sendo a temperatura, concentração de NaCl, pH e disponibilidade de nutrientes as mais importantes (Oliver, Pruzzo, Vezzulli, & Kaper, 2013).

Vibrio spp. inclui bacilos Gram-negativos com elevada motilidade, anaeróbios facultativos e que possuem um metabolismo fermentativo e respiratório (Adams & Moss, 2008). As espécies de Vibrio são halófitas estritas e multiplicam-se numa gama ótima de valores de pH entre 8 e 8,8. A temperatura ótima de multiplicação ronda os 20 e 37 °C (Bhunia, 2008); bactérias enteropatogénicas deste género multiplicam-se consideravelmente a 37 °C, podendo registar-se crescimento também a 10 °C (Adams & Moss, 2008).

Entre as espécies patogénicas destacam-se V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. cholerae, quer a nível epidemiológico, quer pela gravidade da sintomatologia provocada pelo consumo de peixe, moluscos e crustáceos crus e contaminados (Bagenda & Yamazaki, 2011). Segundo os últimos dados divulgados pela EFSA (2014), 2,9% dos casos de doença foram reportados envolvendo V. parahaemolyticus devido ao consumo de crustáceos e moluscos.

.2 Salmonella spp.

Salmonella spp. é um género ubiquitário no meio ambiente cujo reservatório natural é considerado o trato intestinal de diversas espécies animais selvagens e domésticas, resultando num elevado número de potenciais fontes de disseminação destes microrganismos.

6 Trata-se de bactérias Gram-negativas, anaeróbias facultativas e não formadoras de esporos. Apresentam temperatura ótima de multiplicação entre 35 e 37 °C, e valores de pH de 6,5 a 7,5. Geralmente consideradas mesófilas, são organismos fisiologicamente adaptáveis, quer a condições de temperatura, pH, aw ou concentração de sal. Sobrevivem facilmente a temperaturas até 46 °C, mas também se multiplicam em alimentos conservados entre 2 e 4 °C (Amagliani, Brandi, & Schiavano, 2012; Li, Wang, D’Aoust, & Maurer, 2013).

A salmonelose ocorre quando o agente patogénico é introduzido nas várias zonas de preparação de alimentos e, posteriormente, lhe são fornecidas condições de multiplicação, seja através de temperaturas de conservação inadequadas, práticas de confeção impróprias, ou contaminação cruzada de alimentos ready-to-eat (RTE) (Carrasco, Morales-Rueda, & García-Gimeno, 2012). O contacto direto com animais e indivíduos infetados é também uma via de contaminação por Salmonella spp.. Por outro lado, o consumo de produtos provenientes de animais infetados constitui a principal fonte de transmissão de Salmonella spp. (Li et al., 2013); carne de aves, ovos e subprodutos são os principais veículos de transmissão de Salmonella spp., seguindo-lhes a carne de porco e de vaca (EFSA, 2014).

Apesar do pescado não estar normalmente associado ao agente Salmonella spp., têm vindo a ser reportados diversos surtos de salmonelose nos Estados Unidos, no Japão e em vários países europeus (Amagliani et al., 2012; Centers for Disease Control and Prevention, CDC, 2014). Em 2012, Salmonella spp. foi responsável por 45,5% dos surtos de toxinfecção alimentar, entre os quais 11,4% relacionados com o consumo de peixe, crustáceos, moluscos e produtos afins (EFSA, 2014), resultado de contaminação fecal devido a águas poluídas, manipuladores infetados e contaminação cruzada.

.3 Clostridium spp.

Clostridium spp. compreende uma grande diversidade de espécies quer mesófilas e psicrotróficas, quer termófilas, as quais assumem um papel muito importante na indústria de conservas. De um modo geral, são bactérias Gram-positivas, anaeróbias, com ou sem motilidade, e formadoras de esporos termorresistentes. As fontes primárias de Clostridium são o solo e a água, podendo ser particularmente isolados de sedimentos marinhos. Os agentes patogénicos mais relevantes são C. botulinum e C. perfringens; outras espécies são importantes na deterioração de alimentos, tais como C. tyrobutyricum, C. saccharolyticum e C. laramie (García & Heredia, 2009; Ray, 2005).

7 Segundo a EFSA (2014), os surtos relacionados com Clostridium botulinum e Clostridium perfringens representaram 3,2% do total de ocorrências em 2012; carne de bovino e de porco foram os alimentos frequentemente associados. Por outro lado, em estabelecimentos de restauração coletiva, como refeitórios de empresas e escolas, hotéis e diversos serviços de catering, ocorreu a quase totalidade dos casos. Fatores como tempo e temperatura de conservação abusivos, contaminação cruzada e ingredientes crus contaminados foram os principais responsáveis por estes surtos.

.3.1 Clostridium perfringens

C. perfringens está normalmente disperso no meio ambiente, e os esporos deste microrganismo são bastante persistentes no solo, sedimentos e principalmente em áreas poluídas por matéria fecal, estando assim presentes no intestino de animais e de indivíduos adultos saudáveis (Al-Khaldi, 2012). Esta distribuição contribui para uma frequente ocorrência de surtos de intoxicação alimentar.

Esta bactéria produz uma série de toxinas e, baseado na sua capacidade de produção das toxinas alfa, beta, épsilon e iota, consideradas as mais letais, as estirpes de C. perfringens são classificadas em cinco tipos, de A a E. A maioria destas toxinas apresenta atividade no trato gastrointestinal, já que ocorre esporulação no intestino quando doses elevadas (>106) de células vegetativas são ingeridas através de alimentos contaminados. Mas apenas os tipos A e C foram associados a doenças, mais ou menos graves, de origem alimentar (Juneja, Novak, & Labbe, 2010). É um microrganismo que rapidamente recupera ciclos logarítmicos, e facilmente tolera várias condições adversas que, por vezes, favorecem até a sua sobrevivência em alimentos insuficientemente confecionados, inadequadamente armazenados ou com arrefecimento impróprio (McClane, Robertson, & Li, 2013).

Peixe e produtos afins não estão vulgarmente associados a Clostridium perfringens. Porém, a sua ocorrência não pode ser descartada, e, por isso, devem ser adotadas boas práticas de higiene assim como estabelecidas temperaturas de conservação entre 0 e 10 °C. Uma refrigeração apropriada do pescado cru, eventualmente contaminado com esporos ou células viáveis, não favorecerá a multiplicação deste microrganismo patogénico (Juneja et al., 2010).

8 .4 Escherichia coli

E. coli é uma bactéria Gram-negativa, anaeróbia facultativa, e comensal do trato gastrointestinal do Homem e outros animais de sangue quente. Caracteriza-se por ser inofensiva e benéfica, prevenindo a colonização de microrganismos patogénicos indesejáveis ao bem-estar do indivíduo. Por outro lado, existem estirpes patogénicas cujos atributos de virulência lhes permitem induzir infeções graves, desde gastroenterites, infeções urinárias ou meningite, tanto no Homem como em animais (Meng, LeJeune, Zhao, & Doyle, 2013). E. coli enteropatogénica, E. coli enterotoxigénica, E. coli enteroagregativa e E. coli enterohemorrágica são as estirpes patogénicas responsáveis por diversos surtos de toxinfecção alimentar (EFSA, 2014; Feng, 2012).

A transmissão de E. coli ocorre principalmente através de alimentos e água contaminados, e também pelo contacto direto com indivíduos ou animais infetados. E. coli é considerada um microrganismo indicador de contaminação fecal, e, em determinadas circunstâncias, da presença de microrganismos patogénicos entéricos (Baylis, Uyttendaele, Joosten, & Davies, 2011). Quando presente em alimentos crus, de origem animal ou vegetal, evidencia contaminação fecal direta devido a más práticas de higiene de manipuladores, mas também por condições sanitárias negligentes de instalações e utensílios (Ray, 2005).

.5 Bacillus cereus

Bacillus cereus é um microrganismo Gram-positivo, aeróbio facultativo e formador de esporos, que se caracteriza pela elevada resistência a condições adversas, e pelo caráter ubiquitário. Os produtos de origem vegetal como arroz, e outros alimentos ricos em amido e proteína, estão especialmente associados a este microrganismo patogénico (Bottone, 2010).

Segundo a EFSA (2014), 4,8% dos surtos reportados envolveram toxinas de Bacillus cereus. De facto, este agente patogénico é responsável pelas síndromes diarreica e emética que resultam da ingestão de toxinas formadas no alimento como consequência do controlo inapropriado da temperatura. Por exemplo, a germinação de esporos em arroz cozido pode ocorrer entre 5 e 50 °C, e a produção da toxina emética entre 25 e 30 °C (Griffiths, 2010). Os produtos alimentares frequentemente associados a B. cereus são alimentos cozinhados ou produtos que contenham ingredientes confecionados.

9 O controlo de procedimentos de arrefecimento e das temperaturas de refrigeração, bem como a separação entre alimentos crus e alimentos confecionados, são as principais medidas para a redução de B. cereus (Bennet, 2012).

.6 Listeria monocytogenes

Listeria spp. é um género ubiquitário em meios agrícolas, particularmente em reservatórios como solo, forragens, matérias fecais e água; meios aquáticos, marinhos ou de aquacultura, e ambientes de diversas indústrias alimentares. O controlo de L. monocytogenes em ambientes agroindustriais revela-se um grande desafio.

Por um lado, a aptidão de Listeria monocytogenes para formar biofilmes favorece a sua sobrevivência e permanência durante longos períodos de tempo em inúmeras superfícies, quer de aço inoxidável, vidro, plástico ou borracha, que, em geral, fazem parte das infraestruturas de qualquer empresa do setor alimentar, e que, em particular, contactam diretamente com os alimentos (Ryser & Buchanan, 2013).

Por outro lado, Listeria monocytogenes é um microrganismo psicrotrófico, cuja temperatura ótima média de multiplicação é de 1,7 °C (Jemmi & Stephan, 2006). Com isto, alimentos crus e alimentos RTE confecionados são veículos de alto risco para a ocorrência de doença já que estão normalmente refrigerados e oferecem condições à multiplicação de L. monocytogenes, especialmente se o tempo de prateleira em refrigeração for elevado.

A listeriose é uma doença de origem alimentar bastante preocupante devido à sua severidade, ao longo período de incubação e à elevada taxa de mortalidade. Em 2012, a EFSA (2014) registou o maior número de óbitos desde 2006; os alimentos RTE à base de peixe e outros produtos apresentaram a maior percentagem de incumprimento face ao critério microbiológico estabelecido pelo Regulamento (CE) n.º 1441/2007 da Comissão de 5 de dezembro que altera o Regulamento (CE) n.º 2073/2005 da Comissão. L. monocytogenes pode contaminar o músculo do peixe se existir contacto com o conteúdo intestinal durante a evisceração, ou por contaminação cruzada através de superfícies e equipamentos contaminados (Jami et al., 2014).

É ainda de salientar a importância das boas práticas de higiene adotadas pelos manipuladores visto que indivíduos saudáveis podem ser portadores assintomáticos de Listeria monocytogenes.

10 .7 Staphylococcus spp.

Staphylococcus spp., seja S. aureus, outras espécies coagulase-positivas ou ainda espécies coagulase-negativas, fazem parte da microbiota natural da pele e mucosas do Homem, sendo a sua interação frequentemente caracterizada como inofensiva. Contudo, este cenário pode tornar-se prejudicial, visto que indivíduos saudáveis representam uma fonte importante na disseminação de Staphylococcus (Seo & Bohach, 2013).

Staphylococcus aureus caracteriza-se por diversos fatores de virulência que o destacam como microrganismo patogénico, particularmente pela capacidade em formar enterotoxinas responsáveis por diversos surtos de intoxicação alimentar (CDC, 2014; EFSA, 2014; Hennekinne, De Buyser, & Dragacci, 2012). Ainda, outras espécies, tanto coagulase-positivas como coagulase-negativas têm vindo a ser identificadas como microrganismos oportunistas e também responsáveis por diversas infeções (Piette & Verschraegen, 2009).

Staphylococcus aureus e outros Staphylococcus são diretamente introduzidos em alimentos, equipamentos ou utensílios principalmente devido a más práticas de higiene adotadas por manipuladores, ou também por contaminações cruzadas (Nornanno et al., 2005; Sospedra, Mañes, & Soriano, 2012).

I.2.2.1.2. Microbiota deteriorativa

A deterioração microbiológica será dependente das características intrínsecas do pescado cru, mas principalmente das condições extrínsecas oferecidas a este produto tão perecível que poderão potenciar o maior ou menor crescimento de bactérias responsáveis por processos deteriorativos (Gram & Dalgaard, 2002).

.1 Enterobacteriaceae

A família Enterobacteriaceae engloba uma vasta gama de bactérias Gram-negativas, não formadoras de esporos, anaeróbias facultativas, e que produzem ácido e gás da fermentação de D-glucose. A maioria das espécies é mesófila e multiplica-se entre 15 e 40 °C, mas diversas espécies psicrotróficas e termotolerantes fazem também parte desta família (Baylis et al., 2011).

11 A sua presença em pescado cru é um excelente indicador das condições higio-sanitárias de superfícies, equipamentos e utensílios que contactem diretamente com o produto, mas representa também um indício da presença de bactérias patogénicas (Ray, 2005). Por outro lado, Enterobacteriaceae psicrotolerantes produzem off-flavours e off-odours particulares, consequência da degradação enzimática de proteínas e lípidos, produção de componentes voláteis e formação de gás, associados à deterioração de pescado fresco (Gram & Dalgaard, 2002). Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Klebsiella e Hafnia são exemplos de Enterobacteriaceae deteriorativas capazes de se multiplicar a temperaturas de refrigeração (Lindberg, Ljungh, Ahrné, Löfdahl, & Molin, 1998).

.2 Pseudomonas spp.

O género Pseudomonas engloba uma série de espécies capazes de sobreviver sob diversas condições ambientais e são, por isso, ubiquitárias em vários ecossistemas, podendo contaminar alimentos através de várias vias. Por outro lado, determinadas espécies são patogénicas oportunistas e estão associadas a infeções em indivíduos imunodeprimidos; as espécies P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida estão entre as mais importantes (Moore et al., 2006). Mas, de um modo geral, Pseudomonas spp. destaca-se pela sua versatilidade em metabolizar um grande número de substratos e, principalmente, pelo seu papel na deterioração de alimentos de origem animal devido ao elevado conteúdo em água e pH natural do produto (Huis in’t Veld, 1996).

Em particular, Pseudomonas spp. é predominante na deterioração de peixe fresco, refrigerado até 5 °C sob condições de aerobiose. A metabolização da fração de azoto não-proteico, e posterior formação de NH3, aminas biogénicas e ácidos gordos voláteis, resultará em off-flavours e off-odours responsáveis pela perda de qualidade do pescado e, consequentemente, por perdas económicas consideráveis (Ray, 2005).

12 .3 Bactérias produtoras de H2S

Uma das características proeminentes deste grupo de bactérias, Gram-negativas e psicrotróficas, é a formação de H2S a partir de tiossulfato. As bactérias produtoras de H2S constituem uma pequena fração da microbiota inicial do pescado fresco, mas rapidamente se multiplicam sob temperaturas de refrigeração, e a sua proliferação aumenta gradualmente ao longo do tempo (Vogel, Venkateswaran, Satomi, & Gram, 2005). Shewanella putrefaciens e Shewanella baltica são, em peixes marinhos acondicionados em gelo ou a temperaturas entre 0 e 2 °C, os microrganismos deteriorativos por excelência, principalmente pela redução de TMAO a TMA (Galaviz-Silva et al., 2009).

.4 Bactérias do Ácido Láctico

Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Carnobacterium, entre outros géneros, caracterizam-se pela produção de ácido láctico derivado da fermentação de açúcares. Em refrigeração, a sua multiplicação e atividade são superados pelas bactérias S. putrefaciens, Photobacterium phosphoreum e Pseudomonas spp.. Em atmosferas modificadas, as bactérias do ácido láctico heterofermentativas predominam e são responsáveis pela produção de H2S e NH3, ácidos orgânicos e CO2, resultando em off-flavours e off-odours característicos (Françoise, 2010).

.5 Bolores e Leveduras

Os fungos abrangem um número extenso de organismos encontrados numa grande variedade de produtos alimentares de origem animal e vegetal, e que possuem características bastante versáteis quanto à utilização de substratos, desde fontes de carbono e azoto, ácidos orgânicos, proteínas e vitaminas. Por sua vez, são também bastante resistentes a condições adversas tais como pH ácido, baixa aw e temperaturas até 10 °C (Ray, 2005).

A deterioração por bolores e leveduras pode ser facilmente visível na superfície do produto, ou detetada pelo desenvolvimento de odores desagradáveis devido à produção de ácidos, gases ou álcoois. Ainda, apesar de raras as infeções associadas a alimentos contaminados, algumas leveduras podem desencadear reações alérgicas, e alguns bolores, durante o seu crescimento, podem formar micotoxinas, metabolitos secundários tóxicos produzidos principalmente por Aspergillus, Penicillium e Fusarium _{(Huis in’t Veld, 1996).}

13 I.2.2.2. Parasitas

Estima-se que 500 milhões de indivíduos estejam infetados por parasitas, sendo a quase totalidade dessas infeções resultante da ingestão de peixe cru ou insuficientemente confecionado (dos Santos & Howgate, 2011).

A incidência de zoonoses parasitárias tem vindo a aumentar em todo o mundo, não apenas em zonas endémicas. O aumento do consumo de sushi e sashimi, entre outros pratos tradicionais de peixe cru ou marinado, e o crescimento e expansão dos mercados piscícolas, podem ser apontados como as principais causas de transmissão de doenças parasitárias de origem alimentar (Keiser & Utzinger, 2009). A presença de larvas viáveis em peixes resulta não só em problemas e preocupações de saúde pública, mas também em repercussões económicas. Espécies como salmão, bacalhau, pescada e atum são veículos de larvas de parasitas e, ao mesmo tempo, destacam-se pelo seu valor comercial em áreas de pesca por todo o mundo (Viegas, 2009).

Os parasitas apresentam ciclos de vida, por vezes, bastante complexos, mas cujas características e hospedeiros estão descritos e identificados. O Homem será apenas um hospedeiro acidental quando ingere peixe infetado (Hayung, 2013). Anisakis simplex e Pseudoterranova decipiens são as espécies mais vulgarmente associadas a infeções parasitárias no Homem, sendo A. simplex a espécie patogénica de maior prevalência (Audicana, Ansotegui, de Corres, & Kennedy, 2002; dos Santos & Howgate, 2011).

Mundialmente estão reportados cerca de 20 000 casos de anisaquiose dos quais mais de 90% ocorreram no Japão, principalmente em zonas costeiras (Broglia & Kapel, 2011). Na União Europeia, entre 2009 e 2013, foram reportadas mais de 200 ocorrências, maioritariamente devido a peixe parasitado por Anisakis _{spp. (D’amico et al., 2014). Em} Portugal, não existem casos clínicos reportados, mas foram registadas várias ocorrências de larvas de Anisakis spp. e Pseudoterranova spp. em diversas espécies de peixes capturados ao longo da costa; bacalhau (Ramos, 2011), carapau (Cruz, Vaz, & Saraiva, 2005; Silva & Eiras, 2003), verdinho (Cruz, Barbosa, & Saraiva, 2007; Silva & Eiras, 2003), linguado e sardinha (Borges, 2008; Silva & Eiras, 2003), estão entre as espécies estudadas.

Diphyllobothrium latum representa também uma importância considerável na transmissão de doenças de origem parasitária como consequência do consumo de peixe cru ou marinado; trata-se do céstode responsável pela maioria dos casos de infeção reportados. As infeções pelo parasita Diphyllobothrium latum são muitas vezes assintomáticas. Em casos

14 mais graves, anemia perniciosa é uma manifestação comum da doença difilobotríase devido à capacidade do parasita na dissociação do complexo vitamina B12 (Butt et al., 2004; Robertson, Sprong, Ortega, Giessen, & Fayer, 2014). As larvas deste parasita podem ser encontradas em diversas espécies de peixe, como robalo, truta e vários géneros de peixe branco (Hayung, 2013). Porém, D. latum tem vindo a ser particularmente associado a salmão; múltiplos surtos de difilobotríase foram reportados no Brasil, ocasionados pelo consumo de salmão cru (Cabello, 2007). No Japão, o salmão é a espécie mais servida como sushi e sashimi e, consequentemente, mais de 100 casos são registados anualmente (Nawa, Hatz, & Blum, 2005; Scholz, Garcia, Kuchta, & Wicht, 2009).

Outros parasitas, não menos importantes, estão diretamente associados a várias espécies de peixes. Todavia, casos de infeção envolvendo Gnatostoma spp., Capillaria philippinensis, Clonorchis sinensis e Opitorchis viverrini estão, na sua quase totalidade, endemicamente distribuídos pelo continente asiático (Dorny, Praet, Deckers, & Gabriel, 2009; Hayung, 2013; Nawa et al., 2005).

A prevenção de zoonoses parasitárias, com enfoque para o consumo de peixe cru, é facilmente garantida pelo cumprimento da legislação em vigor. O operador económico tem que garantir a eliminação de parasitas viáveis no pescado que será consumido cru através dos tratamentos de congelação referidos no Regulamento (UE) n.º 1276/2011 da Comissão de 8 de dezembro. São ainda necessárias ações de sensibilização junto do consumidor, em geral _– pela maior tendência na preparação doméstica de sushi e sashimi _{–, e daqueles responsáveis} pelas cozinhas de restaurantes japoneses, cujos conhecimentos na deteção de parasitas devem ser particularmente subtis.

15 I.2.2.3. Vírus

De acordo com o último relatório divulgado pela EFSA (2014), o número de surtos de doenças de origem alimentar causadas por vírus aumentou quase 45% entre 2011 e 2012; estima-se que o número de casos documentados continue a aumentar.

Entre os diversos grupos de vírus, aqueles que podem ser transmitidos pela via alimentar incluem os enterovírus, vírus da hepatite A e E, astrovírus, rotavírus e norovírus (NoV) (Jaykus, D’Souza, & Moe, 2013). De uma perspetiva epidemiológica, o vírus da hepatite A e NoV são considerados os mais relevantes.

Os moluscos bivalves representam o principal veículo de alguns vírus entéricos através da via alimentar; surtos de doenças desta origem são conhecidos há décadas, e têm vindo a ser documentados com o passar dos anos. Roos (1956) reportou, na Suécia, o primeiro caso de transmissão de hepatite A através do consumo de moluscos bivalves, e, em 1962, Mason e McLean comunicaram o mesmo surto, nos Estados Unidos (Gerba, 2006). Entre 2003 e 2004, três casos distintos de NoV foram reportados na Austrália associados ao consumo de ostras importadas de um único ponto estuarino localizado no Japão (Webby et al., 2007). Em 2010, 334 casos simultâneos de NoV, associados ao consumo de ostras cruas, foram reportados em cinco países europeus (Westrell et al., 2010).

Os moluscos bivalves alimentam-se por filtração, sendo reservatórios mais ou menos prováveis de vírus entéricos. Qualquer zona de produção, cuja água esteja contaminada com matéria fecal, conduz à bioacumulação de vírus na carne e vísceras dos moluscos, devido à estabilidade e persistência destes organismos nos cursos de água (Lees, 2000). O primeiro estudo realizado em Portugal, o qual incidiu na pesquisa de vírus entéricos em diversas espécies de moluscos, detetou a presença de NoV, enterovírus e do vírus da hepatite A em percentagens significativas de lotes provenientes de vários centros de recolha (Mesquita et al., 2011). Com isto, torna-se mais e mais importante a reunião de esforços entre as várias entidades competentes, de países importadores e exportadores, no controlo sanitário desde as zonas de produção até à expedição de moluscos bivalves.

Os produtos frescos e produtos RTE são também propensos a contaminações provocadas por vírus entéricos, e potenciais veículos para a sua transmissão. Por um lado, porque, na generalidade, são consumidos crus, ligeiramente confecionados ou sem qualquer aquecimento posterior; por outro, devido ao contacto mais ou menos direto entre esses produtos e água ou gelo contaminados, manipuladores infetados, e ainda superfícies ou

16 utensílios incorretamente higienizados (Greening, 2006). As más práticas de higiene adotadas pelos manipuladores são, sem dúvida, a principal causa de disseminação de doenças de origem alimentar causadas por vírus (Food and Agriculture Organization, FAO, & World Health Organization, WHO, 2008; Greening, 2006; Le Guyader et al., 2004).

A transmissão do vírus da hepatite A ocorre através da via fecal-oral, quer por contacto direto com um indivíduo infetado, quer pela ingestão de água ou alimentos contaminados (Fiore, 2004). A maioria dos casos relacionados com alimentos RTE, ocasionados pelo vírus da hepatite A, ocorre devido a um único manipulador infetado; vários surtos foram reportados, tendo o grosso ocorrido em contexto escolar ou serviços de catering (Greening, 2006; Jaykus et al., 2013), enfatizando práticas de higiene inadequadas, ou mesmo ausentes, como o fator de risco na transmissão deste vírus.

Segundo o CDC, pelo menos 50% dos surtos de origem alimentar provocados por NoV devem-se também a manipuladores infetados (Widdowson et al., 2005), ou com recente histórico de gastroenterite _{– infeções por NoV são a causa maioritária de gastroenterite na} União Europeia (EFSA, 2011). Diversos surtos têm sido reportados, envolvendo produtos RTE contaminados por NoV através de manipuladores portadores deste vírus; ressalta-se ainda, na maioria dos estudos, a importância daqueles que não apresentam sintomas de infeção (de Wit et al., 2007; Zainazor et al., 2010).

Apesar da baixa prevalência de doenças de origem alimentar diretamente associadas a vírus, não devem ser descartadas estratégias de prevenção contra este perigo biológico; diversas entidades criaram diretrizes para o seu controlo, com enfoque particular dos vírus da hepatite A e NoV (Codex Alimentarius Commission, CAC, 2012).

Os alimentos RTE, onde se incluem as refeições de sashimi, adquirem um destaque óbvio no âmbito desta temática. Por isso, e como conclusão, a adesão a rigorosas práticas de higiene na manipulação e preparação deste tipo de alimentos é um ponto crítico para o controlo da contaminação por vírus.

17 I.2.3. Critérios microbiológicos

O Regulamento (CE) n.º 178/2002 e o pacote legislativo em matéria de higiene (Regulamentos (CE) n.os _{852, 853 e 854) estabelecem que os géneros alimentícios devem ser} seguros a fim de garantir a proteção da saúde pública. Assim, os operadores de qualquer empresa do setor alimentar devem implementar um sistema baseado nos princípios HACCP que garantam a segurança dos produtos colocados no mercado, bem como respeitar os critérios de higiene e de segurança de processos e procedimentos aplicados às fases de produção, manuseamento, armazenamento e/ou distribuição.

Com isto, e conforme o disposto no Regulamento (CE) n.º 2073/2005 da Comissão, alterado pelo Regulamento (CE) n.º 1441/2007, os géneros alimentícios não devem conter microrganismos, nem as suas toxinas ou metabolitos, em quantidades que representem qualquer risco para a saúde do consumidor.

Desde a década de 80 que diversas entidades internacionais têm construído princípios e recomendações para a definição de critérios microbiológicos para alimentos. É portanto relevante a distinção entre os documentos que se referem a estes critérios (Cordier, 2013):

· Padrão microbiológico – trata-se de um critério obrigatório, estabelecido por uma norma ou lei, tal como o Regulamento (CE) n.º 2073/2005;

· Especificações microbiológicas – representam a base de acordos entre duas partes, e que garantem a qualidade e segurança exigida pelo produto transacionado, bem como a confiança e transparência entre trocas comerciais;

· Diretrizes microbiológicas – caracterizam-se pela sua orientação na avaliação da qualidade microbiológica de produtos alimentares, tal como na elucidação do que é esperado relativamente a determinado microrganismo, ou grupo de microrganismos, (microrganismos patogénicos, de alteração e indicadores) de acordo com o produto, e/ou suas fases de produção, armazenamento e distribuição.

A legislação comunitária refere apenas alguns critérios de segurança de produtos da pesca, moluscos bivalves e crustáceos vivos, e produtos RTE, estabelecendo limites relativos ao teor de histamina, à presença de Salmonella e E. coli, e de Listeria monocytogenes, respetivamente, descritos no Regulamento (CE) n.º 1441/2007 da Comissão de 5 de dezembro que altera o Regulamento (CE) n.º 2073/2005 da Comissão.

18 No entanto, é omissa quanto à grande maioria dos critérios microbiológicos relevantes em vários produtos RTE, e por isso as diretrizes microbiológicas propostas por Gilbert et al. (2000) e Santos, Correia, Cunha, Saraiva, & Novais (2005), devidamente adaptadas (quadro 1), serão o guia para a interpretação, e posterior discussão, da qualidade microbiológica das refeições de sashimi.

Quadro 1 – Diretrizes da qualidade microbiológica das refeições de sashimi.

Qualidade Microbiológica (UFC/g quando não indicado) Critério Satisfatório Aceitável Não Satisfatório

Inaceitável / Potencialmente perigoso Fonte MICRORGANISMOS INDICADORES Aeróbios a 30 °C ≤103 _>103_≤105 _>105 _{NA a} Bolores ≤10 >10 ≤102 _>102 _{# a} Leveduras ≤102 _>102_≤104 _>104 _{NA a} Enterobacteriaceae <100 >100 <104 ≥104 NA b Staphylococcus aureus <20 >20 <100 >100 <104 ≥104 b Escherichia coli <20 >20 <100 ≥100 NA b Listeria spp. <20 >20 <100 ≥100 NA b MICRORGANISMOS PATOGÉNICOS Staphylococcus coagulase-positiva <10 2 _{NA ≥10}2_≤104 _>104 _a Bacillus cereus ≥102 >102 ≤103 >103 <105 ≥105 a Clostridium perfringens <10 ≥10 ≤103 >103 <104 ≥104 a Salmonella spp. Ausente em 25g   Presente em 25g a Listeria monocytogenes Ausente em 25g Presente em 25g

<102_#  ≥10

2 _a

Vibrio parahaemolyticus Ausente em 25g   Presente em 25g a Vibrio cholerae Ausente em 25g   Presente em 25g b

a – Santos et al., 2005; b – Gilbert et al., 2000 NA – Não aplicável

19 I.3. Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp.

Alexander Fleming, ao observar que uma ação química do microrganismo Penicillium notatum inibira a multiplicação de Staphylococcus spp., impulsionou vastas descobertas científicas de agentes antimicrobianos que, em conjunto com a penicilina, impediram a disseminação de inúmeras doenças infeciosas. Porém, ao longo de quase 90 anos, a prevalência de resistências a antibióticos tem aumentado mundialmente e, em pleno século XXI, a saúde pública é, a cada dia, colocada em risco devido ao largo espectro de microrganismos patogénicos resistentes a uma longa lista de agentes antimicrobianos.

Os antibióticos são agentes com toxicidade seletiva contra microrganismos invasores externos. O antibiótico ideal é aquele que interfere na função vital da bactéria sem comprometer as células do hospedeiro. Com isto, um antibiótico pode ser classificado de acordo com a sua ação sobre as bactérias; bactericida se inativa e destrói os microrganismos – são exemplos: penicilinas, quinolonas, aminoglicosídeos e cefalosporinas –, ou bacteriostático se controla o desenvolvimento bacteriano ao inibir a sua multiplicação, não permitindo a evolução ao estado infecioso – são exemplos: cloranfenicol, tetraciclinas, trimetropim e macrólidos (Byarugaba, 2010). Por outro lado, os antibióticos têm modos de ação específicos sobre as bactérias desde a inibição da síntese da parede celular, da membrana citoplasmática ou da síntese proteica nos ribossomas, a inibição da replicação do DNA ou da transcrição, até à alteração do metabolismo celular. Dependendo da via de ação do antibiótico, os microrganismos podem facilmente desencadear mecanismos de resistência próprios e garantir a sua sobrevivência (Zhang, McEntire, Newsome, & Wang, 2013).

A resistência a antimicrobianos é, nos últimos anos, um problema de segurança alimentar visto que os alimentos representam um veículo importante na sua transmissão. O uso excessivo e inapropriado de antibióticos na produção animal e vegetal, seja na prevenção de doenças, para promover o crescimento ou aumentar a produtividade, tornará os produtos de origem animal ou vegetal vias diretas na transmissão de microrganismos patogénicos resistentes através do consumo de alimentos ou água contaminados (Zhang et al., 2013).

20 No quadro 2 apresentam-se alguns dados descritos em literatura sobre as resistências de várias espécies Staphylococcus spp. aos agentes antimicrobianos abordados neste trabalho.

Quadro 2 – Resistências de espécies Staphylococcus a agentes antimicrobianos, descritas em pescado e manipuladores de alimentos.

Espécie

Staphylococcus Antibiótico (s) Amostra (s) Autor (es)

S. aureus P, C, TE Mãos de manipuladores Tan et al. (2014) S. aureus SXT, QD, RD Truta Abrahim et al. (2010) S. epidermidis AMC, P, DA, SXT Truta Abrahim et al. (2010) S. epidermidis SXT, QD, CTX, E Instalações e manipuladores Abrahim et al. (2010) S. haemolyticus AMC, P, OX, RD Instalações e manipuladores Abrahim et al. (2010) S. warneri FOX, E, OX, TE Cavala e arenque Regecová et al. (2014) S. pasteuri E, P, OX Arenque Regecová et al. (2014) S. xylosus P, OX, E Produtos RTE Sergelidis et al. (2014) S. saprophyticus P, OX, SXT Produtos RTE Sergelidis et al. (2014) S. aureus P, CIP, C Pescado Vázquez-Sánchez et al. (2012) S. aureus E, CN, OX, TE Sashimi Hammad et al. (2012)

S. pasteuri E, OX, QD, VA Sashimi Hammad et al. (2012) S. haemolyticus CN, TE, CIP Sashimi Hammad et al. (2012)

Legenda: P – Penicilina G; AML – Amoxicilina; AMC – Amoxicilina-ácido clavulânico; KF – Cefalotina; CTX – Cefotaxima; OX – Oxacilina; FOX – Cefoxitina; CIP – Ciprofloxacina; C – Cloranfenicol; VA – Vancomicina; E – Eritromicina; CN – Gentamicina; DA – Clindamicina; LDZ – Linezolide; RD – Rifampicina; QD – Quinupristina-dalfopristina; SXT – Sulfametoxazol-trimetropim; TE – Tetraciclina.

De facto, não só Staphylococcus aureus multirresistentes, mas também outras espécies coagulase-positivas e ainda espécies Staphylococcus coagulase-negativas resistentes a agentes antimicrobianos, têm vindo a ser isoladas em peixe, e mãos de manipuladores, enfatizando a disseminação de microrganismos multirresistentes na comunidade e, consequentemente, nas mais diversas indústrias de alimentos.

21 Staphylococcus aureus meticilina-resistente (MRSA) é um dos principais agentes patogénicos resistentes a antibióticos causadores de infeções ligeiras da pele e tecidos moles, e de infeções invasivas graves associadas aos cuidados de saúde (David & Daum, 2010).

As estirpes MRSA são endémicas nos meios hospitalares e apresentam-se multirresistentes a um largo espectro de antibióticos, tornando limitada a escolha de princípios ativos para o controlo e tratamento de infeções. Com isto, surgem diversos inconvenientes; a eficácia de terapias profiláticas será comprometida, e a probabilidade de transmissão de infeções entre indivíduos torna-se exponencial (Doyle, Loneragan, Scott, & Singer, 2013). Em 2013, apesar das percentagens elevadas, registou-se um balanço positivo face à prevalência de MRSA, que permanecem a prioridade das várias entidades europeias e internacionais (European Centre for Disease Prevention and Control, ECDC, 2013).

CAPÍTULO II

23 CAPÍTULO II. COMPONENTE EXPERIMENTAL

II.1. Introdução e Objetivos

Sushi é o prato tradicional japonês mais conhecido mundialmente. Em Portugal, o interesse por esta tipicidade não é exceção, e, por todo o continente, podem ser encontrados inúmeros restaurantes japoneses. A adesão maciça a esta especialidade oriental está não só associada à novidade, e à implícita curiosidade em adquirir uma experiência de novos sabores, mas também pelos benefícios nutricionais tão bem reconhecidos do pescado.

Porém, surgem diversos aspetos menos favoráveis relacionados com o consumo de pescado cru, que são o ponto fundamental deste trabalho científico, com enfoque central para os perigos microbiológicos fortemente associados a este produto, seja pela sua elevada suscetibilidade à deterioração – ocasionada por fatores intrínsecos muito particulares e que favorecem o desenvolvimento microbiano –, seja devido às condições na manipulação ou temperaturas de conservação da carne de peixe.

A presença de determinados microrganismos é um indicador fundamental na determinação da adoção eficaz de boas práticas de higiene durante a preparação de sashimi. Staphylococcus spp. é um dos géneros indicadores com merecida relevância devido ao conjunto de características patogénicas que lhe conferem excelentes capacidades em causar graves infeções para além do meio hospitalar, e ainda pela evolução exponencial na aquisição de multirresistências face à ação de vários agentes antimicrobianos.

Este trabalho teve como objetivos:

· Caracterizar a microbiota deteriorativa e patogénica de sashimi adquirido em restaurantes japoneses do norte do país;

· Avaliar a qualidade microbiológica das refeições de sashimi;

· Estudar o perfil de suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus coagulase-positiva e coagulase-negativa.

Com isto, pretendeu-se concluir acerca da qualidade microbiológica das refeições de peixe cru, e verificar ainda se o tão apreciado sashimi representa um veículo de microrganismos potencialmente portadores de resistências a agentes antimicrobianos.