UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA CURSO DE BIOMEDICINA
LIDIANE DA SILVA SANTOS
COMPROMETIMENTO TECIDUAL E DISTRIBUIÇÃO DE CISTOS NO ESTRIADO DE CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO Toxoplasma gondii
Natal-RN Novembro de 2019
COMPROMETIMENTO TECIDUAL E DISTRIBUIÇÃO DE CISTOS NO ESTRIADO
DE CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO Toxoplasma gondii
Por
LIDIANE DA SILVA SANTOS
Monografia apresentada à coordenação do curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial a obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Natal-RN Novembro de 2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE BIOMEDICINA
A Monografia COMPROMETIMENTO TECIDUAL E DISTRIBUIÇÃO DE CISTOS NO ESTRIADO DE CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO Toxoplasma gondii
elaborada por LIDIANE DA SILVA SANTOS
e aprovada por todos os membros da banca examinadora foi aceita pelo curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de:
BACHAREL EM BIOMEDICINA
Natal, 22 de novembro de 2019
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________ Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Orientador - Departamento de Microbiologia e Parasitologia/UFRN
_________________________________________ Profa. Dra. Manuela Sales Lima Nascimento
Examinadora interna - Departamento de Microbiologia e Parasitologia/UFRN
_________________________________________ Msc. Ramayana Morais de Medeiros Brito
AGRADECIMENTOS
Primeiramente quero agradecer a Deus, por me conceder a força necessária para que eu pudesse seguir em frente e assim chegar aonde cheguei, obrigada Senhor; À toda minha família que sempre acreditaram em mim, me apoiaram durante toda a graduação e sempre me auxiliaram fazendo o possível por mim, muito obrigada; Às minhas amigas Nayane, Rayane, Malu, Raquel, Fernanda e Karine, por estarem comigo durante esses 4 anos, obrigada por me acolherem quando caí de paraquedas no curso nesse estado, vocês foram muito importantes na minha adaptação, obrigada pelos conselhos, risadas, e todo o carinho que vocês me proporcionaram.
À Ramayana, muito obrigada por sempre me ajudar, por todas as orientações, sua disponibilidade para correção e conselhos, muito obrigada;
Ao meu orientador Professor Valter, obrigada por toda ajuda, orientação, atenção, por ter me permitido fazer parte dessa equipe maravilhosa do seu laboratório, sempre muito gentis e atenciosos, obrigada por me proporcionar tanto conhecimento enquanto sua IC;
Agradeço a todos que acreditaram na minha vitória, muito obrigada.
RESUMO
A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída pelo mundo, causada pelo Toxoplasma gondii, protozoário intracelular obrigatório, capaz de modular a resposta imune e estabelecer uma infecção crônica bem-sucedida, caracterizada pelo desenvolvimento de cistos cerebrais e um quadro neuroinflamatório em resposta à chegada do parasito ao parequema cerebral. O sistema nervoso central é constituído pela medula espinhal e encéfalo. Este por sua vez compreende a região do telencefalo onde estão localizados os núcleos da base, que formará a região do corpo estriado responsável pela regulação da função motora e alguns aspectos do comportamento do indivíduo. Nesse contexto o objetivo desse trabalho foi quantificar o número de cistos teciduais e neurônios no corpo estriado do cérebro de camundongos suscetíveis e resistentes à infecção por T. gondii. Para a realização desse trabalho foram utilizados camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6 infectados com cistos da cepa ME49 e acompanhados durante 30 dias. Após esse período, foi realizada a análise quantitativa de cistos e neurônios presente no estriado do cérebro de camundongos suscetíveis (C57BL/6) e resistentes (Balb/c) a infecção. Os resultados mostraram que camundongos C57BL/6 apresentam maior redução de peso corporal durante o protocolo experimental e uma média de 66 cistos no estriado, sendo um valor 4,4 vezes maior que o apresentado por camundongos Balb/c. Além disso, a linhagem C57BL/6 também apresentou uma redução de células neuronal WFA+ significativamente (p<0,0001) mais elevado que Balb/c. Esses dados apontam para as diferenças entre a colonização do tecido cerebral pelo parasito entre diferentes hospedeiros, além de refletir a ativação imune distinta entre as duas linhagens durante infecção crônica pelo Toxoplasma gondii.
ABSTRACT
Toxoplasmosis is a widespread zoonosis caused by Toxoplasma gondii, an obligate intracellular protozoan, capable of modulating the immune response and establishing a successful chronic infection characterized by the development of brain cysts and a neuroinflammatory condition in response to the parasite's arrival. to the cerebral parequeman. The central nervous system consists of the spinal cord and brain. This in turn comprises the region of the telencephalon where the base nuclei are located, which will form the striatum body region responsible for the regulation of motor function and some aspects of the individual's behavior. In this context, the objective of this work was to quantify the number of tissue cysts and neurons in the striatum brain body of mice susceptible and resistant to T. gondii infection. The Balb/c and C57BL/6 mice infected with ME49 strain cysts were followed for 30 days. After this period, a quantitative analysis of cysts and neurons present in the striatum of the brain of susceptible (C57BL/6) and infection resistant (Balb/c) mice was performed. The results showed that C57BL/6 mice showed greater body weight reduction during the experimental protocol and an average of 66 striatal cysts, a value 4.4 times higher than that presented by Balb/c mice. In addition, the C57BL/6 strain also showed a higher WFA + neuronal cell reduction than Balb/c. These data point to the differences between parasite colonization of brain tissue between different hosts and reflect the distinct immune activation between the two strains during chronic Toxoplasma gondii infection.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS --- VIII LISTA DE ABREVIAÇÕES --- IX
1. INTRODUÇÃO--- 11
1.1 Toxoplasmose e o Toxoplasma gondii --- 11
1.2 Resposta imune à infecção pelo Toxoplasma gondii --- 17
1.3 Sistema nervoso central e Toxoplasma gondii --- 19
2. OBJETIVO --- 25
2.1 Objetivo geral --- 25
2.2 Objetivos específicos --- 25
3. Metodologia --- 26
3.1 Animais experimentais--- 26
3.2 Manutenção da cepa de T.gondii --- 26
3.3 Obtenção e processamento do tecido cerebral --- 26
3.4 Imunohistoquímica para Wisteria floribunda aglutinina (WFA) --- 27
3.5 Contagem de células positivas para WFA+ e cistos tissulares no estriado --- 28
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA --- 28
4. RESULTADOS --- 29
4.1 Evolução da infecção por Toxoplasma gondii em camundongos Balb/c e C57BL/6--- 29
4.2 Quantificação do número de cistos no corpo estriado de camundongos Balb/c e C57Bl/6 --- 29
4.3 Quantificação das células neuronais WFA+ no estriado de camundongos Balb/c e C57BL/6 --- 31
5. DISCUSSÃO --- 34
6. CONCLUSÃO --- 37
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Taquizoítos de Toxoplasma gondii --- 13
Figura 2: Bradizoítos de T. gondii --- 13
Figura 3: Oocistos de T. gondii --- 14
Figura4: Ciclo biológico do T. gondii --- 15
Figura 5: Mecanismo de invasão celular ---17
Figura 6: Imagem evidenciando a secção coronal do cérebro de camundongos: --- 21
Figura 7: Mecanismos propostos pelos quais o T. gondii atravessa a Barreira hemato - encefálica --- 22
Figura 8: . Esquema ilustrando a ordem das secções utilizadas para contagem de cistos e infiltrado inflamatório: --- 28
Figura 9: Média de perda de peso corporal durante 30 dias de infecção --- 29
Figura10: Imagens evidenciando o corpo estriado do cérebro de camundongos Balb/c e C57BL/6 após 30 dias de infecção com T. gondii ---30
Figura 11: Comparação entre a distribuição de cistos presentes na região do corpo estriado de camundongos da linhagem Balb/c e C57BL/6 --- --31
Figura 12: Análise da redução de células neuronal positiva para WFA+ no corpo estriado de camundongos da linhagem Balb/c e C57BL/6 ---32
Figura 13: Camundongos Balb/c apresentam maior número de célula neuronal WFA+ no estriado quando comparado aos camundongos C57BL/6---33
LISTA DE ABREVIAÇÕES
APCs Células apresentadoras de antígeno CCL1 Quimiocinas I-309
CCL4 Quimiocinas MIP- Proteína inflamatória de macrófago- 1β CCL8 Quimiocinas MCP- Proteína quimiotáxica para monócitos- 2 CCR5 Receptor da quimiocinas CCL4
CD Célula dendrítica CXCL10 Quimiocina IP-10
CXCR3 Receptor da quimiocinas CXCL9/ CXCL10/ CXCL11 ERN Espécie reativas de nitrogênio
EROS Espécie reativas de oxigênio GPI Glicosilfosfatidilinositol
GRA Proteínas dos grânulos densos ICAM-1 Molécula de adesão intercelular 1 IFN-y Interferon gama
IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IL-10 Interleucina 10 IL-12 Interleucina 12
iNOS Óxido nítrico sintase induzível IRG GTPase relacionada a imunidade JM Junção motora
LFA-1 Antígeno 1 associado à função linfocitária MHC Complexo principal de histocompatibilidade MIC Proteínas de micronemas
MyD88 Proteína de diferenciação primaria mielóide 88 NF-κB Fator nuclear kappa B
NK Células natural killer ON Óxido nítrico
PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos RON/ROP Proteínas das roptrias
RRP Receptores de reconhecimento padrão SAG Antígenos de superfícies ancorados em GPI SNC Sistema nervoso central
STAT Fator de transdução e ativação da transcrição T CD4+ Linfócitos T auxiliares
T CD8+ Linfócitos T citotóxicos
TGF-β Fator de transformação do crescimento beta TgPRF Proteínas tipo profilina do T. gondii
Th1 célula T CD4+ da subpopulação helper tipo 1 Th2 célula T CD4+ da subpopulação helper tipo 2 TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
Treg Células T reguladora TRL Receptores do tipo Toll
VCAM-1 Molécula de adesão vascular 1 VLA-1 Antígeno tardio – 1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Toxoplasmose e o Toxoplasma gondii
A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, pertencente ao grupo Alveolata (ADL et al., 2012) sendo um parasito intracelular obrigatório, capaz de invadir qualquer célula nucleada de várias espécies de animais homeotérmicos (SU et al., 2012; SWAPNA; PARKINSON, 2017). Essa zoonose possui ampla distribuição mundial, tendo sido registrada em todos os continentes e em todos os climas (HALONEN; WEISS, 2014). Possui uma taxa de incidência que varia de 30 a 50% entre a população mundial, e uma soroprevalência que pode chegar até 80% de acordo com a região (PAPPAS; ROUSSOS; FALAGAS, 2009; MUNOZ-ZANZI, 2010; IDDAWELA; VITHANA; RATNAYAKE, 2017).
O T. gondii é um parasito capaz de se disseminar por vários tecidos do hospedeiro, onde promove o estabelecimento de uma infecção geralmente assintomática em pacientes imunocompetentes (MONTOYA; ROSSO, 2005). Nesses indivíduos, a infecção por T. gondii não produz um quadro de evolução grave, havendo o desenvolvimento de cistos teciduais com o desenvolvimento de uma infecção crônica (SOUZA, 2013). Porém, quando a infecção se dá de forma sintomática, a manifestação clínica mais comum é a linfadenopatia cervical, ocorrendo entre 10 a 20% dos casos (MONTOYA; ROSSO, 2005). A toxoplasmose representa um importante problema de saúde pública entre as gestantes, podendo levar ao comprometimento do desenvolvimento fetal, abortos ou natimortos. Em indivíduos imunocomprometidos, como pacientes com HIV/AIDS e pacientes transplantados, a infecção ou a sua reativação pode acarretar o desenvolvimento de quadros de encefalomielites, muitas vezes com prognóstico de letalidade (HALONEN; WEISS, 2014).
Espécie única do gênero, T. gondii é classificado em 3 linhagens clonais distintas (tipo I, II e III) bem caracterizadas de acordo com seu padrão de virulência. Possuem diferenças genotípicas que contribuem para fatores de virulência, capacidade de formar cistos e cinética de replicação (SU et al., 2003; SIBLEY et al., 2009). A linhagem do tipo I (RH) é altamente virulenta, com rápida disseminação e crescimento, alcançando uma alta carga parasitária mesmo com um inoculo inicial baixo, não
possuindo a capacidade de formar cistos e estabelecer uma infecção crônica (SULLIVAN; JEFFERS, 2012; KIM; WEISS, 2013). A linhagem tipo II, representada pela cepa ME-49, possui virulência intermediária, baixa taxa de replicação e capacidade de formação de cistos in vivo e pré-cistos in vitro. É a linhagem frequentemente presente em casos clínicos de toxoplasmose mais branda e assintomática, bem como em casos de infecções congênitas na América do Norte (GUIMARÃES et al., 2008; DE MUNO et al.,2014). A linhagem tipo III é a menos virulenta e de baixo crescimento, possuindo a capacidade de formar cistos, porém não se tem relatos de sua associação com casos de toxoplasmose em humanos (SULLIVAM; JEFFERS, 2012).
Existem ainda as cepas denominadas atípicas, caracterizadas por apresentarem genótipos distintos das clonais, e que são oriundas do cruzamento de duas cepas distintas durante o ciclo sexuado do parasito, dando origem a esporozoítos com perfil genético diferenciado. Tais cepas diferem em virulência capacidade migratória no hospedeiro e prevalência (FLEGR et al., 2014).
O T. gondii possui três formas infectantes: taquizoítos; cistos com bradizoítos e oocistos contendo esporozoítos. A fase aguda da toxoplasmose é descrita pela intensa multiplicação dos taquizoítos. Os taquizoítos (Figura 1) constituem a forma infectante de rápida proliferação celular e de menor resistência, sendo destruídos em condições de desidratação e variações osmóticas. Além disso, são capazes de invadir as células e se multiplicar dentro de um vacúolo parasitóforos. (DUBEY, 1998; SOUZA, 2013). Os bradizoítos (Figura 2) representam a forma de resistência do parasito, mantidos dentro de cistos teciduais presentes na fase crônica da doença e transmitidos através da ingestão de carne crua ou malcozida. Esses cistos são encontrados principalmente em tecidos musculares e no cérebro, onde ficam por tempo indeterminado no hospedeiro. Os esporozoítos são as formas presentes nos oocistos (Figura 3), que se desenvolvem no intestino de felinos e são eliminados em suas fezes. No oocisto, os esporozoítos podem resistir à digestão gástrica e assim chegar ao intestino delgado, onde ocorre a penetração ativa do T. gondii no epitélio intestinal (SOUZA, 2013).
Figura 1: Taquizoítos de Toxoplasma gondii: (A) Representação esquemática do taquizoíto, evidenciando suas principais organelas e sua distribuição no interior do parasito. (B) Corte longitudinal com enfoque para o núcleo (N), conóide (C), róptrias (R), apicloplasto (A), complexo de golgi (CG), grânulos densos (g) e micronemas (seta) (SOUZA et al., 2010).
Figura 2: Bradizoitos de Toxoplasma gondii: (A) Cistos teciduais, cada um com núcleo terminal (seta) e parede do cisto (ponta da seta). (B) Três cistos teciduais com paredes bem definidas (ponta das setas). (C) Secção de cisto intracelular, evidenciando a fina parede do cisto tecidual (seta) e o núcleo da célula hospedeira (ponta da seta) (DUBEY, 2004).
Figura 3: Oocistos de Toxoplasma gondii: (A) Oocisto não esporulado com esporoblasto único. (B) Oocisto esporulado com dois esporocistos com quatro esporozoítos cada (setas) (DUBEY et al, 1998).
O Toxoplasma possui um ciclo de vida heteroxeno facultativo (Figura 4), com uma fase gametogônica e esporogônica ocorrendo apenas no hospedeiro definitivo (gatos e outros felideos) e uma fase esquizogônica que ocorre no hospedeiro intermediário (aves e mamíferos, incluindo humanos) (SOUZA,2013).
A infecção do hospedeiro definitivo inicia-se a partir da ingestão de oocistos infectantes e/ou cistos presentes nos tecidos de hospedeiros intermediários (roedores e aves). Após ingestão, os parasitos invadem os enterócitos, onde se multiplicam e passam pelo processo de esquizogonia (merogonia) liberando esquizontes que são capazes de invadir outras células. Após a invasão celular, há a diferenciação de macro e microgametas, formas responsáveis por originar o zigoto e, posteriormente, pela formação dos oocistos. Estes oocistos são liberados, na sua forma não esporulada, no lúmen intestinal, e excretados nas fezes do gato jovem infectado. Uma vez no ambiente, a esporogonia ocorre alguns dias após liberação dos oocistos caracterizada pela redução meiótica e alterações morfológicas resultando em oocistos esporulados com 2 esporocistos, cada um contendo 4 esporozoítos (BLADER et al, 2009; TENTER et al; 2000).
A infecção do hospedeiro intermediário também se inicia pela ingestão de oocistos infectantes (presentes em água e alimentos contaminados) e/ou cistos teciduais presentes em carnes de animais de produção usados para consumo. Nesse hospedeiro ocorre o desenvolvimento esquizogônico do parasito, a partir da liberação dos esporozoítos que penetram no epitélio intestinal e se transformam em taquizoítos. Estes, potencialmente infectam qualquer tipo célula nucleada, onde se multiplicam por endodiogenia ou endopoligenia. Os taquizoítos são convertidos em bradizoítos, levando a formação de cistos teciduais, que surgem a partir de 7 – 10 dias, após a
infecção, permanecendo por tempo indeterminado no cérebro e/ou musculatura do hospedeiro (GANGNEUX; DARDE, 2012).
Figura 4. Ciclo biológico do Toxoplasma gondii. O ciclo pode se dividir em três momentos: desenvolvimento esquizogônico e gametogônico, com liberação de oocistos, no hospedeiro definitivo; etapa de maturação com esporogonia no ambiente, após liberação de fezes com oocistos pelos hospedeiros definitivos infectados. E, em terceiro, infecção do hospedeiro intermediário, com multiplicação por endodiogenia pelo parasito e, então, formação de cistos teciduais característicos da fase crônica (GANGNEUX; DARDE, 2012).
O processo de invasão da célula hospedeira (Figura 5) é constituído por etapas distintas, onde a atuação de moléculas de superfície e organelas secretoras de proteínas localizadas na região apical do parasito é fundamental para a efetivação da invasão da célula hospedeira. A invasão se deve a capacidade do T. gondii em reconhecer moléculas de superfície, como por exemplo, os proteoglicanos sulfatados, responsáveis pela orientação e interação do parasito com a membrana da célula hospedeira (CARRUTHERS et al., 2007).
O complexo apical, presente nesse parasito, é constituído de organelas citoplasmáticas como as roptrias, micronemas e grânulos densos; sendo os micronemas e as roptrias os principais responsáveis pela secreção de proteínas como as MICs e ROPs, respectivamente, que contribuem para a invasão e evasão celular (SMITH, 1995; SHARMA, 2013; SOLDATI; MEISSNER, 2004).
O contato inicial com a célula hospedeira é estabelecido pelo processo de ancoragem do parasito à superfície celular do hospedeiro. Tal mecanismo é mediado pelas SAGs (antígenos de superfície do parasito), responsáveis pelo reconhecimento de receptores de superfície da célula alvo pelo parasita. Posteriormente, os micronemas secretam as proteínas MICs e proteínas AMA1 (antígeno apical de membrana-1). As proteínas MIC estão envolvidas na ligação e penetração na célula-alvo, através do reconhecimento de vários componentes da matriz extracelular e da superfície da célula hospedeira. A proteína AMA-1 se associa as proteínas produzidas e liberadas pelas roptrias (RON – do inglês rhoptry neck) formando o complexo estável da junção motora (JM), que consiste de uma abertura na superfície da célula hospedeira, que permite a efetiva interação do parasito, antes de se estabelecer em um vacúolo parasitóforo (VP) recém-formado ( SOLDATI; MEISSNER, 2004; CARRUTHERS, 2002; WALKER et al. 2014; BLADER et al. 2015).
Uma vez que a interação com a célula hospedeira foi estabelecida, o parasito estimula mudanças conformacionais no nível de citoesqueleto, levando a invaginação da membrana plasmática e formação do VP. O acúmulo de conteúdo proteico liberado pelos grânulos faz com que o VP seja modificado, tornando-o apto em capturar nutrientes oriundos da célula hospedeira (CARRUTHERS et al, 2007; WALKER et al, 2014). Além disso, o VP formado fornece um ambiente ideal para proteção do T. gondii contra a maquinaria de defesa do hospedeiro, onde ele permanece se replicando até romper a célula e se disseminar pelos tecidos, invadindo novas células (CLDUGH; FRICKEL 2017).
Figura 5. Mecanismo de invasão celular pelo Toxoplasma gondii. (1) Contato inicial se dá pelo reconhecimento de receptores pela molécula SAG do hospedeiro; (2) Fixação apical mediada pela liberação de MICs; (3) A invasão é iniciada pela secreção de RONs e associação com a AMA1 derivada de micronemas, que forma a JM. (4) O parasito se reorienta e as ROPs são descarregadas no citoplasma do hospedeiro, onde se associam ao VP em desenvolvimento ou permanecem solúveis. (5) O parasito invade ativamente através do JM, criando o VP invaginado. (6) Uma vez internalizado, o VP é fechado e (7) o parasito se separa da membrana plasmática do hospedeiro e o conteúdo dos grânulos densos são liberados e associados ao VP. SAG: Antígeno de superfície; MIC: Proteínas micronemais; AMA1: Antígeno apical de membrana-1; RON, ROM, ROP: Proteínas de roptrias; PV: Vacúolo parasitóforos (CARRUTHERS BOOTHROYD, 2007).
1.2 Resposta imune à infecção pelo Toxoplasma gondii
O combate à infecção pelo T. gondii é mediado pelo desenvolvimento de uma resposta imune inata e adaptativa. A resposta imune inata é responsável pela defesa inicial contra infecções, mediada por componentes bioquímicos e celulares, principalmente células fagocíticas (macrófagos), células dendríticas (células apresentadoras de antígeno profissionais - APC) e células natural killer (NK) (BEUTLER, 2004; ROMO et al., 2016). A resposta imune adaptativa é estimulada por APCs que possuem receptores de reconhecimento padrão (RRP), como os receptores do tipo Toll (TRLS), que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Os linfócitos T CD4+, constituintes da resposta imune celular, são organizados em subpopulações, como os linfócitos T helper-1 (Th1), linfócitos T helper-2 (Th2) e linfócitos T reguladores (Treg) (LIEBERMAM; HUNTER,2002). As células TCD4+ do tipo Th1 exercem atividade protetora contra parasitos intracelulares
por meio da produção de citocinas pró-inflamatórias como o IFN-y e TNF-α. Por outro lado, as células de perfil Th2 possuem ação antagonista ao perfil Th1, através da produção de citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13.Por outro lado, as células Treg são responsáveis pela produção principalmente de TGF-β e IL-10, citocinas capazes de regular e limitar o desenvolvimento inflamatório (GADY; YAP, 2007). Além disso, os linfócitos T CD8+ também possuem papel importante no controle parasitário, sendo capazes de produzir IFN-y e de eliminar células infectadas (HALONEN; WEISS, 2013).
Macrófagos e células dendríticas (CDs) reconhecem moléculas presentes na superfície do Toxoplasma gondii, como as proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) e proteínas do tipo profilina (TgPRF) que levam à ativação dessas células e a produção de citocinas como IL-12 e TNF-α, através da via dependente de MyD88 (proteína de diferenciação primária mielóide 88) e NF-κB (fator de transcrição tumoral KB) (POLLARD; KNOLL; MORDUE, 2009; YAROVINSKY, 2014; DENKERS, 2003).
A produção de INF-γ por subpopulações de linfócitos Th1 bem como por
células natural Killer (NK), promovem a ativação de macrófagos. Uma vez ativados,
os macrófagos produzem altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROS) e óxido nítrico (ON), ambos descritos como potentes agentes microbicidas, produzidos dentro dos lisossomos de macrófagos, responsáveis pelo controle da replicação intracelular do parasito, seguida da morte e eliminação do mesmo. Além disso, os macrófagos ativados também secretam citocinas como TNF-α e IL-1, cuja uma das funções é promover o recrutamento de leucócitos durante os processos inflamatórios modulados pelo T. gondii (SUZUKI, 2002; CARRUTHERS; SUZUKI, 2007).
O desenvolvimento de uma resposta inflamatória modulada pelo parasito envolve principalmente a ação do TNF-α e diversas quimiocinas que contribuem para o recrutamento de células inflamatórias para o sitio de infecção. Em processos inflamatórios, os monócitos e neutrófilos e linfócitos T ativados são direcionados aos locais de infecção através da interação entre as moléculas de adesão expressas nas células endoteliais (CRUVINEL et al., 2010; MEDZHITOV, 2008). O TNF-α produzido promove a ativação endotelial, aumentando a expressão de moléculas de adesão como ICAM-1 e VCAM-1, que se ligam aos ligantes LFA-1 e VLA-1, respectivamente, presentes na superfície de linfócitos T ativados, mediando assim a forte ligação do endotélio aos leucócitos e, consequentemente, a migração dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ ativados para o local da infecção (MEDZHITOV, 2008; SA et al., 2014).
Além da expressão de moléculas de adesão, quimiocinas como CXCL10 e CXCL4 produzidas pelas células endoteliais ativadas se ligam a receptores CXCR3 e CCR5 expressos nos leucócitos em processo de rolamento contribuindo, dessa forma, para o recrutamento de células T ativadas, bem como para migração de monócitos e células dendríticas para o local da infecção. Uma vez no sitio de infecção, linfócitos T CD4+ reconhecem antígenos do parasito apresentados por APCs presentes no local da infecção, favorecendo assim a amplificação da ativação de macrófagos, estimulando maior recrutamento de leucócitos para o local da inflamação (SA et al., 2014).Os monócitos e neutrófilos circulantes utilizam os mesmos mecanismos mencionados anteriormente para infiltração no sitio de infecção. No entanto, outras quimiocinas como CCL1, CCL8 e CXCL8 secretadas por células residentes favorecem a migração dessas células. (PITTMAN; KNOLL, 2015; BLISS; BUTCHER; DENKERS, 2000).
Em camundongos o desenvolvimento de uma resposta imune característica pode influenciar no seu perfil de susceptibilidade e resistência frente a infecção. Por exemplo, a susceptibilidade observada em linhagens de camundongos C57BL/6 está diretamente relacionada com uma resposta pró-inflamatória exacerbada, mediada por uma resposta imune do tipo TH1 bem efetiva, e caracterizada pela produção elevada de citocinas pró-inflamatórias, que levam ao desenvolvimento de uma patogenia tecidual mais pronunciada no SNC, quando comparado com BALB/C, cujo o perfil de resposta TH1 é menos eficiente (BRANDÃO et al., 2011; LIESENFELD, 2002).
1.3 Sistema nervoso central e Toxoplasma gondii
O sistema nervoso é classificado anatomicamente em sistema nervoso periférico (SNP) e sistema nervoso central (SNC). O SNC é composto pela medula espinhal e encéfalo. Este é formado pelo cérebro, cerebelo e tronco encefálico. O cérebro compreende a região do diencéfalo, constituído pelo tálamo e hipotálamo, e do telencéfalo onde estão presentes o córtex cerebral e os núcleos da base (JIN; BAEK; PARK, 2015).
Os núcleos da base, também chamados de gânglios da base, são constituídos por um conjunto de estruturas (núcleos) da substância cinzenta, localizadas entre o diencéfalo e o córtex cerebral, que estão envolvidas na regulação de funções motoras,
cognitivas e límbicas. Do ponto de vista anatômico, os 3 principais núcleos da base considerados originalmente são: núcleo caudado, putâmem e globo pálido. O putâmem e o globo pálido formam o núcleo lentiforme que, juntamente com o núcleo caudado, formam o corpo estriado. Os distúrbios que envolvem essas estruturas cerebrais estão associados ao desenvolvimento de síndromes neurodegenerativas (Parkinson) e neuropsiquiátricas (esquizofrenia) (JIUANG; KIM, 2018; PRENSA; RICHADR; PARENT, 2003).
O corpo estriado é dividido em uma área ventral (corpo estriado ventral) e uma área dorsal (corpo estriado dorsal) (Figura 6). Nos primatas, o estriado dorsal é formado pelo núcleo caudado e do putâmen; entretanto, em roedores o estriado dorsal constitui-se de um único núcleo da substância cinzenta denominado complexo caudado-putâmen. O corpo estriado ventral é constituído pelo núcleo accumbens e pela porção estriada do tubérculo olfatório (pequena eminência situada posteriormente ao trígono olfatório). Além de ser essencial na regulação das funções motoras, que controlam os movimentos involuntários, o estriado é a estrutura de entrada principal dos gânglios da base, onde se conecta e recebe informações de várias áreas corticais e subcorticais. Ou seja, o córtex cerebral possui compartimentos funcionais que regulam os processos sensório-motores (putâmen), associativos (núcleo caudado) e límbicos (núcleo accumbens) sobre o corpo estriado, parcialmente mantidos ao longo dos gânglios da base (GONZALES; SMITH, 2015; PRENSA; RICHADR; PARENT, 2003).
Figura 6. Imagem evidenciando a secção coronal do cérebro de camundongos: A regiaodorsal regula funções motoras, e a região ventral é responsável pela regulação de alguns aspectos
comportamentais.
Embora o caminho exato pelo qual o T. gondii alcança o SNC ainda não esteja totalmente elucidado (LACHENMAIER et al., 2011), foram propostos 3 mecanismos que buscam explicar a invasão dessa região: migração paracelular dessa região: migração paracelular.
Na migração paracelular (Figura 7-1), ocorre à passagem do parasito pela membrana biológica através da sua migração pelas junções célula-célula; tal migração só é possível devido interação das moléculas secretadas pelo parasito (MIC2) e receptores de superfície celular presentes no endotélio (ICAM-1) (BARRAGAM; BROSSIER; SIBLEY, 2005; MENDES; KOSHY, 2017). A migração transcelular (Figura 7-2) se dá por meio da capacidade invasiva do parasito, que infecta as células endoteliais e atravessa para o lado basolateral da referida célula. O terceiro e último mecanismo, conhecido como cavalo de Tróia (Figura 7-3), é baseado na capacidade do parasito de invadir células migratórias do sistema imune, como macrófagos e leucócitos, que migram para o SNC (MENDES; KOSHY, 2017).
Ao atingir o sistema nervoso central, o parasito infecta células como astrócitos, neurônios e micróglia. Os astrócitos e micróglia (macrófagos residentes do SNC) infectados possuem mecanismos intracelulares como, por exemplo, a produção de
ON, que tendem inibir o crescimento do parasito; já os neurônios permanecem infectados por não possuírem tais mecanismos (BLANCHARD, 2008).
Figura 7. Mecanismos pelos quais o T. gondii atravessa a barreira hematoencefálica: (1) Invasão paracelular; (2) Invasão transcelular; (3) Invasão por meio de células infectadas (mecanismo de cavalo de Tróia) (MENDES; KOSHY, 2017).
Em indivíduos imunocompetentes, os efeitos da resposta imune contra a infecção por T. gondii são cruciais para limitar a proliferação intracelular de taquizoítos, induzindo a mudança para bradizoítos e formação de cistos, o que leva ao estabelecimento de uma infecção crônica (ELISE, 2016; SUZUKI et al, 2011; DUBEY, 2005). A importância da formação dos cistos teciduais, durante a infecção crônica, deve-se a diversos fatores que contribuem para o êxito da permanência do parasito no SNC do hospedeiro. Essa conversão está relacionada com a capacidade de ativação de células cerebrais residentes. No cérebro, os astrócitos e micróglia participam do controle da infecção por mecanismos mediados por IFN-y. Durante a infecção, os astrócitos ativados utilizam as GTPases relacionadas a imunidade (IRGs), expressas em resposta a estimulação por IFN-y, para eliminar cerca de 90% parasitos intracelulares. Os IRGs comprometem a integridade da membrana do VP causando a liberação do parasito no citoplasma da célula onde são destruídos. Por outro lado, a micróglia é ativada por IFN-y e secretam altos níveis de NO, interrompendo o crescimento intracelular do parasito por meio do bloqueio da atividade enzimática e causando danos diretos ao DNA do parasito (CABRAL et al, 2016; PITMAN; KNOLL, 2015; BLANCHARD; DUNAY; SCHULER, 2015).
Estudos com camundongos infectados demonstraram que a distribuição e densidade dos cistos no SNC são bastante heterogêneas, podendo ser encontrados em qualquer região anatômica do cérebro. No entanto, a maioria dos cistos são encontrados na região do córtex, tálamo, amígdala e corpo estriado. Foi demonstrado que cerca de 34% dos cistos são encontrados na região do córtex, 25% na região da amígdala e cerca de 12% na região do putâmen caudado (região que compreende o corpo estriado) (MELZER et al., 2010; BERENREITEROVÁ et al., 2011; SCHULUTER; BARRAGAN, 2019). Essa distribuição anatômica de cistos tem uma forte influência na manipulação do comportamento do hospedeiro, uma vez que estudos apontam para a predominância de cistos em áreas límbicas (amígdala, tálamo, putâmen) responsáveis por processos emocionais e comportamentais do indivíduo (SCHULUTER; BARRAGAN, 2019). Por exemplo, a presença de cistos nessas regiões límbicas do cérebro de ratos infectados está relacionada com menores níveis de ansiedade, bem como a presença de cistos na amígdala se associa com a perda de aversão aos felinos (GONZALES et al., 2007).
Foi demonstrado que as alterações comportamentais observadas em indivíduos infectados com T. gondii podem estar relacionadas com a presença de cistos tissulares na região do núcleo accumbens. Adicionalmente, a análise dessa região em ratos infectados revelou um aumento na impulsividade e redução da concentração de espinhas dendríticas e aumento da produção de dopamina. A infecção por T. gondii promove o aumento dos níveis de neurotransmissores como a dopamina, em regiões especificas do cérebro, como o núcleo accumbens e córtex cerebral, culminando no desenvolvimento de transtornos psicóticos semelhantes ao observado em indivíduos com esquizofrenia (TORREY; DICKERSON; YOLKEN, 2009; TAN et al., 2015; MELZER et al., 2010).
Além da influência da distribuição de cistos pelo SNC, o desenvolvimento de um quadro neuroinflamatório, com níveis de infiltrado celular consideráveis, é observado no cérebro de hospedeiro infectado. A infiltração de células inflamatórias no cérebro em resposta à infecção é mediada não só por quimiocinas expressas por leucócitos, mas também por quimiocinas expressas por astrócitos e micróglia residentes do cérebro do hospedeiro infectado (BISWAS et al., 2015; AVILES et al., 2008). Os astrócitos produzem quimiocinas como CXCL10 e CCL2, já a micróglia secreta citocinas como CXCL9 e CCL5, bem como quantidades mais reduzidas de
CXCL10, cruciais para o recrutamento de células T ativadas para o SNC do hospedeiro infectado (ROCK et al., 2004).
Além das quimiocinas e do papel do TNF-α na ativação das células endoteliais para o recrutamento de células inflamatórias ao sítio da infecção, o INF-γ tem ganhado ênfase no que diz respeito à migração de células T ativadas para o local da infecção no SNC. Por exemplo, no cérebro de camundongos Balb/c, o INF-y é importante para a indução de moléculas de adesão celular vascular-1 (VCAM-1) nos vasos endoteliais cerebrais, e no posterior recrutamento de células T ativadas para o cérebro desses camundongos durante o estágio crônico da infecção (SUZUKI et al., 2011; WAMG et al., 2007).
Com o intuito de traçar o perfil neuroimunipatológico durante a infecção por T. gondii em hospedeiros com perfil de susceptibilidade e resistência a infecção, foi realizada a análise quantitativa do número de cistos e Células neuronal WFA+ na região do corpo estriados de camundongos infectados com T. gondii.
2.OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
Quantificar o número de cistos teciduais e neurônios no corpo estriado do cérebro de camundongos suscetíveis (C57BL/6) e resistentes (Balb/c) a infecção pela cepa ME49 de Toxoplasma gondii.
2.2. Objetivos específicos
Acompanhar a taxa de variação de peso corporal dos camundongos durante a evolução da infecção;
Quantificar e comparar o número de cistos teciduais no estriado de camundongos C57BL/6 e Balb/c durante infecção crônica por T. gondii; Verificar e comparar o nível de células neuronais no estriado dos
3- Metodologia
3.1 Animais experimentais
Para a realização desse trabalho foram usados camundongos fêmeas da espécie Mus musculus, compreendendo as linhagens Balb/c e C57BL/6, entre 8 e 12 semanas de idade. Os animais foram organizados em quatro grupos de cinco (sendo um grupo infectado e um controle para cada linhagem) e infectados por via oral com 25 cistos da cepa ME49 de Toxoplasma gondii, acompanhados durante 30 dias e tiveram seu peso corporal registrado. Os camundongos foram alojados em gaiolas de dimensões de 30x20x13 cm, mantidos com fornecimento livre de alimento e água e ciclo claro/escuro de 12 horas cada. Os grupos controles foram inoculados por via oral com cérebros não infectados homogeneizados em PBS estéril.
Este projeto está de acordo com as normas expedidas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), aprovadas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA / UFRN), sob o protocolo 048/2019, número do certificado 124.048 / 2018.
3.2 Manutenção da cepa
Foi utilizada a cepa clonal ME49 (Tipo II) do Toxoplasma gondii, gentilmente cedida pelo Laboratório de Toxoplasmose, chefiado pelo Professor Dr. Ricardo Wagner de Almeida Vitor, no Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, e mantida na rotina do laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose/UFRN. As cepas forma mantidas por passagens a cada 2 meses em camundongos suíços, que foram inoculados por via oral com 10-25 cistos permanecendo infectados por 30 dias para formação de cistos cerebrais.
3.3. Obtenção e processamento do tecido cerebral
No trigésimo dia pós-infecção, os animais foram devidamente anestesiados com solução de xilazina e cetamina na proporção de 10 e 80 mg/kg respetivamente. Depois de confirmada a ausência de respostas a estímulos, a perfusão transcardíaca
foi iniciada com uma injeção intraventricular de 200 mL de tampão fosfato (0,1M) e salina 0,9% (pH 7,2) com 0,2 ml de anticoagulante (Heparina Sódica, ARISTON), seguida de 300 mL de paraformaldeído tamponado 4% (PFA, SIGMA).
Após esse procedimento, os cérebros foram cuidadosamente removidos do crânio e mantidos em solução crioprotetora (solução de sacarose tamponada 30%) por 72 horas a 4°C. Secções coronais de 60 µm de espessura foram feitas com o auxílio de um criostato (Leica CM1850) em todos os cérebros e, em seguida, foram mantidas em solução anticongelante a -20°C até serem utilizadas.
3.4. Imunohistoquímica para Wisteria floribunda aglutinina (WFA)
As secções do cérebro foram submetidas à técnica de imunohistoquímica para a lectina Wisteria floribunda biotinilada (SIGMA), capaz de se ligar aos terminais N-acetil-D-galactosamina do condroitim sulfato presente na matriz extracelular.
Para tanto, as secções dos cérebros foram lavadas, cinco vezes por cinco minutos cada, em tampão fosfato (TF 0,1M – pH 7,4) e incubadas em solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3%. Após esse tempo, os cortes foram submetidos a outra sequência de lavagem conforme descrito.
Após lavagem, as secções de cérebros foram incubadas overnight em solução contendo 0,5% de WFA biotinilada em TXTF 0,3% (TF 0,1M + 0,3% de Triton X-100) em temperatura ambiente e sob agitação suave e constante. Em seguida, os cortes foram lavados em nova solução de TF 0,1M, por cinco vezes de cinco minutos cada. Seguida de incubação no complexo avidina-biotina-peroxidase (Kit ABC – sendo 1 gota de solução A + 1 gota de solução B para 5 mL de TF 0,1M-NaCl), por 2 horas e, então, lavada quatro vezes de 5 minutos.
Após lavagem, iniciou-se a reação em diaminobenzidina (DAB) para revelação do antígeno na presença da enzima peroxidase. Para tanto, alíquotas de 1 mL de DAB (25 mg/mL) foram diluídas em 100 mL de TF 0,1M. Antes de iniciar a reação, incubaram-se as secções na solução de DAB por cinco minutos e, após esse período, adicionou-se solução de 10 mL de TF 0,1M com 100 μL de H2O2. Então, as secções foram mantidas imersas na solução DAB/ H2O2 por mais cinco minutos.
As secções foram montadas em lâminas gelatinizadas, secas em temperatura ambiente e, em seguida, submetidas ao protocolo de desidratação e diafanização.
Após término da bateria, as lâminas foram montadas com lamínulas em meio de montagem Entellan® e permaneceram secando em temperatura ambiente por 5 dias.
3.5. Contagem de células positivas para WFA+ e cistos tissulares no estriado
A quantificação de cistos e células positivas para WFA+ no corpo estriado foi feita com auxílio do atlas, ´O cérebro de camundongos´ dos autores Keith B.J. Franklin e George Paxinos (2007), utilizado para mapear a região do corpo estriado.
Para tanto foram usadas cinco secções coronais por animal, com uma distância de 120 μm de uma para outra, seguindo a posição 0,86 a 0,26 μm anterior ao Bregma (FIGURA 8). As imagens foram tratadas com o auxílio do software ImageJ (NIH) e o software Canvas12.
Figura 8. Esquema ilustrando a ordem das secções utilizadas para contagem de cistos e infiltrado inflamatório: As secções coronais (azul) representa especificamente os pontos das áreas
coronais que foram utilizados para contagem de cistos e infiltrado. Asterisco indica a região do corpo
estriado onde foi realizado o estudo.
A contagem dos cistos foi realizada seguindo a organização de secções descrita acima. O número total de cistos e células WFA+ foi quantificado manualmente como auxílio de um microscópio óptico em objetiva de 10 e 40x.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Os dados tiveram sua normalidade analisada pelo teste Shapiro-Wilk. A análise do tecido foi realizada utilizando teste t student com correção de Welch para dados paramétricos. Ao final das análises, os dados foram considerados significativos quando p<0,05.
4. RESULTADOS
4.1. Evolução da infecção por Toxoplasma gondii em camundongos Balb/c e C57BL/6.
Analisando as alterações no peso corporal, foi possível observar que camundongos C57BL/6 infectados apresentaram uma perda de 25% de seu peso inicial, sem conseguir restabelecer o peso inicial, enquanto os camundongos Balb/c exibiram uma diminuição de apenas 6% do seu peso durante o estágio agudo da infecção (Figura 9).
Figura 9. Média de perda de peso corporal durante 30 dias de infecção, em camundongos das linhagens C57BL/6 e Balb/c. Os dados foram apresentados como porcentagem da média+DP do peso corporal inicial, monitorado durante o protocolo experimenta. Dados com p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
4.2 Quantificação do número de cistos no corpo estriado de camundongos Balb/c e C57BL/6.
A análise do número de cistos presentes no corpo estriado (Figura 10) do cérebro de camundongos Balb/c e C57BL/6 infectados revelou uma diferença significante (p<0,0001) entre as linhagens. Os camundongos C57BL/6 apresentaram um número de cistos variando de 29 a 138 (média ± DP: 66 ± 29) na área analisada, sendo uma média com valor aproximadamente 4,4 vezes maior que o número de cistos encontrados em camundongos Balb/c, que apresentaram uma carga de cistos variando de 3 a 28 cistos (média ± DP: 15 ± 11,3) (Figura 11).
Figura 10. Imagens evidenciando o corpo estriado de camundongos dos grupos de camundongos infectados (A, B) das linhagens Balb/c (A) e C57BL/6 (B ). Imagens obtidas em objetiva de 10x (A e B), com escala de 100 µ.Imagens menores objetiva de 4x escala de 500 µm.Setas:Cisto teciduais; asteriscos: corpo estriado onde foi feita a contagem de cistos.
C57BL/6 Balb/c 0 20 40 60 80 100 M é d ia d e c is to s n o c o rp o e s tr ia d o
****
Figura 11. Comparação entre a distribuição de cistos presentes no corpo estriado de camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6. O número de cistos cerebrais no estriado dos camundongos após 30 dias de infecção com a cepa ME49. Os dados foram apresentados como média ± DP. **** p<0,0001.
4.3 Quantificação de células WFA+ no corpo estriado de camundongos Balb/c e C57BL/6.
A quantificação do número total de neurônios WFA revelou uma redução de 77% e 61 % da marcação em camundongos infectados das linhagens Balb/c e C57BL/6 (p<0,0001). Os camundongos C57BL/6 e Balb/c infectados exibiram em média 55,26 (média ± DP:20) e 106 (média ± DP:22,8) células positivas por campo respectivamente. Por outro lado camundongos C57BL/6 e Balb/c controles apresentaram em média 242,53 (média ± DP:36,7) e 276 (média ± DP:35,4) células positivas por campo (Figura 12 e 13).
Figura 12. Análise da redução de células neuronal positiva para WFA+ no corpo estriado de camundongos da linhagem Balb/c (A e A’) e C57BL/6 (B e B’). A e B: estriado de camundongos controles. A’: Observa-se uma maior quantidade de células neuronal no estriado de Balb/c. B’: Redução do número de células neuronais no estriado de C57BL/6 infectados. Dados foram apresentados como
média ± DP. **** p<0,0001. Imagens obtidas em objetiva de 10x, com escala 100µ.Imagens menores
objetiva de 4x escala de 500 µm. Cabeça das setas indicam células neuronais WFA+; asterisco: corpo estriado.
Figura 13. Camundongos Balb/c apresentaram maior número de células neuronal WFA+ na região do corpo estriado quando comparado aos camundongos C57BL/6. A e B: Comparação entre a média de células neuronais WFA+ no estriado de de camundongos C57BL/6 e Balb/c infectados e controle. C: Observa-se uma maior redução de células neuronais no estriado de camundongos C57BL/6 infectados. Dados foram apresentados como média ± DP. **** p<0,0001. CTL: grupos controle; WFA+: Wisteria floribunda.
5. DISCUSSÃO
Este trabalho demonstrou que durante a fase aguda da infecção, período caracterizado por uma ampla multiplicação parasitária, houve um declínio do peso corporal dos animais infectados. Em camundongos C57BL/6 suscetíveis a infecção por Toxoplasma gondii, a principal patologia observada é a necrose da mucosa intestinal desencadeada por uma elevada ativação da resposta pró-inflamatória, comprometendo a absorção de alimentos e favorecendo a redução do peso desses animais (LIESENFELD, 2002; HATTER et al., 2018; FUX et al., 2003). Por outro lado, em camundongos Balb/c resistentes à infecção, há o desenvolvimento de uma resposta imunorreguladora capaz de atuar na proteção e reparo tecidual, levando ao menor comprometimento do tecido do hospedeiro, refletindo-se em uma menor redução de peso corporal, acompanhado de um padrão da recuperação de peso mais eficiente (HATTER et al., 2018).
Cistos teciduais foram encontrados no cérebro de ambos os camundongos infectados. No entanto, o número de cistos quantificado foi significativamente maior entre os camundongos C57BL/6 do que em camundongos Balb/c, fato que é corroborado por resultados apresentados em outros estudos (WATSON; DAVIS, 2019; SUZUKI et al., 2000, WELTER et al., 2007). A diferença no número de cistos no corpo estriado das linhagens de camundongos, observada neste estudo, pode estar relacionada às diferentes características genéticas desses hospedeiros. Foi demonstrado que a variação de haplótipos de MHC de classe 1 entre as linhagens Balb/c e C57BL/6 infectados com a cepa ME49, tem forte influência sobre o número de cistos encontrados, bem como na capacidade do hospedeiro de estabelecer uma resposta antiparasitária eficiente (BLANCHARD et al., 2008). Os peptídeos apresentados pelo MHC de classe 1 são fundamentais para o reconhecimento de antígenos pelas células T CD8+ e sua posterior ativação. As células T CD8+ são capazes de reconhecer antígenos que são restritos a região H2d de MHC de classe 1 e são responsáveis por estimular a ativação dessas células.
Em camundongos Balb/c, que expressam o haplótipos H2d de MHC de classe 1, foi encontrado menor número de cistos teciduais e esse fato é acompanhado pelo desenvolvimento de uma resposta imune mediada pelas células T CD8+ mais eficiente do que o observado em camundongos C57BL/6, que apresentam haplótipos H2b. Essa diferença na resposta acontece pois, camundongos Balb/c conseguem
apresentar o peptídeo HF10, derivado da proteína GRA6, via MHC de classe 1, mais eficientemente do que C57BL/6; promovendo assim ativação e a expansão de células T CD8+ capazes de limitar a carga parasitária e reduzir a quantidade de cistos presente nesses camundongos (SUZUKI et al., 2011; BRANDÃO 2008; BLANCHARD et al., 2008).
Muitos estudos buscam analisar a variação na distribuição de cistos no cérebro do hospedeiro com o objetivo de estabelecer um possível padrão ou perfil de tropismo do T. gondii para regiões cerebrais específicas. No entanto, estudos revelaram uma falta de tropismo específico na distribuição do parasito através do cérebro (MELZER et al., 2010;; BERENREITEROVA et al., 2011) e esse padrão de disseminação do parasito pode estar relacionado aos pontos de inserção de veias e artérias cerebrais para suprimento sanguíneo do sistema nervoso central, uma vez que a principal rota de disseminação do parasito através do organismo hospedeiro é por leucócitos infectados na circulação sanguínea (COURRET et al., 2006; ESTATO et al. 2018).
Com base na diferença do perfil de susceptibilidade e resistência, e do conhecimento que se tem a acerca da resposta imune desenvolvida entre as linhagens de camundongos, foi observada uma diferença marcante no número de neurônios presentes no estriado de camundongos infectados quando comparado aos grupos controle. Em camundongos C57BL/6, além de elevado número de cistos observou-se uma maior redução no número de neurônios WFA+ do que os camundongos Balb/c infectados. O estabelecimento um quadro neuinflamatório mais intenso observado no parênquima cerebral de camundongos C57BL/6, favorece o comprometimento neuronal durante a infecção crônica, e dessa forma contribuir para redução do número celular e aumento da apoptose neuronal, resultantes de uma neuroinflamção exacerbada estimulada pelo parasito no SNC desses camundongos (LU; LAI, 2012; LIU; HUANG; LU, 2018; WANG et al., 2018).
Em camundongos C57BL/6, o grande número de cistos cerebrais sugere que os achados observados seja de forte infiltrado de células inflamatórias associado a uma maior redução do número de neurônios, que reflete seu perfil de suscetibilidade a infecção. Essa característica de susceptibilidade pode estar relacionada com o desenvolvimento de uma resposta pró-inflamatória exacerbada, caracterizada pela produção elevada de citocinas pró-inflamatórias. Esse cenário pode servir de explicação para o comprometimento da homeostase cerebral, caracterizada por uma
maior redução do número de neurônios, acompanhado de uma neuroinflamção mais intensa observada no cérebro desses camundongos (LISENFIELD et al., 2002; BRANDÃO, 2011; IQUIBAL; 2016).
Por outro lado, camundongos Balb/c conseguem controlar mais eficiente à resposta inflamatória contra o parasito, por meio do desenvolvimento de uma resposta imunorreguladora caracterizada pela produção de citocinas como IL-10 e TGF-β, capazes de limitar e regular a superprodução de citocinas pró-inflamatórias, resultando no aparecimento de uma discreta reação inflamatória no SNC e menor redução do número de células neuronais,acompanhado de um número consideravelmente menor de cistos (HATTER et al., 2018; SILVA et al., 2010; SUZUKI, 2000).
6. CONCLUSÃO
A quantificação de cistos no estriado dos camundongos infectados revelou que a linhagem C57BL/6 apresentou um número de cistos quatro vezes maior que o observado para os camundongos da linhagem Balb/c.
Adicionalmente ao número mais elevado de cistos, os camundongos C57BL/6 infectados também apresentaram um número considerável de núcleos diferentes das células neuronais e que são sugestivos de infiltrado inflamatório.
Esses dados apontam para as diferenças entre a colonização do tecido cerebral pelo parasito entre diferentes hospedeiros, além de refletir a ativação imune distinta entre as duas linhagens durante infecção crônica pelo Toxoplasma gondii.
7-REFERÊNCIA
ADL, S .M. et al. The revesid classification of eukaryotes. Journal Eukaryot Microbiol n. 5, p 429–493, 2012.
AVILES et al. Genetic expression kinetics of systemic cytokines and brain chemokines in murine toxoplasma infection. Journal Immunol, v.94, n.6, p.1282-1288,2008.
BARRAGAN, A.; BROSSIER, F.; SIBLEY, L. D. Transepithelial migration of Toxoplasma gondii involves an interaction of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1) with the parasite adhesin MIC2.Cell Microbiology, v. 7 , p. 561-568, 2005. BERENREITEROVÁ, M.; FLEGR, J.; KUBENA, A. A.; NEMEC, P. The distribution of Toxoplasma gondii cyst in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for behavioural manipulation hypothesis. PlosOne, v. 6 (12), p. 1 – 14, 2011.
BEUTLER, B. Innate immunity: an overview. Molecular Immunology, p.845-859, 2004.
BLISS, S.K.; BUTCHER, B.A.; DENKERS, E.Y. Rapid recruitment of pre-mobilized IL12-containing neutrophils during microbial infection. Journal Immunol,
p.45154521,2000
BISWAS, A. et al. Ly6C (high) monocytes control cerebral toxoplasmosis. Journal Immunol, v.194, n.9, p.3223-3225,2015.
BLADER, I. et al. The lytic cycle of Toxoplasma gondii: 15 years later. Annu Reviews Microbiol, p.463-485,2015.
BLADER, I.J.; SAEIJ, J.P. Communication between Toxoplasma gondii and its host: impact on parasite growth, development, immune evasion, and virulence. The Authors Journal Compilation, p.458-476,2009.
BLANCHARD, N; DUNAY, IR; SCHUTER, D. Toxoplasma gondii resistance in the central nervous system: an adjusted balance between the parasite, the brain and the immune system. Parasite Immunol, v.37, n.3, p. 150-158,2015.
BLANCHARD, N. et al. Immunodominant , protective response to the parasite Toxoplasma gondii requires antigen processing in the endoplasmic reticulum.Nature Immunology, v. 9, n. 8, p. 937–944, 2008.
BRANDÃO, G.P. Avaliação da reinfecção de camundongos BALB/c e C57BL/6 com cepas de Toxoplasma gondii isoladas no Brasil. 2008. 129 f. Tese (Doutorado) -
Laboratórios de Toxoplasmose e Biologia de Leishmania do Departamento de Parasitologia, Programa de Pós-graduação em Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais, 2008.
BRANDÃO, G.P. et al. Susceptibility to re-infection in C57BL/6 mice with recombinant strains of Toxoplasma gondii. Experimental Parasitology, p.433-437,2011.
CABRAL, et al. Neurons are the primary target cell for the brain-tropic intracellular Parasite Toxoplasma gondii. PLOS Pathogens, p.2-20,2016.
CARRUTHERS, V. B. Host cell invasion by the opportunistic pathogen. Microbiology
and Immunology, v. 81, p. 111–122, 2002.
CARRUTHERS, V.B.; SUZUKI, Y. Effects of Toxoplasma gondii infection on the brain.
Schizophr. Bull, v.33, p.745-751, 2007.
CLOUGH B, FRICKEL EM. The Toxoplasma parasitophorous vacuole: an evolving host–parasite Frontier. Trends in Parasitology, v.33, n.6, p.473-488 2017.
COURRET, N. et al. CD11c- and CD11b-expressing mouse leukocytes transport single Toxoplasma gondii tachyzoites to the brain.BLOOD, v.107, p.309-316, 2017. COURRET, N. et al. CD11c- and CD11b-expressing mouse leukocytes transport single Toxoplasma gondii tachyzoites to the brain. The American Society of Hematology, v.107, n.1, p.309-315.2006.
CRUVINEL, W.M. et al. Fundamentos da imunidade inata comênfase nos mecanismos moleculares e celulares da resposta inflamatória. Reviews Bras Reumatol, v.50, n.4,
p.434-461, 2010.
DE MUNO, R.M. et al. Spontaneous cystogenesis of Toxoplasma gondii in feline epitelial cells in vitro. Institute of Parasitology, Biology Centre ASCR, v.61, n.2,2014.
DENKERS, E.Y. From cells to signaling cascades : manipulation of innate immunity by Toxoplasma gondii. FEMS Immunol Medical Microbiol, v. 39, p. 193–203, 2003. DUBEY, J. P. Unexpected oocyst shedding by cats fed Toxoplasma gondii tachyzoites: in vivo stage conversion and strain variation. Veterinary Parasitology. v. 133, p. 289-298, 2005.
DUBEY, J.P. Advances in the life cycle of Toxoplasma gondii. International Journal for Parasitology, v. 28, p. 1019 – 1024, 1998.
ELISE, P.S. A proposed mechanism for cerebral toxoplasmosis as a contributing factor in Schizophrenia. 2016. 63 f. Dissertação (Mestrado) - Department of Cellular and
Molecular Medicine The University of Arizona,2016.
ESTATO, V. et al. The Neurotropic Parasite Toxoplasma gondii Induces Sustained Neuroininflamation with microvascular dysfunction in infected mice. The American
FLEGR, J.et al. Toxoplasmosis – A global threat. correlation of latent toxoplasmosis with specific disease burden in a set of 88 countries .Plos One, v.9, n.3, p.90-203,2014.
FUX, B. et al. Role of cytokines and major histocompatibility complex restriction in mouse resistance to infection with a natural recombinant strain ( Type I-III ) of Toxoplasma gondii.Infection and Immunity v. 71, n. 11, p. 6392–6401, 2003.
GADY, P.J., YAP, G.S. Cytokine regulation of immunopathology in toxoplasmosis.Immunol cell Biol, v.85, n.2, p.155-159,2007.
GANGNEUX, R.F.; DARDE, M.L. Epidemiology of and diagnostic strategies for toxoplasmosis. Clinical Microbiology Reviews, v. 25, n. 2, p.265-267, 2012.
GONZALES, et al. Toxoplasma gondii infection lower anxiety as measured in the plus-maze and social interaction tests in rats A behavioral analysis. Behavioural Brain
Reserarch, v.137, n.1, p.70-79,2007.
GONZALES, K., SMITH, Y. Striatal Cholinergic interneurons in the dorsal and ventral striatum: anatomical and functional considerations in normal and diseased conditions.
Ann N Y Acad Sci, p.1-45, 2015.
GUMARÃES, E.V.; CARVALHO, L.; Primary culture of skeletal muscle cells as a model for Studies of Toxoplasma gondii cystogenesis. Journal of Parasitology, v.94, n.1,
p.72-83,2008.
HALONEN, S. K.; WEISS, M. L. Toxoplasmosis. NIH Public Access, p. 125–145
2014.
HAN, S. J. Visualization of immune cells during Toxoplasma gondii infection.2012. 46 f. Dissertation (master)- Zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der
Naturwissenschaft eingereicht im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universität Berlin,2012.
HATTER et al. Toxoplasma gondii infection triggers chronic cachexia and sustained commensal dysbiosis in mice.Plos One, p. 1–16, 2018.
IDDAWELA D, VITHANA SMP, RATNAYAKE C.Seroprevalenceoftoxoplasmosis and risk factors of Toxoplasma gondii infection among pregnant women in Sri Lanka: a cross sectional study. BMC Public Health, v.17, p.1-6 ,2017.
IQBAL, J. Toxoplasmosis : Role of Cytokines in Disease Modulation & Tissue Pathology. Ann Clin Patho, v. 4, p. 4–9, 2016.
JIN, H. Y.H; BAEK, H.S; PARK, T.S. Morphologic changes in autonomic nerves in diabetic autonomic neuropathy. Diabets & Metabolism Jounal, n.39, p. :461-467,2015.
JIUANG, H., KIM, H.F. Anatomical Inputs From the Sensory and Value Structures to the Tail of the Rat Striatum. Frontiers in Neuroanatomy, v.12, p1-17, 2018.
KIM, K; WEISS, L.M. Toxoplasma gondii: the model apicomplexa. NIH Public Access, v. 34, n. 3, p. 423-432, 2003.
LANCHENMAIER, S.M. et al. Intracellular transport of Toxoplasma gondii through the blood– brain barrier. Europe PMC Funders Group, v. 232, p. 119-130, 2011.
LIEBERMAN, LA.; HUNTER, CA. The role of cytokines and their signaling pathways in the regulation of Toxoplasma gondii immunity.Internation Rev Immunol,
p.373-403,2002.
LIESENFELD, O. Oral Infection of C57BL / 6 Mice with Toxoplasma gondii : A New model of inflammatory bowel disease ? The Journal of Infectious Diseases, v. 185,
n. Suppl 1, p. 96–101, 2002.
LYONS, E.R. et al. Toxoplasma gondii tachyzoite–bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology, v.8, n,5 , p.198-201,2002.
LU, C. Y.; LAI, S. C. Matrix metalloproteinase-2 and -9 lead to fibronectin degradation in astroglia infected with Toxoplasma gondii. Acta Tropica, v. 125, p. 320 – 329, 2012. LIU, J.; HUANG, S.; LU, F. Galectin-3 and Galectin-9 May Differently Regulate the Expressions of Microglial M1/M2 Markers and T Helper 1/Th2 Cytokines in the Brains 84 of Genetically Susceptible C57BL/6 and Resistant BALB/c Mice Following Peroral Infection With Toxoplasma gondii. Frontiers in immunology, v. 9, n. July, p. 1648, 2018
MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation.
Nature,p.428-435,2008.
MELZER, T.C.; CRANSTON, H.J.; WEISS, L.M.; HALONEN, S.K. Host cell preference of Toxoplasma gondii cysts in murine brain: a confocal study. Journal of
Neuroparasitology, 2010.
MENDES, O.A.; KOSHY, A.A. Toxoplasma gondii: Entry, association, and physiological influence on the central nervous system. PLOS Pathogens, v.13, n.7, p.2-12,2017 .
MONTOYA J, ROSSO F. Diagnosis and management of toxoplasmosis. Clinical
Perinat, v.32, n.3, p. 705-726, 2005.
MUNOZ-ZANZI CA, FRY P, LESINA B, HILL D. Toxoplasma gondii oocyst-specific antibodies and source of infection. Emerg Infect Dis , v.16, n.10, p. 1591–1593, 2010.
PAPPAS G, ROUSSOS N, FALAGAS ME. Toxoplasmosis snapshots: global status of Toxoplasma gondii seroprevalence and implications for pregnancy and congenital toxoplasmosis. Int Journal Parasitol, v. 39, n.12, p. 1385–1394, 2009. PITTMAN, K.J.; KNOLL, L.J. Long-term relationships: the complicated interplay between the Host and the developmental stages of Toxoplasma gondii during Acute and Chronic Infections. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.79, n.4, p.387-396,2015.
POLLARD, A. M.; KNOLL, L. J.; MORDUE, D. G. The role of specific Toxoplasma gondii molecules in manipulation of innate immunity. Trends in Parasitology, v. 25, n. 11, p. 491–494, 2009.
PRENSA, L., RICHARD, S., PARENT, A. Chemical anatomy of the human ventral striatum and adjacent basal forebrain structures. The Jounal of Comparative
Neurology, p. 346-365, 2003.
ROCK et al. Role of microglia in central nervous system infections. Clinical Microbiology Reviews, v.17, n.4, p.942-964,2004.
ROMO, M.R.; PEREZ –MARTINEZ, D.; FERRER, C.C. Innate immunity in vertebrates: na overview. Immunology , p.125-139, 2016.
SA, Q. et al. VCAM-1/41 integrininteraction is crucial for prompt recruitment of immune T cells into the brain during the early Stage of reactivation of chronic infection with Toxoplasma gondii to prevent toxoplasmic encephalitis.Infection and Immunity, v.87,
n.7, p.2826-2839, 2014.
SCHLÜTER, D.; BARRAGAN, A. Advances and challenges in understanding cerebral toxoplasmosis. Frontiers inImmunology, v. 10, p. 1–13, 2019.
SHAEFER, M. et al. Dynamic Imaging of T Cell-Parasite Interactions in the Brains of Mice Chronically Infected with Toxoplasma gondii. The Journal of Immunology,
p.6380-6392,2009.
SHARMA P, CHITNIS EC. Key molecular events during host cell invasion by Apicomplexan pathogens. Current Opinion in Microbiology, p.432-437,2013.
SWAPNA, L.S; PARKINSON, J. Genomics of apicomplexan parasites.HHS Public
Acces, v. 52, n. 3, p. 254-273, 2017.
SIBLEY, L.D. et al. Genetic diversity of Toxoplasma gondii in animals and humans.The
Royal Sociayte, v. 364, n. 1, p. 2749-2761, 2009.
SILVA et al. Toxoplasma gondii: the severity of toxoplasmic enchephalitis in C57BL/6 mice is associated with increased ALCAM and VCAM -1 expression in the central
