Observação de efeito do campo magnético em três espécies de clorófitas

Universidade de Aveiro

2010

Departamento de Biologia

Ana Maria Ferreira

Capitão

Observação de efeito do campo magnético em três

espécies de clorófitas

Universidade de Aveiro

2010

Departamento de Biologia

Ana Maria Ferreira

Capitão

Observação de efeito do campo magnético em três

espécies de clorófitas

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Biologia Molecular e Celular, realizada sob a orientação científica do Dr. Sushil Kumar Mendiratta, Professor catedrático do Departamento de Física da Universidade de Aveiro e co-orientação do Dr. António Calado, Professor Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

o júri

presidente Prof. Dra. Maria Adelaide De Pinho Almeida

Professora Auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Prof. Dr. Sushil Kumar Mendiratta

Professor catedrático do Departamento de Física da Universidade de Aveiro Prof. Dr. António José Brito Mendes Calado

Professor auxiliar do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro

Prof. Dra. Lilia Maria Antunes dos Santos

agradecimentos Em primeiro gostaria de agradecer aos meus orientadores, Dr. Sushil Kumar Mendiratta e Dr. António Calado da Universidade de Aveiro pelo apoio e orientação durante a realização deste trabalho.

Agradeço a todo o laboratório de sólidos não cristalinos do departamento de física da Universidade de Aveiro, especialmente ao Engenheiro Jorge Monteiro, pela forma como me receberam e ajudaram durante todo o meu trabalho.

Agradeço também à algoteca de Coimbra pelas culturas facultadas, à Dra. Sandra Calado e à doutoranda Ana Luís pelos meios de cultura, culturas e principalmente pelo tempo dispendido.

Agradeço ainda à Professora Susana Mendes da Escola Superior de Turismo e Tecnologia de Mar pela ajuda na análise estatística.

Não posso esquecer a minha família e amigos que sempre me apoiaram, e estiveram comigo apesar da distância.

E por ultimo, não poderia deixar de agradecer ao meu Nico por todo o apoio, paciência e amor.

palavras-chave Campo magnético, electroíman arrefecido, alterações celulares, algas, taxa de crescismento, Spirogyra sp., Pediastrum duplex, Pandorina morum.

resumo Os campos magnéticos são uma presença constante no dia a dia. A sua interacção com os organismos biológicos tem ganho cada vez mais relevância à medida que vão aparecendo mais estudos, estes possuem diferentes resultados e propõem diferentes mecanismos, torna-se portanto essencial perceber quais os resultados unicamente devido ao efeito do campo magnético e quais são devido outros factores. Com esse propósito desenvolveu-se um procedimento para avaliar os efeitos dos campos magnéticos no crescimento de diferentes tipos de algas, Spirogyra sp., Pediastrum duplex, Pandorina morum excluindo assim outros factores. Spirogyra sp. revelou um crescimento mais lento quanto maior a intensidade do campo magnético aplicada, sem alterações significativas devido à temperatura. Pediastrum duplex e Pandorina morum demonstraram alterações de crescimento devido a pequenas alterações da temperatura, estas camuflaram possíveis efeitos de campos magnéticos. Os resultados obtidos apoiam a ideia de que o mecanismo de interacção entre os campos magnéticos e os organismos biológicos não é tão simples como por exemplo o efeito de choque térmico. Continuam a ser efectuadas experiências para comprovar que os resultados obtidos não são devidos outros factores, e serão testados vários mecanismos susceptíveis a interacções com o campo magnético, como é o caso da fotossíntese.

keywords Magnetic field, cooled electromagnet, cellular changes, algae, growth rate, Spirogyra sp., Pediastrum duplex, Pandorina morum.

abstract Magnetic fields are a constant presence in everyday life. Their interaction with biological organisms is acquiring more relevance as more studies appear. Many studies have different results and propose a diversity of mechanisms to explain sometime contradictory results. It is, therefore, essential to separate the results due the effect of the magnetic field from what may be due to other factors. We have developed a methodology to evaluate the effect of magnetic field on the growth of different types of algae; Spirogyra sp., Pediastrum duplex and Pandorina morum, and minimising the effect of other stress factors. Spirogyra sp. showed a slower growth as the intensity of the applied magnetic field was increased and no significant changes due to temperature. Pediastrum duplex and Pandorina morum, however, showed alterations in growth due to small temperature changes, thus possibly masking the effects of magnetic fields. The results support the idea that the mechanism of interaction between magnetic fields and biological organisms is not as simple as for example of a thermal shock. Experiments are continuing to improve the discrimination of the effects due to field. Also, several mechanisms, like photosynthesis, will be tested that may be involved in the interaction of the magnetic field in these species.

Índice

1. Introdução

1.1.Campos magnéticos 1

1.2.Interacção dos campos magnéticos com os organismos biológicos 3

1.3.Magnetorecepção e Magnetotaxia 5

1.3.1.Bacterias 6

1.3.2.Algas 7 1.4.Alterações ao nível celular atribuídas à exposição a campos magnéticos 1.4.1.Cálcio 8 1.4.2.Expressão genética 10

1.4.3.Morfologia Celular 12

1.4.4.Viabilidade e Crescimento Celular 13

1.4.5.Fotossíntese 13

1.4.6.Estudos com algas e cianobactérias ………14

1.5.Controvérsia dos resultados 15

1.6. Âmbito e motivação da investigação 16

2. Material e métodos 2.1.Material biológico 17 2.1.1.Spirogyra sp. 17 2.1.2.Pandorina morum ………18 2.1.3.Pediastrum duplex 18 2.2.Condições de cultura 19

2.3.Descrição do dispositivo experimental 19

2.4.Procedimento experimental 21

2.4.1.Spirogyra sp. 21

2.4.2.Pediastrum duplex e Pandorina morum 22

3.5.Técnicas de análise de dados 23

3.Resultados e discussão 3.1 Características do electroíman 24

3.2 Testes Preliminares de Spirogyra sp. 26

3.3 Efeito do campo magnético sobre a mitose em Spirogyra sp. 28

3.4 Testes Preliminares de Pandorina morum 30

3.5 Efeito do campo magnético no crescimento de Pandorina morum 33

3.6 Testes Preliminares de Pediastrum duplex 38

3.7 Efeito do campo magnético no crescimento de Pediastrum duplex 40

3.8 Alterações morfológicas devido à exposição ao campo magnético 44

5. Conclusão e perspectivas futuras 45

1. Introdução

O campo magnético (B) é a região do espaço na qual actuam forças magnéticas (Burns e Macdonald, 1975), que não se vê, não se sente e não é atenuado pela maioria dos materiais, incluindo os constituintes biológicos, como a membrana celular (Bioinitiative Report, 2007). O mesmo é mais intenso junto da fonte e diminui com a distância. A sua unidade no sistema internacional é o tesla (T). Os campos magnéticos podem ser uniformes quando mantêm a mesma intensidade de campo num determinado local, e contínuos, quando mantêm uma determinada intensidade de campo magnético ao longo do tempo, ou alternados, quando a intensidade varia (Burns e Macdonald, 1975).

A interacção entre os campos magnéticos e objectos de diferentes materiais pode ser classificada de três formas diferentes (Gerthsen et al., 1998):

• Diamagnetismo, quando o objecto é repelido pelo campo magnético; • Paramagnetismo, quando o objecto é atraído pelo campo magnético;

• Ferromagnetismo, quando após a exposição ao campo magnético o objecto mantém um campo magnético. Esses materiais são utilizados para produzir ímanes permanentes (ex: materiais ricos em: ferro, níquel, cobalto)

Os campos magnéticos podem ser produzidos de duas formas: através de ímanes ou de correntes eléctricas (Giancoli, 1998).

Qualquer íman, independentemente da sua forma, tem dois terminais ou faces, chamados pólos, que são os locais em que o campo magnético é mais forte. O pólo de um íman livremente suspenso que apontar para norte é designado o pólo norte do íman, o outro pólo que aponta para sul é designado o pólo sul (Giancoli, 1998).

Os ímanes podem ser permanentes, quando após terem sido magnetizados mantêm um campo magnético, ou electroímanes, quando o seu campo magnético depende da passagem de corrente eléctrica. Os electroímanes são constituídos por um solenóide (bobina de fio composta por várias espiras) com um pedaço de ferro “macio” (ferro que adquire e perde o seu magnetismo rapidamente) no seu interior. Este tipo de íman consegue produzir um campo magnético consideravelmente elevado. Devido à sua corrente

contínua os electroímanes produzem calor, sendo por isso necessário a construção de bobinas arrefecidas que neutralizem este efeito (Giancoli, 1998).

Os campos magnéticos podem ser de origem natural, como o campo magnético terrestre, ou artificial, como os produzidos pela vasta gama de tecnologias que alteraram o panorama da nossa vida (Quadro 1) (Bioinitiative Report, 2007). Na tentativa de explicar os efeitos biológicos dos campos magnéticos, é útil classificá-los como fracos (< 1mT(miliTesla)), moderados (1mT – 1T), fortes (1T – 5T) e ultra-fortes (>5T) (Dini e Abbro, 2005).

Quadro 1 – Exemplos de campos magnéticos naturais e artificiais existentes e respectivas intensidades

(adaptado de Dini e Abbro, 2005)

Campos Intensidade Fonte _Referência

0.1-0.3 µT (microTesla)

Residências NRC, 1996

30 µT Linhas de transmissão Simon et al., 1992

30-70 µT Geomagnético Polk e Postow, 1996

50-150 µT Electrodomésticos Frac os (<1mT ) 40-270 µT Estações geradoras Simon et al., 1992

50 mT Reactores de fusão; comboios Maglev

Moderado (1mT

-1T

)

>50 mT Equipamento DC (ex. processos electrolíticos, caminhos de ferro, reactores de fusão, etc.); Polk e Postow, 1996 Forte _(1T-5T ) 1.5-2.5 T Ressonância magnética NRC, 1996 Ultr a-for tes (>5T )

1.2.Interacção dos campos magnéticos com os organismos biológicos

A maioria das tecnologias eléctricas foi desenhada para maximizar a eficiência energética, sem ter em consideração os efeitos biológicos. O rápido aumento de distribuição das mesmas levanta preocupações relacionadas com os possíveis riscos ou desordens funcionais nos sistemas biológicos (Bioinitiative Report, 2007). Os avanços nas últimas décadas elevaram o estatuto da pesquisa biomagnética ao nível de novo campo de investigação emergente. As observações experimentais de efeitos biomagnéticos não podem continuar a ser interpretadas como artefactos, mesmo que os mecanismos moleculares e celulares ainda não sejam claros. O conhecimento actual sobre os efeitos dos campos magnéticos em organismos vivos ainda é diminuto, sendo necessária mais pesquisa (Dini e Abbro, 2005).

Os campos magnéticos são praticamente imperturbáveis pelos tecidos biológicos, dessa forma interagem directamente com as moléculas anisotrópicas (polarizadas) ou com materiais ferromagnéticos e cargas em movimento (correntes) (Repacholi et al., 1999). Existem quatro mecanismos pelos quais os campos magnéticos podem interagir com os tecidos vivos (Repacholi e Greenbaurn., 1999):

1. Indução magnética – os campos magnéticos exercem forças que movem iões em solução (ex: electrólitos), dando origem a campos eléctricos e correntes;

2. Efeito magnético-mecânico – os campos magnéticos produzem torções em determinadas moléculas e em qualquer material ferromagnético, tal como a magnetite;

3. Interacções electrónicas – os campos magnéticos conseguem alterar níveis de energia e a orientação da rotação dos electrões.

4. Magnetorecepção – os organismos utilizam sensores para se orientarem no campo geomagnético (Kirschvink et al., 2010).

Existe um elevado número de tentativas para explicar os efeitos biológicos da exposição ao campo magnético nos organismos eucariotas e procariotas a nível molecular (El May et al., 2009). Já foi demonstrado que o campo magnético pode afectar funções biológicas dos organismos através de alterações no crescimento, proliferação e viabilidade celular (Raylman et al., 1996; Potenza et al., 2004b), na morfologia celular, na indução de mutações pontuais do ADN (ácido desoxirribonucleico) (Potenza et al., 2004a), e provocando alterações na quantidade de cálcio (Amara et al., 2004) (quadro resumo no anexo I). Foi também demonstrado que alguns organismos possuem a capacidade de detectar o campo geomagnético e orientarem o seu movimento em função do mesmo, esta orientação pode ser activa ou passiva, magnetorecepção ou magnetotaxia (Komeili, 2007)

1.3.Magnetorecepção e Magnetotaxia

A ideia de os animais conseguirem detectar o campo magnético da terra passou de ser considerada ridícula a ser um facto bem estabelecido em pouco mais de uma geração (Komeili et al., 2007). Dezenas de experiências demonstram actualmente que diversas espécies de animais possuem uma “bússola” interna, exemplo disso é o atum (Walker e tal., 2002), as abelhas (Walker et al., 2002; Kirschvink et al., 2010), os pombos correio (Mora et al., 2002), as trutas (Walker et al., 2002), o peixe zebra, a tilápia (Shcherbakov et al., 2005), os tubarões e as raias (Kirschvink et al., 2010; Meÿer et al., 2005). A forma como os animais sentem o campo magnético permanece um tópico controverso (Kirschvink et al., 2010).

A subsequente identificação de no mínimo dois mecanismos biofísicos plausíveis para a magnetorecepção pelos animais, um baseado na magnetite biogénica e outro nas reacções bioquímicas, levaram a maiores esforços nas ultimas décadas para testar estes dois modelos, assim como para perceber a ultraestrutura e função das possíveis células magnetoreceptoras. Infelizmente, os progressos para entender a magnetorecepção têm tido como desafios (Kirschvink et al., 2010):

(i) A disponibilidade poucas técnicas para analisar as respostas comportamentais dos animais aos campos magnéticos;

(ii) A dificuldade em conseguir resultados reprodutíveis utilizando as técnicas disponíveis;

(iii) A dificuldade em desenvolver e implementar novas técnicas que tragam mais poder experimental.

O único magnetoreceptor conclusivamente demonstrado foi encontrado no fitoplancton e bactérias, estes contêm cadeias de cristais de minerais ferromagnéticos, magnetite (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) (Kirschvink et al., 2010).

A biomineralização de magnetite é um fenómeno bem conhecido, tendo sido inicialmente descoberta em moluscos por Lowenstam (1962). Análises bioquímicas subsquentes mostraram que a magnetite biogénica é um mecanismo viável para a magnetorecepção (Kirschvink et al., 2010; Yorke, 1979). Os cristais de magnetite perfeitamente adequados à magnetorecepção foram encontrados em todos os domínios de

organismo excepto Archaea, com uma variedade de candidatos a receptores nos tecidos animais (Kirschvink et al., 2010).

1.3.1.Bacterias

As bactérias magnetotáticas são um grupo de organismos filogenéticamente e morfologicamente diverso que consegue alinhar o seu sistema de navegação de acordo com o campo geomagnético. Esta característica única é conseguida com a ajuda dos magnetossomas (figura 1), cristais magnéticos rodeados por uma membrana e organizados em cadeias dentro da célula (Komeili, 2007).

Figura 1 – Bacteria magnetotatica. Microfotografia através de microscopia electrónica de transmissão de

Magnetospirillum magneticum. Pode-se observar uma cadeia de partículas magnéticas (magnetossomas) (Komeili, 2007).

Ao examinar uma bactéria magnetotática, recorrendo à miscroscopia electrónica de transmissão, consegue-se observar a base física da magnetotaxia. Cada Bactéria mangnetotática está equipada com uma ou mais cadeias de organelos especializados. Estes organelos consistem em cristais com 30-50 nm de magnetite de óxido de ferro, ou greigite de sulfeto de ferro, rodeados por uma membrana com uma bicamada lipídica (Komeili, 2007). Esta cadeia está fixa dentro da célula permitindo que a bactéria se alinhe passivamente com os campos magnéticos externos. Nos 30 anos seguintes à sua descoberta por Blackemore (Blackemore, 1975), as bactérias magnetotáticas e os magnetossomas têm sido o centro de uma variedade de esforços interdisciplinares com o objectivo de caracterizar e explorar as propriedades magnéticas destes cristais (Komeili, 2007).

Já se observaram desde organismos com apenas um ou dois cristais de magnetite, Magnetossoma

variação considerável na forma dos cristais produzidos, as suas morfologias variam entre formas redondas a formas de bala (Thornhill et al., 1994). Na maioria dos casos, contudo, os cristais magnéticos são quimicamente puros. Já foram identificadas estruturas semelhantes a magnetossomas e minerais magnéticos também em organismos eucarióticos (Kirschvink et al., 2010).

1.3.2.Algas

Um exemplo de algas magnetotáticas encontra-se no gênero Anisonema, estas contêm várias cadeias de magnetite que parecem estar localizadas perto da parede celular. Cada cadeia é um dipolo magnético permanente (Frankel, 1984). Araújo et al. (1986) observaram que as células de Anisonema sp. quando mortas e suspensas em água mantinham a direcção do campo magnético e quando este era trocado as células davam uma volta de 180º.

1.4.Alterações ao nível celular atribuídas à exposição a campos magnéticos 1.4.1.Cálcio

O fluxo de iões é considerado por vários autores um dos principais alvos das radiações magnéticas em diversos modelos experimentais (Rosen e Rosen, 1990; Fanelli et al., 1999; Teodori et al., 2002a; Chionna et al., 2003). A acção dos campos magnéticos nos sistemas biológicos poderá estar ligada a propriedades da estrutura molecular da membrana como a anisotropia magnética (Dini e Abbro, 2005) ou propriedades diamagnéticas (ex: rotação das moléculas de fosfolipidos da membrana) (Rosen, 2003). O efeito dos campos magnéticos na estrutura molecular das membranas excitáveis pode ser o suficiente para modificar a função dos canais iónicos. (Rosen, 2003).

Durante mais de uma década de pesquisa sobre os efeitos dos campos magnéticos nos sistemas biológicos tem-se conseguido compilar dados que demonstram o envolvimento das vias de sinalização de Ca2+ (ião cálcio) como alvo primário dos mesmos. Estaé uma das principais vias de sinalização intracelular, o que torna esta descoberta de elevada relevância fisiológica (Dini e Abbro, 2005). As propostas de efeitos fisiológicos das alterações de Ca2+ devido à exposição a campos magnéticos variam de autor para autor. Já foram demonstradas alterações na função ciliar (Rosen e Rosen, 1990), alterações na taxa de proliferação celular (Dini e Abbro, 2005), alterações na frequência de apoptose (Fanelli et al., 1999; Teodori et al., 2002a,b; Chionna et al., 2003; Bian et al., 1997; Buemi et al., 2001; Tenuzzo et al., 2009) e alterações morfológicas (Popov et al., 1991; Santoro et al., 1997).

Com a aplicação de campos magnéticos foi observado um aumento na sobrevivência das células por inibição da apoptose através da modulação da entrada Ca2+ na célula (Fanelli et al., 1999; Teodori et al., 2002a,b; Chionna et al., 2003). Os fluxos de Ca2+ são cruciais como mediadores na sinalização para o desenvolvimento da apoptose. Um aumento na quantidade de Ca2+, devido à libertação do Ca2+ intracelular e à entrada de Ca2+ do meio extracelular, é um fenómeno geral na apoptose (Bian et al., 1997). Em muitos tipos celulares foram medidas elevadas concentrações de Ca2+ após a exposição simultânea a campos magnéticos e drogas apoptogénicas. Contudo, o papel do aumento de Ca2+ durante a apoptose é ambíguo pois tem efeitos diferentes em sistemas celulares diferentes (Fanelli et al., 1999). Assim, um aumento no Ca2+ acompanha a apoptose quer possua um papel anti-apoptótico ou pró-apoptótico (Teodori et al., 2002a,b). A escolha do

sistema celular pode explicar os diversos resultados relatados por outros investigadores que em contraste falharam na detecção de efeitos apoptóticos dos campos magnéticos (Teodori et al., 2002a,b; Buemi et al., 2001).

O aumento e a mobilização de Ca2+ no interior das células devido à exposição aos campos magnéticos pode também ser responsável por alterações morfológicas como microvilosidades lamelares. Alguns dos estudos disponíveis sugerem que o mecanismo de reorganização e quebra de diferentes elementos do citoesqueleto poderá estar relacionado com a modificação da homeostasia do Ca2+, ou com a alteração do estado fosforilado vs desfosforilado das proteínas (Popov et al., 1991; Santoro et al., 1997). O aumento e a mobilização de Ca2+ durante a exposição aos campos magnéticos pode causar, directa ou indirectamente, a reorganização de microfilamentos, de microtúbulos e alterações no formato celular (Dini e Abbro, 2005).

Apesar da interacção dos campos magnéticos com a membrana celular, a transferência de energia para o Ca2+, pode ser explicada a nível físico através de diversos modelos, a incerteza encontra-se no local da interacção bioquímica dos campos magnéticos. Contudo, através do conhecimento actual de dados experimentais e teorias, podem ser definidas três propriedades essenciais da interacção bioquímica (Dini e Abbro, 2005):

(i) O sistema de interacção deve conter uma molécula de Ca2+ ou uma estrutura que envolva uma sinalização de Ca2+;

(ii) O local de interacção deve exibir uma ligação muito fraca ao Ca2+, no entanto o efeito biológico global da deslocação deste tem de ser de elevada relevância biológica;

(iii) O mecanismo de interacção deve exibir propriedades moleculares, permitindo a diferenciação da energia térmica por oposição à energia proveniente dos campos magnéticos.

1.4.2.Expressão genética

A expressão genética diferencial é o componente central, comum a todos os sistemas biológicos, que permite a resposta correcta sob condições normais assim como a adaptação a condições de stress (incluindo a exposição aos campos magnéticos) (El May et al., 2009). Foram referidas possíveis alterações da expressão genética relativamente à apoptose (Dini e Abbro, 2005; Tenuzzo et al., 2009; Jajte et al., 2002; Miyakoshi et al., 2005; Potenza et al., 2004b), às proteínas do choque térmico (Chow e Tung, 2000; Li et al., 2001; Carlo et al., 2002; Miyakawa et al., 2001; Lin et al., 1997; Pipkin et al., 1999) e aos indicadores de stress (El May et al., 2009) devido à exposição a campos magnéticos.

A apoptose, uma forma distinta de morte celular, é executada e regulada por vários grupos de proteínas. A família de proteínas bcl-2 é o principal regulador do processo apoptótico, actuando quer como inibidor quer como promotor (Yokoyama et al., 2002). Os membros da família bcl-2 pró- e anti-apóptóticos devem funcionar em harmonia para manter a regulação da maquinaria apoptótica, os seus níveis são determinantes para destino celular (Nuñes e Clarke, 1994). Existem muitos outros genes, tais como p53 e bax, assim como os genes relativos ás proteínas de choque térmico (ex: hsp70) que estão envolvidos na regulação da apoptose (Hofseth et al., 2004; Tenuzzo et al., 2009). Até à data, poucos dados têm sido publicados sobre os efeitos dos campos magnéticos na expressão genética em geral, e nos genes relacionados com a apoptose em particular (Tenuzzo et al., 2009).

Tenuzzo et al. (2009) induziu a apoptose em linfócitos humanos (isolados há 1 dia e há 5 dias) e expôs os mesmos a um campo magnético de 6 mT. Observou dois efeitos principais:

(i) Modulação da expressão de genes relacionados com a apoptose (bcl-2, bax, p53 e hsp70);

(ii) Maior sensibilidade das células mais antigas.

Os campos de intensidade moderada utilizados por Tenuzzo et al. (2006 e 2009) e Jajte et al. (2002) por si só não interferiam com a taxa de proliferação ou de morte celular, nomeadamente com a apoptose. Contudo, verificou-se que os campos magnéticos podem induzir dramáticas alterações na resposta de morte celular quando as células estão simultaneamente expostas a campos magnéticos e a drogas que se sabe induzirem a apoptose, demonstrando um efeito sinergético (Tenuzzo et al., 2009; Jajte et al., 2002). A

extensão variável do aumento vs diminuição da expressão dos genes apoptóticos, sugere um complexo, ainda não completamente elucidado, processo metabólico após a exposição a campos magnéticos de 6 mT (Tenuzzo et al., 2009).

Os dados publicados relativamente ao efeito dos campos magnéticos na expressão de proteínas do choque térmico são equívocos. As dificuldades em interpretar os dados podem ser ilustradas através de estudos em que usaram as células HL60 (leucemia promielocítica humana) para investigar a expressão das proteínas de choque térmico. Pipkin et al. (1999) descobriram que a intensidade do campo magnético é um factor importante: 1mT activa uma resposta das proteínas de choque térmico, enquanto 100 µT é insuficiente. Em contraste, Lin et al. (2001) encontraram um efeito a intensidades muito baixas (8 µT), e Miyakoshi (2000) não encontrou nenhum efeito com intensidades superiores a 50 mT.

A resposta celular aos campos magnéticos de diferentes intensidades pode ser afectada por diversos factores, incluindo a intensidade e duração da exposição ou o tipo celular usado para aceder à resposta. Actualmente não é possível prever qual o factor ou combinação de factores que podem desencadear uma resposta biológica (Coulton et al., 2004). Existem vários estudos (Chow e Tung, 2000; Li et al., 2001; Carlo et al., 2002; Miyakawa et al., 2001; Lin et al., 1997; Pipkin et al., 1999) que relataram, tal como Pipkin et al. (1999) e Li e Chow. (2001) alterações na expressão das proteínas de choque térmico, numa gama variada de tipos celulares, após a exposição a diferentes campos magnéticos. Outros tal como Miyakoshi et al. (2000; 2005) (Kang et al., 1998; Morehouse and Owen, 2000; Shi et al., 2003; Bodega et al., 2005) não encontraram evidências de que a exposição a diferentes campos magnéticos induzisse a expressão de genes que codificam para as proteínas do choque térmico. Como forma de sensibilização celular Coulton et al. (2004) expuseram as células a 40ºC, mas não obteve alterações na expressão genética devido à exposição ao campo magnético.

El May et al. (2009) observaram uma super-expressão dos genes rpoA, katN e dnaK após 10 horas de exposição a campos magnéticos de 200 mT, a mesma super expressão foi observada por Chow e Tung (2000) e Del Re et al. (2006). A super-expressão dos genes rpoA, dnaK e katN sugere um estado de stress das células quando expostas ao campo magnético (El May et al., 2009).

Os resultados contraditórios encontrados na bibliografia sobre os efeitos dos campos magnéticos na expressão genética podem dever-se a variadas condições experimentais tais como o tempo de exposição, intensidade e gradiente dos campos aplicados (Tenuzzo et al., 2009). Por exemplo, Hirose et al. (2003) observaram que a exposição a um campo homogéneo de 10 T foi incapaz de alterar a expressão dos genes c-Jun, c-Fos e c-Myc, enquanto um campo magnético não homogéneo de 6 T aumentou de forma significativa a expressão de c-Jun, utilizando tempo de exposição mais longo.

1.4.3.Morfologia Celular

As modificações na configuração das células e na membrana plasmática como consequência dos campos magnéticos já foram observadas em vários tipos celulares (Hamada et al., 1989; Paradisi et al., 1993; Santoro et al., 1997; Lisi et al., 2000; Chionna et al., 2003; Rieti et al., 2004).

Tem-se demonstrado que a exposição de neurónios a campos magnéticos acima de 5T levam à contracção das células neuronais, retracção da neurite e eventualmente à morte celular (Prina-Mello et al., 2006; Valiron et al., 2005). Contudo, segundo Khodarahmi et al. (2010) a viabilidade de astrócitos expostos por mais de 3 dias a 2.1T permaneceu intacta. Esta discrepância pode estar relacionada com variados factores, por exemplo o baixo campo magnético usado por Khodarahmi et al. ou os diferentes tipos celulares utilizados.

Os microtúbulos e os filamentos de actina estão entre as estruturas celulares que possuem características diamagnéticas. Foi demonstrado experimentalmente que os mesmos se alinham in vitro quando expostos a campos magnéticos acima de 5 (Bras et al., 1998) e 12T (Torbet e Dickens, 1984). Dessa forma, foram considerados como possíveis alvos celulares de campos magnéticos fortes (Valiron et al., 2005). Como os astrócitos diferem das células neuronais ao nível destas macromoléculas, podem-se esperar diferentes reacções dos astrócitos aos campos magnéticos quando comparados com os neurónios (Khodarahmi et al., 2010).

A exposição de Escherichia coli e Paracoccus denitrificans a um campo magnético de 10 mT (Fojt et al. 2009), ambas durante uma hora, não revelaram quaisquer alterações na proliferação nem na morfologia celular (Bodega et al., 2005). Já a exposição a campos magnéticos de 300mT alteram a proliferação de Escherichia colli.

1.4.4.Viabilidade e Crescimento Celular

Strašák et al. (2002) verificaram que os campos magnéticos (2.7 – 10 mT durante 0 – 12min.) podem afectar a bactéria Escherichia colli, não existindo diferenças significativas entre o efeito de um campo homogéneo ou não-homogéneo. O efeito observado não é bacteriostático, dado que o número de bactérias aumenta durante a exposição da cultura ao campo magnético, mas esse aumento é menor que o verificado na cultura controlo. Os resultados obtidos por Fojt et al. (2007) estão de acordo com os Strašák et al., no entanto, Fojt et al. (2007) encontraram diferenças entre estirpes bacterianas Gram positivas e Gram negativas. O número de unidades formadoras de colónias (UFC) diminui cerca de 20% nas estirpes Gram positivas e cerca de 30-40% nas estirpes Gram negativas quando expostas a um campo magnético de 10 mT durante 24 minutos. Já Aldinucci et al. (2003) e Wiskirchen et al. (1999) afirmam que os campos magnéticos superiores a 5T têm um efeito residual ou nulo no crescimento celular.

Os resultados obtidos por Strašák et al. (2002) demonstram que os campos magnéticos não possuem efeito no metabolismo, o menor crescimento de Escherichia colli quando exposta a campos magnéticos deve-se à morte celular de uma parte das bactérias. Já Motta et al. (2001), verificaram um aumento da actividade metabólica, e consequentemente no crescimento de Saccaromyces cerevisae quando exposta a um campo magnético de 220 mT durante 12 horas (Motta et al., 2001; Motta et al., 2004). Um resultado contrário foi observado aquando da exposição de Saccaromyces cerevisae a 110 mT durante 22 horas, nestas condições tanto a taxa metabólica como o crescimento de

Saccaromyces cerevisae diminuem (Motta et al., 2001).

1.4.5.Fotossíntese

Os resultados obtidos por Hirano et al. (1998) sugerem que os campos magnéticos aceleram a excitação da clorofila, a produção de pares de radicais, as reacções de transferência de electrões, e a conversão de energia luminosa em energia química. Da mesma forma Takashi et al. investigaram a relação entre o crescimento da alga verde

Chlorella e a intensidade de campo magnético, e concluíram que a activação luminosa da

clorofila era superior a intensidades magnéticas abaixo dos 10 mT (Takashi et al., 1985). Em Spirulina platensis esta activação da excitação luminosa da clorofila está fortemente relacionada com o efeito dos campos magnéticos na concentração do pigmento

fotossintético ficocianina. Aparentemente os campos magnéticos não possuem nenhum efeito no conteúdo de clorofila e β-caroteno (Hirano et al. 1998). O conteúdo de ficocianina foi máximo com um campo de 10 mT, e diminuiu com o aumento de intensidade do campo magnético. Tendo em consideração a aceleração da evolução da taxa de O2 durante a exposição aos campos magnéticos, deduziram que o aumento na quantidade de ficocianina possui um papel importante na activação do fotossistema II. Esta é uma das responsáveis pela a activação das reacções de transferência electrónica durante a fotossíntese com intensidades de campo magnético acima dos 10 mT (Hirano et al. 1998).

O crescimento de Spirulina platensis foi inibido com um campo magnético de 40-70 mT mediado pelo declínio funcional da membrana de tilacóides, devido à inibição da síntese de gliceroglicolípidos, ficocianina e açúcares. O campo magnético não teve qualquer impacto quando Spirulina platensis foi cultivada de uma forma heterotrófica (Hirano et al. 1998).

1.4.6.Estudos com algas e cianobactérias

Poucos estudos foram conduzidos sobre o efeito dos campos magnéticos nas algas, e os que existem estão principalmente relacionados com a redução do crescimento de algas em piscinas ou com a filtração magnética da água (Wang et al., 2008).

Wang et al. (2008) observaram um aumento significativo no crescimento de

Chlorella vulgaris (clorófita unicelular) quando exposta a campos magnéticos entre 10 e

35 mT. Com a exposição a intensidades entre 45 e 50 mT a diferença entre o crescimento das células expostas a campos magnéticos e o controlo diminuiu. Newman e Watson (1999) demonstraram que Cladophora glomerata (clorófita filamentosa) quando exposta a um campo magnético de 190 mT durante 28 dias diminui o seu crescimento, mas uma exposição de apenas 4 dias não induz qualquer efeito.

Li et al. (1998, 2007) observaram os efeitos dos campos magnéticos no crescimento da cianobactéria Spirulina platensis. Em ambos os testes, observaram-se diferenças no valor de campo que induz o crescimento máximo. As observações efectuadas por Li et al. (1998) indicam o crescimento máximo com um valor de campo de 250 mT, enquanto as observações descritas em 2007, indicam o crescimento máximo com um campo de 10 mT, sendo o crescimento inibido acima dos 40 mT, estando estas últimas em concordância com o observado por Hirano et al. (1998).

1.5.Controvérsia dos resultados

As células e os organismos possuem a capacidade de responder a um amplo espectro de estímulos ambientais e de stress, incluindo os campos magnéticos, através de alterações intra e extra-celulares (Saffer e Phillips, 1996). As alterações podem ser classificadas de irreversíveis vs reversíveis ou estruturais vs funcionais. As modificações celulares e moleculares existentes devido à interacção dos campos magnéticos com o material biológico são, contudo, dependentes da duração e tipo de exposição, da penetração nos tecidos, da geração de calor, que por sua vez está relacionada com a intensidade e frequência do campo magnético e do tipo de células expostas (Dini e Abbro, 2005; Cossarizza et al., 1989; Walleczek e Liburdy, 1990).

São poucos os estudos existentes relativamente ao efeito dos campos magnéticos a nível celular, o que dificulta uma avaliação clara. Os estudos publicados até ao momento variam na intensidade do campo, no tempo de exposição e também no tipo de células utilizado, o que impossibilita uma comparação directa entre os mesmos (Miyakoshi et al., 2005). Muitas das tentativas existentes de reprodução dos resultados observados foram infrutíferas (Repacholi e Greenebaum, 1999). A exposição aos campos magnéticos não é um factor de stress universal como a temperatura (Coulton et al., 2004), pode ser necessária a sensibilização celular para a observação de efeitos biológicos devido à exposição ao campo magnético, ou para ampliar os efeitos existentes (Junkersdorf et al., 2000; Gutzeit, 2001). É contudo necessário um conhecimento total dos efeitos biológicos (positivo ou negativo) dos campos magnéticos nos organismos vivos (Dini et al., 2005).

1.6. Âmbito e motivação da investigação

Apesar da existência de vários estudos sobre o efeito do campo magnético em diferentes tipos celulares e organismos, ainda não existem estudos que permitam a comparação de resultados. Os estudos existentes focam diferentes efeitos, em diferentes tipos celulares e utilizando diferentes campos magnéticos. Torna-se assim necessário um estudo onde se possa comparar o efeito de várias intensidades de campo magnético num dado tipo celular, e onde também se comparem os efeitos de determinada intensidade de campo magnético em tipos celulares diferentes. Outra lacuna na maioria dos estudos existentes é a falta de controlo das condições externas. O campo magnético não é um factor de stress universal (Coulton et al., 2004) e torna-se essencial que todos os estudos tenham condições bem definidas e controladas.

Este trabalho teve como objectivo inicial estabelecer um protocolo e condições experimentais adequadas à avaliação do efeito de campos magnéticos de várias intensidades (50, 100, 200 e 250 mT) no crescimento e morfologia de três espécies, representando grupos distintos dentro das clorófitas: Spirogyra sp., Pandorina morum,

Pediastrum duplex. Através dos dados recolhidos pretende-se ainda definir um valor

mínimo de intensidade de campo magnético para a existência de alterações no crescimento. Verificar se existe uma relação entre os diferentes tipos de clorófitas e o efeito causado e finalmente perceber se é necessário algum tipo de sensibilização celular para que se observarem efeitos nas diversas espécies. Os dados recolhidos durante este estudo fazem parte de um estudo mais aprofundado que pretende identificar alterações na taxa fotossintética de algumas clorófitas devidas à exposição aos campos magnéticos.

2. Material e métodos

O termo algas designa um conjunto polifilético de organismos predominantemente fotossintéticos com variadíssimas morfologias, que não se adequa a uma classificação filogenética moderna (anexo II). Estima-se existirem cerca de 1 a 10 milhões de espécies de algas (Barsanti e Gualtieri, 2006), que contribuem com aproximadamente 40-50% do oxigénio da atmosfera, sendo na sua maioria micro algas (Barsanti e Gualtieri, 2006). Em termos económicos, as algas representam aproximadamente 22% dos 39.4 milhões de toneladas métricas dos produtos de aquacultura vendidos em todo o mundo (Andersen, 2005). Muitas algas de água doce são utilizadas como bioindicadores devido à sua resposta rápida e previsível a alterações ambientais (Bellinger e Singer, 2010).

Neste estudo utilizaram-se três espécies dulçaquícolas pertencentes à divisão clorófita, Spirogyra sp., Pediastrum duplex Meyen e Pandorina morum (O. F. Müller) Bory (quadro 2). As algas verdes (clorófitas) são um dos grupos mais diversificados dos eucariotas caracterizadas pela presença de cloroplastos com duas membranas, tilacóides empilhados e clorofilas a e b. Encontram-se distribuídas por todo o mundo e podem ser encontradas em praticamente todo o tipo de habitat das regiões do árctico ao antárctico, dos oceanos aos lagos de água doce, assim como em solos de áreas temperadas e áridas. Acredita-se que as plantas terrestres derivam directamente de um grupo de clorófitas de água doce (Barsanti e Gualtieri, 2006).

2.1.1.Spirogyra sp.

Spirogyra sp. (figura 2) ocorre numa grande

variedade de habitats, onde se encontra tipicamente ligada a um substrato estável ou como um manto flutuando livremente (Lembi et al., 1988). A espécie utilizada neste estudo, possui células cilíndricas, com um diâmetro de aproximadamente 15µm e cerca de 35 µm de comprimento, que se juntam nas extremidades para formar um filamento não ramificado. As paredes celulares são firmes, com um septo plano e possui uma 30 µm

Figura 2 – Fotografia de Spirogyra sp.

utilizando microscopia óptica (Zeiss Axiovert S100 TV equipado com uma sensicam 12 Bit Cooled Imaging).

camada de mucilagem no exterior, dando-lhe uma superfície viscosa. Possui apenas um cloroplasto com formato em hélice. O núcleo é normalmente visível e encontra-se no centro da célula. Os filamentos podem ser fragmentados, originando-se um novo filamento a partir de cada fragmento. A reprodução sexuada na Spirogyra ocorre através da conjugação entre células de filamentos diferentes e resultam na produção de um zigoto resistente. Para a identificação da espécie é essencial a observação do zigoto (Bellinger e Singer, 2010; Transeu, 1951).

2.1.2.Pandorina morum

As colónias de Pandorina morum (figura 3), comuns no plâncton, possuem uma forma esférica com 16 células densamente empacotadas. As células encontram-se envolvidas numa banda larga de mucilagem através da qual sobressaem dois flagelos de cada célula. As células podem-se dividir e formar colónias filhas que depois se libertam (Bellinger e Singer, 2010). Pandorina morum encontra-se na lista de Palmer (1969) das 10 espécies mais tolerantes à poluição orgânica.

2.1.3.Pediastrum duplex

Pediastrum duplex (figura 4) é uma alga colonial

planctónica que forma placas circulares (Bellinger e Singer, 2010), encontra-se em águas paradas, como lagos, de uma grande variedade de habitats ricos em nutrientes (Bellinger e Singer, 2010). A parede celular contém polímeros de ácidos gordos e alguma sílica, sendo por isso muito resistente e persistindo por algum tempo após o conteúdo ter desaparecido (são das poucas algas verdes com registos fósseis) (Gelin et al., 1997).

20 µm

Figura 3 – Fotografia de Pandorina

morum utilizando microscopia óptica (Zeiss Axiovert S100 TV equipado com uma sensicam 12 Bit Cooled Imaging).

Figura 4 – Fotografia de Pediastrum

duplex utilizando microscopia óptica de contraste interferencial (Zeiss Axioplan 2 imaging, equipado com uma câmara Olympus DP70).

Quadro 2 – Lista de espécies utilizadas e respectivas características

Espécie Estirpe Origem Características

Spirogyra sp. ACOI strain:2538

(Santos, M.)

Moncorvo, Portugal (2004)

Filamentosa;

Filamentos sem ramificações; Cloroplastos em hélice;

Pediastrum duplex (Calado, S.) Charcos artificiais em

Aveiro, Portugal (2009)

Colonial;

Flagelada apenas durante a formação de novas colónias;

Pandorina morum (Calado, S.) Charcos artificiais em

Aveiro, Portugal (2009)

Colonial;

Todas as células são flageladas;

2.2.Condições de cultura

As diferentes espécies utilizadas foram escolhidas não apenas pelas suas características particulares, descritas anteriormente, mas também pela sua disponibilidade em cultura e rápido crescimento. Todas as culturas foram mantidas num espaço criado para o efeito (figura 5) a uma temperatura de 20±1 ºC (manteve-se a temperatura recorrendo ao uso de ar condicionado), com um ciclo de luz/escuro de 13/11 horas e com uma intensidade de aproximadamente 10 µmol.m-2.s-1. A

Spirogyra sp. foi cultivada em meio LC oligo (anexo

III), enquanto que Pediastrum duplex e Pandorina

morum foram cultivadas em meio L16 suplementado

com vitaminas (anexo III). Repicaram-se regularmente as culturas stock, a crescer em frascos T, de forma a providenciar uma fonte contínua de células a crescer a uma taxa razoavelmente constante.

2.3.Descrição do dispositivo experimental

O campo magnético aplicado às amostras foi produzido por um electroíman arrefecido (figura 7) através da circulação de ar nas bobines, este sistema permite manter a temperatura estável nos pólos, ou seja no local da amostra. Este sistema funcionou com dois tipos de iluminação, através de LED (díodo emissor de luz) e iluminação fluorescente, dependendo da amostra a testar, mas em ambos os casos com uma intensidade de aproximadamente 16 µmol.m-2.s-1. As características do electroíman, homogeneidade do

Figura 5 – Fotografia do espaço de

campo magnético e temperatura no local da amostra foram testadas para as diferentes intensidades de campo magnético utilizadas.

Foi criado um espaço de controlo (figura 6), com condições de luz e temperatura semelhante ao espaço de cultura. Tanto no electroíman como no espaço controlo foi utilizado um sistema de termopares para medir a temperatura. Todo este sistema foi montado e optimizado numa sala fechada, com a temperatura controlada através da utilização de ar condicionado, no laboratório de materiais não cristalinos do departamento de Física da Universidade de Aveiro pelo professor Sushil Kumar Mendiratta e pelo Eng.º Mestre Jorge Monteiro.

Figura 7 – Fotografia do electroíman

utilizado para aplicar o campo magnético nas amostras. Pode-se observar uma placa com amostras entre os pólos e a iluminação utilizando LEDS.

Figura 6 – Espaço controlo com iluminação de

2.4.Procedimento experimental 2.4.1.Spirogyra sp.

Cortaram-se placas de 96 poços com um formato redondo, semelhante ao dos pólos do electroíman. Lavaram-se e esterilizaram-se as caixas através de luz ultra-violeta. Retiraram-se vários filamentos da cultura stock e cortaram-se, com a ajuda de pequenos pedaços de vidro, de forma a ficarem com tamanhos que variaram entre 1 a 5 células. Cada filamento foi colocado num dos poços das duas placas e preencheu-se cada poço com meio semi-sólido LColigo (Popovsky e Pfiester, 1990) (espessado através da adição de 3% de agar). Cobriram-se as placas com película aderente, de forma a evitar a evaporação e manter a passagem de luz. Colocou-se uma das placas no electroíman com um campo magnético 0 mT (controlo) com iluminação de LEDS e outra no espaço controlo com iluminação fluorescente. Efectuaram-se observações diárias recorrendo a um microscópio invertido (Zeiss Axiovert S100 TV) e utilizando ampliações de 320 ou 500 ×, registou-se o número de células em cada filamento, assim como as células em que ocorreu mitose. Utilizando uma sensicam (12 Bit Cooled Imaging) adaptada ao microscópio efectuou-se um registo fotográfico das células que sofreram mitose. Esta observação ocorreu apenas em 3 mitoses consecutivas, pois só se conseguem manter os filamentos de Spirogyra sp. fixos no porta-amostras enquanto estes possuem tamanhos reduzidos (até cerca de 20 células). Definiu-se um tempo máximo de teste de 1 mês, por questões logísticas. Repetiu-se o procedimento utilizando diferentes iluminações. E posteriormente utilizando diferentes campos magnéticos, com intensidades de 50, 100 e 250 mT e iluminação LED, enquanto se utilizou iluminação fluorescente no espaço controlo. Apenas existe um electroíman e portanto não é possível correr mais de uma experiência em simultâneo. Durante a observação ao microscópio foi também registada a existência de alterações morfológicas.

2.4.2.Pediastrum duplex e Pandorina morum

A avaliação dos efeitos do campo magnético nas espécies Pediastrum duplex e

Pandorina morum efectuou-se segundo o mesmo protocolo e em paralelo. Cortaram-se

placas de 24 poços ao meio de forma a se ajustarem ao tamanho dos pólos, seguidamente lavaram-se e esterilizaram-se as mesmas recorrendo à utilização de luz ultra-violeta. Das culturas stock (Pediastrum duplex e Pandorina morum) retirou-se 0,5 mL de cultura para cada um dos 7 poços das placas de cultura, 4 poços para as amostras colocadas no espaço controlo e 3 poços para as amostras colocadas no electroíman, e juntou-se 1,5 mL de meio L16 suplementado com vitaminas (Lindström, 1991). Fecharam-se as caixas com Parafilm, evitando dessa forma a evaporação. Colocaram-se as duas placas durante aproximadamente 5 dias (para entrarem na fase exponencial) nas mesmas condições que as culturas stock, após esse período transferiu-se a placa com apenas 3 amostras para o electroíman com um campo de 0 mT (controlo) e outra para o espaço controlo. Utilizaram-se lâmpadas fluorescentes na iluminação das amostras colocadas no electroíman, excepto nos testes preliminares. O procedimento de contagem celular foi adaptado de Guillard e Siereacki (2005), de 48 em 48 horas retiraram-se 100µL de cada uma das amostras que se diluíram em 900µL de água destilada. As amostras foram posteriormente fixadas com soluto de Lugol, seguidamente contaram-se recorrendo a uma câmara de Sedgwick-Rafter utilizando uma ampliação entre 100-200 ×. O procedimento foi repetido utilizando diferentes iluminações, e campos magnéticos com intensidades de 100, 200 e 250 mT com iluminação fluorescente. No teste preliminar, que compara a iluminação de fluorescência e os LEDS, as amostras utilizadas não tiveram o período de adaptação no espaço controlo para atingirem a fase exponencial. Regularmente efectuaram-se observações ao microscópio com o intuito de registar a existência de alterações morfológicas.

3.5.Técnicas de análise de dados

A taxa de crescimento foi calculada de duas formas, apenas para a fase exponencial das curvas de crescimento, utilizando a seguinte expressão (Guillard e Siereacki, 2005):

µ=(Ln (Nf) – Ln (N0))/t Onde: µ é a taxa de crescimento

Nf é a concentração final de colónias/mL N0 é a concentração inicial de colónias/mL

e através do declive da curva corresponde ao logaritmo neperiano da concentração das amostras.

Os valores de estimulação (%) foram calculados utilizando a seguinte expressão (Guillard e Siereacki, 2005):

S=((( µi- µc)/ µc) ×100) Onde: S é o valor da estimulação em percentagem

µi é a taxa de crescimento da amostra exposta ao campo magnético de intensidade i

µc é a taxa de crescimento da amostra controlo

Efectuou-se a análise estatística utilizando o programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 15 para o Windows. Testou-se a validade dos resultados utilizando a análise ANOVA e o teste t-student sempre com um intervalo de confiança de 95%.

3.Resultados e discussão

O electroíman foi desenhado de forma a conseguir minimizar o aquecimento provocado pela corrente eléctrica que circula na bobine. Através do gráfico da figura 8 pode-se verificar que até uma intensidade de campo magnético igual a 250 mT a diferença entre a temperatura nos pólos e na sala se mantém praticamente constante, o que não se verifica com intensidades superiores a 250 mT, sendo este o factor de restrição da intensidade de campo magnético utilizado nas várias exposições.

17,6 18 18,4 18,8 19,2 19,6 20 0 50 100 150 200 250 300 350 Campo magnético (mT) Te m p e ra tur a ( ºC )

Figura 8 – Variação da temperatura no electroíman consoante a variação do campo magnético.

(▲) Temperatura da sala; (●) Temperatura no electroíman 15 minutos após a aplicação do campo magnético; (■) Temperatura no electroíman 30 minutos após a aplicação do campo magnético.

Foi também verificada a homogeneidade do campo magnético nos pólos para as diferentes intensidades de campo utilizadas. Na tabela 1 é possível verificar uma diminuição da homogeneidade do campo magnético nos pólos com o aumento da intensidade do mesmo. Verifica-se que à medida que o campo magnético vai aumentando de intensidade, as variações são superiores na periferia dos pólos. Os pólos possuem um diâmetro de cerca de 7 centímetros, e os poços utilizados para colocar as amostras ocupam no máximo 6 centímetros, ou seja dado que as amostras são sempre colocadas no centro dos pólos, nenhuma amostra fica sujeita à variação de intensidade de campo magnético observada nas extremidades. Os valores de variação até 3 centímetros do centro, local onde são colocadas as amostras, quando comparados com o valor de intensidade de campo

magnético no interior correspondem a menos de 15%. O campo magnético aplicado ás amostras era continuo uniforme.

Tabela 1 – Intensidade de campo magnético nos pólos do electroíman.

Centro 1cm do centro 2cm do centro 3cm do centro 3,5cm do centro 0 mT 0 mT 0 mT 0,5 mT 1 mT

50 mT 50,4 mT 51,5 mT 60 mT 85 mT 100 mT 100,3 mT 102 mT 110 mT 150 mT 200 mT 201 mT 205 mT 220 mT 270 mT 250 mT 252 mT 260 mT 280 mT 350 mT

Foram também medidos os valores de campo magnético no espaço de cultura e no espaço controlo, sendo os mesmos de 0,23 mT no espaço de cultura e de 0,065 mT no espaço controlo. Segundo Polk et al. (1996) o campo geomagnético possui valores entre 0,03 mT e 0,07 mT, ou seja o campo magnético no espaço de controlo está dentro dos valores de campo geomagnético.

3.2 Testes Preliminares de Spirogyra sp.

Spirogyra sp. é encontrada numa grande variedade de habitats (Lembi et al., 1988),

dado que não necessita de condições especificas para o seu crescimento (Bellinger e Singer, 2010), é uma alga fácil de manter em cultura. Como não possui movimento próprio nem ramificações é ideal para estudos dos efeitos direccionais do campo magnético. Os seus cloroplastos em forma de hélice são um alvo para a observação de alterações morfológicas.

Inicialmente tentou-se obter curvas de crescimento para Spirogyra sp. através do aumento de tamanho das células. Fotografaram-se as células com a sensicam adaptada ao microscópio invertido e posteriormente mediam-se as diferentes células. Este procedimento foi abandonado devido à inexistência de um software que possibilitasse a medição do tamanho celular automaticamente, conseguindo assim uma análise menos morosa e com um maior número de indivíduos.

Foram realizados vários testes com o intento de comparar o crescimento de

Spirogyra sp,. no espaço controlo e no electroíman, exposta a um campo de intensidade de

0 mT com dois tipos distintos de iluminação (LEDS brancos e lâmpadas fluorescentes). As lâmpadas fluorescentes são a iluminação comummente utilizada em culturas de algas. Os LEDS por sua vez representam um tipo de iluminação que produz menos calor, mais pequeno e por isso mais facilmente adaptável ao electroíman, tendo ainda a potencialidade de utilizar comprimentos de onda mais específicos. Observou-se uma diferença estatisticamente significativa (intervalo de confiança de 95%) no tempo médio entre mitoses das amostras com a iluminação LED comparando com as amostras com uma iluminação fluorescente (gráfico da figura 9). Foi observado um tempo entre mitoses menor, ou seja um crescimento superior das amostras com iluminação fluorescente.

Figura 9 – Tempo médio entre duas mitoses em Spirogyra sp. com diferentes iluminações, LEDS e

Fluorescente.

Nas experiências realizadas para comparação do crescimento de Spirogyra sp. quando exposta a diferentes campos magnéticos utilizou-se iluminação LED com uma intensidade luminosa de 16 µmol.m-2.s-1. No espaço controlo utilizou-se iluminação fluorescente com uma intensidade luminosa de 10 µmol.m-2.s-1. Para controlo utilizaram-se as amostras no electroíman com um campo magnético de intensidade 0 mT.

LEDS Fluorescente 4 3 2 1 0 LEDS Fluorescente 5 4 3 2 1 0 1 2 Tempo méd io en tre mito ses (d ias) 1ª – 2ª mitose 2ª e 3ª mitose

3.3 Efeito do campo magnético sobre a mitose em Spirogyra sp.

Para facilitar a interpretação de resultados, as várias experiências estão esquematizadas na tabela seguinte (tabela 2).

Tabela 2 – Valores de campo magnético no espaço controlo e no electroíman durante o decorrer das várias

experiências.

Campo electromagnético

Experiência Espaço controlo Electroíman

1 0,065 mT 0 mT 2 0,065 mT 50 mT 3 0,065 mT 100 mT 4 0,065 mT 250 mT

A exposição a campos magnéticos de várias intensidades revela um aumento no tempo médio entre duas mitoses consecutivas, ou seja um decréscimo no crescimento (gráficos da figura 10). Utilizando o teste ANOVA, com um intervalo de confiança de 95 %, verificou-se que os tempos médios entre mitoses são estaticamente diferentes. O tempo entre a 1ª e a 2ª mitose aumentou de uma média de 2.46 dias com um campo magnético de intensidade 0 mT, para 4.59 dias com uma intensidade de 50 mT, 6.41 dias com uma intensidade de 100 mT e 17.25 dias com uma intensidade de 250 mT. Já o tempo entre a 2ª e terceira mitose aumentou de uma média de 3.47 dias com um campo magnético de intensidade 0 mT, para 5.15 dias com uma intensidade 50 mT e para 6.18 dias com uma intensidade de 100 mT. Não se observou o tempo entre a 2ª e 3ª mitose com 250 mT, pois esta observação ultrapassaria o limite de 1 mês por experiência.

Figura 10 – Tempo médio entre duas mitoses consecutivas em Spirogyra sp. em função da

intensidade de campo magnético aplicado (mT).

3 2 1 8 6 4 2 0 4 3 2 1 25 20 15 10 5 0 1 2 Tempo méd io en tre mito ses (d ias) 1ª – 2ª mitose 2ª – 3ª mitose

De forma a averiguar se as alterações entre as várias experiências se devem a variações externas ao campo magnético mantiveram-se amostras no espaço controlo, com diferença na iluminação, utilizando uma iluminação fluorescente e de menor intensidade (gráfico da figura 11). Realizando o teste de ANOVA, com um intervalo de confiança de 95 %, não se observaram diferenças significativas entre as várias experiências. Verifica-se assim, que as possíveis variações externas ao campo magnético existentes não afectaram o crescimento de Spirogyra sp..

Figura 11 – Tempo médio entre duas mitoses consecutivas em Spirogyra sp. no espaço de controlo em cada uma das diferentes experiências..

As alterações encontradas no crescimento das amostras expostas no electroíman devem-se ao efeito do campo magnético. Alguns autores referem a necessidade de existir um factor de sensibilização para se poderem observar os efeitos do campo magnético (Junkersdorf et al., 2000; Gutzeit, 2001), estudos posteriores poderão revelar se a iluminação através de LEDS serviu como factor de sensibilização.

Strašák et al. (2002) refere que a diminuição do crescimento de Escherichia colli quando exposta a campos magnéticos se deve à morte celular de uma parte das bactérias. No estudo actual observam-se as células individualmente, podendo identificar com toda a segurança se a consequência da aplicação de campo magnético é a diminuição de crescimento ou a morte de uma parte das células. Dado que não se observou morte celular nas amostras, pode-se portanto afirmar que o efeito é definitivamente de diminuição do crescimento. Tempo méd io en tre mito ses (d ias) 1-2ª mitose 2ª-3ª mitose 1 2 4 3 2 1 3 2 1 0 3 2 1 3 2 1 0

3.4 Testes Preliminares de Pandorina morum

Pandorina morum é uma alga colonial, que possui dois flagelos por célula podendo

movimentar-se livremente (Bellinger e Singer, 2010). Estas características permitem que numa amostra exposta a um campo magnético as colónias se movimentem, assegurando indirectamente, a homogeneidade do campo magnético aplicado á amostra. A movimentação através dos flagelos é por si só um alvo para a influência do campo magnético devido às potenciais alterações de cálcio.

Foram realizados vários testes de forma a comparar o crescimento de Pandorina

morum no espaço controlo e no electroíman. Esta foi exposta a um campo de intensidade 0

mT, com dois tipos distintos de iluminação, LED brancos e lâmpadas fluorescentes. Os vários testes vieram não só demonstrar que o crescimento de Pandorina morum é bastante reduzido com a utilização de LEDS mas também que existem diferenças estatisticamente significativas entre o crescimento no electroíman com um campo magnético de intensidade 0 mT e no espaço controlo (gráficos da figura 12). Diferenças estas relacionadas com a diferença de intensidade luminosa nos dois locais.

Recorrendo ao teste t-student, com um intervalo de confiança de 95%, verificaram-se as diferenças no crescimento de Pandorina morum consoante o tipo de iluminação e o local de crescimento. Ao comparar o crescimento de Pandorina morum sujeita a uma iluminação fluorescente, no espaço controlo, com o crescimento da mesma sujeita a uma iluminação utilizando LEDS, no electroíman, observa-se uma diferença estatisticamente significativa a partir das 74 horas (gráfico 1 da figura 12). Comparando o crescimento de

Pandorina morum no espaço controlo e no electroíman, ambos com iluminação LEDS,

observa-se uma diferença estatisticamente significativa após 218 horas (gráfico 2 da figura 12). Com a utilização de iluminação fluorescente em ambos os locais, a diferença é estatisticamente significativa a partir das 126 horas (gráfico 3 da figura 12). É interessante observar que no teste relativo à iluminação com LEDS nos dois locais se verifica um maior crescimento no espaço controlo, mas no teste com iluminação fluorescente ocorre o inverso, o crescimento é superior no electroíman.

Nota-se que as diferenças relacionadas com o tipo de iluminação são mais significativas que as observadas entre o espaço controlo e o electroíman utilizando o mesmo tipo de iluminação com intensidades luminosas diferentes.

Os resultados descritos anteriormente deixam clara a existência de diferenças entre a taxa de crescimento no espaço controlo e no electroíman, independente do tipo de iluminação utilizada. Pequenas diferenças de temperatura (menores que 0,5 ºC) entre os dois espaços podem ser um factor adicional de variação. Repacholi e Greenebaum (1999) que definiram as condições ideais para o estudo dos efeitos dos campos magnéticos, referem que é aconselhável utilizar dois electroímanes em que se possa reverter a corrente, não produzindo campo magnético mas criando condições semelhante às existentes na amostra sujeita ao campo magnético. Actualmente apenas existe um electroíman, tendo-se optado por considerar como controlo a amostra que se colocou no electroíman com campo 0 mT.

Figura 12 – Curvas de crescimento obtidas para Pandorina morum quando exposta a diferentes iluminações

no espaço de controlo e no electroíman com um campo de 0 mT. Os valores representam a média do número de colónias por mililitro e as barras o coeficiente de variação (desvio padrão). 1 – Iluminação com luz fluorescente no espaço de controlo (azul) e iluminação com LED no electroíman (verde); 2 – Iluminação com LED (azul – amostras no espaço de controlo; verde – amostras no electroíman); 3 – Iluminação com luz fluorescente (azul – amostras no espaço de controlo; verde – amostras no electroíman).

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 33 6 31 4 29 3 26 9 24 0 21 7 19 6 17 0 14 4 12 2 96 74 48 24 0 12500 10000 7500 5000 2500 0 2 93 2 69 2 40 2 18 196 170 144 121 96 73 48 24 0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 24 0 21 6 19 2 16 8 15 0 12 6 96 72 57 24 0

Número de colónias/mL (média)

Tempo (horas)

1 2

3.5 Efeito do campo magnético no crescimento de Pandorina morum

Considerou-se como controlo as amostras expostas no electroíman com campo magnético de 0 mT. Ainda assim foram colocadas amostras no espaço controlo em simultâneo com as amostras colocadas no electroíman.

Para facilitar a interpretação de resultados, as várias experiências estão esquematizadas na tabela seguinte (tabela 3).

Tabela 3 – Valores de campo magnético no espaço controlo e no electroíman durante o decorrer das várias

experiências.

Campo electromagnético

Espaço controlo Electroíman

1 0,065 mT 0 mT 2 0,065 mT 100 mT 3 0,065 mT 200 mT 4 0,065 mT 250 mT

Ao observar isoladamente as taxas de crescimento (calculadas de acordo com o descrito na secção 3.5) das culturas expostas ao campo magnético (gráfico da figura 13), verificam-se alterações com a aplicação de um campo de intensidade 200 mT. As alterações ocorridas com intensidades de 100 e 250 mT não são estatisticamente significativas, o mesmo não ocorre com o aumento observado a 200 mT, neste caso a diferença entre a taxa de crescimento observada com 200 e com 0 mT é estatisticamente significativa. Ao observar as amostras que se encontram no espaço de controlo verificam-se variações verificam-semelhantes, uma diferença estatisticamente significativa na experiência 3 (onde se testou o efeito do campo magnético de 200 mT), enquanto nas experiências 2 e 4 (onde se testou o efeito do campo magnético de 100 e 250 mT, respectivamente) não se observam diferenças estatisticamente significativas. Os resultados descritos, demonstram a existência de no mínimo um factor de variação que não o campo magnético.

Figura 13 – Representação gráfica das taxas de crescimento médias de Pandorina morum durante as

várias experiências no electroíman (♦) e no espaço de controlo (■)

As diferenças entre as taxas de crescimento, com campos magnéticos de várias intensidades em comparação com a taxa de crescimento com um campo magnético de intensidade 0 mT, podem se observar através da percentagem de estimulação, ou seja a estimulação que os campos magnéticos causam nas amostras comparando com o controlo. Na tabela 4 verificamos que com a aplicação de um campo magnético de intensidade 100 mT a estimulação média é de apenas de 1 %, ou seja, praticamente nula. Com um campo magnético de 200 mT a estimulação do crescimento é relativamente elevada, 54 %, e com a exposição a 250 mT existe uma inibição praticamente nula, 7 %. Em concordância com o observado anteriormente, também estes dados variam de forma semelhante nas amostras colocadas no espaço controlo, reforçando a ideia da existência de um factor de variação entre as diversas experiências que não a de intensidade de campo magnético. Dessa forma, a comparação entre as taxas de crescimento das amostras expostas a campos magnéticos de várias intensidades e as amostras expostas a um campo magnético de intensidade 0 mT, por si só, não permite tirar conclusões.

0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 0,008 0 1 2 3 4 5 Experiência T a xa d e cr esci m e n to

Tabela 4 – Índices de crescimento das amostras de Pandorina morum expostas a vários campos magnéticos

de diferentes intensidades e das amostras colocadas no espaço controlo durante o mesmo período de tempo.

Amostras no

electroíman Taxa de Crescimento Desvio Padrão (mínimo – máximo) Estimulação (%) 1 4,63×10-3 _2,95×10-4 2 4,69×10-3 _1,45×10-4 _{1 (-8 – 12)} 3 7,12×10-3 _1,97×10-3 _{54 (5 – 110)} 4 4,29×10-3 _2,07×10-4 _{-7 (-17 – 4)} Amostras no espaço controlo 1 3,46×10-3 _6,89×10-4 2 3,81×10-3 _2,90×10-4 _{10 (-15 – 48)} 3 5,16×10-3 7,26×10-4 49 (8 – 112) 4 3,55×10-3 _5,32×10-4 _{2 (-27 – 47)}

Segundo Repacholi e Greenebaum (1999) é necessário existir igualdade de condições entre a amostra exposta e a amostra controlo, o que, como se verificou anteriormente, não ocorre. De forma a minimizar as variações externas existentes, considerando que as amostras no espaço controlo sofreram as mesmas variações, calculou-se a diferença entre as taxas de crescimento das amostras colocadas no espaço controlo e no electroíman (gráfico da figura 14). Os resultados apresentam uma ligeira diminuição da taxa de crescimento de Pandorina morum quando exposta a um campo magnético de intensidade 100 mT e 250 mT. No entanto, os resultados apresentam um aumento na taxa de crescimento quando exposta a 200 mT. Estes resultados sugerem a possível existência de um efeito de estimulação do crescimento de Pandorina morum com um campo magnético de intensidade 200 mT, mas um efeito de inibição quando exposta a campos magnéticos de intensidades 100 e 250 mT, sendo esta mais pronunciada no ultimo. Contudo, são imprescindíveis novos testes para confirmar os resultados descritos anteriormente.

Figura 14 – Representação gráfica da diferença entre as taxas de crescimento das amostras de Pandorina

morum no espaço controlo e as amostras colocadas no electroíman durante as diferentes experiências. Como foi referido anteriormente e sugerido por Repacholi e Greenebaum (1999) um dos factores passíveis de causar a assimetria nas várias experiências é a temperatura, outros serão o estado da cultura, e a iluminação.

É possível estabelecer uma relação entre a variação da temperatura e as diferentes taxas de crescimento observadas durante a exposição de Pandorina morum a campos magnéticos de diferentes intensidades, assim como no espaço de controlo (gráfico da figura 15). Observa-se uma clara diminuição da taxa de crescimento com o aumento da temperatura, sendo esta mais evidente entre os testes efectuados a cerca de 19,3 ºC e a temperaturas superiores a 20 ºC. A temperatura média no electroíman e no espaço controlo possui uma diferença menor que 0,5 ºC, durante as experiências, o que pode ser um factor de variação acrescido entre o espaço controlo e o electroíman. É assim evidente, que o controlo preciso da temperatura é crucial para se conseguir obter resultados claros sobre o efeito de campos magnéticos de diferentes intensidades no crescimento de Pandorina

morum. 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0 1 2 3 4 5 Experiência D if e re n ça en tr e as taxa d e cr esci m e n to