Sílica gel 60 (63-200 µm) – MERCK

MATERIAIS E MÉTODOS

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Fases estacionárias para cromatografia - Cromatografia em coluna de vidro:

Sílica gel 60 (63-200 µm) – MERCK

Sílica gel 60 H (70-230 µm) – MERCK

Sílica gel tipo flash (35-70 µm) – ACROS

Sephadex LH 20 - SIGMA

- Cromatografia em camada delgada preparativa:

Sílica gel 60 PF

(5-25 µm) – MERCK

(placas de vidro: 20 x 20 cm, 1 mm de espessura) Placa comercial em sílica gel (5-17 µm)– ALDRICH

(placas de vidro: 5 x 20 cm, 1 mm de espessura) - Cromatografia em camada delgada analítica:

Sílica gel 60 HF

– MERCK

(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura) Sílica silanizada 60 HF

– MERCK

(placas de vidro: 3 x 10 e 5 x 10 cm, 0,25 mm de espessura) 3.1.2 Solventes

- para cromatografia:

Solventes P. A. – SINTH

, VETEC

e MALLINCKODT

Solventes grau cromatográfico - MALLINCKODT

e MERCK

- para RMN:

Solventes deuterados - ACROS

e ALDRICH

(acetona, água, clorofórmio, DMSO, metanol e piridina)

3.1.3 Equipamentos

§ Capela de fluxo laminar - VECO

VL FS – 09 M

§ Autoclaves verticais - PHOENIX

AV 75

§ Estufa de incubação

- FANEM Ltda

– 347 CD

§ Mesa agitadora

- INNOVA

4300 – New Brunswick Scientific

§ Estufa com ar circulante - Soc. FABBE. Ltda

§ Microscópio

- OLYMPUS

CH-2

§ Espectrômetro de RMN

- BRUKER

DPX-300 MHz

- BRUKER

DRX-400 MHz

- BRUKER

DRX-500 MHz

§ Espectrômetro de Massas

- CG-EM: Shimadzu

QP 5000

(coluna D 3-5; 25 m X 0,25 mm X 0,25 µ m)

- ESI-EM: Micromass Quattro LC (ionização por electronspray)

§ Evaporador

- BÜCHI

- modelo rotavapor R

§ Cromatógrafo a gás-CG

- Hewlett Packard HP 5890- série II

(coluna HP-1; metilsilicone 100%; 25 m X 0,25 mm X 0,25 µ m)

§ Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência-CLAE - Shimadzu

SHIM-PAK- Diode array detector

(coluna CLC - ODS (M), 250 mm X 4,6 mm)

§ CLAE – Reciclante

- Shimadzu

LC- GAV (U.V.-SPD-10AV)

( coluna Shodex

Asahipak GS-310 26 500 mm X 1,5 mm)

§ Espectrofotômetro no UV-VIS

- Shimadzu

PC 1520 - Diode Array Spectrophotometer

§ Espectrofotômetro no Infravermelho - Nicolet - Protege 460

§ Estufa de secagem e esterilização

- FANEM Ltda

3.1.4 Microrganismos

Os fungos foram isolados de amostras de solo brasileiro (P. viridicatum da região do Rio Miranda-MS e os demais da região de São Carlos-SP) pela Profa. Dra. Suraia Said, identificados na Fundação Tropical de Pesquisa

“André Tosello” e foram mantidos através de repiques sucessivos, a 4°C, em meio PDA ("Potato Dextrose Agar") no Laboratório de Enzimologia Industrial da FCFRP-USP.

3.2 Métodos

3.2.1 Condições de cultivo

Inicialmente, as espécies de Penicillium foram cultivadas em diferentes meios de cultura semi-sólidos para seleção dos meios (tabela 4, p.32) nos quais os fungos apresentaram maior produção de conídios.

Os fungos foram repicados, em duplicata, em tubos de ensaio contendo cerca de 5,0 mL dos meios de cultura solidificados com inclinação semelhante (garantindo mesma superfície de contato para multiplicação dos conídios) e incubados a 30°C por 7, 10 e 16 dias. Em seguida, os conídios produzidos foram coletados adicionando-se cerca de 5 mL de água estéril à superfície da cultura e raspando-se levemente, formando uma suspensão de conídios, que foram contados em Câmara de Neübauer (figura 7, p. 33).

Após a seleção do fungo, P. verrucosum foi cultivado em duas etapas.

Inicialmente em uma pré-cultura e em seguida na cultura fermentativa onde

as condições de cultivo foram variadas.

Tabela 4. Constituintes dos meios de cultura semi-sólidos Meio YES, descrito por Larsen et al. (2000)

Extrato de levedura 20 g/L Merck

Sacarose 150 g/L Vetec

MgSO

7H

O 0,5 g/L Reagen

Ágar 20 g/L Oxoid

Meio CYA, descrito por Malmstrom et al. (2000)

Extrato de levedura 5 g/L Merck

Caldo de Czapek * 35 g/L -

Ágar 15 g/L Oxoid

Meio MEA, descrito por Kozlovsky et al. (2000)

Extrato de malte 20 g/L Merck

Peptona 1 g/L Oxoid

Glicose 20 g/L Synth

Ágar 20 g/L Oxoid

Meio AVEIA, descrito por Malmstrom et al. (2000)

Farinha de aveia 30 g/L Nestlé

Ágar 15 g/L Oxoid

Meio PDA, descrito por Nam et al. (2000)

PDA ( Potato Dextrose Agar) 39 g/L Oxoid

* Caldo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992) (tabela 2)

Cerca de 5 x 10

a 1 x 10

conídios por mL de P. verrucosum foram inoculados em 60 mL de meio pré-fermentativo (tabela 5, p. 33) e incubados inicialmente por 24 e 48 horas sob agitação constante (120 rpm) a 30°C. Em seguida a massa micelial foi assepticamente coletada por filtração a vácuo.

Com objetivo de selecionar a melhor condição para produção de metabólitos

secundários ativos, a massa micelial obtida do meio pré-fermentativo foi

inoculada em 120 mL de 4 diferentes meios fermentativos (tabela 5, p. 33) e

incubada por 48, 72 e 144 horas sob agitação constante (120 rpm) a 30°C.

Novamente o fluido da cultura foi separado da massa micelial por filtração a vácuo. Procedimento ilustrado na figura 8 (p. 36).

Figura 7. Fluxograma de seleção do meio de cultura semi-sólido que favorece a conidiogênese para cada espécie de Penicillium estudada

Tabela 5. Constituintes dos meios líquidos de cultura

Meio Pré-fermentativo, descrito por Jackson et al. (1993)

Pó de milho (fubá) 2,5 g/L Yoki

Glicose 10 g/L Synth

Farinha de aveia 10 g/L Nestlé

Pasta de tomate 40 g/L Quero

P. viridicatum P. verrucosum P. ochrochlorum P.waksmanii P.simplicissimum

Repique em duplicata para cada tempo de incubação

Meio MEA Meio

CYA Meio

YES Meio

PDA Meio

AVEIA

Incubação a 30°C

7 dias

7 dias 10 dias10 dias 16 dias16 dias

5mL H₂O estéril

Raspagem, agitação, filtração Suspensão conidial

Diluição

Contagem em Câmara de Neübauer

CaCl

2H

O 10 g/L Merck

Sol. traço de elementos de Jackson 10 mL/L -

- Solução traços de elementos de Jackson

FeSO

7H

O 1 g/L Reagen

MnCl

. 4H

O 1 g/L Carlo Erba Reagente

CuCl

. 2H

O 0,025 g/L Divisã0 QM

CaCl

. 2H

O 0,1 g/L Merck

H

BO

0,56 g/L Reagen

(NH

)

MoO

4H

O 0,019 g/L Mallinckrodt

ZnSO

7H

O 0,2 g/L Mallinckrodt

Meio Fermentativo de Jackson, descrito por Jackson et al. (1993)

Glicerol 15 g/L Sigma

Melaço de cana de açúcar 15 g/L Usina da Pedra*

Peptona 6 g/L Oxoid

Extrato de levedura 1,5 g/L Merck

NaCl 30 g/L Synth

KH

PO

0,6 g/L Synth

MgSO

7H

O 5 g/L Reagen

CuSO

5H

O 0,001 g/L Reagen

FeSO

7H

O 0,003 g/L Reagen

Meio Fermentativo de Vogel, descrito por Vogel (1956)

Glicose 20 g/L Synth

Solução salina de Vogel 20 g/L -

- Solução salina de Vogel concentrada 50 vezes

Na

C

H

O

. 2H

O 125 g/L Synth

KH

PO

250 g/L Synth

NH

NO

100 g/L Nuclear

CaCl

. 2H

O 5 g/L Merck

MgSO

7H

O 10 g/L Reagen

Sol. traço de elementos de Vogel 5 mL/L -

Solução de biotina 1 ml/L - - Solução traços de elementos de Vogel

H

C

H

O

. H

O 5 g Reagen

ZnSO

. 7H

O 5 g Mallinckrodt

Fe (NH

)

(SO

)

. 6H

O 1 g Synth

CuSO

. 5H

O 0,25 g Reagen

MnSO

. H

O 0,05 g Reagen

H

BO

0,05 g Reagen

Na

MoO

2H

O 0,05 g Mallinckrodt

H

O destilada 95 mL -

- Solução de biotina

Biotina 0,005 g Sigma

Álcool 50% 100 mL Synth

Meio Fermentativo de Czapeck, descrito por Alviano et al. (1992)

Sacarose 30 g/L Vetec

NaNO

2 g/L Vetec

K

HPO

1 g/L Henrifarma

MgSO

7H

O 0,5 g/L Reagen

KCl 0,5 g/L Reagen

FeSO

7H

O 0,01 g/L Reagen

pH=5

Meio Fermentativo de Takeuchi, descrito por Takeuchi et al. (1989)

Amido 25 g/L Synth

Sacarose 20 g/L Vetec

Casamino ácido 10 g/L Fisher Scientific

KH

PO

5 g/L Synth

MgSO

7H

O 2,5 g/L Reagen

* Ribeirão Preto- SP.

Figura 8. Fluxograma das condições de cultivo de Penicillium verrucosum

3.2.2 Obtenção dos extratos brutos

A massa micelial foi inicialmente extraída com MeOH por 24 horas resultando num primeiro extrato metanólico. Seqüencialmente a massa foi seca em estufa com ar circulante a 40°C, triturada, pesada e extraída com CH

Cl

e MeOH por processo de maceração durante 5 dias. Foram feitas 3 repetições consecutivas para cada solvente. O fluido da cultura foi submetido a partição líquido-líquido com AcOEt por 3 vezes consecutivas, resultando em um extrato orgânico e um aquoso (figura 9, p. 37).

Suspensão de conídios

5 X 10⁶ à 1 X 10⁷ conídios/mL

60 mL meio pré- fermentativo (MPF)

120 mL meio Takeuchi

Incubação a 30°C; 120 rpm

24 horas 48 horas

48 horas 72 horas 144 horas

120 mL meio Vogel

120 mL meio Czapeck

120 mL meio Jackson A

B

C

A-Filtração e transferência da massa micelial para cada meio de cultura.

B-Incubação do meio pelos 3 tempos distintos a 30°C; 120rpm C-Filtração a vácuo para cada condição de cultivo

B B B

A

C C

C C

C B

C C

B

C C

B

C C

Total = 23 condições de cultivo

*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.

Massa micelial Fluido da cultura

B

C C C

Após o processo de extração tanto da massa micelial quanto do fluido da cultura, os solventes foram evaporados até a secura em rotaevaporador ou liofilizados.

Figura 9. Fluxograma de obtenção dos extratos brutos intra e extra celular de P. verrucosum

As condições de cultivo e rendimentos obtidos para os 115 extratos brutos produzidos em pequena escala encontram-se na tabela 6 (p. 38).

Todos os extratos brutos obtidos em pequena escala foram avaliados quanto a sua atividade tripanocida, atividade inibitória da enzima GAPDH de T. cruzi e enzima APRT de L. tarentolae.

Massa micelial

Suspenção em MeOH 24 horas

Filtração

Massa micelial

Secagem a 40°C Ressuspenção em MeOH Ultra-som por 30 minutos

Extração por 5 dias (3 vezes consecutivas) Filtração

Extrato Me MeOH - 2 Massa

micelial

Ressuspenção em CH₂Cl₂

Extração por 5 dias (3 vezes consecutivas)

Extrato Ma MeOH- 1 Extrato Ma MeOH- 1

Extrato Dc CH₂Cl₂

Fluido da cultura

Partição líquido-líquido com AcOEt

Extrato Aq Aquoso

Extrato Ac AcOEt Cultura de

Penicillium verrucosum

Total = 115 extratos brutos

*Perda: MPF 48 h., Vogel 144 h.

Tabela 6. Quantidade dos 115 extratos brutos obtidos das 23 condições de cultivo de P. verrucosum em pequena escala

N ° Condição de cultivo

Peso (mg)

N ° Condição de cultivo

Peso (mg)

N ° Condição de cultivo

Peso (mg) Ac1 F

24

C

48

32,0 Dc41 M 24 J 72 22,1 Ma81 M 48 V 144 * Ac2 F 24 C 72 8,4 Dc42 M 24 J 144 5,5 Aq82 F 48 V 48 672,3 Ac3 F 24 C 144 43,2 Me43 M 24 J 48 56,6 Aq83 F 48 V 72 885,2 Ma4 M 24 C 48 56,6 Me44 M 24 J 72 105,1 Aq84 F 48 V 144 * Ma5 M 24 C 72 343,3 Me45 M 24 J 144 135,3 Me85 M 48 V 48 151,8 Ma6 M 24 C 144 156,7 Ac46 F 24 T 48 5,6 Me86 M 48 V 72 94,4 Aq7 F 24 C 48 1485,9 Ac47 F 24 T 72 8,1 Me87 M 48 V 144 * Aq8 F 24 C 72 1153,0 Ac48 F 24 T 144 51,9 Dc88 M 48 V 48 1,2 Aq9 F 24 C 144 273,8 Ma49 M 24 T 48 229,3 Dc89 M 48 V 72 6,4 Dc10 M 24 C 48 8,9 Ma50 M 24 T 72 311,1 Dc90 M 48 V 144 * Dc11 M 24 C 72 26,0 Ma51 M 24 T 144 234,7 Ac91 F 48 J 48 16,3 Dc12 M 24 C 144 5,5 Aq52 F 24 T 48 2364,0 Ac92 F 48 J 72 12,1 Me13 M 24 C 48 83,7 Aq53 F 24 T 72 1251,8 Ac93 F 48 J 144 11,1 Me14 M 24 C 72 111,0 Aq54 F 24 T 144 747,4 Ma94 M 48 J 48 723,2 Me15 M 24 C 144 27,8 Dc55 M 24 T 48 37,9 Ma95 M 48 J 72 459,4 Ac16 F 24 V 48 37,8 Dc56 M 24 T 72 23,0 Ma96 M 48 J 144 482,3 Ac17 F 24 V 72 44,5 Dc57 M 24 T 144 5,4 Aq97 F 48 J 48 1910,6 Ac18 F 24 V 144 28,0 Me58 M 24 T 48 172,9 Aq98 F 48 J 72 2630,5 Ma19 M 24 V 48 153,6 Me59 M 24 T 72 149,8 Aq99 F 48 J 144 2756,8 Ma20 M 24 V 72 175,1 Me60 M 24 T 144 94,4 Me100 M 48 J 48 222,7 Ma21 M 24 V 144 99,7 Ac61 F 48 C 48 4,3 Me101 M 48 J 72 123,0 Aq22 F 24 V 48 528,1 Ac62 F 48 C 72 3,7 Me102 M 48 J 144 206,5 Aq23 F 24 V 72 318,4 Ac63 F 48 C 144 4,8 Dc103 M 48 J 48 9,0 Aq24 F 24 V 144 412,6 Ma64 M 48 C 48 205,0 Dc104 M 48 J 72 7,4 Dc25 M 24 V 48 6,8 Ma65 M 48 C 72 237,5 Dc105 M 48 J 144 4,8 Dc26 M 24 V 72 3,2 Ma66 M 48 C 144 231,2 Ac106 F 48 T 48 6,4 Dc27 M 24 V 144 1,9 Aq67 F 48 C 48 1555,0 Ac107 F 48 T 72 14,5 Me28 M 24 V 48 40,9 Aq68 F 48 C 72 1186,3 Ac108 F 48 T 144 5,3 Me29 M 24 V 72 54,5 Aq69 F 48 C 144 309,4 Ma109 M 48 T 48 469,8 Me30 M 24 V 144 10,2 Me70 M 48 C 48 194,4 Ma110 M 48 T 72 357,5 Ac31 F 24 J 48 23,7 Me71 M 48 C 72 203,2 Ma111 M 48 T 144 415,8 Ac32 F 24 J 72 15,8 Me72 M 48 C 144 156,9 Aq112 F 48 T 48 1443,4 Ac33 F 24 J 144 59,9 Dc73 M 48 C 48 40,5 Aq113 F 48 T 72 1189,0 Ma34 M 24 J 48 284,1 Dc74 M 48 C 72 52,7 Aq114 F 48 T 144 889,8 Ma35 M 24 J 72 477,8 Dc75 M 48 C 144 11,6 Me115 M 48 T 48 214,7 Ma36 M 24 J 144 349,9 Ac76 F 48 V 48 3,6 Me116 M 48 T 72 210,2 Aq37 F 24 J 48 1349,9 Ac77 F 48 V 72 5,2 Me117 M 48 T 144 361,8 Aq38 F 24 J 72 1647,4 Ac78 F 48 V 144 * Dc118 M 48 T 48 23,8 Aq39 F 24 J 144 3715,5 Ma79 M 48 V 48 123,8 Dc119 M 48 T 72 93,4 Dc40 M 24 J 48 31,1 Ma80 M 48 V 72 330,9 Dc120 M 48 T 144 52,0

1 Origem: M= massa micelial e F= fluido da cultura; ² Tempo de incubação na pré-cultura: 24 e 48 horas; ³ Meio de cultura fermentativo: C= Czapeck, J= Jackson, V= Vogel e T= Takeuchi; ⁴ Tempo de incubação no meio fermentativo: 24, 48 e 72 horas (meios de cultura e procedimentos previamente descritos (p..32-39). * perda da massa micelial durante o processo de filtração a vácuo.

3.2.3 Perfis cromatográficos via CLAE

Cerca de 30 extratos brutos, de origem intra e extracelular, tiveram seu perfil cromatográfico determinado via CLAE. As condições de trabalho incluem coluna CLC - ODS (M), 25 cm X 4,6 mm, partículas de 5 µm, detecção simultânea a 220, 254 e 270 nm a temperatura ambiente de 22 a 25°C. As amostras foram filtradas em membrana millipore de 0,45 µm e 20 µl de uma solução a 1 mg/mL foram analisadas em 60 min. de eluição, fase H

O - MeOH 30% , fluxo de 0,5 mL/min e sistema de integração computadorizado com software CLASS-VP versão 5,02.

A escala do eixo das ordenadas (mAU) e do eixo das abcissas (min) foram expandidas para visualizar a presença dos picos de baixa intensidade de absorção e ampliar a visualização de cada pico em seu tempo de retenção.

3.2.4 Aumento da produção dos extratos Ac47 e Me59

Os extratos Ac47 e Me59 foram selecionados para fracionamento cromatográfico. Inicialmente foram produzidos em escala intermediária.

Porém, após os fracionamentos preliminares do extrato Ac47 verificou-se que

a quantidade não era suficiente para isolamento das substâncias, portanto o

fungo foi novamente cultivado em escala ampliada (tabela 7, p. 40).

Tabela 7. Produção em diferentes escalas do extrato bruto Ac47 e Me59 Escala de

produção

Quantidade de cultura fermentada (L)

Quantidade de extrato Ac (mg)

Quantidade de extrato Me (mg)

Pequena 0,12 8,1 149,8

Intermediária 2,80 448,3 2.170,0

Ampliada 9,60 1.751,0 4.358,1

3.2.5 Fracionamento cromatográfico de Ac47 e Me59

3.2.5.1 Extrato Ac47 produzido em escala intermediária

O extrato Ac47

foi fracionado através de diversos processos cromatográficos: coluna líquida a vácuo (CLV) usando como fase estacionária (FE) sílica gel 60 H e fase móvel (FM) hexano, hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%,20%, 30%, 50% e 80% além de AcOEt:MeOH 50%

e MeOH, originando 10 frações. Destas frações, Ac47.6

foi fracionada por cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) usando como FM hexano:AcOEt 1:1, originando 5 frações. A fração Ac47.9

foi fracionada em coluna flash isocrática com FM CH

Cl

:MeOH 9:1, originando 17 frações, das quais, Ac47.9.8

foi fracionada por CCDP comercial usando como FM CH

Cl

:MeOH 9:1, originando 4 novas frações (figura 10, p. 41).

Os espectros de RMN

H das frações Ac47.9.9

e Ac47.9.10

apresentaram-se muito semelhantes portanto as duas frações foram reunidas e novamente separadas por lavagens consecutivas com MeOH e CHCl

, originando Ac47.b1

e Ac47.b2

respectivamente. A fração Acb1

foi fracionada por CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 11 (p.

41).

Figura 10. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47

de P. verrucosum

Figura 11. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.9

e Ac47.9.10

Ac47.9.9

6,8 mg

Ac47.9.10

5,7 mg

Lavagem com MeOH

Ac47.b1

8,9 mg

MeOH

Resíduo 3,6 mg

Lavagem com CHCl

Ac47.b2

1 mg

Resíduo 2,6 mg CLAE reciclante

Coluna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo = 5mL/min. (10 ciclos) FM= MeOH:CH

Cl

50%

λ = 254 nm, 365 nm 20 Fr.

Frações analisadas via RMN

H

AC47_i 448,3 mg

CLV (FE = sílica gel 60 H) 13 X 5 cm (h X ø)

FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH

10 Fr.

Ac47.6_i 16,2 mg

CCDP (20 X 20cm) FM= Hex : AcOEt 50%

5 Fr.

Ac47.6.1_i 1,7 mg

Coluna em sílica flash 40 X 2 cm

FM = CH₂Cl₂:MeOH 9:1 17 Fr.

CCDP 5 X 20cm FM = CH₂Cl₂:MeOH 9:1 4 Fr.

Ac47.9_i 200 mg

Ac47.6.2_i 1,1 mg

Ac47.6.3_i 1,2 mg

Ac47.6.5_i 3,1 mg

Ac47.6.4_i 2,2 mg

Ac47.9.8_i 2,9 mg

Ac47.9.9_i 6,8 mg

Ac47.9.10_i 5,7 mg

Ac47.9.8.1_i 0,7 mg

Ac47.9.8.2_i 1,6 mg

Ac47.9.8.3_i 0,4 mg

Ac47.9.8.4_i 0,8 mg

3.2.5.2 Extrato Ac47 produzido em escala ampliada

O extrato Ac47, produzido em escala ampliada, também foi submetido a processos cromatográficos, inicialmente por CLV usando como FE sílica gel 60 H e FM Hexano, Hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50% e 80% além de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH. A fração Ac47.9 foi fracionada novamente por CLV usando como FE sílica gel 60 H e FM CH

Cl

, CH

Cl

:MeOH nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50% e 80% e MeOH, originando 8 frações (figura 12, p. 42). As frações Ac47.9.2, Ac47.9.3 e Ac47.9.4 foram submetidas a novos processos cromatográficos. Para a fração Ac479.2 utilizou-se coluna flash isocrática (CHCl

:MeOH 9:1), procedimento ilustrado na figura 13 (p. 43).

Ac47 1,75 g

CLV (FE = sílica gel 60 H) 9 X 9 cm

FM = Hexano, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH

10 Fr.

Ac47.9 683,2 mg

CLV (FE = sílica gel 60 H) 18 X 4 cm

FM = CH

Cl

, CH

Cl

:MeOH 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, MeOH

8 Fr.

Ac47.9.1 4 mg

Ac47.9.2 98,3 mg

Ac47.9.3 269,4 mg

Ac47.9.4 131 mg

Ac47.9.5 62,2 mg

Ac47.9.6 25,7 mg

Ac47.9.7 10,7 mg

Ac47.9.8

13,7 mg

Figura 12. Fluxograma de fracionamento do extrato Ac47

Figura 13. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.2

Para a fração Ac47.9.3 utilizou-se coluna em sílica gel com FM CHCl

:MeOH 9:1, originando 14 frações, das quais Ac47.9.3.8 foi separada em CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 14 (p. 43).

Coluna em sílica gel 15 X 2 cm

FM = CHCl

:MeOH 9:1 14 Fr.

Ac47.9.3.8 35,7 mg

CLAE reciclante

Coluna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =3mL/min. (12 ciclos) FM = MeOH:CH

Cl

50%

λ

= 225 nm, 276 nm 9 Fr.

Ac47.9.3.8.1 2 mg

Ac47.9.3.8.2 0,8 mg

Ac47.9.3.8.3 0,8 mg

Ac47.9.3.8.4 1,4 mg

Ac47.9.3.8.5 1,1 mg

Ac47.9.3.8.6 0,8 mg

Ac47.9.3.8.7 0,9 mg

Ac47.9.3.8.8 0,7 mg

Ac47.9.3.8.9 0,7 mg Ac47.9.3

269,4 mg Ac47.9.2 98,3 mg

Coluna em sílica flash 19 X 2 cm

FM = CHCl

:MeOH 9:1 9 Fr.

Ac47.9.2.1 0,2 mg

Ac47.9.2.2 3,2 mg

Ac47.9.2.3 48,3 mg

Ac47.9.2.4 32,6 mg

Ac47.9.2.5 9,7 mg

Ac47.9.2.6 2,5 mg

Ac47.9.2.7 1,6 mg

Ac47.9.2.8 1,5 mg

Ac47.9.2.9

2,7 mg

Figura 14. Fluxograma de fracionamento de Ac47.9.3

A fração Ac47.9.4 foi fracionada inicialmente por coluna em Sephadex LH 20 usando como FM MeOH, originando 8 frações das quais duas (Ac47.9.4.4 e Ac47.9.4.5) foram separadas em CLAE reciclante nas condições especificadas na figura 15 (p. 44). Na CLAE foram geradas 9 e 13 frações respectivamente. Destas frações foi isolada uma substância que corresponde a fração Ac47.9.4.4.7 e Ac47.9.4.5.12 que apresentaram espectro de RMN

H iguais e foram reunidas de acordo com a figura 15 (p.

44).

Figura 15. Fluxograma de isolamento da substância F1

Ac47.9.4 131 mg

CLAE reciclante

Coluna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =5mL/min. (6 ciclos) FM= MeOH:CH

Cl

50%

λ = 225 nm, 276 nm 9 Fr.

Coluna em Sephadex LH 20 40 X 4 cm

FM= MeOH 8 Fr.

Ac47.9.4.4 34,9 mg

Ac47.9.4.5 24,3 mg

CLAE reciclante

Coluna polimérica 500 X 21,5mm Fluxo =3mL/min. (22 ciclos) FM= MeOH:CH

Cl

50%

λ = 225 nm, 276 nm 13 Fr.

Ac47.9.4.4.7 1,8 mg

Ac47.9.4.5.12 1 mg

RMN

H RMN

H

Substância F1

2,8 mg

Em todos os fracionamentos utilizou-se cromatografia em camada delgada (CCDA) em sílica gel ou sílica silanizada para reunião de frações semelhantes, escolha de FM, entre outros procedimentos.

3.2.5.3 Extrato Me59 produzido em escala ampliada

Inicialmente o extrato Me59 foi particionado com solventes orgânicos, originando 5 frações (figura 16, p. 45).

Figura 16. Fluxograma de partição líquido-líquido do extrato Me59

A fração Me59.1 foi fracionada por CLV, usando como FE sílica gel 60H e FM hexano, hexano:AcOEt nas proporções 5%,10%, 20%, 30%, 50%

Me59 4,36g

Fração Hidroalcoólica CH

Cl

Suspensão em MeOH:H

O 1:3 Partição líq-líq com CH

Cl

Me59.5 194,7 mg

Concentração

Suspensão em MeOH Partição líq-líq com Hex

Me59.1 335,6 mg

Partição líq-líq com AcOEt

Me59.4 56 mg

Fração Hidroalcoólica

Partição líq-líq com n-BuOH

Me59.3 1,44 g Me59.2

1,81 g Me59.1- MeOH

Me59.2- n-BuOH

Me59.3- Aquoso

Me59.4- AcOEt

Me59.5- Hex

e 80% além de AcOEt, AcOEt:MeOH 50% e MeOH, originando 9 novas frações. A fração Me59.1.9 foi fracionada novamente por coluna em Sephadex LH 20 usando como FM MeOH, originando 6 frações das quais uma, Me59.1.9.2, foi fracionada por CCDP usando como FM nBuOH:AcOH:H

O 6:1:3 (figura 17,p. 46).

A fração Me59.2 também foi fracionada por CLV usando como FE sílica gel 60 H e FM AcOEt, AcOEt:(MeOH:H

O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 50%, 80%, 100%, originado 10 frações. Para a fração Me59.2.1 utilizou- se coluna flash isocrática (Hex:Me

CO:AcOH 9:1:0,3), seguida de CCDP para Me59.2.1.3 usando como FM Hex:Me

CO:AcOH 19:1:0,6 (figura 18, p. 47).

Figura 17. Fluxograma de fracionamento de Me59.1

Me59.1 335,6 mg

CLV (FE = sílica gel 60 H) 18 X 5 cm

FM = Hex, Hex:AcOEt 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, AcOEt, AcOEt:MeOH 50%, MeOH

9 Fr.

M59.1.9 205,4 mg

Coluna em Sephadex LH 20 28 X 2 cm

FM= MeOH 6 Fr.

Me59.1.9.2 13,9 mg

CCDP (5 X 20cm)

FM= n-BuOH:AcOH:H

O 6:1:3 6 Fr.

Me59.1.9.2.1 5,4 mg

Me59.1.9.2.2 0,3 mg

Me59.1.9.2.3 5,2 mg

Me59.1.9.2.4 2,3 mg

Me59.1.9.2.5 1,6 mg

Me59.1.9.2.6

2,8 mg

A fração Me59.2.8 foi acetilada e purificada por CCDP originando a substância M3a, conforme a figura 18 (p. 47). Além disso, esta fração também foi esterificada com diazometano, originando a mistura de substâncias M2, analisada por CG/EM.

Figura 18. Fluxograma de fracionamento de Me59.2

Usando coluna em sephadex LH 20, FM H

O:MeOH 7:3, a fração Me59.3 originou 5 novas frações e a substância M3. Para Me59.3.2 e Me59.3.3 foi utilizado fracionamento em coluna em sílica gel com FM H

O:Me

CO 4:1. Da fração Me59.3.3. foram isolada a substância M5 e a

Me59.2 1,81 g

Me59.2.1 259,5 mg

Me59.2.8 242,2 mg

Me59.2.1.3 127,2 mg

CLV (FE = sílica gel 60 H) 20 X 5 cm

FM = AcOEt, AcOEt:(MeOH:H₂O/1:1)1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 50%, 80%, 100%

10 Fr.

Coluna em sílica flash 22 X 2 cm

FM = Hex:Me₂CO:AcOH 9:1:0,3 7 Fr.

CCDP 3X (20 X 20cm)

FM= Hex:Me₂CO:AcOH 19:1:0,6 2 Fr.

Me592.1.3.1 77 mg

Me59.2.1.3.2 62,7 mg

Acetilação 40mg (piridina/anidrido acético) 12 horas.Extração com AcOEt Me59.2.8.1

30 mg

CCDP (20 X 20cm) FM= Me₂CO:Hex 9:1

2 Fr.

Me59.2.8.1.2 13,9 mg

CCDP (20 X 20cm) FM= MeOH:Me₂CO 1:1

2 Fr.

Substância M3a 8,2 mg

diazometano

Coluna em sílica gel 22 X 2 cm

FM = MeOH:CHCl₃ Mistura de substâncias M2

32 mg CG/EM

Ésteres metílicos de ácidos

graxos

substância M4 que foi acetilada e purificada por coluna em sílica gel, originando a substância M4a, conforme a figura 19 (p. 48).

Figura 19. Fluxograma de fracionamento de Me59.3

Me59.3 1,44 g

Coluna em Sephadex LH 20 44 X 2,5 cm

FM= MeOH:H₂O 7:3 6 Fr.

Me59.3.2 18 m g

Me59.3.3 183,1 mg Coluna em sílica gel

13 X 1 cm

FM = H₂O:Me₂CO 4:1 3 Fr.

Me59.3.2.1 8,4 m g

Me59.3.2.2 2,2 m g

Me59.3.2.3 10 m g

Substância M3 187,7 mg

Substância M5 16,3 mg Substância M4

118,3 mg

Acetilação 30mg (piridina/anidrido acético) 12 horas.Extração com AcOEt

Coluna em sílica gel 18 X 1 cm

FM = Hex:Me₂CO 3:2

Substância M4a 10,2 mg

Coluna em sílica gel 22 X 2 cm

FM = H₂O:Me₂CO 4:1 6 Fr.

Me59.4 56 mg

CCDP (20 X 20cm) FM= CHCl₃:AcOEt 7:3 6 Fr.

Mistura de substâncias M6

30 mg

Transesterificação 30mg (MeOH/H₂SO₄)

2 horas em refluxo.Extração com Hex Mistura de

substância M6b 5,5 mg

CG/EM Ésteres metílicos dos ácidos

graxos

Figura 20. Fluxograma de fracionamento de Me59.4

A fração Me59.4 foi fracionada em CCDP usando como FM CHCl

:AcOEt 7:3, gerando 5 frações e a mistura de substâncias M6 que foi transesterificada originando a mistura de substâncias M6b que foi analisada via CG-EM (figura 20, p. 48).

3.2.6 Reações químicas efetuadas em algumas substâncias

- Acetilação

As reações de acetilação foram feitas com 1,0 mL de anidrido acético e 0,5 mL de piridina para 30 mg da substância M4 e 40mg da fração Me59.2.8. As misturas reacionais foram deixadas em agitação por 14 horas à temperatura ambiente. A mistura reacional foi vertida sobre água gelada e os produtos extraídos com AcOEt. A fase orgânica foi lavada com solução de ácido acético 10%. O solvente foi evaporado após a secagem com sulfato de sódio anidro (Santos, 2001).

- Transesterificação de triglicerídeos

A transesterificação foi feita com 30 mg da mistura de substâncias M6

que foi solubilizada em 2,0 mL de MeOH. Pedaços de porcelana e 30µl de

H

SO

foram adicionados à mistura reacional que foi refluxada por 2 horas

sob agitação ocasional. A extração foi feita com hexano após adição de

20,0mL de H

O e a fase orgânica foi lavada com solução bicarbonatada 5%, seca com sulfato de sódio e rotaevaporada até a secura (Santos, 2001).

- Esterificação com diazometano

A fração Me59.2.8 foi esterificada com uma solução de diazometano.

Para isso foi adicionada uma solução de diazometano em éter ao substrato até não ser mais observada a eliminação de gás de N

A solução de diazometano foi preparada dissolvendo-se 2,14g de p- toluilsulfonilmetilnitrosamida (diazald) em 30 mL de éter etílico (em balão de destilação) e resfriando-se a solução em banho de gelo. Foi adicionada uma solução de 0,4 g de KOH em 10,0 mL de etanol. Após 5 minutos a solução etérea de diazometano foi destilada com aquecimento por banho de óleo. O reagente foi recolhido sobre éter etílico resfriado em banho de gelo (Pupo, 1997).

3.2.7 Elucidação estrutural das substâncias

A elucidação das estruturas químicas foi feita através das técnicas espectroscópicas: IV, EM, RMN

H, RMN

C, COSY

H

H, HMBC, HMQC.

3.2.8 Ensaios antiparasitários in vitro para avaliação da atividade tripanocida

Esse ensaio foi realizado pelo Prof. Dr. Sérgio de Albuquerque

(FCFRP-USP). O bioensaio foi realizado em amostras sangüíneas coletadas

de ratos albinos Swiss no sétimo dia de parasitemia após a infecção com a linhagem Y de T. cruzi (Silva & Nussenzweig, 1953). O sangue infectado foi diluído a uma concentração de 2x10

tripomastigotas/mL. Os ensaios foram realizados em microplacas (96 orifícios) com 400 µL de sangue em triplicata.

Para extratos brutos a concentração utilizada nos ensaios foi de 500 µg/mL e 1 mg/ml. Para substâncias puras a concentração foi de 8, 32 e 128 µM. As placas foram incubadas a 4

C e o número de parasitas contados após 24 horas, de acordo com o procedimento descrito por Brener, 1962. Sangue infectado com o mesmo volume de DMSO foi usado como controle negativo e a violeta de genciana foi usada como controle positivo (250 µg/mL).

3.2.9 Ensaios de inibição das atividades enzimáticas

As enzimas utilizadas neste trabalho são obtidas de forma recombinante a partir dos plasmídeos inseridos em bactérias Escherichia coli.

A preparação e a purificação das enzimas são feitas rotineiramente de acordo com os procedimentos estabelecidos no Laboratório de Cristalografia de Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo. O procedimento para GAPDH já foi descrito (Souza et al., 1998).

- Enzima GAPDH de T. cruzi

Os ensaios foram realizados no Laboratório de Química Farmacêutica da FCFRP-USP e foram feitos conforme procedimento previamente descrito (Vieira et al., 2001), pela medida espectrofotométrica de NADH formado em 340 nm durante 30 s. A mistura reacional contém (volume final 1 mL): 50 mM tampão Tris-HCl pH 8,6 com 1 mM EDTA e 1mM β-mercaptoetanol, 30 mM arseniato de sódio, 2,5 mM NAD, 0,3 mM gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e 1,5 µg de enzima. A reação é iniciada pela adição do substrato.

Para o teste de inibição, as soluções dos extratos (1 mg/mL) foram preparadas em DMSO e 100 µL foi adicionado à mistura reacional.

Substâncias puras são inicialmente testadas em 100 µg/ml e esta concentração é diminuída até a obtenção de aproximadamente 50% de inibição (IC

). A concentração final de DMSO usada foi 10% e este volume foi subtraído do volume do tampão. Substâncias puras são inicialmente testadas em 100 µg/mL e esta concentração é diminuída até a obtenção de aproximadamente 50% de inibição (IC

). Ensaios controle foram feitos na ausência de extratos, onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado.

As medidas foram feitas em triplicata e considerou-se o valor da média.

- Enzima APRT de L. tarentolae

Os ensaios foram realizados no Laboratório de Cristalografia de

Proteínas e Biologia Estrutural do Instituto de Física de São Carlos da

Universidade de São Paulo. Utilizou-se a enzima APRT de L. tarentolae,

clonada e caracterizada por Thiemann e colaboradores em 1998 e estes

ensaios foram feitos de acordo com a modificação de um procedimento previamente descrito (Tuttle & Krenistsky, 1990) pela medida espectrofotométrica da formação de AMP. Os ensaios de atividade foram acompanhados por 60 segundos e o comprimento de onda utilizado é 259 nm. A mistura reacional contém (volume final de 0,5 mL): tampão Tris - HCl 100 mM (pH 7,4); MgCl

5 mM; Adenina 100 mM; PRPP 560 mM e APRT 7,5 µg. Para o teste de inibição, as soluções dos extratos (1 mg/ml) foram

preparadas em DMSO e 100µL foi adicionado à mistura reacional. A concentração final de DMSO usada foi 10% e este volume foi subtraído do volume do tampão. Ensaios controle foram feitos na ausência de extratos, onde um volume equivalente de DMSO foi adicionado. As medidas foram feitas em triplicata e considera-se o valor da média.

Os resultados obtidos para GAPDH e APRT foram avaliados conforme procedimento previamente descrito (Vieira et al., 2001). Todas as medidas são feitas em triplicata, onde se calcula a média e em seguida aplica-se a fórmula:

onde:

∆ t = min.

ε

= 6,22 mM

cm

ε

= 1,24 mM

cm

volumes expressos em mililitros (mL) Atividade específica =

(U/mg)

∆Abs

∆t (min)

_________ x volume da cubeta

__________________________________

ε

x vol. enzima na cubeta x [enzima]

A atividade específica das enzimas (unidade/mg) é calculada através de medidas espectrofotométricas da formação do produto (NADH) pela diferença de absorbância entre os tempos específicos de reação para cada enzima.

Através da atividade específica é possível calcular a porcentagem de inibição da enzima GAPDH de T. cruzi (tabela 13, p. 61) e enzima APRT de L. tarentolae (tabela 15, p. 65) frente aos extratos brutos testados. Pela fórmula:

As enzimas foram armazenadas a 4°C e utilizadas nos experimentos nas concentrações de 0,3 mg/mL para GAPDH e 0,9 mg/mL para APRT .

% = 100 X U/mg (controle) – U/mg (amostra)

U/mg (controle)