Câmpus de Botucatu
Câmpus de Botucatu
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Júlio de Mesquita Filho”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
POLIMORFISMOS EM ÉXONS DO GENE MICA E O IMPACTO FUNCIONAL DESSAS VARIANTES EM DIFERENTES
REGIÕES BIOGEOGRÁFICAS
AMANDA MUNIZ RODRIGUES
ORIENTADOR: ERICK DA CRUZ CASTELLI
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção de Bacharel em Ciências Biomédicas.
BOTUCATU – SP 2022
Palavras-chave: MICA; Polimorfismos; SNP; sMICA.
Polimorfismos em éxons do gene MICA e o impacto funcional dessas variantes em diferentes regiões
biogeográficas / Amanda Muniz Rodrigues. - Botucatu, 2022 Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biomédicas) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Erick da Cruz Castelli
Capes: 20205007
1. Polimorfismo (Genética). 2. Polimorfismo de
Nucleotídeo Único. 3. Resposta imune. 4. Células Killer.
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais Maria e Roberto e ao meu irmão Danilo, por todo o apoio e dedicação durante esses anos e por me ajudarem a realizar meu sonho. Devo muito a vocês.
Às minhas avós Lourdes e Maria, por todo o amor e carinho que me dão e por sempre acreditarem no meu potencial. Amo vocês.
À minha melhor amiga e companheira Sarah, por estar sempre ao meu lado nos momentos difíceis e felizes, por me incentivar a sempre crescer e buscar o melhor. Te amo.
À minha roommate Maysa, por sempre me apoiar e estar ao meu lado nos momentos mais difíceis, pela companhia e por tornar esses anos mais felizes.
Ao meu orientador Prof. Erick C. Castelli, pela dedicação, competência e profissionalismo. Obrigada pelos ensinamentos e incentivo durante esses anos.
À minha companheira de trabalho e pesquisa Viviane, parceira do grupo MICA, pela paciência e por sempre me ajudar.
A todos da equipe GeMBio, em especial: Gabriela, Isabelle, Joyce, Nayane e Raphaela por tornarem essa jornada mais especial, leve e alegre.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram com meus estudos e minha pesquisa.
Sou eternamente grata.
O gene MICA codifica moléculas imunomoduladoras que atuam como sinalizadoras de estresse celular, como, por exemplo, infecções e estresse oxidativo. Há duas isoformas de MICA, uma ancorada na membrana (mMICA) e outra solúvel (sMICA). Ambas isoformas interagem com os receptores NKG2D promovendo ações distintas. mMICA interage com os receptores ativando a citotoxicidade das células NK. sMICA promove a inativação das células NK e consequente supressão da resposta imune. Polimorfismos em MICA podem influenciar em qual isoforma será produzida, a interação com o NKG2D ou favorecer mecanismos de escape imunológico. O objetivo deste estudo foi analisar polimorfismos em éxons do gene MICA e a frequência dos SNPs e alelos em 5 regiões biogeográficas, em mais de 5000 amostras com sequenciamento completo de genoma, obtidas em bancos de dados públicos.
No geral, as variantes encontradas com altas frequências estavam presentes em todas as regiões biogeográficas. Além disso, alguns SNPs, como rs1140700 e o rs1063635, apresentam impacto funcional. Ao todo foram encontrados 19 alelos de MICA, sendo MICA*008 o mais frequente. Este alelo está associado com a produção da isoforma solúvel devido a presença de um códon de parada prematura, que impede a transcrição da região transmembrana. Apesar da maior parte das amostras terem alelos associados com a codificação de mMICA, as frequências de sMICA foram elevadas e são diferentes nas regiões biogeográficas. Nas análises do dimorfismo MICA-129, a maioria das amostras tinham alelos que codificam o aminoácido valina, que já foi associado com fraca interação com os receptores NKG2D. As amostras do Brasil demonstraram um padrão diferente do esperado nas análises de sMICA e de MICA-129, apresentando frequências maiores do que as observadas na Europa ou África, possivelmente relacionadas com o componente Português existente no Brasil uma vez que as amostras européias incluídas neste estudo não contemplam a região de Portugal. Além disso, sMICA já foi associado com MICA-129-Val em estudos anteriores. Sugerimos que essa associação pode estar sendo sustentada pelo alelo *008 que está presente no grupo de alelos que codificam valina. Dessa forma, alguns polimorfismos e alelos de MICA podem estar associados a mecanismos de escape imunológico.
Palavras-chave: MICA; sMICA; SNP; Regiões biogeográficas.
ABSTRACT
The MICA gene encodes immunomodulatory molecules that act as cellular stress signals, such as, for example, infections and oxidative stress. There are two isoforms of MICA, one anchored to the membrane (mMICA) and the other soluble (sMICA). Both isoforms interact with NKG2D receptors promoting different actions. mMICA interacts with receptors activating NK cell cytotoxicity. sMICA promotes the inactivation of NK cells and consequent suppression of the immune response. Polymorphisms in MICA can influence which isoform will be produced, the interaction with NKG2D or favor immune escape mechanisms. The aim of this study was to analyze polymorphisms in exons of the MICA gene and the frequency of SNPs and alleles in 5 biogeographical regions, in more than 5000 samples with whole genome sequencing, obtained in public databases. Overall, the variants found with high frequencies were present in all biogeographical regions. Furthermore, some SNPs, such as rs1140700 and rs1063635, have functional impact. In all, 19 MICA alleles were found, with MICA*008 being the most frequent. This allele is associated with the production of the soluble isoform due to the presence of a premature stop codon, which prevents the transcription of the transmembrane region. Although most samples had alleles associated with mMICA encoding, sMICA frequencies were high and are different across biogeographical regions. In MICA-129 dimorphism analyses, most samples had alleles encoding the amino acid valine, which has been associated with weak interaction with NKG2D receptors. Samples from Brazil showed a different pattern than expected in the sMICA and MICA-129 analyses, showing higher frequencies than those observed in Europe or Africa, possibly related to the Portuguese component existing in Brazil since the European samples included in this study do not include the region of Portugal. Furthermore, sMICA has been associated with MICA-129-Val in previous studies. We suggest that this association may be supported by the *008 allele that is present in the group of alleles that encode valine. Thus, some MICA polymorphisms and alleles may be associated with immune escape mechanisms.
Keywords: MICA; sMICA; SNP; Biogeographic regions.
Figura 2 - Interação das isoformas de MICA com os receptores NKG2D …..……… 9 Figura 3 - Nomenclatura de alelos MICA ……….…...…... 15 Figura 4 - SNPs presente em éxons do gene MICA e seus efeitos ……….……. 16 Figura 5 - Frequência dos SNPs do gene MICA e sua distribuição global ……..…… 17 Figura 6 - Frequência por região biogeográfica dos alelos MICA ……….……. 18 Figura 7 - Frequência de alelos que produzem MICA solúvel obrigatoriamente e
que podem produzir MICA de membrana, por região biogeográfica ….… 19 Figura 8 - Frequência de alelos que são gerados a partir do dimorfismo MICA-129
por região biogeográfica ……….… 20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Alelos MICA solúvel e MICA de membrana ………. 19 Tabela 2 - Alelos do dimorfismo MICA-129 ………... 20
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ……… 8
1.1 POLIMORFISMOS DO GENE MICA ………..……… 10
1.2 MECANISMO DE ESCAPE IMUNOLÓGICO ……… 11
1.3 ESTUDOS GENÉTICOS POPULACIONAIS ……….. 11
1.4 ASSOCIAÇÃO COM DOENÇAS ………. 12
1.5 JUSTIFICATIVA E OBJETIVA ………. 13
2 METODOLOGIA ………. 14
2.1 AMOSTRAS ………...……… 14
2.2 PROCESSAMENTO DE DADOS, CHAMADA DE VARIANTES E IDENTIFICAÇÃO DOS ALELOS ………... 14
2.3 OUTRAS ANÁLISES ……… 15
3 RESULTADOS ……….. 16
4 DISCUSSÃO ……….. 20
5 CONCLUSÃO ………... 24
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……….. 25
8
1 INTRODUÇÃO
O gene de cadeia A relacionado ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex ) classe I ( MICA ), descrito pela primeira vez em 1994 (TCHACROME et al., 2022) , está localizado no braço curto do cromossomo 6 (em 6p21.3), dentro do Complexo Principal de Histocompatibilidade, ou MHC ( Major Histocompatibility Complex ). A região do MHC é conhecida por conter genes relacionados com o sistema imune e por ser uma região muito polimórfica (BIRTSAS et al., 2021) . O gene MICA codifica uma glicoproteína de classe I não clássica altamente polimórfica (TCHACROME et al., 2022) e pertence a uma superfamília gênica composta por sete genes, MICA, MICB, MICC, MICD, MICE, MICF, MICG. MICA e MICB foram identificados como genes funcionais e os demais são pseudogenes (BARANWAL; MEHRA, 2017) .
MICA é composto por cinco íntrons e seis éxons que codificam diferentes domínios da molécula glicoprotéica de mesmo nome (Figura 1). O éxon 1 codifica o peptídeo líder; o éxon 2, 3 e 4 codificam os domínios 𝛂1, 𝛂2 e 𝛂3, respectivamente; o éxon 5 codifica a região transmembrana e o éxon 6 codifica a cauda citoplasmática (RISTI; BICALHO, 2017) .
Figura 1 - Estrutura do gene MICA
Fonte: Material adaptado de RISTI; BICALHO, 2017 e criado com BioRender.com. Estrutura e organização do gene MICA , onde EX representa os éxon e INT os íntrons. As cores estão de acordo com o que cada éxon codifica, segundo a legenda. Os números representam a quantidade de nucleotídeos que compõem cada íntron ou éxon.
As glicoproteínas MICA têm estrutura semelhante à cadeia pesada das moléculas do complexo antígenos leucocitários humanos (HLA, do inglês Human Leukocyte Antigen ) de classe I, porém, diferentemente das moléculas HLA, não se associam a 𝛃2-microglobulina e não apresentam peptídeos em sua fenda de ligação (ZOU et al., 2020) . MICA e MICB são expressas em células endoteliais, células epiteliais, monócitos, fibroblastos e queratinócitos sob condições de estresse oxidativo como inflamações, infecções virais e tumores, o que confere à molécula a característica de sinalizadora de estresse celular (BARANWAL;
MEHRA, 2017; CARAPITO et al., 2022) . Proteínas MICA podem ser encontradas ancoradas na superfície da membrana celular pela sua região transmembrana (mMICA) ou no soro em sua isoforma solúvel (sMICA), decorrente da presença de um códon de parada prematuro em alguns indivíduos, ou por uma associação com a chaperona ERp5 levando à quebra proteolítica da molécula no domínio 𝛂3, mediada por metaloproteinases ADAM10, ADAM17 ou MMP14 (FUERTES; DOMAICA; ZWIRNER, 2021; RISTI; BICALHO, 2017) .
A proteína MICA exerce sua função biológica interagindo com os receptores da proteína de membrana integral NKG2D, presentes na superfície das células Natural Killers (NK) e de linfócitos T γδ e CD8 + , ativando mecanismos de resposta imune inata através da citotoxicidade das células NK, que libera IFN-γ e TNF-α (CARAPITO et al., 2022) . Ambas isoformas de MICA (i.e., membrana ou solúvel) interagem com os receptores NKG2D associado ao DAP10, porém produzem ações distintas sob a regulação das células NK (Figura 2). Quando ancorada à membrana, regula positivamente a resposta citotóxica das células NK e consequente eliminação da célula alvo. No entanto, quando expressa na isoforma solúvel, promove o bloqueio dos receptores NKG2D e, assim, compromete os mecanismos de citotoxicidade das células NK, levando à uma supressão da resposta imunológica (DU et al., 2019; FUERTES; DOMAICA; ZWIRNER, 2021; RISTI; BICALHO, 2017) .
Figura 2 - Interação das isoformas de MICA com os receptores NKG2D
Fonte: Material adaptado de CASTELLI et al., 2021 e criado com BioRender.com. Na figura A, a interação de mMICA com os receptores NKG2D leva a ativação da citotoxicidade das células NK. Na figura B, a liberação
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de sMICA por exossoma ou pela ação de metaloproteinases que clivam MICA da membrana celular, ocasiona a inibição da citotoxicidade das células NK.
1.1 POLIMORFISMOS DO GENE MICA
MICA é o gene mais polimórfico entre os genes de classe I não clássicos , com mais de 500 alelos e 200 proteínas descritas no banco de dados oficial que regulamenta suas sequências conhecidas, o IPD-IMGT/HLA (acessado em outubro de 2022, http://hla.alleles.org/proteins/classo.html). MICA encontra-se a 46 kb de distância do gene HLA-B, resultando em um forte desequilíbrio de ligação devido a proximidade entre os dois genes e ausência de um hotspot de recombinação (BIRTSAS et al., 2021) . Seus polimorfismos estão bem distribuídos entre os éxons 2, 3, 4 e 5, e geralmente são variações de um único nucleotídeo (SNP, do inglês Single Nucleotide Polymorphism) .
Polimorfismos presentes nos éxons 2-4 podem modificar o domínio de ligação ao receptor NKG2D ou de sustentação/localização da molécula na superfície celular (TCHACROME et al., 2022; ZINGONI et al., 2018) . Sobretudo, polimorfismos presentes no éxon 5, que codifica a região transmembrana da molécula, podem decorrer na formação de repetições curtas em tandem (STR, do inglês Short Tandem Repeats ), dos nucleotídeos GCT que codificam o aminoácido alanina. A variação de repetições de 4-10 alaninas dá origem a grupos de alelos MICA conhecidos como A4, A5, A6, A7, A8, A9 e A10. Além disso, A5 pode ter uma sub-variação conhecida como A5.1, que ocorre devido à uma inserção de Guanina (GGCT) ocasionando uma mudança no quadro de leitura (mutação frameshift ), resultando na formação de um códon de parada prematuro que impede a formação da região transmembrana da molécula e, consequentemente, força a produção de uma isoforma solúvel que é liberada para o meio extracelular por exossomas (GUTIÉRREZ-BAUTISTA et al., 2022) .
O dimorfismo MICA-129, gerado pelo SNP rs1051792 e localizado na posição 31411200 do genoma de referência hg38, consiste em uma troca de A>G na posição do aminoácido 129, levando à uma mutação não sinônima com troca de metionina para valina.
Esse polimorfismo está presente no éxon 3 e classifica 2 grupos de alelos, MICA-129-Met e MICA-129-Val. Esses alelos possuem afinidade diferencial ao NKG2D. O 129-Met está associado com uma melhor afinidade aos receptores, sendo capazes de induzir uma sinalização de 10 a 50 vezes mais forte e rápida levando à uma maior citotoxicidade das células NK. Já o alelo 129-Val, possui menor afinidade de interação com receptores NKG2D,
induzindo à rápida regulação negativa das células NK. Além disso, estudos já observaram que a variante 129-Met é menos eficientemente expressa na superfície celular do que 129-Val.
Dessa forma, o polimorfismo MICA-129 pode ter grande influência em situações patológicas, em virtude das diferenças na ativação da citotoxicidade de células NK (BARANWAL;
MEHRA, 2017; TCHACROME et al., 2022; ZINGONI et al., 2018) .
1.2 MECANISMO DE ESCAPE IMUNOLÓGICO
NKG2D é um alvo crítico para mecanismos de escape imunológico. Dessa forma, as moléculas MICA podem influenciar a evasão imune (SCHMIEDEL; MANDELBOIM, 2018) . Os tumores, por exemplo, utilizam de mecanismos a fim de evitar a imunidade anti-tumoral mediada por MICA-NKG2D, através da liberação de sMICA decorrente da ação de metaloproteinases liberadas pelo tumor (MMP), superexpressão de microRNAs como miR-93, que prejudica a expressão de MICA pela célula tumoral, e pela interação de sMICA-NKG2D, impedindo que NKG2D interaja com outros ligantes ativadores das células NK (DE ANDRADE et al., 2020; LUO et al., 2020; SCHMIEDEL; MANDELBOIM, 2018) . Em infecções virais, as células infectadas utilizam do mecanismo de liberação de sMICA com o objetivo de escapar do reconhecimento dos receptores NKG2D (BOUAYAD, 2021) . Além disso, o dimorfismo MICA-129 favorece mecanismos de escape devido a fraca interação do alelo 129-Val com os receptores NKG2D. Dessa forma, indivíduos que possuem alelos 129-Val podem ter a resposta imune mediada por células NK comprometida (ZINGONI et al., 2018) .
1.3 ESTUDOS GENÉTICOS POPULACIONAIS
A caracterização de polimorfismos contribui para a identificação de variantes que influenciam o funcionamento gênico e a susceptibilidade a doenças e fenótipos específicos.
Estas variantes podem estar presentes entre indivíduos de uma determinada população ou entre diferentes populações (OKAZAKI et al., 2021) . A identificação de polimorfismos é bastante utilizada em estudos de associação, onde as variantes detectadas em indivíduos podem ser associadas a uma característica ou doença. Por exemplo, a presença de determinados alelos HLA pode influenciar doenças infecciosas e autoimunes. Com isso, os
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estudos de associação podem detectar padrões genéticos e, assim, ser possível criar estratégias de identificação, prevenção e tratamento de doenças (CARRESS; LAWSON; ELHAIK, 2021) .
Uma grande contribuição para a evolução do conhecimento genético foi o desenvolvimento de projetos que geram dados de sequenciamento de DNA em larga escala, como o projeto 1000 genomas, que permitiu a construção de banco de dados com a informação genética de indivíduos de diversas populações, colaborando com grandes avanços em estudos genéticos nos últimos anos (OKAZAKI et al., 2021) .
1.4 ASSOCIAÇÃO COM DOENÇAS
MICA já foi associado com diversas doenças infecciosas e autoimunes, rejeição de transplante e com o câncer. Níveis séricos de sMICA podem servir como marcador de gravidade clínica em paciente com COVID-19 (BOUAYAD, 2021) . Polimorfismos associados a regulação de MICA e produção de isoformas solúveis são muito mais frequentes em indivíduos com infecção sintomática de COVID-19 (CASTELLI et al., 2021a) .
O polimorfismo MICA -129 foi associado com infecções, abortos recorrentes e distúrbios autoimunes como Artrite Reumatóide, Diabetes Mellitus Tipo I, Espondilite Anquilosante e Lúpus Eritematoso Sistêmico (TCHACROME et al., 2022) . O alelo MICA -129-Val está relacionado com níveis significativamente mais altos de sMICA e progressão do Mieloma Múltiplo (ZINGONI et al., 2018) .
O SNP rs2596542 foi relacionado com o aumento da probabilidade de Carcinoma Hepatocelular (CHC) induzido pelo vírus da hepatite C. Assim, esse SNP seria um marcador genético de CHC (WANG et al., 2019) . Além disso, níveis séricos alterados de sMICA foram observados em diferentes tipos de câncer. Dessa forma, sMICA seria um marcador prognóstico para o câncer e imunoterapias anti-sMICA teria um potencial terapêutico no tratamento de tumores malignos (TCHACROME et al., 2022) .
Recentemente, um estudo demonstrou a importância da inclusão do gene MICA durante a análise de histocompatibilidade (CARAPITO et al., 2022) . MICA foi associado à menor sobrevida do enxerto e, também, anticorpos específicos do doador anti-MICA foram associados com rejeição mediada por anticorpos tanto antes quanto após o transplante.
Polimorfismos presente no gene MICA do doador foram relacionados com a piora de
sobrevida após transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas em pacientes com leucemia mielóide aguda (MACHULDOVA et al., 2021) .
1.5 JUSTIFICATIVA E OBJETIVO
Mutações são forças motrizes para a evolução. Os polimorfismos ocorrem a nível molecular em um indivíduo e podem influenciar o funcionamento de um gene em diversos níveis. Por exemplo, um polimorfismo pode influenciar o nível de expressão do gene, seja pela modificação de regiões regulatórias ou por mecanismos pós-transcricionais.
Polimorfismos também podem modificar o produto proteico originado a partir de um gene, ou a forma que o transcrito primário é editado ( splicing alternativo ), entre outros mecanismos.
Portanto, a caracterização e compreensão do impacto de um determinado polimorfismo pode auxiliar no conhecimento prévio de fatores de risco, predisposição e suscetibilidade a diversas doenças. Além disso, polimorfismos são importantes marcadores genéticos para o rastreio de ancestralidade genética de populações ou até mesmo entre espécies.
O gene MICA desempenha um papel relevante na modulação da resposta imune.
MICA é um gene altamente polimórfico e as variantes que alteram sua sequência ou seu padrão de expressão já foram associadas a diferentes desfechos patológicos. No entanto, a diversidade de MICA pode estar bastante subestimada considerando-se que poucos trabalhos exploraram esse gene em milhares de indivíduos e entre diferentes populações. Dessa forma, identificar os polimorfismos presentes na região codificadora do gene e como esses polimorfismos se distribuem em diversas populações permitirá uma compreensão da influência dessas variantes em processos patológicos. Além disso, esses dados auxiliarão no desenvolvimento de metodologias capazes de modular a expressão de MICA para fins terapêuticos. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi identificar e avaliar polimorfismos presentes em éxons do gene MICA , o impacto funcional dessas variantes e suas frequências em diferentes regiões biogeográficas.
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2 METODOLOGIA
2.1 AMOSTRAS
Neste trabalho, foram incluídas nas análises 5.169 amostras de indivíduos de seis regiões biogeográficas. Dessas, 789 amostras são provenientes da África, 833 da América, 1.455 da Ásia, 1.322 do Brasil e 770 da Europa. Embora o Brasil esteja na América, optamos por apresentar os resultados do Brasil de forma separada. Os dados de sequenciamento de nova geração dessas amostras foram baixados de diferentes bancos de dados, como projeto 1000 Genomas, Human Genome Diversity Project (HGDP) e do projeto Saúde, Bem Estar e Envelhecimento (SABE), conduzido pelo Centro de Estudos do Genoma Humano e Células-Tronco (CEGH-CEL) da Universidade de São Paulo (IB/USP).
2.2 PROCESSAMENTO DE DADOS, CHAMADA DE VARIANTES E IDENTIFICAÇÃO DOS ALELOS
Após o download dos dados brutos de sequenciamento das amostras, os reads foram alinhados ao genoma de referência humano versão hg38, utilizando o algoritmo BWA-MEM.
Os genes do MHC são muito polimórficos e similares entre si, ocorrendo erros de alinhamento com algoritmos comuns como o BWA-MEM. Por isso, para corrigir esses erros, utilizamos o software HLA-mapper (CASTELLI et al., 2018) , que gera alinhamentos específicos para estes genes. Esse software utiliza um banco de dados de sequências conhecidas para cada gene e define qual é o gene de origem de cada read , possibilitando a tipagem específica do gene MICA . No final de todo esse processamento, obtemos um arquivo BAM com as sequências alinhadas ao genoma de referência hg38.
Em seguida, foi realizada a chamada de variantes utilizando o algoritmo HaplotypeCaller do pacote Genome Analysis Toolkit (GATK), versão 4.7.1 (MCKENNA et al., 2010) . Após a genotipagem inicial, as variantes codificadas em um arquivo VCF ( Variant Call Format ) foram tratadas para remoção de artefatos. Nessa etapa, os genótipos passam por um controle de qualidade utilizando o pacote VCFx (CASTELLI et al., 2015; LIMA et al., 2016) e VQSR do GATK, onde são detectadas as variantes falso-positivas e é realizada a correção dos genótipos. Por fim, obtemos um arquivo VCF com a anotação dos SNPs
encontrados em cada amostra. Além disso, foram feitas as análises para verificar o impacto funcional de cada SNP encontrado, utilizando o software SnpEff (CINGOLANI et al., 2012) .
A fase entre os sítios de variação (haplótipos) foi definida usando o software WhatsHap (PATTERSON et al., 2015) , o qual inferiu a fase entre duas heterozigoses próximas e presentes em um mesmo fragmento ou reads . Os haplótipos finais foram estimados combinando esses conjuntos de fases com modelos probabilísticos usando o Shapeit4 (DELANEAU et al., 2019) . As duas sequências completas de cada indivíduo, uma para cada cromossomo, foram inferidas a partir da conversão do arquivo VCF final em sequências completas, para isso utilizamos o software VCFx fasta . Com isso, obtemos um arquivo com os alelos de MICA encontrados em cada amostra. Esses alelos são nomeados seguindo o padrão descrito na figura 3 e utilizado pelo banco de dados IPD-IMGT/HLA.
Figura 3 - Nomenclatura de alelos MICA
Fonte: Material elaborado pelo autor. Cada alelo tem um número único e um conjunto de dígitos separados por dois pontos. O nome dos alelos iniciam-se pelo nome do gene, seguido pelo grupo alélico, grupo proteico, no terceiro campo são diferenciados por substituições sinônimas presentes em região codificante e, por último, um sufixo que indica alterações de expressão gênica.
2.3 OUTRAS ANÁLISES
A partir do VCF final, realizamos os cálculos das frequências de cada SNP e alelo (o haplótipo) por região biogeográfica. Para isso, utilizamos scripts desenvolvidos com linguagem de programação Perl. Por fim, a plotagem dos gráficos foram feitas utilizando R 4.2.1, através de scripts desenvolvidos localmente, onde os resultados foram analisados utilizando bibliotecas para testes estatísticos, foi possível avaliarmos e ilustrarmos as variantes em éxons do gene MICA e suas frequências de acordo com cada superpopulação.
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3 RESULTADOS
Identificamos 94 polimorfismos presentes na região codificadora do gene MICA , sendo a maioria SNPs presentes nos éxons 4 e 6. Desses, 52 caracterizam uma mutação de sentido trocado (ou missense ) com consequente troca de aminoácido na proteína final. Quatro SNPs encontrados no éxon 5 eram do tipo frameshift , que ocorrem devido a uma inserção ou exclusão de um ou mais nucleotídeo causando alteração no quadro de leitura. Um SNP do tipo stop gained foi observado no éxon 4: essa variante causa um códon de parada prematura. Os demais SNPs caracterizam mutações sinônimas e não modificam a proteína final (Figura 4).
Embora o gene MICA apresente diversos SNPs, a maioria apresenta uma frequência menor que 1% e poucos são de fato frequentes.
Figura 4 - SNPs presente em éxons do gene MICA e seus efeitos
Fonte: Material elaborado pelo autor. Cada ponto no gráfico representa uma variante encontrada na mesma posição em que ocorre no gene. O RNA mensageiro do gene está sendo plotado logo abaixo, nas cores cinza e preto para distinguir cada éxon, bem como, a parte mais estreita corresponde a região não traduzida. As cores dos pontos representam o efeito da variante de acordo com a legenda.
As frequências de cada SNP foram então calculadas para cada região biogeográfica e empilhadas de forma com que o somatório corresponda à frequência global. Neste caso, consideramos apenas variantes com frequências superiores a 1% em pelo menos uma região biogeográfica. Portanto, incluímos nesta análise 51 variantes (Figura 5).
No geral, as variantes encontradas com alta frequência global estão presentes em todas as regiões biogeográficas. O SNP encontrado com maior frequência foi o rs1140700, com frequência global de 40,39%. Este SNP é uma variante missense encontrada no éxon 4, presente em todas as regiões biogeográficas, variando de 14,06% na Ásia a 3,51% na África.
A segunda variante mais frequente foi rs1063635, com frequência de 40,36%. Trata-se de uma variante missense observada no éxon 4. O SNP rs1051792 missense encontrado no éxon 3 que define o dimorfismo 129, foi observado com frequência global de 37,33%, variando de 4,82% na Europa a 9,35% no Brasil. Além disso, a variante frameshift presente no éxon 5, rs67841474, que caracteriza a inserção de uma Guanina levando à formação do alelo MICA*008 e que produz apenas sMICA, apresentou frequência global de 26,48%, variando de 11,07% na Ásia a 1,8% na África. Curiosamente, os SNPs rs9266825, rs9266826, rs9266827, rs9266828, rs1131904 e rs9266831, todos no éxon 6, apresentaram frequência global de 34,41% e as mesmas frequências em cada região biogeográfica.
Figura 5 - Frequência dos SNPs do gene MICA e sua distribuição global
Fonte: Material elaborado pelo autor. A região codificadora do gene MICA está localizada logo abaixo das barras, com cores em preto e cinza para delimitar o começo e fim de cada éxon, a parte mais estreita dos éxons corresponde à região não traduzida. Além disso, os pontos vermelhos representam variantes missenses na mesma posição em que são encontradas. Cada barra do gráfico corresponde a um SNP localizado na mesma região do gene em que estão sendo plotados e a altura da barra representa a frequência global do SNP. Cada barra foi criada de acordo com a frequência com que cada região biogeográfica contribui para a frequência global do SNP, de acordo com as cores da legenda.
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A presença de mutações em um locus levam a formas alternativas de um mesmo gene, com alelos distintos e que podem resultar em diferentes características fenotípicas. Além disso, a combinação das trocas de nucleotídeos ao longo da sequência de um gene geram haplótipos, i.e., um conjunto de alelos que ocorrem em um mesmo cromossomo. Na comunidade de imunogeneticistas, os diferentes haplótipos de MICA (ou de um gene HLA) são conhecidos como alelos de MICA.
Nós investigamos os alelos MICA encontrados em cada região biogeográfica. As análises das frequências dos alelos também foram realizadas através do empilhamento das frequências, de forma que a soma de todas as frequências por região biogeográfica corresponda a frequência global de um determinado alelo. Encontramos 75 alelos distintos, 33 deles não registrados no banco de dados IPD-IMGT/HLA. Portanto, esses alelos configuram novos alelos. Porém, a maioria desses novos alelos são raros. Apenas 19 dos alelos apresentam frequência superior a 1% em pelo menos uma região biogeográfica (Figura 6).
O alelo encontrado com maior frequência foi MICA*008 (24,24%), seguido de *002 (19,23%), *004 (11,85%), *009 (8,45%) e *010 (6,55%). MICA*008 foi também o alelo observado com maior frequência na região da Ásia, no Brasil e na Europa. Na África e América, o alelo mais frequente foi *002. Os alelos *010, *019 e *027 são bem prevalentes na Ásia e encontrados com baixa frequência nas outras regiões. Nossa amostra Brasileira apresentou todos os 19 alelos frequentes, além de apresentar maior frequências do alelo *011 em relação às outras regiões biogeográficas.
Figura 6 - Frequência por região biogeográfica dos alelos MICA
Fonte: Material elaborado pelo autor. As barras do gráfico correspondem a frequência global de cada alelo, e a contribuição da frequência de cada região biogeográfica de acordo com a legenda. Abaixo do gráfico está plotado o nome do alelo correspondente.
Alguns dos alelos ilustrados acima estão relacionados com a produção de isoformas solúveis de MICA (Tabela 1). Esta associação deve-se à presença de códons de parada prematuro, que impedem a tradução da região transmembrana. Dessa forma, agrupamos a frequência dos alelos da Tabela 1 (produção obrigatória de sMICA) e comparamos com a frequência de todos os demais (que podem produzir MICA de membrana, mMICA). Em seguida, analisamos as frequências de sMICA e mMICA por região biogeográfica (Figura 7).
Todas as regiões biogeográficas apresentaram maior frequência de alelos que originam mMICA. A América apresentou menor frequência de sMICA, 3,7%, enquanto o Brasil apresenta maior frequência de alelos que estão relacionados com sMICA 7,04%.
Tabela 1 - Alelos MICA solúvel e MICA de membrana
Fonte: Material elaborado pelo autor.
Figura 7 - Frequência de alelos que produzem MICA solúvel obrigatoriamente e que podem produzir MICA de membrana, por região biogeográfica
Fonte: Material elaborado pelo autor. O gráfico representa a frequência dos alelos encontrados em cada região biogeográfica. As barras em azul correspondem a frequência de alelos correspondente a MICA membrana e em cinza, a frequência de alelos correspondentes a MICA solúvel.
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Como análise adicional, avaliamos o SNP rs1051792 que está associado com a presença do aminoácido valina ou metionina na posição MICA-129. Separamos os alelos que são gerados a partir do dimorfismos valina e metionina em dois grupos (Tabela 2). Todas as regiões biogeográficas apresentam frequências mais altas de valina na posição 129 (Figura 8).
A Europa foi a região que apresentou menor frequência de alelos que codificam metionina na posição 129 (4,75%), enquanto a África apresentou a menor frequência de alelos que codificam valina (14,46%).
Tabela 2 - Alelos do dimorfismo MICA-129
Fonte: Material elaborado pelo autor.
Figura 8 - Frequência de alelos que são gerados a partir do dimorfismo MICA-129 por região biogeográfica
Fonte: Material elaborado pelo autor. Gráfico que representa a frequência da presença dos aminoácidos valina ou metionina na posição 129 por região biogeográfica. As barras em rosa representam as frequências de valina e as cinzas de metionina.
4 DISCUSSÃO
Neste trabalho apresentamos diversas informações sobre a frequência de SNPs e alelos do gene MICA observados em mais de 5000 amostras de todo mundo, incluindo amostras do Brasil. Os dados nos permitem obter um panorama geral de como os polimorfismos de MICA
se distribuem em diferentes regiões biogeográficas, tanto no nível de SNPs quanto de alelos.
É importante destacar que há um viés de amostragem nas diferentes regiões (a maior amostra, por exemplo, é a Brasileira). No entanto, foi possível ter clareza de como as frequências de cada SNP e alelo se apresentam nas diferentes regiões biogeográficas.
Embora MICA seja o gene de classe I não clássico do MHC mais polimórfico, observamos que poucos polimorfismos são de fato frequentes. Apesar disso, a maioria desses polimorfismos observados são não-sinônimos, ou seja, modificam o produto protéico. Porém, alguns SNPs frequentes, como o rs1140700 e o rs1063635, não possuem nenhuma significância clínica descrita. Isso se deve ao fato de que os SNPs comuns têm seus efeitos mais associados com alterações sutis de suscetibilidade a doenças (possivelmente influenciando a ligação entre MICA e seus receptores) do que com a causa direta das doenças (HETTIARACHCHI et al., 2022) .
No entanto, encontramos SNPs com altas frequências que estão relacionados com uma característica específica. O SNP rs1051792, relacionado com o dimorfismo MICA-129, caracteriza dois grupos de alelos: MICA-129-Met e MICA-129-Val, que vão afetar a interação com receptores NKG2D, apresentando maior e menor interação, respectivamente (ROHN et al., 2018) . Observamos este SNP presente em todas as populações e com maior prevalência na África, Ásia e no Brasil, sendo que todas as regiões apresentam predominância do alelo que contém valina (menor interação com NKG2D). Outro polimorfismo é o rs67841474, que é encontrado com alta frequência na Ásia e no Brasil e pouco frequente na África. Essa variante corresponde a uma inserção que origina uma variação frameshift e leva a formação do alelo MICA*008, que está relacionado com a produção obrigatória de MICA solúvel (FUERTES;
DOMAICA; ZWIRNER, 2021; SEIDEL et al., 2021) .
Poucos alelos apresentaram altas frequências em nossas análises. Dos alelos mais frequentes observados (MICA*002, *004, *008, *009 e *010), apenas *010 não é encontrado em todas as regiões biogeográficas. Este alelo não foi observado na África e já foi associado à perda de expressão de MICA de membrana, devido a uma substituição de prolina para arginina na posição 6. Além disso, esse alelo também não produz sMICA, sugerindo que a proteína gerada fique presa intracelularmente (WANG et al., 2021) . Alelos com frequências inferiores à 5%, apresentam disparidades significativas entre as populações. MICA*027, *041 e *045, por exemplo, não foram encontrados em todas as regiões. Do mesmo modo, na figura 6, a maioria dos alelos que apresentaram frequências menores que 5% não foram observados em todas as regiões. Além disso, em todos os alelos menos frequentes sempre há maior predomínio em pelo menos uma região biogeográfica. Entretanto, estudos anteriores já
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observaram que existem maiores diferenças entre indivíduos que possuem frequências alélicas mais baixas, entre 1 e 5%, do que indivíduos que apresentam frequências alélicas mais comuns (BOUWMAN; HAYES; CALUS, 2017).
Apesar de identificarmos apenas 3 alelos que codificam sMICA em nossas amostras, as frequências observadas dessa isoforma foram bem relevantes. Brasil, Ásia e Europa são as regiões que demonstraram maiores frequências: 7,04%, 6,94% e 6,23%. Interessantemente, a frequência desses alelos é bem menor na África e América. MICA solúvel provoca regulação negativa dos receptores NKG2D, que é o principal receptor ativador das células NK (TCHACROME et al., 2022). Portanto, a frequência de alelos sMICA obrigatórios é menor na África e em populações da América que possuem um componente Africano em sua formação.
Considerando que estes alelos estão presentes em todas as regiões biogeográficas, é provável que tenham surgido antes da dispersão humana a partir da África. Portanto, a baixa frequência dessas variantes na África poderia ser um efeito causado por seleção natural contra estas variantes, possivelmente ligado a uma maior exposição a patógenos na África e América.
Porém, o padrão observado no Brasil não acompanha o padrão observado na África e Europa.
Sabe-se que a composição genética do Brasil é uma das mais heterogêneas do mundo, com ancestralidade africana, europeia e nativo americana. E que em decorrência da colonização portuguesa, a ancestralidade européia tem maior predominância (DE SOUZA et al., 2019) . Porém, nota-se tanto na figura 7 quanto na figura 8, que o Brasil foge do padrão esperado. As frequências de sMICA e de MICA-129 são maiores no Brasil do que na África, Europa e com maior disparidade na América. É possível que a maior frequência de alelos sMICA no Brasil esteja relacionado com o componente Português presente no Brasil. A amostra estudada possui uma maior ancestralidade Europeia, particularmente de origem portuguesa. Porém, não é possível comprovar esta teoria pois não há dados de sequenciamento de portugueses em bancos de dados públicos. Além disso, em nossas análises, mais da metade das amostras da região da América (sem contar o Brasil) eram compostas por populações com ancestralidade Hispânica e Nativo Americana (Colômbia, México, Peru e Porto Rico). Em um banco de dados de frequências alélicas, o alelo MICA*008, principal alelo associado com a liberação de sMICA, foi observado com frequências muito baixas em uma população brasileira com ancestralidade majoritariamente nativo americana (GONZALEZ-GALARZA et al., 2020) . Além disso, neste mesmo banco de dados, populações da Nigéria e da Europa apresentaram altas frequências do alelo *008. Isso sugere que a ancestralidade portuguesa nas amostras brasileiras podem ter componentes que elevam as frequências tanto de sMICA quanto de MICA-129 nessas amostras, já que a
presença do alelo *008 em populações europeias e africanas é bem significativa e, mesmo assim, o Brasil apresenta maiores frequências. Em contrapartida, na América, o componente nativo americano pode estar contribuindo para diminuição das frequências. Dessa forma, a influência das ancestralidades das amostras é um fator importante e que se apresenta de diferentes formas, causando essas disparidades observadas.
MICA-129-Val já foi associado com a liberação de sMICA em estudos anteriores (MARIASELVAM et al., 2018, p.; MICHITA et al., 2018) . Porém, observamos que no grupo de alelos que codificam 129-Val está presente o alelo MICA*008. Assim, supomos que a correlação entre sMICA e 129-Val, pode estar sendo sustentada pelo alelo *008, pois este alelo é o maior responsável pela produção de sMICA, além de ser o alelo mais prevalente. A presença da valina na posição 129 já foi relacionada com mecanismos de escape imunológico devido à fraca interação com os receptores NKG2D (GUTIÉRREZ-BAUTISTA et al., 2022) . Dessa forma, levantamos a hipótese de que o alelo *008 pode ter sua interação com NKG2D prejudicada devido a presença da valina na posição 129 em seu domínio 𝛂2 de ligação com o receptor.
O NKG2D é um receptor importante para a ativação das células imunes, principalmente das células NK (CAMPOS-SILVA; KRAMER; VALÉS-GÓMEZ, 2018) . MICA é um dos principais ligantes de NKG2D capaz de ativar ou inibir a citotoxicidade das células NK. Assim, a presença de polimorfismos no gene MICA que alteram a estrutura da proteína final e a diversidade alélica, são fatores que influenciam no papel que esta molécula exerce. Diversos alelos de MICA vêm sendo associados com doenças, devido a mecanismos que afetam a atividade das células NK (FECHTENBAUM et al., 2019; TCHACROME et al., 2022; VON LINSINGEN et al., 2018) . Além disso, estudos anteriores já observaram que indivíduos que possuem altas concentrações de sMICA no soro, estão mais propensos a apresentarem supressão da resposta imune antiviral e antitumoral (XING; FERRARI DE ANDRADE, 2020) . E também, já demonstraram a eficácia terapêutica após a modulação de MICA através de bloqueadores que impedem a liberação de sMICA (DU et al., 2019;
FUERTES; DOMAICA; ZWIRNER, 2021) . Com isso, o entendimento dos mecanismos de interação MICA/sMICA-NKG2D, podem auxiliar no desenvolvimento de estratégias imunomoduladoras. Além disso, MICA pode ser alvo potencial para modulação imunológica em situações de resposta imune exacerbada, devido a sua capacidade ativadora ou inibitória.
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5 CONCLUSÃO
Apesar do alto grau de polimorfismo do gene MICA, poucos SNPs e alelos são realmente frequentes. Porém, a identificação e caracterização dessas variantes é importante, pois esses polimorfismos têm grande impacto no fenótipo dos indivíduos. A maioria das amostras estudadas possuem alelos que codificam valina na posição 129, sugerindo que esses indivíduos possuem sua resposta imune mediada por MICA-NKG2D comprometida, porém existem outros mecanismos, além do MICA, para sinalização de estresse celular e ativação de células NK. Apesar da expressão de MICA de membrana ser prevalente, sMICA apresenta frequências significativas em algumas regiões biogeográficas. Diante disso, alguns polimorfismos e alelos estão fortemente associados a mecanismos de escape imunológico.
MICA é um ligante de NKG2D que desempenha um papel importante tanto na ativação quanto na inibição da vigilância imunológica. Moléculas MICA é um alvo crítico de mecanismos de escape imunológico utilizados por tumores e infecções. Dessa forma, as moléculas MICA podem ser utilizadas para o desenvolvimento de estratégias imunoterapeuticas a fim de modular a resposta imune mediada por células NK. Até o momento, existem poucos estudos funcionais de MICA e muitos mecanismos de interação com NKG2D ainda não foram elucidados. Com isso, estudos funcionais devem ser desenvolvidos para compreendermos o real impacto dos polimorfismos observados, tanto na interação com NKG2D quanto na liberação de sMICA, a fim de desvendar a função dessa molécula na imunomodulação.
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