Propolis effect in vitro on canine Transmissible Venereal Tumor cells Efeito in vitro da Própolis sobre células do Tumor Venéreo Transmissivel canino
Sandra Bassani-Silva
1*, José M. Sforcin
2, Anne S. Amaral
1, Luiz F. J. Gaspar
1, Noeme S. Rocha
11Department of Veterinary Clinics, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Husbandry, UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brazil
2Department of Microbiology and Immunology, Biosciences Institute, UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brazil
RPCV (2007) 102 (563-564) 261-265 R E V I S T A P O R T U G U E S A
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DE
Summary:Transmissible venereal tumor (TVT) is a sexually transmissible neoplasm, attracting researchers’ interest because of its origin, manner of transmission, and possibility of spontaneous regression, which modify the behavior of this tumor in comparison to other neoplasias. Chemotherapy procedure is still the preferred treatment for patients with TVT in spite of its toxic side effects that lead to treatment interruption in some cases. Since antitumor property of propolis has been reported, this work attempted to verify its possible antitumor action on TVT malignancy. Five animals from the Veterinary Hospital, FMVZ, UNESP, Campus of Botucatu, Brazil, were used. Based on the cell morphology stained with Giemsa, a new nomenclature was proposed by the Pathology Veterinary Service of this University, and the TVT-cells were divided into three groups: "lymphocyte-like" transmissible venereal tumor, "plasmocyte-like" transmissible venereal tumor and "mixed" transmissible venereal tumor. In this study, propolis was active against TVT-cells. Propolis showed an effective antitumoral activity against TVT-cells, including the
"plasmocyte-like" cells, considered the most malignant form, with a cytotoxic effect with the highest propolis concentration after 48h.
Resumo: O tumor venéreo transmissível (TVT) é uma neoplasia sexualmente transmissível que desperta, no meio científico, o interesse pela sua origem, modo de transmissão e questionável regressão espontânea. O comportamento versátil desse tumor difere dos mecanismos de outras neoplasias. O procedimento quimioterápico continua sendo o tratamento de eleição para os pacientes com TVT, apesar dos efeitos colaterais tóxicos graves causados por essa conduta terapêutica, necessi- tando a interrupção do tratamento em alguns casos. Uma vez que pesquisadores têm relatado a propriedade antitumoral da própolis em inúmeras neoplasias, este estudo objetivou verificar a possível ação antitumoral da própolis sobre a agressividade do TVT. Foram utilizados 5 animais provenientes do atendimento do Hospital Veterinário da FMVZ – UNESP, Campus de Botucatu, Brasil. Baseado na morfologia celular de preparados citológicos corados com Giemsa, uma nova nomenclatura foi
proposta pelo Serviço de Patologia Veterinária desta Universidade, e as neoplasias foram divididas em três grupos:
TVT linfocitóide, TVT plasmocitóide e TVT misto. Neste estudo, a própolis foi efetiva sobre as células de TVT. A própolis apresentou efetiva atividade antitumoral sobre as células de TVT, incluindo nas do grupo plasmocitóide, considerada a forma mais maligna, com efeito citotóxico após 48 horas e na maior concentração da própolis.
Introduction
Transmissible venereal tumor (TVT) is a contagious and sexually transmissible neoplasm with an unclear origin and affecting only canines. It has a world wide distribution but is detected mainly in tropical and subtropical zones (Varaschin et al., 2001).
Despite its ubiquitous distribution and studies on its origin and classification, the nature and behavior of these tumor cells remain controversial. Related studies support the hypothesis of a histiocytic origin (Tinucci- -Costa, 1999; Albanese et al., 2002; Murgia et al., 2006).
Its diagnosis may be done through cytological or histological examinations. Cytological evaluation of fine needle-aspirations reveals abundant round or oval cells with diameter of 14 to 30 mm, cytoplasmatic border well-delineated. Cellular nuclei are round or oval, usually eccentric with variable size. They appear with clumped chromatin and contain one or more prominent nucleoli. The nuclear:cytoplasmic ratio is high (Boscos et al., 1999). The cytoplasm is discretely basophilic with small, empty space and multiple vacuoles mainly located close to the cytoplasmic border (Varaschin et al., 2001).
Studies on TVT of natural origin do not show any predisposition of gender or breed, and it is found mainly in adult animals during reproductive age. TVT may also have extra-genital location (Rodrigues et al., 2001) and metastasis to many other organs has also been reported (Boscos et al., 1999; Ferreira et al., 2000; Park et al., 2006).
*Correspondência: sabassani@yahoo.com.br Fax: + 55 14 3811-6293
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The normal diploid number of chromosomes in the somatic cell of the dog (Canis familiaris) is 78, and 76 of these are acrocentric. TVT has a stable number of about 59:16 metacentric chromosomes and 43 acrocentric chromosomes. The constant and specific chromosomal aberrations, the identical rearrangement of the LINE/c-myc in all tumors, including the Brazilian ones (Portela et al., 2003), suggest that TVT cases developed from the same origin and subsequently were transmitted continually as allografts in many different geographical locations (Chu et al., 2001).
Although chemotherapy has been used for TVT treatment with further tumor regression, in many cases there are toxic side effects due to this therapeutic procedure, with eventual treatment interruption (Ogilvie, 1996). Besides, Tinucci-Costa (1999) and Brandão et al. (2002) reported that some TVTs are resistant to chemotherapy.
Propolis is a resinous beehive product with a complex composition, produced by bees from the secretions of trees, flowers, leaves and pollen. Bees use it to seal combs, cover irregular surfaces or other insects and eventual intruders that die inside the beehive, in order to avoid their decomposition (Banskota et al., 2001).
Propolis presents several therapeutic properties, such as antibacterial, antifungal, anti-inflammatory, immunomodulatory, among others (Sforcin et al., 2002; Orsi et al., 2005; Sforcin et al., 2005; Sforcin, 2007). Many authors have reported its antitumor property (Matsuno et al., 1997; Banskota et al., 2001).
Thus, the goal of this work was to verify the possible in vitro action of propolis on canine venereal transmissible tumor (TVT).
Material and methods
Clinical data of the dogs
This work conforms with Ethical Principles in Animal Research adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation (n. 60/2002).
From January to July 2003, 30 dogs were subjected to physical examination, anamnesis and complete clinical history at the Veterinary Hospital, FMVZ, UNESP, Campus of Botucatu. From those, 25 dogs of either gender, any breed or age, with cytological TVT diagnosis and absence of previous antitumor treatments were used for culture standardization. Five dogs included in these conditions were selected for the propolis assays, and among these five tumors, 2 of them were plasma cells-like TVT, 2 were lymphocyte- like TVT and one was a lympho-plasma cell TVT form.
Cytopathological analysis
Cytopathological analyses were carried out on tumor smears obtained by puncture or exfoliation for the TVT diagnosis and, based on the cell morphology
and using the new nomenclature proposed by the Patology Veterinary Service of this University, the tumors were classified in "lymphocyte-like" transmis- sible venereal tumor, "plasmocyte-like" transmissible venereal tumor and "mixed" transmissible venereal tumor. These smears were stained with Giemsa (Santos do Amaral, 2007).
Propolis and TVT cell cultures
Propolis was collected in the Beekeeping Section, FMVZ, UNESP, Campus of Botucatu, located on the Lageado Experimental Farm. Propolis samples were collected from colonies of Africanized honeybees (Apis mellifera) with plastic nets, which were later frozen to remove the propolis.
The propolis sample was analysed by gas-chroma- tography, gas chromatography-mass spectrometry and thin layer chromatograph, revealing that its main components are phenolic compounds (flavonoids, aromatic acids, benzopyranes), di- and triterpenes, essential oils, among others. Propolis was ground and mixed with 70% ethanol (30 g propolis to 100 mL of 70% ethanol), and protected from bright light, under moderate shaking, for 7 days. After this period, solutions were filtered and used at adequate concen- trations in the biological assays (Sforcin et al., 2005).
TVT cells from biopsies of each animal were put in RPMI 1640 medium and processed, in order to carry out the cell cultures immediately. TVT cells were counted in a hematocytometer by Trypan blue exclusion in order to obtain a final concentration of 2x10
6cells/mL, and were incubated at 37 ºC under 5%
CO2 tension into 96-well microplates with flat bottom in RPMI 1640 medium supplemented with 20 mM HEPES (Sigma Chemical Co., USA), 2x10
-5M 2-mer- captoethanol (Sigma), 0.2% sodium bicarbonate, 1%
glutamine 2 mM and 10% of heat-inactivated fetal calf serum. Then, propolis was added to the monolayers of each 5 animals in the following 4 concentrations: 10, 25, 50 and 100 µg/well (100 µl). The final volume in each well was 100 µl. All assays were carried out in duplicate (Orsi et al., 2005).
Propolis effect was analyzed after 6, 24 and 48 h, comparing propolis-treated cells with the control cells. Cell viability was analyzed by Trypan blue exclusion. In order to observe a possible effect of the propolis solvent, other cells were incubated only with 70% ethanol (20 µl), corresponding to the highest propolis concentration (100 µg).
Statistical analysis
Friedman’s test was used in order to analyze cell viability in the cultures, for each propolis concentra- tion according to the time period. Kruskall-Wallis’s test was used to analyze the time period according to propolis concentrations.
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Analysis of variation was used to analyze cellular concentration in the cultures, for each propolis concentration according to the time period and for every time period according to propolis concentra- tions. The value of each animal was considered to be the average of the two duplicates.
Results and discussion
Differences between cellular lineages were seen in morphological characteristics of TVT, influencing its biological behavior (Varaschin et al., 2001).
According to cell characteristics, a new terminology for TVT has been suggested by our group and tumors were classified into lymphocyte-like TVT, plasma cell-like TVT and lympho-plasma cell-like TVT forms (Amaral et al., 2004; Bassani-Silva, 2005; Gaspar, 2005). This morphology classification shows TVT malignancy: plasma cell-like TVT shows a higher frequency of nuclear abnormalities associated with a larger expression of P-glycoprotein, an elevated rate of metastasis and cellular proliferation in comparison to lymphocyte-like TVT or lympho-plasma cell-like TVT forms. Plasma cell-like TVT is the most injurious and also the most malignant (Bassani-Silva, 2005;
Gaspar, 2005).
To be sure that the culture did not contain any other cells than TVT, morphologic analysis of culture cells
by Giemsa as well as chromosome analysis revealed that the cells were really from TVT. No antibiotic was added to the cultures within 48 h. Our preliminary 25 cultures showed that within this time period, antibiotics were not necessary. So, we chose this time period to carry out our cell cultures.
Comparing propolis-treated cells with control cells, one may verify that propolis showed a time-concentra- tion effect on TVT.
After 6 h, propolis (100 µg) showed a significant antitumor activity (p<0.05). It was also effective at lower concentrations, but in a long-term way (after 24 h with 50 µg, and 48 h with 25 µg) (Tables 1 and 2). With regards to TVT morphology, plasma cell-like TVT was more resistant to propolis action (Table 3).
One may verify a similar number of 70% ethanol- treated cells and control, indicating the absence of propolis solvent effect and suggesting that the results were exclusively due to propolis components.
The chemical composition of propolis is very complex and is dependent upon the source plant. Bud exudates of different poplar species are the main sources of propolis in temperate zone, including Europe, Asia and North America. Samples originating from these regions are characterized by similar chemi- cal composition; the most important constituents appeared to be phenolics: flavonoids, aromatic acids and their esters. The main vegetal source of propolis in Botucatu, São Paulo State, Brazil, is Baccharis
Table 1- TVT cell viability (average %) after 6, 24 and 48 h of incubation with different propolis concentration (P) (µg) and 70%
ethanol (20 µl)
Time period Group
0 h 6 h 24 h 48 h
Control 52.07Aa 81.41Aa 76.12Aa 60.83Aa
P (10 µg) 52.07Aa 44.38Aab 9.39ABab 1.47Bb
P (25 µg) 52.07Aa 31.56Aab 1.00Bb 0Bc
P (50 µg) 52.07Aa 0.41Bb 0Bb 0Bc
P (100 µg) 52.07Aa 0Bb 0Bb 0Bc
70% Ethanol 52.07Aa 80.79Aa 75.06Aa 60.02Aa
Different capital letters indicate significant differences between each time period according to propolis concentration (α=0,05).
Different small letters indicate significant differences between each propolis concentration according to the time period (α=0,05).
n=5 averages of each animal.
Table 2- TVT cell concentration (x 106cells/mL) after 6, 24 and 48 h of incubation with different propolis concentration (P) (µg) and 70% ethanol (20 µl)
Time period Group
0 h 6 h 24 h 48 h
Control 2.00Aba 2.52Ba ± 0.31 1.70Aa± 0.42 1.15Ca± 0.27
P (10 µg) 2.00Aab 1.28ACbc± 1.25 0.28BCbc± 0.30 0.08Bb± 0.13
P (25 µg) 2.00Aab 0.96Bbc± 0.95 0.08BCbc± 0.11 0.02Cb± 0.03
P (50 µg) 2.00Ab 0.31Bbc± 0.63 0.03Bbc± 0.04 0.01Bb± 0.01
P (100 µg) 2.00Ab 0.02Bb± 0.04 0.01Bb± 0.02 0.Bb± 0
70% Ethanol 2.00Aab 1.85Abc± 0.15 1.56Bc± 0.38 1.20Ba± 0.35
Different letters indicate significant differences by the variation analysis for repeated measures on entirely random experiment, for every group between each circumstance and for every circumstance, between each group, with a significance of α=0,05.
n=5 averages of each animal.
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dracunculifolia DC., followed by Eucalyptus citriodora Hook and Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze (Bankova et al., 1999).
The main constituents of our propolis sample were isolated and identified: flavonoids are present in small quantities in Brazilian propolis (kaempferid, 5,6,7- trihydroxy-3,4’-dimethoxyflavone, aromadendrine- 4’-methyl ether); a prenylated p-coumaric acid and two benzopyranes: E and Z 2,2-dimethyl-6-carbo- xyethenyl-8-prenyl-2H-benzopyranes); essential oils (spathulenol, (2Z,6E)-farnesol, benzyl benzoate and prenylated acetophenones); aromatic acids (dihy- drocinnamic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid, which are common for poplar propolis, 3,5-diprenyl-p-coumaric acid, 2,2-dimethyl-6- carboxy-ethenyl-8-prenyl-2H-1-benzo-pyran); di- and triterpenes, among others. Seasonal variations in propolis composition are not significant and are predominantly quantitative (Bankova et al., 1998).
Twenty-three components have been isolated from Brazilian propolis, with cell-toxicity against fibrosar- coma in men and murine colon carcinoma (Banskota et al., 1998). Artepilin-C is an isolated component of Brazilian propolis with cytotoxic activity against tumor cells in vitro. This cytotoxicity was related to DNA fragmentation, inducing apoptosis (Matsuno et al., 1997).
Orsolic et al. (2004) showed that according to the results obtained in their study on the growth and metastatic potential of a transplantable mammary carcinoma of CBA mouse, the antitumor activity of tested compounds can be related to the immunomodu- latory properties of the compounds, their cytotoxicity to tumor cells, and their capacity to induce apoptosis and necrosis. They also showed that experimental data corroborate that polyphenolic compounds isolated
from propolis and propolis itself could be potentially useful in the control of tumor growth in experimental models.
The literature reports immune suppression during TVT growth, allowing metastasis. In order to reduce the side effects of chemotherapy and considering that propolis possesses antitumor, anti-metastatic and immunomodulatory activities, its introduction as a therapeutic procedure in vivo could provide new contribution to TVT treatment, as well as to other neoplasia treatments.
There are no works dealing with propolis and TVT, demonstrating the originality of our research and its great contribution to the therapeutic procedures.
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Table 3- Propolis (P) effect, according to its concentration and period of incubation, on different TVT cell morphology*.
Plasma cell-like TVT P (10 µg) P (25 µg) P (50 µg) P (100 µg)
n=2 averages of each animal
0 h 2.00 2.00 2.00 2.00
6 h 1.95 ± 0.75 1.42 ± 0.61 0.77 ± 0.94 0.06 ± 0.04
24 h 0.47 ± 0.28 0.20 ± 0.04 0.07 ± 0.01 0.03 ± 0.04
48 h 0.19 ± 0.16 0.06 ± 0.01 0.03 ± 0.01 0 ± 0
Lymphocyte-like TVT P (10 µg) P (25 µg) P (50 µg) P (100 µg)
n=2 averages of each animal
0 h 2.00 2.00 2.00 2.00
6 h 1.25 ± 1.76 0.98 ± 1.39 0.01 ± 0 0± 0
24 h 0.24 ± 0.34 0.01 ± 0.02 0± 0 0± 0
48 h 0.02 ± 0.03 0± 0 0± 0 0± 0
Lympho-plasma cell-like TVT P (10 µg) P (25 µg) P (50 µg) P (100 µg)
n=1 average
0 h 2.00 2.00 2.00 2.00
6 h 0 0 0 0
24 h 0 0 0 0
48 h 0 0 0 0
* 2 x 106cells/mL
Results are expressed in mean ± standard deviation.
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Maturação in vitro de oócitos de cadelas domésticas: efeitos na qualidade oocitária e presença espermática na maturação in vitro Bitch oocytes in vitro maturation: effects of oocyte quality and spermatozoa in in vitro maturation
A. A. Rocha*, R. Bastos, I. C. N. Cunha, C. R. Quirino
Universidade estadual do Norte Fluminense, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal
Av. Alberto Lamego, 2000 – Horto, Campos dos Goytacazes, Brasil – CEP.: 28013-602
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CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DE
Resumo: Na aplicação das biotecnologias reprodutivas em canídeos, os oócitos recuperados de folículos ováricos das fêmeas representam uma fonte importante de estudos que envolvem o desenvolvimento dos gametas femininos in vitro.
Porém os resultados obtidos nas técnicas de maturação in vitro (MIV) para espécie canina, por exemplo, são muito inferiores se comparados com os de outros mamíferos domésticos. Nesta espécie o mecanismo de maturação pré-ovulatória ocorre de forma diferente exigindo que após a ovulação os oócitos permaneçam ainda de 2 a 5 dias completando a maturação nos oviductos. De acordo com a fisiologia reprodutiva da fêmea durante este período já se observa a aceitação da cópula com o macho, o que permite o contacto dos oócitos já ovulados com os espermatozóides. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da fase do ciclo éstrico, da idade e do índice de condição corporal de cadelas domésticas na qualidade oocitária, e avaliar a influência da presença de espermatozóides caninos durante o processo de MIV. Os resultados obtidos neste estudo demonstram a existência de uma influência significava da idade da fêmea, tendo-se verificado que quanto mais velha for a cadela, menor é o número de oócitos de melhor qualidade obtidos. Dados semelhantes foram verificados com cadelas com baixo índice de condição corporal em que se observaram taxas de oócitos degenerados também elevadas. Em relação à presença de espermatozóides caninos no processo de MIV, verificou-se que o contato espermatozóide-oócito eleva significantemente o índice de MIV.
Palavras-chave:oócito, cadela maturação in vitro, espermatozóide
Summary:Oocytes recovered from ovarian folicules represent important studies for in vitrogametes development. In canids, studies with reproductive biotechnologies are increasing, however studies from in vitro maturation (IVM) of canine oocytes are poor if compared with other domestic mammals.
The mechanisms for canine oocyte maturation are different.
After ovulation oocytes still remain 2-5 days completing the
maturation. In this period the female reproductive physiology allows acceptance of males and matting occurs, and the occytes stay in contact whit spermatozoa in the uterine tube. The aim of this study was to investigate the effect of female age, estrous cycle and body codition on quantity and quality of oocyte; and the influence of interactions between canine spermatozoa and oocyte during the IVM process. Results showed significant influence of age with older bitches obtaining lower number of oocytes with good quality. Similar results were obtained in relation the females with low body condition, whith higher rates of degenerate oocytes. In relation the presence of canine spermatozoa in the IVM, it was verified that the contact spermatozoa-oocyte raises the IVM significantly.
Keywords:Oocyte, bitch, in vitromaturation, spermatozoa
Introdução
Na aplicação das biotecnologias reprodutivas em canídeos, os oócitos recuperados de folículos ováricos das fêmeas representam fonte importante de estudos que envolvem o desenvolvimento dos gametas femininos in vitro. Porém os resultados verificados nas técnicas de maturação in vitro (MIV) para espécie canina, por exemplo, são muito inferiores se comparados com outros mamíferos domésticos. Em cadelas e raposas, o mecanismo de maturação pré-ovulatória acontece de forma diferente se comparados com outras espécies de mamíferos. Nestas fêmeas a ovulação ocorre de 1 a 2 dias após o pico pré-ovulatório de LH, ainda no início da fase de estro, e os folículos ováricos iniciam sua luteinização antes mesmo da ovulação, além disso, estes oócitos são ovulados ainda imaturos, no início da primeira divisão meiótica (MI) e logo após a ovulação ocorre a quebra da vesícula germinativa. Desta forma após a ovulação os oócitos requerem ainda de 2 a 5 dias para completar a maturação (Otoi et al., 2000).
Fisiologicamente, no momento da ovulação, a fêmea destas espécies já se encontra aceitando a monta do
*Correspondência: amanda@uenf.br/rocha_aa@yahoo.com.br Tel: +55 21 97155317; +55 21 33914702
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macho, fazendo com que seus oócitos imaturos permaneçam em contato com espermatozóides por longos períodos no trato genital (Yamada et al., 1992).
A maturação in vitro (MIV) de oócitos retoma a esperança de preservação de espécies em extinção, porém resultados satisfatórios nem sempre são verifi- cados quando trata-se de MIV em oócitos de cadelas.
Vários motivos podem influenciar em bons índices de MIV, entre eles a qualidade oocitária parece possuir grande impacto (Hewitt e England, 1997b). Para a espécie canina não se sabe ainda ao certo, quais os motivos que podem levar a dadora, a apresentar quan- tidade maior ou menor de oócitos e índices diferentes de qualidade oocitária. Os aspectos mais discutidos até o momento referem a idade da cadela dadora e da fase do ciclo éstrico em que esta se encontra (Nickson et al., 1993; Yamada et al., 1993; Hay et al., 1997;
Rodrigues et al., 2003).
Estudos em cães podem servir como modelo experi- mental próximo ao ideal para o desenvolvimento da reprodução assistida em canídeos, contribuindo para preservação de espécies em extinção (Bolamba et al., 1998). Porém a baixa competência meiótica de oócitos cultivados in vitro ainda é um obstáculo para a fertili- zação in vitro e consequentemente desenvolvimento embrionário nos programas de recuperação genética.
Por este motivo, este estudo buscou verificar se a idade, a fase do ciclo éstrico e estado nutricional da fêmea dadora de ovários possui efeito na quantidade e qualidade oocitária, bem como determinar se existe influencia da presença de espermatozóides em dife- rentes etapas do processo de MIV de oócitos.
Material e métodos
Avaliação das cadelas
Foram utilizadas 107 cadelas dadoras de ovários, com idades variando de 6 meses a 16 anos, prove- nientes da rotina de ovariohisterectomia (OSH) do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) do município de Campos dos Goytacazes – RJ, Brasil e do Hospital Veterinário da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF – RJ, Brasil). A avaliação de todas as cadelas utilizadas foi feita antes do procedimento de OSH, através de exame clínico e anamnese com o proprietário do animal.
Avaliação da fase do ciclo éstrico das fêmeas As cadelas passaram por exame clínico com inspeção da região vulvar e perineal, seguido de recolha de material para realização de citologias vaginais para estadiamento do ciclo (Johnston et al., 2001). Após a cirurgia, a avaliação da superfície ovariana permitiu a confirmação da determinação da fase do ciclo.
Neste estudo, os animais foram divididos em dois grupos: animais em atividade reprodutiva (pro-estro,
estro e diestro) e animais em repouso reprodutivo (anestro).
Avaliação da idade dos animais
Todas as cadelas foram avaliadas quanto à idade, tendo sido feita pela inspeção da dentição formada no momento da recolha (erupção, desgaste e perda den- tária). Neste estudo utilizou-se os padrões descritos por Román (1999).
As fêmeas avaliadas foram divididas em 3 grupos:
cadelas pré-púberes (entre 6 meses e 1,5 anos), cadelas maturas (entre 1,5 e 8 anos), cadelas com mais de 8 anos.
Avaliação do estado nutricional (índice corporal) A análise do índice corporal foi baseado no sistema de avaliação da condição corporal da Nestlé PURINA
®(Laflamme, 1997; Mawby et al., 2001; Kealy, 2002).
Por este sistema os animais foram subdivididos em três grupos: cadelas magras, regulares e obesas.
Preparação dos meios de cultura e procedimento de maturação
A preparação dos meios de lavagem dos oócitos, bem como os meios de maturação foram preparados diariamente em material estéreis e em capela de fluxo laminar. O fluido foi mantido em tubos cônicos, em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO2 em ar, para equilíbrio até o momento de utilização.
Os meios de manipulação dos oócitos foram preparados com TCM-199 (sem heppes) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), e equilibrados em pH 7,5. Os meios de maturação seguiaram protocolo de TCM 199, acrescido de 10% de soro de cadela em estro, e penicilina e estreptomicina, equilibrados em pH 7,6. O soro de cadela em estro foi previamente coletado e armazenado em microtubos para congelação.
Todo o material foi previamente equilibrado em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO2 em ar, pelo menos por 2 horas antes da utilização. As culturas foram realizadas em placas plásticas de cultura celular, com 4 gotas de 100 µl do meio de maturação cobertas por óleo mineral Sigma
®, em cada gota eram tratados de 15 a 20 oócitos.
Obtenção e classificação dos oócitos
Os ovários recolhidos das cadelas foram levados ao Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal (LRMGA/UENF) e o início do processamento do material ocorreu em no máximo 3 horas do término da cirurgia. O par de ovários de cada fêmea separada- mente foi fatiado e escarificado com lâminas de bisturi, o fluido obtido foi avaliado em estéreo-microscópico em aumento de 20 a 40X, dentro de fluxo laminar.
Os oócitos foram classificados em grau I, grau II e
degenerados conforme descrição de Hewitt e England
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(1997a). Para cada cadela, todos os oócitos obtidos foram contados e classificados em cada um dos grupos.
Maturação in vitro dos oócitos
Os oócitos classificados em grau I foram selecionados para o processo de MIV por 72 horas e/ou co-incu- bação com espermatozóides, de acordo com o grupo de tratamento. Durante este período, os oócitos foram mantidos em gotas de meio de maturação suplementa- dos com hormonas (TCM + FSH + LH + antibióticos), em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO2 em ar.
Os oócitos de grupos tratados foram submetidos a meio de fecundação (Talp Fec) durante a co-incubação com espermatozóides.
Seleção do doador e preparação do sêmen
Foi utilizado um único doador de sêmen, um cão da raça Bull Terrier de 2 anos, em boas condições de saúde.
O sêmen foi recolhido por massagem peniana e mostrou-se dentro de excelentes padrões quanto a moti- lidade, vigor, concentração e patologias espermáticas, segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1996). Os espermatozóides viáveis foram selecionados pela técnica de gradiente de centrifugação com Percoll
®, ajustando a concentração espermática a 10
6esperma- tozóides/ml.
Determinação da MIV (avaliação da configuração nuclear)
Durante a avaliação foram considerados maturados todos os oócitos que se apresentaram em metáfase II (MII) com cromossomos visivelmente condensados.
Os oócitos em fases anteriores a MII ou sem identifi- cação de material nuclear foram considerados imaturos e degenerados respectivamente (Hewitt e England, 1997a).
Para determinar se houve maturação, os oócitos tratados foram corado por iodeto de propídeo e verifi- cados em microscópio de fluorescência (aumento de 40X, filtro excitador 510, posição G 247).
Delineamento experimental
Experiência I – Influência da idade, da fase do ciclo éstrico e do estado nutricional das fêmeas dadoras de
ovários, na quantidade e qualidade dos oócitos obtidos.
Nesta etapa, cada par de ovários proveniente de dadoras, foi processado separadamente para que os oócitos pudessem ser contados e avaliados. Os oócitos foram separados em três grupos (GI, GII e degenerados).
Experiência II – Influência de diferentes tempos de co-incubação entre o espermatozóide e oócito, na indução da maturação in vitro de oócitos de cadelas.
Esta etapa propôs verificar a influência da presença de espermatozóides caninos durante o período de maturação in vitro de oócitos de cadelas. Para isto, quatro tratamentos foram propostos: Grupo controle - oócitos cultivados em meios de MIV, por 72 horas.
Grupo spz 48h – oócitos maturados por 48 horas, e incubados por 24 horas com espermatozóides caninos.
Grupo spz 24h – oócitos maturados por 24 horas e incubados por mais 24 horas com espermatozóides caninos e retornaram o cultivo por mais 24 horas em meio de MIV. Grupo spz 0h – oócitos imaturos foram incubados por 24 horas com espermatozóides caninos em meio de FIV, e após este período passaram por 48 horas de MIV. Todos os tratamentos completaram 72 horas de MIV. O esquema a seguir demonstra o deli- neamento proposto (Figura 1).
Analise estatística
Após a análise preliminar, onde foi realizada a análise descritiva, os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste T com 5% de significância.
Resultados e discussão
Experiência I
Idade das cadelas dadoras de ovários. A ANOVA mostrou que não houve diferença estatística entre os efeitos analisados (P>0,05). As cadelas pré-púberes, maduras e com mais de 8 anos obtiveram em média a mesma quantidade de oócitos. Porém em relação a qualidade oocitária verificou-se diferença estatística entre os grupos (P<0,05). A Tabela 1 apresenta as médias e desvios-padrão para o número total de oócitos.
Grupos 0 h 24 h 48 h 72 h
Controle MIV MIV MIV avaliação
Sptz 48 MIV MIV sptz-oócito avaliação
Sptz 24 MIV sptz-oócito MIV avaliação
Sptz 0 sptz-oócito MIV MIV avaliação
Figura 1- Delineamento experimental da Experiência II
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Os dados descritos na tabela mostram que com o aumento da faixa etária ocorre diminuição na qualidade das estruturas analisadas. Estes estudos concordam com os apresentados por Rocha et al. (2004) que relatou que a média de oócitos de melhor qualidade foi significantemente menor em cadelas idosas.
Estes dados sugerem que deficiências na regulação dos eixos de estímulo hormonal, bem como a capaci- dade de fertilização oocitária in vivo estariam relacionadas com a idade avançada das fêmeas.
Fase do ciclo éstrico das cadelas dadoras de ovários. A ANOVA não mostrou diferença significati- va em nenhum dos grupos (P>0,05). O número total de oócitos apresentou médias semelhantes tanto para cadelas em e atividade reprodutiva, como para as que estavam em repouso reprodutivo. O mesmo resultado foi verificado em relação a qualidade oocitária nos dois estados reprodutivos. A Tabela 2 mostra os resul- tados visualizados para a característica efeito do ciclo éstrico na quantidade e qualidade oocitária.
Índice corporal das cadelas dadoras de ovários. Foi possível observar influência significativa entre a condição corporal as cadelas ováriohisterectomizadas na qualidade dos oócitos obtidos dos folículos ováricos (P<0,05).
Para as quatro avaliações realizadas (número total de oócitos, número de oócitos GI, GII e degenerados) o resultado estatístico foi semelhante. Observou-se que os animais que estavam magros apresentaram redução no número total de oócitos. Em relação à qualidade destes oócitos, em todas as classes analisadas, as fêmeas magras apresentaram diminuição da qualidade das estruturas, com redução no número de oócitos GI e GII (P<0,05), ao comparar com cadelas de índice corporal regular ou obesas (Tabela 3).
Pelo fato de poucas hipóteses terem sido avaliadas sobre este aspecto, sugere-se que os diferentes estados nutricionais das fêmeas acarretam grande variação na concentração plasmática de leptina. A leptina é um hormônio secretado pelo tecido adiposo sendo crucial em diversos processos fisiológicos, principalmente o
Tabela 1- Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos de grau I, grau II e degenerados obtidos de ovários de cadelas em diferentes faixas etárias
Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos
Faixa Etária Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerados
Pré-púberes 59,1 + 16,0 a 16,2 + 7,6 a 17,5 + 4,2 a 25,4 + 9,0 a
(n=11)
Maturas 57,3 + 22,8 a 15,5+10,1 ab 18,6 + 9,6 ab 22,9 + 8,0 ab
(n=38)
Com mais de 8 anos 54,6 + 15,6 a 11,5 + 5,7 b 16,1 + 6,6 a 27,1 + 7,4 a
(n=58)
A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
Tabela 2- Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos GI, GII e degenerados obtidos de ovários de cadelas em estação reprodutivo e repouso reprodutivo
Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos
Fase do ciclo éstrico Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerado
Repouso reprodutivo 55,0 +18,1 a 13,4 + 8,0 a 17,0 + 7,6 a 24,8 + 7,9 a
(n=69)
Atividade reprodutiva 57,7 + 9,0 a 13,5 + 8,7 a 17,4 + 7,7 a 26,5 + 8,0 a
(n=38)
A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
Tabela 3- Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos de grau I, grau II e degenerados obtidos de ovários de cadelas em diferentes estados nutricionais
Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos
Scorecorporal Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerado
Magras 40,5 + 2,8 a 7,7 + 3,8 a 11,1 + 4,7 a 21,7 + 7,9 a
(n=39)
Regular 65,8+16,6 b 17,8 + 9,1 b 21,2 + 7,5 b 26,7 + 7,5 b
(n=51)
Obesas 62,1 + 7,9 b 13,4 + 3,7 b 18,6 + 3,6 b 30,1 + 5,7 b
(n=17)
A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
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reprodutivo (Zhang et al., 1994; Mantzoros, 2000).
Desta forma os animais em estado de sub-alimen- tação, bem como em sobre-alimentação (obesas) apresentam respectivamente deficiência e abundância deste hormônio (Stergios Moschos et al., 2002).
Lebrethon et al. (2000) determinaram que a elevação na concentração plasmática de leptina acelera a freqüência dos pulsos do GnRH. Sendo que direta- mente este fato irá estimular a secreção do FSH e LH.
Estes dois últimos hormônios, por sua vez, possuem grande importância no desenvolvimento oocitário intra-folicular, atuando diretamente na qualidade da célula oocitária (Hafez, 1995; Figueiredo et al., 2002).
Em tal estudo não foram avaliadas as concentrações plasmáticas da hormona leptina, porém os dados observados podem sugerir o fato de cadelas em condição corporal ideal ou sobre-alimentadas, logo, com maior quantidade de tecido adiposo e possivel- mente maior concentração plasmática de leptina, apresentarem maior número de oócitos, associado a elevação direta da qualidade destas estruturas.
Experiência II
A ANOVA realizada neste trabalho determinou que os grupos tratados, consequentemente que sofreram influência da presença de espermatozóides durante algum momento do processo de maturação, atingiram taxas maiores de MIV, se comparados com o grupo controle, o qual não passou por co-incubação espermática (P<0,05).
Neste experiência foram utilizados 748 oócitos, provenientes de 82 cadelas em idade matura, condição corporal regular e em anestro, divididos nos seguintes grupos: 178 (grupo controle), 196 (grupo SPZ 48), 203 (grupo SPZ 24) e 171 (grupo SPZ 0) de forma aleatória a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO2 em ar.
Sendo que apenas os oócitos que atingiram MII foram considerados maturados. A Tabela 4 mostra as médias e desvios encontrados em cada grupo de tratamento e cada situação de divisão meiótica (oócitos maturos e imaturos).
O desenvolvimento oocitário canino, in vivo e in vitro, ainda não foi totalmente estudado, muito pouco se sabe sobre a fisiologia deste processo. Porém, os resultados deste estudo comprovam a possibilidade da presença de espermatozóides caninos induzir a retomada da meiose, atingindo assim a maturação oocitária in vitro. Saint-Dizier et al. (2001), mostraram que a penetração espermática in vitro induz o término da maturação oocitária atingindo consequentemente fase de metáfase II, sendo que 10%
de MII já foi verificada versus 2,1% em oócitos controle sem presença de espermatozóides.
Algumas espécies de mamíferos já estudados apresentam duas hipóteses que podem auxiliar na discussão destes resultados. Eppig (2001) verificou que em oócitos de murganhos a forte união das células do cumulus realiza efeito inibitório no processo de maturação, sendo este efeito revertido no momento em que se inicia a expan- são da camada de células do cumulus.
Por outro lado, Hay (1996) cita que vários autores descreveram o fato da interação entre esperma- tozóides e a zona pelúcida dos oócitos estimular a síntese do fator promotor da maturação (MPF) no citoplasma oocitário. Estes estudos foram realizados em bovinos (Hay, 1996).
Desta forma, o resultado deste estudo leva a crer que o contato do espermatozóide canino estimule a retomada da meiose, induzindo a separação das células do cumulus e consequentemente a maturação in vitro. Durante o processo de fertilização oocitária, em situação in vivo ou in vitro, como verificada neste estudo, o espermatozóide canino necessita ultrapassar a barreira fisiológica formada pela compactação das células do cumullus ao redor do oócito. A expansão desta camada induzida pela passagem do esperma- tozóide, seja por ação enzimática das reações acrosso- mais ou mecânicas, concorda com estudos já citados de Eppig (2001), que verificou esta ação em murganhos. Este fato sugere que a ativação do processo de maturação possivelmente seja influenciada pela presença espermática em oócitos caninos, devido a ação de expansão das células do cumulus.
Tabela 4- Médias reais e desvios-padrão para número de oócitos degenerados ou não identificados, imaturos e maturos (MII) nos grupos controle e tratados com espermatozóides
Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos
Tratamento % degenerados % oócitos em diferentes estádios de MIV
Não identificados Imaturos Maturos (MII)
Controle 30,35 + 14,02 a 64,75 + 11,91 a 4,91 + 4,76 a
(n=178)
SPZ 48 18,15 + 10,97 b 55,66 + 16,71 a 26,19 + 18,57 b
(n=196)
SPZ 24 15,51 + 6,70 b 60,13 + 16,87 a 24,36 + 13,27 b
(n=203)
SPZ 0 20,58 + 8,77 b 59,46 + 14,06 a 19,96 + 17,89 b
(n=171)
A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
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Além disso, a idéia de que o amadurecimento do núcleo da célula espermática esteja relacionado com a elevação da concentração de MPF dentro do ooplasma, também concorda com os resultados obtidos, indicando que a interação estimulada pelo espermatozóide de cão pode controlar fatores citoplasmáticos dos gametas femininos. Mesmo sem as mensurações das concentrações de MPF intra-ooci- tária, a concordância dos fatos sugere que como verificado na espécie bovina (Hay, 1996), em cães o contato entre células do cumulus e espermatozóide também possa elevar as taxas de maturação na espécie.
Para confirmação de tal fato porém, são necessários maiores estudos que determinem as concentrações dos fatores que promovem a maturação e sua ocorrência e aumento em células imaturas que permanecem na presença de espermatozóides.
Os valores médios obtidos para a MIV dos oócitos na forma convencional (apenas em meios de cultivo suplementados) foram de 4,9% em média. Esta taxa é bastante semelhante com o que boa parte da literatura descreve (Hay, 1996; Hewitt e England, 1998a; Hewitt e England, 1998b; Vannucchi, 2003).
Sabe-se também que mesmo com os resultados obtidos nos grupos tratados (em média 23,5% de MIV), este estudo encontra-se bastante distantes do sucesso que a técnica apresenta em outras espécies. Porém, para espécie canina este resultado pode ser considerado como um grande avanço na biotecnologia aplicada a reprodução de carnívoros.
Conclusão
Os resultados obtidos neste estudo permite concluir que a elevação das taxas de MIV de oócitos de cadelas domésticas, é possível com adequação da técnica, onde oócitos ainda imaturos podem ser incubados com espermatozóides caninos, sendo que, este fato eleva significantemente as taxas de maturação in vitro.
Além disso, a idade das cadelas dadoras de ovários, bem como a condição corporal em que esta fêmea se encontra, influencia na quantidade de oócitos de melhor qualidade, conferindo maior índice de oócitos viáveis para técnica de MIV.
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Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon).
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CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DE
Resumo:A mastite bovina permanece a razão mais frequente para a utilização de antibióticos nas explorações leiteiras. A escolha do fármaco a administrar é geralmente empírica, baseada na sua disponibilidade para administração intra- mamária e reflete a experiência adquirida do Médico Veterinário. Informação relativa às susceptibilidades dos microrganismos isolados em diferentes regiões geográficas assume uma crescente importância. Este trabalho visou a avaliação da susceptibilidade a 12 fármacos, por difusão em disco, de 234 isolados contagiosos e ambientais de mastite subclínica, obtidos em explorações da zona centro de Portugal, no período compreendido entre 2000 e 2003. Os fármacos testados foram: penicilina, ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefazolina, cefoperazona, cefquinoma, aminosidina, estreptomicina, gentamicina, sulfametoxazole/trimetoprima, rifaximina e colistina. No total dos isolados testados, cefazolina (91,0%) e a associação amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) revelaram a maior eficácia in vitro. As cefalosporinas constituíram o grupo de fármacos com os melhores resultados, inclusivamente contra microrganismos Gram negativos. Níveis elevados de resistência in vitroa penicilina e ampicilina foram observados para microrganismos Gram positivos, particular- mente face a Staphilococcus aureuse Streptococcus agalactiae.
De uma forma global, o maior número resistências encontrado neste estudo, em comparação com outros países, poderá ser reflexo da pressão selectiva sobre estirpes resistentes devidas a antibioterapias mal direccionadas.
Summary: Bovine mastitis remains the main reason for antibiotic use in dairy farms. Antimicrobial drug selection is usually empirical, based on the drug availability for intramam- mary administration and reflects the previous experience of the Veterinarian. Information regarding susceptibility of the micror- ganisms isolated in different geographic regions has become of major importance. The present work aimed at assessing the susceptibility to 12, through disc diffusion, drugs of 234 contagious and environmental mastitis pathogens from subclinical mastitis cases, isolated in dairy farms from the central region of Portugal, from 2000 to 2003. The drugs tested were: penicillin, ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid,
cefazolin, cefoperazone, cefquinome, aminosidine, strepto- mycin, gentamycin, sulfamethoxazole/trimethoprim, rifaximin and colistin. Overall, cefazolin (91.0%) and the association amoxicillin/clavulanate (90.2%) revealed higher in vitro efficacy. Cephalosporins were the antimicrobial group showing better results, including Gram negative microrganisms. High levels of in vitro resistance to penicillin and ampicillin were found for Gram positive pathogens, especially against Staphilococcus aureusand Streptococcus agalactiae. Globally, the high number of resistances found in this study, when compared to other countries, may reflect the selective pressure on resistant strains due to misguided antibiotherapies.
Introdução
A mastite permanece como a patologia de maior impacto económico nas explorações de bovinos leiteiros. A forma subclínica de infecção, apesar de menos evidente para o produtor do que a clínica, é a que mais afecta o rendimento económico da produção de leite. O impacto das mastites subclínicas deriva da diminuição do nível de produção e qualidade do leite, particularmente por aumento do número de células somáticas, constituindo igualmente a razão mais frequente para a administração de antibióticos em bovinos leiteiros (Hillerton e Berry, 2005).
Questões de saúde pública, principalmente as relacionadas com a presença de resíduos e a dissemi- nação de resistências bacterianas aos antibióticos, determinaram recomendações para uma redução gradual da utilização de antibióticos em medicina veterinária (WHO, 2001). A identificação dos agentes etiológicos de qualquer infecção e a avaliação do seu perfil de sensibilidade a fármacos antimicrobianos torna-se assim essencial para a adequada selecção da antibioterapia a instituir (Gentilini et al., 2002).
No entanto, e no caso específico de mastite, este procedimento nem sempre é passível de ser adoptado pelo clínico assistente da exploração, sobretudo pela
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