Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Universidade Federal de Ouro Preto
Yara Cristina de Paiva Maia
PEPTÍDEOS LIGANTES DE CÉLULAS TUMORAIS E
DE IMUNOGLOBULINAS G ESPECÍFICOS DO
CÂNCER DE MAMA
Orientador: Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho Co-orientadora: Profa. Dra. Renata Nascimento Freitas
Yara Cristina de Paiva Maia
PEPTÍDEOS LIGANTES DE CÉLULAS TUMORAIS E
DE IMUNOGLOBULINAS G ESPECÍFICOS DO
CÂNCER DE MAMA
Tese de doutorado apresentada ao Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para obtenção do grau de doutora em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho Co-orientadora: Profa. Dra. Renata Nascimento Freitas
DEDICATÓRIA
Dedico o meu doutorado aos meus dois amores: Marcelo e Mariana!
Faltam-me palavras para expressar a minha profunda admiração, gratidão e amor por vocês. Tudo que eu escrever será muito pouco perto do que vocês representam na minha vida.
Marcelo, meu amado companheiro e amigo, obrigada pelo incentivo para seguir carreira acadêmica e alcançar os meus sonhos, por mais difíceis e ousados que pudessem ser. Obrigada pelo ombro amigo que tantas vezes me amparou e fez com que eu não desistisse. O seu companheirismo, paciência, orientação e otimismo foram fundamentais para a conclusão de um ciclo importante e decisivo na minha vida profissional.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que, de maneiras diferentes, contribuíram para este trabalho:
A Deus, por todas as graças que tenho alcançado e por me proporcionar saúde, paciência, sabedoria e perseverança para finalizar mais uma etapa da minha formação.
Ao Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart, que prontamente aceitou se credenciar no NUPEB para que eu pudesse desenvolver o meu trabalho de doutorado sob a sua orientação no Laboratório de Nanobiotecnologia em Uberlândia. Obrigada pela liberdade que me foi concedida durante estes anos, pelos inúmeros conhecimentos transmitidos e pelo exemplo de pesquisador inovador, criativo, dedicado, produtivo e humano. Sinto-me preparada para abraçar a docência e a pesquisa, pois seguirei o seu exemplo e estou certa de que o sucesso acontecerá.
A Profa. Dra. Renata Nascimento Freitas, pelo exemplo de rigor, seriedade e critério científico na condução de uma pesquisa. Obrigada pela sua amizade, carinho, atenção e orientação desde o meu mestrado.
Aos docentes do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas pelos ensinamentos ministrados. Aos professores Renata Guerra, Ieso Miranda Castro e Andrea Maranhão pelas sugestões e considerações feitas na banca de qualificação do doutorado e que tanto contribuíram para o aperfeiçoamento desta tese.
A querida Cida, pela competência, amizade e por toda a solicitude e presteza desde o meu mestrado.
Ao CNPq, CAPES, UFU, UFOP que financiaram o meu trabalho.
Aos meus amados pais, Antonio Carlos de Paiva e Yara Aguiar Rezende de Paiva, por serem o meu “Porto Seguro” e por acreditarem que o maior legado que os pais podem deixar para os filhos é a educação. Agradeço pelo exemplo de trabalho, caráter, honestidade, respeito e união a mim transmitidos desde os meus primeiros passos. Se hoje estou concluindo o doutorado e sou professora da UFU é devido à dedicação e exemplo de vocês, portanto o título de doutora e a minha profissão pertencem também a vocês.
A Dra. Bianca Sakamoto Ribeiro de Paiva, por ser a irmã que eu pude escolher na vida. Obrigada pelas suas orações, orientações e amizade. Obrigada pelo seu ombro amigo que tantas vezes ouviu os meus desabafos em relação aos insucessos experimentais e pessoais e que vibrou com os meus momentos de sucesso. Obrigada pelo incentivo para que eu fosse cada vez mais feliz e mais realizada.
Aos meus eternos amigos de Ouro Preto, vocês fazem parte da minha história.
Aos queridos e eternos amigos do laboratório de Nanobiotecnologia, Ana Carolina Siquieroli, Ana Paula Carneiro, Ângela Sena, Ayla, Prof. Carlos, Carol Reis, Christiane, Eliza, Emilia, Érica, Fabiana Santos, Fausto Capparelli, Galber, Janaína, professor Jair Júnior, Juliana Franco, Karina Marangoni, Larissa Minari, Larissa Goulart, Luciana Bastos, Lucélia, Patrícia Terra, Patrícia Tieme Fujimura, Paula Cristina, Paula Souza, Rafael Nascimento, Rone, Tamiris, Thaise, Tininha, Thiago, Vanessa, Vívian, e Washington pela troca de conhecimentos, pelas longas conversas, pela amizade, pelas discussões científicas e pelo exemplo de que um grupo pode ser cada dia melhor e mais produtivo.
A amiga Patrícia Tieme Fujimura, que em 2007 me apresentou o laboratório do Prof. Luiz e desde então foi a amiga de todas as horas. Obrigada pela troca de conhecimentos e pela valiosa colaboração em um momento que o tempo pareceu curto demais para tantos experimentos e atividades.
A amiga Thaise que esteve comigo desde os primeiros passos para a organização do banco de dados da mama e a partir daí esteve sempre presente. A convivência com uma pesquisadora organizada, competente e inteligente foi muito enriquecedora para mim. Estou certa de que colheremos muitos frutos de tanta dedicação e trabalho.
Ao amigo Fausto Capparrelli, pela presteza em momentos importantes da minha vida de pesquisadora, por me ensinar os primeiros passos no mundo do PD e por não medir esforços para auxiliar a todos os integrantes do Grupo Nanos.
Aos meus amigos Ju, Galber, Tamiris e Carol por todos os momentos de convivência sempre agradável e pela enorme ajuda em momentos importantes desta tese.
A querida Vanessa pela seleção do anticorpo monoclonal e pela enorme ajuda na realização dos ELISAS em um momento que o tempo era muito importante para mim.
Não poderia deixar de agradecer a colaboração dos seguintes integrantes da equipe médica e de enfermagem do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia: Dra. Priscila, Dr. Thales, Dr. Alair, Dr. Sinval, Dr. Eduardo, Vanessa, Gina, Cleonice, Aparecida, Maria de Fátima, Ana Aloisa, Divina. Sem o trabalho e compreensão de vocês nenhum resultado seria alcançado.
Agradecimento especial a enfermeira Emilia Hissami Toyama, que prontamente colaborou com a coleta de todo o material biológico das pacientes portadoras de câncer de mama. Agradecimento especial ao Osmar e a Noêmia, que tantas vezes me auxiliaram na coleta do material biológico.
Ao Dr. Amilcar pela enorme contribuição na realização da imunofluorescência e imunohistoquímica.
Ao Dr. Rafael Malagoli e ao Dr. Fernando Soares, por abrirem as portas da Anatomia Patológica do Hospital ACCamargo, em São Paulo, para a realização da validação clínica dos biomarcadores.
A Suely, pesquisadora do Hospital ACCamargo, pela enorme contribuição na realização da Imunohistoquímica. A convivência com uma pesquisadora dinâmica, competente e produtiva foi muito enriquecedora para mim.
A toda a equipe do Hospital ACCamargo, pelos conhecimentos transmitidos e pela convivência durante o estágio realizado no Serviço de Anatomia Patológica. Agradecimento especial ao Carlinhos e ao Severino que tanto contribuíram na realização
do Tissue Micro Array com os pacientes da Universidade Federal de Uberlândia.
A professora Dra. Ana Grace, Dr. João Marcos e ao Dr. Diego pela enorme colaboração no desenvolvimento dos sensores eletroquímicos.
A Dra Paula Cristina pela realização do gel bidimensional e pela amizade.
Aos meus queridos sogros, Altair e Niza, pelas orações, pelo carinho e pelo amor. Às minhas amigas Andrea e Cleusa, pela amizade, companheirismo, pelas orações e por compreender os meus momentos de crise.
A toda a família da Casa da Fraternidade São Francisco de Assis pelo acolhimento e pelas orações em momentos difíceis da minha vida profissional e pessoal.
COLABORADORES
Prof. Dr. Amílcar Sabino Damazo (Departamento de Ciências Básicas em Saúde - Faculdade de Ciências Médicas – UFMT, Laboratório de Histologia)
Profa. Dra. Ana Grace Brito Madurro, Prof. Dr. João Marcos Madurro e Dr. Diego Leoni Franco (Laboratório de Filmes Poliméricos e Nanotecnologia – UFU)
Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira (Laboratório de Nanobiotecnologia - UFU)
Dr. Carlos Eduardo Paiva (Oncologista clínico - Hospital do Câncer de Barretos)
Prof. Dr. Fernando Soares e Dr. Rafael Malagoli Rocha (Departamento de Anatomia Patológica – Hospital ACCamargo)
Prof. Dr. Marcelo de Almeida Maia (Faculdade de Computação – UFU)
ÍNDICE GERAL LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO
Í NDICE GERAL
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 3
2.1 EPIDEMIOLOGIA E ETIOLOGIA DO CÂNCER DE MAMA ... 3
2.2 ASPECTOS ANÁTOMO-PATOLÓGICOS ... 4
2.3 ASPECTOS MOLECULARES ... 7
2.4 ASPECTOS IMUNOLÓGICOS ... 7
2.5 USO DE BIBLIOTECAS COMBINATORIAIS NO CÂNCER ... 10
2.6 SENSORES ELETROQUÍMICOS ... 14
3 OBJETIVOS... 17
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 18
4.1 ESTRATÉGIA 1:OBTENÇÃO DE SEQUÊNCIAS LIGANTES EM LINHAGEM CELULAR HCC1954 ... 18
4.1.1 Biopanning de células HCC 1954 ... 18
4.1.2 Análise de um peptídeo imunodominante sintetizado quimicamente ... 24
4.1.3 Análise da qualidade da seleção – Screening ELISA ... 25
4.1.4 Análise in silico de peptídeo imunodominante ... 27
4.2 ESTRATÉGIA 2:OBTENÇÃO DE SEQUÊNCIAS LIGANTES À IGG DE TECIDOS MAMÁRIOS ... 28
4.2.1 Biopanning de Imunoglobulinas G provenientes de tecido mamário ... 29
4.2.2 Pre-screening (ELISA) dos ciclos de seleção dos biopannings ... 37
4.2.3 Análise da imunorreatividade dos fagos recombinantes ... 37
4.2.4 Análise do peptídeo sintético com melhor imunorreatividade via fago ... 39
4.2.5 Desenvolvimento de sensor eletroquímico para a detecção do câncer de mama ... 41
4.2.6 Seleção de anticorpos scFv expressos na superfície de fagos ... 41
4.2.7 Análise in silico de peptídeo selecionado ... 48
5 RESULTADOS ... 49
5.1 ESTRATÉGIA 1:SEQUÊNCIAS LIGANTES EM LINHAGEM CELULAR HCC1954 ... 49
5.1.1 Biopanning de células HCC 1954 ... 49
5.1.2 Análise do peptídeo imunodominante SC195 ... 51
5.1.3 Seleção nos ciclos de biopanning ... 55
5.1.4 Análise in silico de peptídeo imunodominante ... 62
5.2 ESTRATÉGIA 2:SEQUÊNCIAS MIMÉTICAS EM TECIDOS MAMÁRIOS ... 66
5.2.1 Biopanning utilizando Imunoglobulinas G provenientes de tecido mamário ... 66
5.2.2 Pre-screening (ELISA) dos ciclos de seleção dos biopannings ... 71
5.2.3 Imunorreatividade dos fagos recombinantes ... 71
5.2.4 Imunorreatividade do peptídeo sintetizado a partir do fago F4 ... 76
5.2.6 Seleção dos anticorpos scFv ... 80
5.2.7 Análise in silico de peptídeo selecionado ... 81
6 DISCUSSÃO... 84
6.1 ESTRATÉGIA 1:SEQUÊNCIAS LIGANTES EM LINHAGEM CELULAR HCC1954 ... 84
6.1.1 A perda de variabilidade nos sucessivos ciclos de seleção ... 84
6.1.2 O peptídeo imunodominante SC195 como potencial marcador de prognóstico ... 86
6.1.3 Análise in silico de peptídeo selecionado ... 88
6.1.4 Considerações sobre o processo de seleção por phage display ... 89
6.2 ESTRATÉGIA 2:SEQUÊNCIAS MIMÉTICAS EM TECIDOS MAMÁRIOS ... 90
6.2.1 O impacto na seleção do biopanning com a utilização de vários grupos... 90
6.2.2 Imunorreatividade em soro dos fagos recombinantes obtidos de tecido ... 91
6.2.3 Análise in silico de peptídeo selecionado ... 94
6.2.4 Viabilidade de desenvolvimento de sensor eletroquímico ... 95
6.2.5 Viabilidade para o uso de anticorpos scFv ... 95
6.2.6 Considerações sobre a estratégia de seleção subtrativa em phage display ... 97
7 CONCLUSÃO ... 98
8 ANEXOS ... 99
8.1 ANEXO I–TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ... 99
8.2 ANEXO II–QUESTIONÁRIO CLÍNICO ... 101
8.3 ANEXO III–APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ... 103
8.4 ANEXO IV-PRODUTO ... 104
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Micro anatomia da mama. UTDL = unidade terminal ducto-lobular. Fonte: Brasileiro Filho, G.
Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan, 2006.
Figura 2 - A. Células epiteliais da glândula mamária. Representação do corte de um ducto mamário normal, no qual se observam células luminais, progenitoras e mioepiteliais. A membrana basal separa as células mioepiteliais do estroma adjacente. (Adaptada de Birnbaum, D et al. Int. J. Oncol., 25:249-58,2004.) B. Dúctulo
de glândula mamária normal. Imunohistoquímica para uma proteína basal (p63) identifica os núcleos das células basais/mioepiteliais (seta). Fonte: Brasileiro Filho, G. Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan,
2006.
Figura 3- Fago filamentoso. A) Composição do gene III, mostrando o sítio de ligação de clonagem para introdução do gene adicional; B) Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e PIX; C) Cristalografia dos domínio D1 e D2 da proteína III (97), as alfa-hélices estão coloridas em vermelho e as fitas em ciânico. (HOLLIGER et al., 1999).
Figura 4 - Ciclos de seleção de proteínas a partir de uma biblioteca de phage display. Bibliotecas de proteínas
(coloridas) são apresentadas em partículas de fagos fusionadas às proteínas de superfície (preto) (SIDHU e KOIDE, 2007).
Figura 5 - Representação esquemática do fragmento scFv. Os domínios VH e VL presentes na molécula scFv aparecem nas cores verdes e vermelhas, respectivamente. O polipeptídeo (peptide linker) estabilizador dos domínios está indicado pela seta (WEISSER e HALL, 2009).
Figura 6 - Organograma descritivo da metodologia adotada com apresentação das estratégias 1 e 2.
Figura 7 - Delineamento experimental para a realização do biopanning com a biblioteca contendo 12
aminoácidos randômicos e utilizando-se como alvo extrato proteico de células HCC 1954 BL e HCC 1954. Figura 8 - Esquema ilustrativo da utilização de microesferas ativadas com proteína G para purificação de IgG e imunoprecipitação de proteínas específicas.
Fonte:http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/100.03D04D_Dynabeads_Protein_G_(rev004).pdf. Figura 9 - Estratégia experimental do biopanning realizado com Imunoglobulinas G provenientes de tecido de
pacientes com câncer de mama.
Figura 10 - Esquema representativo do ensaio imunoenzimático ELISA para avaliação da reatividade dos cinco fagos em amostras de soro.
Figura 11 - Etapas de construção do sensor para câncer de mama. Eletrodo de grafite (azul), polímero (marrom), peptídeo (vermelho) e IgG (ciano).
Figura 12 - Título dos fagos. As colônias azuis representam a infecção das bactérias E.coli (ER2738) com os
fagos M13 carregando o gene da -galactosidase. A, B, C e D representam titulações de 10-1 até 10-4.
Figura 13 - Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo, contendo: M: DNA de fago M13 padrão contendo 400ng de DNA (Pharmacia). 1-6: Amostras do DNA de fago M13 selecionados randomicamente no biopanning.
Figura 14 - Imunofluorescência para o peptídeo SC195 indicando marcação positiva em células de adenocarcinoma ductal de mama.
Figura 15 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos trinta primeiros clones mais reativos obtidos no primeiro ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Figura 16 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos trinta primeiros clones mais reativos obtidos no segundo ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Figura 17 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos três clones obtidos no terceiro ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Figura 18 - Validação dos fagos selecionados por meio de PD tendo como alvo linhagem celular HCC 1954. Figura 19 - Alinhamento tridimensional do peptídeo C195 contra alvos selecionados.
Figura 20 - Expressão do gene KCNMA1 em diversos tipos de câncer. (Fonte: www.genecards.com)
Figura 22 - Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos mamários. Coluna M: Marcador de peso molecular Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range (Bio-rad). Colunas 1 a 3: 15 microgramas de proteínas de tecido de paciente com câncer de mama, doença benigna da mama e controles, respectivamente. Figura 23 - Membrana de Dot Blot das amostras de extrato de proteína total (Ptn. T.), proteínas remanescentes
(R) e de IgG purificada (IgG P.) de amostras de pacientes CO, DBM e CM. Figura 24 - Absorbância dos 5 clones mais reativos de cada grupo de pacientes
Figura 25 - Gráficos representativos das leituras a 492 nm do ensaio ELISA mostrando a reatividade dos clones contra os soros de pacientes individuais de diferentes grupos.
Figura 26 - Gráfico representativo da Curva ROC (CA x CO) referente ao Fago F4.
Figura 27 - Gráfico de dispersão para comparação da absorbância do fago F4 em relação ao grau histológico, a receptor de estrógeno (RE), a receptor de progesterona (RP) e a receptor c-erb B2.
Figura 28 - Gráfico de Dispersão da Absorbância relativo ao peptídeo sintético F4. A linha horizontal representa o valor do cut off obtido por meio da curva ROC.
Figura 29 - Diagrama de Nyquist de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo ( ) peptídeo (sonda) e ( ) peptídeo-IgG (alvo) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de potássio, potencial aplicado: +0.24 V, amplitude: 0,10 V. Inset: região de alta frequência ampliada.
Figura 30 - Diagrama de Nyquist de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo ( ) peptídeo (sonda), ( ) peptídeo e igG (alvo) e ( )peptídeo e igG (alvo não-complementar) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de potássio, potencial aplicado: +0.24 V, amplitude: 0,10 V. Inset: região de alta frequência ampliada.
Figura 31 - Circuito equivalente para simulação dos dados de EIE. Rs é a resistência da solução, Qdl,1 é a capacitância da dupla camada elétrica, Rct,1 é a resistência à transferência de carga, W é a resistência de Warburg e Qdl,2 é a segunda capacitância.
Figura 32 - Voltamogramas de pulso diferencial de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo ( ) apenas o peptídeo (sonda), ( ) contendo peptídeo e igG (alvo) e ( ) peptídeo e igG (alvo não complementar) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de potássio, 16 mV/s.
Figura 33 - Absorbância dos clones (anticorpos scFv) mais reativos relacionados ao peptídeo sintético (SF4). Figura 34 - Absorbância dos cinco clones (Anticorpos scFv) mais reativos em relação ao fago com o peptídeo e o fago selvagem.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Variáveis para o cálculo de sensibilidade especificidade e acurácia
Tabela 2 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes ao extrato proteico de células HCC 1954. Título obtido (pfu) no processo de seleção.
Tabela 3 - Frequência de cada clone obtido no terceiro ciclo de seleção.
Tabela 4 - Relação das amostras analisadas na Imunofluorescência, com o diagnóstico histopatológico e com a intensidade de marcação em relação ao Recepetor de Estrógeno (RE), Receptor de Progesterona (RP) e HER. Tabela 5 - Avaliação da Intensidade de Fluorescência (IF) categorizada em 0, 1-2 e 3 considerando os Receptores de Estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP), classificação de Scarff-Bloom-Richardson SBR) e o perfil (luminal ou triplo negativo TPN) utilizando-se o Teste Exato de Fischer.
Tabela 6 - Valores médios com os respectivos desvios padrões da absorbância dos clones presentes nos três ciclos de seleção.
Tabela 7 - Valores referentes ao Ensaio Imunoenzimático dos clones selecionados referentes aos três ciclos de seleção com os valores da média da absorbância do clone em relação ao extrato proteico das células HCC 1954, em relação às células normais e valores da média da absorbância da razão Tumor/ Câncer.
Tabela 8 - Clones referentes aos três ciclos de seleção com respectivos valores de absorbância e marcação na imunohistoquímica.
Tabela 9 - Comparação dos resultados referentes à Imunohistoquímica realizada com o fago C195 e a Imunofluorescência realizada com o peptídeo sintético SC195.
Tabela 10 - Alinhamentos mais significativos para o peptídeo C195 – Banco de Dados “Reference Proteins”
Tabela 11 - Caracterização dos agrupamentos de pacientes com CM, DBM e CO que fizeram parte do
biopanning.
Tabela 12 - Aspectos clínico-patológicos dos cinco grupos de câncer de mama (G1, G2, G3, G4, G5) considerando o grau do tumor, o estadiamento, a classificação de Scarff-Bloom Richardson (SBR), os receptores
de estrógeno e progesterona, cerB2 e p53.
Tabela 13 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes a proteínas do câncer de mama. Título obtido (UFC) no processo de biopanning com amostras de IgG provenientes do soro e tecido.
Tabela 14 - Ciclos de seleção do biopanning com o respectivo número de sequências válidas, sequências únicas
e repetidas.
Tabela 15 - Fagos F4, C10, B1, D11 e A7 com os respectivos valores referentes à curva ROC considerando os grupos CA x CO, CA x DBM e CA x DBM x CO.
Tabela 16 - Fagos com correlação de Pearson estatisticamente significativa (P-value < 0,05).
Tabela 17 - Correlação de Pearson entre os valores de absorbância dos 33 pacientes para os 5 fagos (acima Valor de Correlação de Pearson, abaixo P-value).
Tabela 18 - Peptídeo sintético SF4 com os valores referentes à curva ROC. Tabela 19 - Sensibilidade, especificidade e acurácia do peptídeo SF4.
Tabela 20 - Parâmetros obtidos por meio de simulação de dados de EIE usando circuito equivalente proposto para eletrodos de grafite modificado com poli ácido 3- hidroxifenilacético contendo peptídeo (sonda), peptídeo e IgG (sonda e alvo) e peptídeo e igG (sonda e alvo não-complementar)
LISTA DE ABREVIATURAS
BCIP - Bromochloroindolyl phosphato
BLASTp - (Basic Local Alignment Search Tool), programa de busca por alinhamento. BLOSUM - (BLOck SUbstitution Matrix)
BSA - Bovine Serum Albumin, Soroalbumina Bovina CEP/UFU - Comitê de Ética em Pesquisa na UFU CM - Câncer de mama humano
CO - Controle
DAB- 3-3’ – (diaminobenzidine tetrahydrochloride), tetrahidrocloreto diaminobenzidina DNA - Ácido desoxirribonucleico
DNA2PRO- Programa do RELIC destinado a dedução do DNA DTT - Ditiotreitol
EDTA - Etileno diamino tetra acetato
ELISA- (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), Imunoensaio enzimático EIE - Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
ER2738 - Escherichia coli cepa ER2738
HC- Hospital de Clínicas HE- Hematoxilina e Eosina HER-2- Human receptor 2 = cerb2
HRP- (Horse rad Imuno Histoquímica peroxidase), marcação com peroxidase IgG - Imunoglobulinas G
IHQ - Imunohistoquímica
INCA - Instituto Nacional de Câncer
IPTG- (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) LB- Meio de cultura Luria-Bertani
M13KE - Bacteriófagos filamentosos ML - Mass Ladder
NBT - Nitroblue tetrazolium Ni – Níquel
OD - Densidade ótica OPD- Orto-fenilenodiamina
pB - Par de base
PBS- Tampão fosfato salino
PBST - Fosfato de sódio com tween 20 0,5% pComb3X - Vetor de clonagem
PCR - Reação em cadeia da polimerase PD - Phage Display
PDB – Protein Data Bank
PEG - Polietileno glicol
Ph.D - Bibliotecas de Phage Display New England Biolabs
pIII - Proteína III do capsídio de bacteriófagos filamentosos pIX – Proteína nove do capsídeo do fago
pVI- Proteína seis do capsídeo do fago pVII- Proteína sete do capsídeo do fago
PVIII - Proteína VIII do capsídio de bacteriófagos filamentosos
RELIC- (Receptor Ligands Contacts), site com programas disponíveis on-line para análise de sequências peptídicas
scFv - Fragmento variável de cadeia única SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SEL- Selvagem
TBS - Trifosfato de sódio, Tampão Tris-Nacl TBST - Trifosfato de sódio com Tween 20 TNM - Tumor Linfonodo Metástase TRH - Terapia de Reposição Hormonal UFC - Unidade formadora de colônia UFU- Universidade Federal de Uberlândia UNIPROT- (Universal Protein Resource) VPD - Voltamogramas de pulso diferencial
RESUMO
Até o momento, não existem biomoleculares que sejam efetivamente utilizados no diagnóstico do câncer de mama. Uma alternativa para auxiliar a busca por marcadores moleculares é baseada na seleção de ligantes de alta afinidade por meio de Phage Display
(PD). O principal objetivo desta tese foi o desenvolvimento de novos biomarcadores envolvidos no câncer de mama selecionados contra uma linhagem celular tumoral altamente agressiva e contra IgG purificada específica de tecido mamário de pacientes. Após a seleção PD em biblioteca aleatória de peptídeos, todos os clones imunorreativos foram caracterizados por sequenciamento, deduzidos in vitro e submetidos a análises in silico. Validações
ABSTRACT
Currently there are no biomarkers that have effectively been used in breast cancer (BC) diagnosis, which has been accomplished mainly based on mammography and pathological analysis of biopsy specimens. An alternative technology for the discovery of markers is through selection of high affinity ligands by Phage Display (PD). The main objective of this investigation was the development of new biomarkers involved in breast cancer that were selected against a highly aggressive tumor cell lineage and against purified tissue-specific IgG from BC patients. After PD selections of random peptide libraries, all immunoreactive ligands were further characterized by sequencing, in vitro translated and submitted to bioinformatic
1
Introdução
O câncer de mama ocupa o primeiro lugar em incidência e o segundo em mortalidade entre as mulheres no mundo e é considerado um problema de saúde pública a nível mundial. Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer, 15% das pacientes com câncer de mama apresentam idade inferior a 45 anos e 60 % dos casos são diagnosticados em estádios avançados (estádios 3 e 4) (INCA, 2009). A melhor compreensão anatomo-patológica e molecular do câncer de mama vem permitindo observar que os diferentes subtipos desta doença apresentam características clínicas e prognósticas diferentes, além de perfil de resposta aos tratamentos diferenciados para cada subtipo. Na última década os esforços foram no sentido de se buscar e caracterizar um marcador tumoral associado ao câncer, hoje as pesquisas apontam para a busca de padrões ou perfis para o câncer. Com base na heterogeneidade da doença, acredita-se que alterações em diversas vias de sinalização celular sejam necessárias para que a doença ocorra.
Proteínas mamárias câncer específicas podem ser identificadas para utilização como marcadores em diagnósticos e prognósticos (ZHONG et al., 2008). Neste sentido, esforços têm sido empregados no sentido de se descobrir novos marcadores moleculares, contribuindo assim na predição da evolução clínica de um número maior de pacientes, possibilitando a detecção do câncer em estádios precoces (diagnóstico), favorecendo o monitoramento da progressão da doença e possibilitando a detecção de metástases ocultas. Estes marcadores moleculares podem ainda ter papel prognóstico, por meio da avaliação do risco de recorrência e morte na ausência do tratamento. Outros benefícios da descoberta de marcadores moleculares encontram-se na definição de terapia sistêmica adjuvante, predição de resposta ao tratamento (Fator preditivo), estadiamento ou triagem populacional e ainda estes marcadores podem funcionar como carreadores de drogas. Os marcadores tumorais podem ser detectados em alvos como tumores sólidos, células tumorais, saliva, soro e plasma. A obtenção de biomarcadores pode melhorar a qualidade de vida das mulheres portadoras desta patologia.
Uma alternativa para auxiliar a busca de marcadores é a técnica conhecida como
phage display (PD), a qual permite selecionar ligantes de alta afinidade e seus receptores.
Estes ligantes são selecionados em vários ciclos de biopanning. Ocorre que ainda não é bem
estudada como esta recomendação de seleção de ligantes ao término do processo pode influenciar na qualidade dos marcadores selecionados. Esta tese analisa a eficácia de duas estratégias para aplicação da técnica phage display para obtenção de biomarcadores
associados com o câncer de mama com o objetivo de selecionar biomarcadores durante o processo bem como para o desenho dos biomarcadores.
A presente tese poderá auxiliar na determinação de novos alvos tumorais fornecendo subsídios para compreender as alterações proteicas causadas pelo câncer. Enfim, acredita-se que em um futuro próximo o diagnóstico precoce do câncer e os critérios de prognóstico sejam guiados principalmente, pelo monitoramento de marcadores tumorais. Assim marcadores tumorais que possam ser detectados no soro do paciente pode ser um caminho promissor na detecção precoce do câncer ou no monitoramento da doença (ZHONG et al., 2008). Neste sentido, pelo fato de ainda não existir um método efetivo para o diagnóstico precoce do câncer de mama uma proposta foi desenvolver um imunossensor de baixo custo utilizando um peptídeo sintético obtido neste estudo para a detecção precoce do câncer de mama.
2
Revisão da literatura
A seguir serão abordados aspectos referentes à epidemiologia e etiologia do câncer de mama, bem como seus aspectos anátomo-patológicos, moleculares e imunológicos. Em seguida, serão revistas referências relacionadas ao uso de bibliotecas combinatoriais no câncer utilizando como células e autoanticorpos como alvos. Finalmente, será feita uma breve revisão sobre sensores eletroquímicos.
2.1
Epidemiologia e etiologia do câncer de mama
O nome câncer abrange um vasto conjunto de doenças caracterizadas por apresentar um grupo de células que cresce aparentemente sem controle algum. O câncer está entre as primeiras causas de morte, ao lado das cardiopatias, doença do aparelho respiratório, doenças infecciosas e parasitárias (BOYLE e LEVIN, 2008).
No Brasil, as estimativas, para o ano de 2010, válidas também para o ano de 2011, apontam a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada para a América Latina (INCA, 2009). O câncer de mama ocupa o primeiro lugar em incidência e o segundo em mortalidade entre as mulheres no mundo e é considerada uma doença heterogênea com alterações em diversas vias de sinalização molecular.
localizados nos braços longos dos cromossomos 17 e 13 respectivamente, são responsáveis por parcela importante dos casos de câncer de mama hereditários (MCPHERSON et al., 2000). Apesar de conferirem um risco adicional, mutações nos genes TP53, PTEN e CDH1 raramente são responsáveis pelo desenvolvimento do câncer de mama (CURIGLIANO et al., 2007).
A prevenção primária dessa neoplasia ainda não é totalmente possível devido à variação dos fatores de risco que estão envolvidas na sua etiologia. Entretanto, a detecção precoce do câncer é fundamental para o sucesso do tratamento, pois a cada milímetro de crescimento do tumor, há uma redução em 1% na chance de cura da doença (INCA, 2009). Neste sentido, novas estratégias de rastreamento factíveis para países com dificuldades orçamentárias como o Brasil têm sido estudadas e até o momento a mamografia, para mulheres com idade entre 50 e 69 anos, é recomendada como método efetivo para detecção precoce (INCA, 2009). Países como a Inglaterra, Alemanha, França, Itália e Estados Unidos também recomendam a realização da mamografia a partir dos 50 anos. A Sociedade Americana de Câncer e a Sociedade Brasileira de Mastologia recomendam a realização da mamografia a partir dos 40 anos e países como o Japão, Coréia do Sul e Suécia seguem este padrão de rastreamento. Ocorre que 15% dos casos de câncer de mama são detectados antes dos 45 anos e 60% dos casos são diagnosticados em estádios muito agressivos.
O exame clínico da mama deve ser realizado em todas as mulheres que procuram o serviço de saúde, independente da faixa etária, como parte do atendimento à saúde da mulher. Para as mulheres de grupos populacionais considerados de risco elevado (com história familiar de câncer de mama em parentes de primeiro grau), recomenda-se o exame clínico da mama e a mamografia, anualmente, a partir de 35 anos (SCHOUSBOE JT et al., 2011).
Apesar de ser considerado um câncer de relativamente bom prognóstico, se diagnosticado e tratado oportunamente, as taxas de mortalidade por câncer de mama continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente porque a doença ainda é diagnosticada em estádios avançados. Na população mundial, a sobrevida média após cinco anos é de 61%, sendo que para países desenvolvidos essa sobrevida aumenta para 73%, já nos países em desenvolvimento fica em 57% (INCA, 2009).
2.2
Aspectos anátomo-patológicos
ramificados pode ser dividido em dois grupos: a unidade terminal ducto-lobular (UTDL) e os grandes ductos (Figura 1). A UTDL é considerada a unidade anátomo-funcional da mama. As células epiteliais que compõem a glândula estão arranjadas em duas camadas: a camada epitelial luminal e a camada mioepitelial basal (Figura 2). Toda esta estrutura encontra-se circundada pela membrana basal (BRASILEIRO FILHO, 2006). A biologia e patologia da mama são embasadas nas células glandulares ou luminais e nas células mioepiteliais.
Os ductos e lóbulos são revestidos por uma camada luminal de células secretoras cuboidais. As células mioepiteliais estão em contato com a membrana basal contendo proteínas de músculo liso (BIRNBAUM et al., 2004; MAYROSE et al., 2007). No tecido mamário humano normal, os ductos e os lóbulos mamários estão delineados por duas camadas celulares distintas, uma superficial, formada por células epiteliais que estão em contato direto com a luz do ducto, denominada luminal, e outra interna que possui íntima relação com a membrana basal à qual está justaposta, denominada basal (Figura 2) (GUSTERSON et al., 2005). Histologicamente, a maior parte dos cânceres esporádicos da mama tem origem nas células epiteliais luminais, sendo este fato apoiado por evidências morfológicas, bioquímicas e moleculares (CALLAGY et al., 2003).
Os diferentes subtipos do câncer de mama apresentam características clínicas e prognósticas distintas, além de perfil de resposta ao tratamento diferenciado para cada subtipo de tumor. Alguns estudos apontam que a agressividade dos tumores se deve ao fato de estarem relacionados ao receptor de estrógeno (RE) positivo ou negativo. As variações morfológicas também estão relacionadas ao RE, como por exemplo, os carcinomas medulares em RE-negativos e os carcinomas tubulares e lobulares em RE-positivos (INCA, 2009).
Na atual década, crescente número de evidências vem demonstrando que a expressão gênica dos tumores de mama é diversa entre os grupos histologicamente identificáveis e, como resultado direto desse entendimento, pode-se, por exemplo, definir o emprego de drogas, como o trastuzumabe (PICCART-GEBHART et al., 2005) naquelas pacientes que apresentam expressão patologicamente aumentada do human epidermal growth factor
receptor 2 (HER-2) ou dos antagonistas dos receptores de estrógeno (RE) ou de progesterona
de mama do subtipo luminal apresenta evolução boa, ao passo que o subtipo triplo negativo apresenta evolução ruim, sendo considerado de pior prognóstico.
Figura 1 - Micro anatomia da mama. UTDL = unidade terminal ducto-lobular. Fonte: Brasileiro Filho, G.
Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan, 2006.
Figura 2 - A. Células epiteliais da glândula mamária. Representação do corte de um ducto mamário normal, no qual se observam células luminais, progenitoras e mioepiteliais. A membrana basal separa as células mioepiteliais do estroma adjacente. (Adaptada de Birnbaum, D et al. Int. J. Oncol., 25:249-58,2004.) B. Dúctulo
basais/mioepiteliais (seta). Fonte: Brasileiro Filho, G. Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan,
2006.
2.3
Aspectos moleculares
O aparecimento de um tumor está associado com a ocorrência de alterações que se acumulam progressivamente no material genético de uma célula normal associadas com alterações epigenéticas. Dessa forma, o câncer pode ser considerado como uma doença genética e como uma doença genômica e a caracterização destas alterações são fundamentais para a compreensão das bases moleculares da doença. A identificação de genes e processos envolvidos consiste no primeiro passo para o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sensíveis, terapias e medidas preventivas mais específicas e eficazes (MAIA, 2007).
O câncer é caracterizado por uma proliferação celular descontrolada que leva à formação de um tumor e ocorre devido a danos genéticos herdados e/ou adquiridos que alteram a expressão ou as propriedades bioquímicas de genes envolvidos na regulação do crescimento e diferenciação celular. Anormalidades tanto nos proto-oncogenes como nos genes supressores tumorais podem conferir a uma célula vantagens de crescimento e desenvolvimento sobre as células normais.
A progressão do tumor está associada com a ocorrência de seis capacidades funcionais que são úteis para a racionalização da complexidade das doenças neoplásicas. Estes marcos incluem o aumento dos sinais de crescimento celular, redução nos sintais de anti crescimento celular, aumento da invasão e metástase, redução do controle do programa de multiplicação celular, aumento da angiogênese e redução da apoptose (HANAHAN et al., 2000). Subjacente a estes marcos encontram-se duas características habilitadoras que são a instabilidade genômica que leva a diversidade genética e a inflamação que promove múltiplas funções relacionadas com os marcos acima citados. Dois marcos emergentes para a progressão do câncer é a reprogramação do metabolismo energético e a evasão da resposta imune ao tumor (HANAHAN e WEINBERG, 2011).
2.4
Aspectos imunológicos
Existem evidências que muitos tipos de câncer geralmente provocam uma resposta imune e que pacientes com câncer podem produzir autoanticorpos (SAHIN et al, 1995; CHEN et al, 1998; STOCKERT et al, 1998; BRICHORY et al, 2001, MINENKOVA, 2003). Pesquisas têm mostrado que os autoanticorpos são uma forma de resposta imune contra o tumor para vários antígenos tumorais próprios desenvolvidos por muitos pacientes (BRADFORD et al., 2006).
Foi realizado um estudo em 2005, com o objetivo de identificar autoanticorpos contra antígenos tumorais nos pacientes com câncer de próstata e os autores sugeriram que tais autoanticorpos pudessem ter valor diagnóstico e prognóstico (XIAOJU et al., 2005). Uma melhor compreensão do significado biológico da resposta imune, como por exemplo, a utilização no diagnóstico ou classificação do tumor, no potencial terapêutico, no uso no tratamento da doença, pode ser benéfica para pacientes com câncer (FORRESTER et al., 2007). O estudo da autoimunidade associada ao tumor pode oferecer esclarecimentos não apenas na patogênese das doenças autoimunes em geral, mas talvez até em eventos que direcionam alguns tipos de cânceres (TAN, 2001).
A natureza dinâmica do sistema circulatório e seus constituintes refletem as condições fisiológicas e patológicas mais diversas fazendo com que a busca de biomarcadores tumorais no soro esteja sendo amplamente investigada (HANASH et al., 2008). Em adição, uma nova área de pesquisa é a imunômica tumoral, ciência baseada no conceito de que os pacientes com câncer produzem autoanticorpos contra antígenos de seus tumores. O crescimento de um tumor no organismo pode então ser caracterizado pela presença de autoanticorpos que precedem achados clínicos por meses ou anos. A geração de anticorpos circulantes que se ligam à autoproteínas pode ser compreendida como uma amplificação do sistema imune de um sinal que indica a presença do tumor (CARON et al., 2007), sugerindo que ambas as moléculas possam apresentar valor diagnóstico e prognóstico nesta doença.
Existem muitos estudos sobre a resposta imune humoral de pacientes com diversos tipos de cânceres, tais como, colorretal (COOMBER e WARD, 2001), de testículo e próstata (FOSSA et al., 2004), pulmão (YAGIHASHI et al., 2005), mama (MADRID, 2005) (CANELLE et al., 2006), carcinoma hepatocelular (COVINI et al., 1997), melanoma (HOUGHTON et al., 2001) e cânceres ginecológicos (KORNEEVA et al, 2000).
(KORNEEVA et al., 2000), -metilacetil Coa (SREEKUMAR et al., 2004), mucina (VON MENSDORFF-POUILLY et al., 2000), proteína HER2 (DISIS et al., 1997) estas duas últimas envolvidas na inibição da progressão tumoral.
A detecção de anticorpos presentes no soro e que estejam associados a antígenos tumorais pode fornecer pistas para a descoberta de marcadores sorológicos para o diagnóstico e prognóstico do câncer (HANASH, 2003). Alterações no nível da expressão gênica (SCANLAN et al., 2001) e expressão aberrante de produtos gênicos associados ao tumor (JÄGER et al., 2001) são fatores importantes no desenvolvimento da resposta imune humoral em pacientes com câncer. Existem inúmeras vantagens para o uso de anticorpos como marcadores de desenvolvimento tumoral. A primeira é que autoanticorpos circulam no sangue muito mais precocemente do que antígenos sorológicos. Autoanticorpos associados a P53 têm sido relatados em pacientes com estádio inicial de câncer de ovário e câncer colorretal. Em segundo lugar, os anticorpos podem estar presentes em maior quantidade do que os antígenos tumorais. Em contraste com a detecção de antígenos sorológicos, a detecção de anticorpos sorológicos para antígenos tumorais podem prover marcadores sorológicos confiáveis para prognóstico e diagnóstico do câncer (ZHONG et al., 2008).
Assim, a detecção de autoanticorpos no soro de pacientes com câncer de mama pode fornecer uma forma menos invasiva e mais precisa de diagnóstico, além de novas abordagens terapêuticas, como por exemplo, o uso de triagem de autoanticorpos (ZHONG et al., 2008). Um estudo utilizando a técnica de phage display com o objetivo de identificar proteínas
associados ao câncer de mama e de avaliar a reatividade dos autoanticorpos em soro de pacientes com câncer de mama e controles mostrou que a acurácia de diagnóstico aumentou quando se utilizou uma combinação de marcadores (ZHONG et al., 2008).
O interesse imediato na aplicação terapêutica da imunidade do câncer concentra-se em estimular o sistema imune contra os antígenos tumorais. Isso levou ao desenvolvimento de inúmeros protocolos de vacinação contra o câncer. A habilidade dessas vacinas de estimular a produção de anticorpos e de ativar os linfócitos T é observada com frequência, porém, clinicamente ainda não se converteram em uma resposta antitumoral objetiva (DUPONT, 2002).
altamente expressa em metástases (KWON et al., 2003). Em um trabalho mais recente foi demonstrado que a partir de autoanticorpos é possível selecionar biomarcadores solúveis no soro de pacientes com câncer de próstata a partir da combinação das técnicas de phage display
e microarray. Em adição, um estudo da resposta imune humoral de pacientes com câncer de
mama em um painel de antígenos tumorais humanos identificados por phage display revela
que os anticorpos contra estes antígenos é indicativo de potencial uso como marcadores em imunoterapia ou em diagnóstico (PAVONI et al., 2007).
2.5
Uso de bibliotecas combinatoriais no câncer
A necessidade de desenvolver ferramentas inovadoras de diagnóstico e prognóstico que efetivamente exploram biomarcadores para os cânceres humanos tem sido considerada (CASIANO et al., 2006). Várias tecnologias vêm sendo utilizadas na identificação e detecção desses biomarcadores por meio de autoanticorpos como eletroforese em gel bi-dimensional (CANELLE et al., 2006), microarrays (PATWA et al., 2009), ressonância plasmônica de
superfície –SPR- (AVRAMIS et al., 2009), SEREX (WANG et al., 2009), biossensores (CONROY et al., 2009), e phage display (PASSARELLA et al., 2009).
Tradicionalmente, a maioria dos métodos de identificação de marcadores tumorais é baseada em anticorpos monoclonais contra proteínas das quais se tenha alguma suspeita e, dessa forma, buscam os mesmos marcadores para diversos tipos de câncer. A utilização de metodologias que fazem uma varredura das células tumorais, sem conhecimento prévio das proteínas nelas presentes, propicia a identificação de novos marcadores tumorais. A técnica de bibliotecas apresentadas na superfície de fagos permite a utilização não apenas de um anticorpo monoclonal, mas de uma vasta biblioteca de anticorpos ou peptídeos contra o conjunto das proteínas do tumor. Por esta vantagem, a técnica de phage display (PD) vem
sendo empregada visando a identificação de marcadores tumorais (AUSTIN, 1989).
Esta tese é fundamentada no uso da técnica de phage display, que consiste na expressão
e seleção por afinidade de proteínas ou peptídeos expressos em fusão com proteínas virais presentes em capsídeo de bacteriófagos. Os fagos recombinantes expressando peptídeos randômicos podem ser selecionados por afinidade e a seguir expandidos em ciclos adicionais de crescimento em bactérias E. coli hospedeiras apropriadas (SMITH, 1985). A técnica de PD
é baseada no uso de um fago filamentoso (M13), um bacteriófago que infecta E. coli. A
constituída por cinco proteínas: pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX conforme ilustrado na Figura 3 (HOUSHMAND, 1999).
Figura 3- Fago filamentoso. A) Composição do gene III, mostrando o sítio de ligação de clonagem para introdução do gene adicional; B) Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e PIX; C) Cristalografia dos domínio D1 e D2 da proteína III (97), as alfa-hélices estão coloridas em vermelho e as fitas em ciânico. (HOLLIGER et al., 1999).
A técnica utiliza o princípio de que polipeptídeos podem ser expressos na superfície desses bacteriófagos pela inserção de um segmento de DNA codificante no genoma dos mesmos, de modo que a proteína ou o peptídeo expresso fique exposto na superfície da partícula viral fusionado a uma proteína endógena, pIII ou pVIII (BARBAS et al., 2001), enquanto seu material genético permanece no interior do fago (BENHAR, 2001).
O fato do fago M13 ter a capacidade de infectar E. coli, pela ligação da pIII ao pilus F
da célula bacteriana (AZZAZY e HIGHSMITH, 2002), é utilizado para recuperar os fagos ligados ao alvo pela amplificação em E. coli (BARBAS et al., 2001). As novas partículas de
fago são montadas no espaço periplasmático da bactéria (BENHAR, 2001). O gene lacZ no
bacteriófago recombinante M13, facilita a distinção entre colônias bacterianas infectadas com
fagos que carregam sequências exógenas (colônias azuis) e colônias não infectadas por partículas virais ou mesmo infectadas com fagos selvagens (colônias brancas) (MESSING, 1983).
Um ciclo completo de biopanning está representado na Figura 4. O esquema mostra
selecionado pode ser sequenciado e revelar a sequência da proteína apresentada que possui afinidade com o antígeno. Neste processo a molécula alvo é imobilizada em um suporte
sólido, geralmente uma placa de microtitulação, mas também se utiliza microesferas magnéticas, resinas, membranas ou células. Uma população de fagos em solução é incubada com a molécula alvo. Os fagos contendo peptídeos com afinidades pelo alvo são capturados e permanecem ligados; os fagos não ligados (não específicos) são eliminados por sucessivas lavagens. O grupo de fagos ligados ao alvo é então eluído e amplificado (crescido em E. coli).
Os fagos resultantes deste processo são titulados e submetidos a um novo biopanning (ligação
ao alvo, eluição e amplificação) visando o enriquecimento das sequências específicas para o alvo. Após três ou quatro repetições deste processo, clones individuais são submetidos a ensaios imunológicos e suas sequências de DNA podem ser obtidas por sequenciamento (BARBAS et al., 2001).
O reconhecimento e remoção das células transformadas é uma incumbência permanente do processo de vigilância imunológica, sendo os anticorpos componentes fundamentais desta atividade antitumoral do sistema imune (VOLLMERS e BRÄNDLEIN, 2009).
Os anticorpos ou imunoglobulinas (Ig) são glicoproteínas de massa molecular elevada, em torno de 150 kDa, encontradas em abundância no soro de animais vertebrados. Essas moléculas são de natureza tetramérica, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, unidas por uma extensiva rede de interações não-covalentes, estabilizadas por pontes
Figura 4 - Ciclos de seleção de proteínas a partir de uma biblioteca de phage display. Bibliotecas de
13 dissulfeto. Tanto as cadeias leves quanto as pesadas, contêm uma série de domínios globulares repetitivos homólogos, cada uma com cerca de 110 resíduos de aminoácidos que se enovelam independentemente em um motivo globular classificado como Domínio Imune (PADLAN, 1994).
Cada cadeia leve contém um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL); as cadeias pesadas contêm um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). A molécula de anticorpo pode ser subdividida em porções Fc e Fab, onde Fc é constituída pelos domínios constantes (CH2-CH3) e Fab constituída pelos domínios VH-CH1 e VL-CL, responsáveis pela ligação aos antígenos e, portanto, denominado sítio combinatorial para o antígeno. Dentro de cada domínio VH e VL existem três regiões hipervariáveis, onde a variabilidade está concentrada e loops são formados. Em uma imunoglobulina, as três regiões
hipervariáveis da cadeia leve e as três regiões hipervariáveis da cadeia pesada e ocupam conjuntamente um espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação para o antígeno. Como estas sequências formam uma superfície complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, as regiões hipervariáveis são também chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) (FERREIRA e TEIXEIRA, 2005).
Os fragmentos de anticorpos scFv (single-chain variable fragment) representam o
menor domínio funcional VH-VL de um anticorpo necessário para uma ligação de alta afinidade a um antígeno. Os peptídeos conectores flexíveis que ligam as cadeias VH e VL são usualmente compostos por 10 a 25 aminoácidos, sendo o decapentapeptídeo (Gly4Ser)3 o mais comum deles (Figura 5) (WEISSER e HALL, 2009). As regiões variáveis podem ser conectadas no sentido VH-conector-VL ou VL-conector-VH e a orientação das cadeias no scFv pode afetar a eficiência da expressão, estabilidade e capacidade de ligação do mesmo ao
antígeno (DESPLANCQ et al., 1994).
Em phage display, pode ser utilizado diferentes alvos tais como proteína total, saliva,
soro, tecido e células. A linhagem celular HCC 1954 é uma linhagem agressiva, proveniente da glândula mamária de uma paciente indiana com 61 anos de idade diagnosticada com carcinoma ductal invasivo sem metástase nos linfonodos, estadiamento IIA, grau III. HCC1954 é positivo para o marcador específico de célula epitelial – Epithelial Glycoprotein 2
e para citoqueratina 19 e é negativo para a expressão do receptor de estrógeno (RE) e receptor de progesterona (RP); verifica-se também a super expressão de HER-2 (GAZDAR et al., 1998).
A linhagem celular HCC 1954 BL é uma linhagem celular originária da mesma paciente indiana, citada no parágrafo acima, proveniente de células B linfoblastóides derivadas do fibroblasto de um linfócito imaturo. Portanto, nesta linhagem celular encontram-se células mononucleares originárias do sangue periférico do mesmo paciente, não sendo células tumorais. Estas células mononucleares são transformadas e infectadas no vírus EpsteinBarr e
mantidas imortalizadas, mas que morrem após certo nível de passagens. Vale dizer que esta linhagem celular chegou ao Brasil na passagem 15. A linhagem celular HCC 1954 e HCC 1954 BL foram recentemente sequenciadas e comparadas (GALANTE et al., 2011).
2.6
Sensores eletroquímicos
Biossensores são dispositivos analíticos que integram a especificidade de um elemento biológico a um transdutor que converte um sinal biológico em um sinal mensurável. Os biossensores de afinidade utilizam anticorpos ou haptenos, receptores, fragmentos de DNA ou oligonucleotídeos como elementos de reconhecimento biológico (LUPPA et al., 2001; GOULART et al., 2010).
O elemento de biorreconhecimento de um biossensor interage com o analito alvo, assegurando a seletividade e especificidade do sensor (ARYA et al., 2008) sendo que a sensibilidade é altamente influenciada pelo transdutor. O transdutor quantifica um sinal resultante da interação do composto biológico com o analito alvo. A imobilização das biomoléculas no eletrodo é uma das etapas mais importantes na construção de um biossensor. A adsorção física é o método mais simples e rápido de imobilização, pois não exige qualquer modificação química e necessita apenas de uma solução contendo a biomolécula. Baseia-se na formação de ligações de hidrogênio, forças atrativas de Van der Waals e formação de
principais vantagens da adsorção são o baixo custo e a facilidade de imobilização (SHARMA et al., 2003; JIANG et al., 2008).
Uma alternativa para garantir a imobilização das biomoléculas sobre a superfície dos eletrodos condutores são os filmes poliméricos eletropolimerizados (POURNARAS et al., 2008). Os polímeros condutores são policonjugados com propriedades eletrônicas semelhantes às dos metais que mantém as propriedades de polímeros orgânicos convencionais e podem ser sintetizados quimicamente e eletroquimicamente (HEINZE, 1991). A polimerização eletroquímica é mais utilizada em aplicações biológicas uma vez que o processo é realizado à temperatura ambiente, os eletrodos apresentam uma maior área de superfície, a espessura do filme pode ser controlada na escala de nanômetro para micrômetro e as propriedades do mesmo podem ser moduladas pela variação de condições de polimerização eletroquímica (PENG et al., 2009).
Alguns estudos mostraram o desenvolvimento de outros filmes poliméricos derivados do 3-aminofenol, 4-aminofenol sobre a superfície do eletrodo de grafite utilizando as técnicas eletroquímicas de voltametria cíclica e impedância (BRITO-MADURRO et al., 2007; FRANCO et al., 2008). Além disso, um estudo recente apresentou o desenvolvimento de um novo filme polimérico derivado do ácido-3-hidroxifenilacético sobre a superfície do eletrodo de grafite por voltametria cíclica (OLIVEIRA et al., 2010).
Os imunossensores utilizam as propriedades de interação entre anticorpos e antígenos específicos, para obter um sinal correspondente a essa interação. A construção de um imunossensor consiste na modificação de um transdutor com um material biológico que servirá como sonda (anticorpos ou antígenos) para detecção da reação de ligação específica da sonda com o analito alvo (anticorpos ou antígenos). Esse processo consiste de uma transferência de sinal, para responder às mudanças eletroquímicas do receptor causadas pela ligação específica(RUAN et al., 2002).
Transdutores eletroquímicos são os métodos mais comuns utilizados nos biossensores. O princípio baseia-se nas propriedades elétricas dos eletrodos que são afetados pela interação anticorpo-antígeno. Esses transdutores podem determinar o nível do analito alvo medindo a variação de potencial, condutância, corrente ou impedância causada pela imunorreação, apresentando alta especificidade e baixos limites de detecção semelhante aos métodos de imunoensaios tradicionais (JIANG et al., 2008).
quantificação da interação entre Ac e Ag (BALKENHOHL e LISDAT, 2007; JIANG et al., 2008; RAMANAVICIUS et al., 2009), visto que detecções eletroquímicas diretas são complicadas uma vez que dificilmente ambos compostos biológicos apresentam eletroatividade.
O desenvolvimento de biossensores é uma alternativa para obtenção de diagnósticos clínicos e laboratoriais realizando análises ultra-sensíveis, precisas, rápidas e em tempo real. Além disso, esses dispositivos têm sido utilizados como ferramentas analíticas em várias outras áreas, tais como no monitoramento ambiental, indústria de alimentos, indústria farmacêutica e genética (SHARMA et al., 2003; NAYAK et al., 2009; THALER et al., 2009). Desta forma, os biossensores representam uma alternativa rápida e de baixo custo para substituir e minimizar o tempo gasto em diagnóstico e análise laboratorial, uma vez que podem detectar uma variedade de moléculas biológicas com alta especificidade e sensibilidade.
Frente a estes fatos, uma abordagem biotecnológica baseada em phage display, poderá
3
Objetivos
O principal objetivo desta tese foi selecionar e caracterizar peptídeos ligantes às células HCC 1954 e às imunoglobulinas G provenientes de tecidos de pacientes com câncer de mama.
Um objetivo secundário foi analisar a eficácia da própria técnica phage display na
obtenção de biomarcadores associados ao câncer de mama de tal forma a aprimorar a aplicação da mesma.
Os objetivos específicos do trabalho referentes à seleção e caracterização de peptídeos ligantes à linhagem celular são os seguintes:
• Seleção de peptídeos ligantes a extrato proteico total de linhagem celular HCC
1954;
• Caracterização da reatividade dos peptídeos ligantes expressos por fagos às
células;
• Identificação de possíveis ligantes alvos mimetizados por peptídeos selecionados
para identificar e compreender os processos aos quais os peptídeos estão relacionados;
• Verificar a antigenicidade do peptídeo sintético desenhado a partir de fago;
• Avaliação dos critérios de seleção de peptídeos na técnica phage display e da
abordagem de desenho dos biomarcadores.
Os objetivos referentes à seleção e caracterização de peptídeos ligantes às imunoglobulinas G provenientes de tecidos são os seguintes:
• Seleção de peptídeos ligantes a IgGs provenientes de tecido;
• Identificação de possíveis antígenos alvos mimetizados pelos peptídeos
selecionados para identificar e compreender os processos imunológicos aos quais os peptídeos estão relacionados;
• Verificação da possibilidade de os peptídeos miméticos ligantes de tecido serem
detectados na corrente sanguínea;
• Validação em larga escala de peptídeos selecionados como biomarcadores para
triagem;
• Seleção de anticorpos monoclonais scFv ligante aos peptídeos miméticos (contra
fago e peptídeo sintético) com a finalidade de caracterizar os antígenos verdadeiros;
4
MATERIAL E MÉTODOS
A fim de se obter biomarcadores específicos para o câncer de mama, a proposta foi utilizar duas diferentes estratégias. Uma visão geral das estratégias pode ser encontrada na Figura 6. Inicialmente na estratégia 1, utilizou-se como alvo células HCC 1954 e HCC 1954 BL, para se obter biomarcadores ligantes as mesmas. Na estratégia 2, utilizou-se como alvos imunoglobulinas G provenientes de amostras de tecido de pacientes com câncer de mama, doença benigna da mama e controles, respectivamente. Nesta estratégia buscou-se selecionar peptídeos recombinantes miméticos de IgGs. A Figura 6 apresenta um organograma com a descrição geral da metodologia utilizada. Nesta tese, serão analisadas questões referentes à técnica adotada a fim de se discutir e propor alternativas para otimização do processo de seleção dos alvos.
4.1
Estratégia 1: Obtenção de sequências ligantes em linhagem celular
HCC 1954
Nesta seção será descrita a metodologia adotada referente à estratégia 1, que consistiu na seleção de peptídeos ligantes a linhagem celular específica de câncer de mama. Serão descritos os protocolos e a metodologia adotada referente ao biopanning, às análises in silico,
à imunofluorescência realizada com o peptídeo sintético, à imunohistoquímica realizada com os fagos e os ensaios imunoenzimáricos realizados com os fagos e às análises in silico.
4.1.1 Biopanning de células HCC 1954
4.1.1.1 Seleção do alvo para a realização do biopanning com células
Bio p an nin g
Célu las H CC 1954
Se leçã o d o Alvo
T itula ção do s C lo ne s
Am p lifica ção do s fa gos
Ob ten ção e Se qu encia m ent o d o D NA O bjetivo : Ob te nçã o d e seq uên cias
lig an tes em linh age m celu la r
An álise de u m Pep tíd eo Im u n od o mi nan te
Sín tese q uím ica do pe ptíd eo im u nod om ina nt e Aná lise p or I mu no fluo re scên cia
Obje tivo: Re con he cime nt o d a ma rc ação do p ep tíde o em t ecido
A ná lise in silico
Ob je tivo: Id ent if icaçã o d e poss íveis a lvo s liga nte s p ar a ide ntifica r e co m pr een de r pr oce ssos re la cion ad os a pe ptí de os selecio nad os
Se le ção de P ro teí nas Alvo com B la stP
An álise d o Alinh am en to Trid im e nsion al de P ep tíde o Se le cion ado co nt ra Prot eín as Alvos
An álise da q u alid ad e da seleção n os
Ciclo s d e B iop an n ing
Obje tivo: Avalia r a q ualida de d a seleçã o nos d if er en tes ciclos de b iopa nn in g Scree ning E LIS A
Purificaç ão de F ag os
Aná lise p or Im u noh isto quí mica
Análi se d a Im u no rr eativida de
E LIS A
A nálise Esta tíst ic a
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