DANIELA DE CARVALHO MARTINS
AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUIMICA DA
PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR EM
NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS
CANINAS
Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira
Universidade Federal Fluminense
NITERÓI
DANIELA DE CARVALHO MARTINS
AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PROLIFERAÇÃO E
MORTE CELULAR EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS
MALIGNAS CANINAS
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Anatomia Patológica Humana e Veterinária.
Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira
NITERÓI
2008
DANIELA DE CARVALHO MARTINS
AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR EM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS
Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira
Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Anatomia Patológica Humana e Veterinária.
Aprovada em 30 de maio de 2008.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Profº Drº Geovanni Dantas Cassali
Departamento de Patologia Geral - UFMG
______________________________________________
Profª Drª Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira
Departamento de Patologia e Clínica Veterinária – UFF
____________________________________
Profª Drª Marcela Freire Vallim de Mello
Departamento de Patologia e Clínica Veterinária – UFF
__________________________________________
Profª Drª Terezinha de Jesus Sirotheau-Corrêa
Departamento de Morfologia - UFF
____________________________________________
Profª Drª Marilene de Farias Brito Queiroz
Departamento de Epidemiologia e Saúde Publica - UFRRJ
NITERÓI 2008
A toda minha família, em especial, meus pais, meu irmão, meu marido, minha avó (in memorian) e meus animais Bud, Bingo e em especial Teddy (in memorian). Com muito amor e carinho, pois é impossível ser feliz sozinho e sem o AMOR a vida seria insípida. Amo muito vocês!!
AGRADECIMENTOS
A Deus, nosso Pai supremo, fonte eterna de Amor, pelas bênçãos de sermos e existirmos, somente Ele tem o poder sobre os homens e será sempre conforme a Sua vontade.
A Ana Maria Reis Ferreira, minha amiga pessoal, profissional e orientadora. Por todos esses anos, desde a iniciação científica, pela paciência e profissionalismo, contribuindo enormemente para meu amadurecimento científico. O que sou profissionalmente, devo a você. Muito obrigada pelas inúmeras vezes em que mediante minhas dúvidas, dificuldades, medos e incertezas esteve ao meu lado e me amparado, por ter me mostrado que sempre há um caminho. Além dos ensinamentos, ofereceu-me apoio fraterno. Minha gratidão, admiração e respeito imensuráveis. Muito obrigada por tudo!
A Eliene Carvalho da Fonseca, amiga e chefe do Laboratório de Imuno-histoquímica do HUAP-UFF. Pela calorosa acolhida todos esses anos, desde a iniciação científica, por estar sempre de braços abertos, pela enorme competência, sempre oferecendo sugestões e contribuindo com sua experiência. Obrigada pela confiança em mim depositada, amizade e ensinamentos.
A Ana Beatriz Soares Monteiro, pela paciência, sempre com muita disposição e boa vontade na realização das análises estatísticas. Obrigada por tudo!
A Geovanni Dantas Cassali pela amizade, disponibilidade e colaboração de forma ética e responsável na leitura e revisão deste trabalho. Muito obrigada!
A Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira, pela amizade, carinho, compreensão, apoio, competência e colaboração na leitura e revisão deste trabalho. Muito obrigada! As “meninas”, técnicas do Laboratório de Imuno-histoquímica do HUAP-UFF, em especial Rita de Cássia Costa Cunha e Kátia Valéria Ferreira Costa, minhas amigas, pelo apoio, amizade de longa data, companheirismo, ajuda sempre presente,
compartilhando valiosas sugestões para a melhoria de nossas reações imuno-histoquímicas. Obrigada por tudo!
A Antonio Carlos dos Santos, pela simpatia, dedicação e paciência na realização dos cortes histológicos.
Ao curso de Pós-graduação em Patologia da UFF, em especial a Profª Drª Eliane Pedra Dias, coordenadora e Thereza Cristina Fontana de Paiva (Tê), secretária, pelo apoio, ajuda, companheirismo, colaboração e competência.
A minha família, em especial minha mãe, Marilza de Carvalho Martins, meu pai, Wilson Martins e meu irmão Walace de Carvalho Martins, extensivo também a Mainha, Dindão, Suzy e Alex, aos quais devo tudo que sou e todas as minhas conquistas, por toda compreensão, por minhas ausências e “abandono”. Sem vocês nada disso seria possível. A vocês meu amor, meu amor, meu amor!!!
A minha avó, Azumitha de Carvalho Grado (in memorian), que nos deixou há tão pouco tempo, o meu amor, meu carinho e saudades eternas.
Ao meu amigo e marido, André Luis Tenório e Silva, pelo carinho, amor, pela paciência, e por toda sua compreensão nas horas em que estive ausente.
A Elan Cardozo Paes-de-Almeida, minha amiga, exemplo profissional, que nunca mediu esforços para ajudar, pelo carinho, cumplicidade, incentivo constante, sempre com muita disposição e boa vontade. Obrigada por tudo!
A Anna Carolina Donato, Juliana Leite, Marcela Freire, minhas amigas, pelo estímulo, pela ajuda sempre constante, convívio extremamente agradável, pelo apoio e palavras encorajadoras.
A Universidade Unigranrio, em especial ao Profº Drº Carlos Henrique de Freitas Burity, diretor do Instituto de Biociências, pelo apoio, compreensão, competência, respeito, seriedade, paciência e plena disponibilidade. Muito obrigada!
Aos amigos e companheiros da Unigranrio, em especial, Viviane Moreira de Lima, Ricardo Luis de Azevedo Pereira e João Cossatis, pela amizade, por terem me ouvido quando precisei, pelo apoio sempre constante e incentivo. Obrigada pro tudo! Aos meus animais, Bud, Bingo e em especial Teddy (in memorian), pela amizade sincera e desinteressada, pelo companheirismo, lealdade, fidelidade e amor incondicional. Muitas, muitas saudades!
Aos animais, únicos responsáveis pela minha escolha profissional.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram na elaboração deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REVISÃO DE LITERATURA 20
2.1 NEOPLASIA MAMÁRIA 20
2.2 PROLIFERAÇÃO CELULAR 26
2.2.1 MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR 30
2.2.1.1 Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA) 30 2.2.1.2 Marcador de Proliferação Celular – KI-67 34
2.3 MORTE CELULAR POR APOPTOSE 38
2.3.1 MARCADOR DE APOPTOSE – CASPASE-3 45
3 HIPÓTESES 48 4 OBJETIVOS 49 4.1 OBJETIVO GERAL 49 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 49 5 MATERIAIS E MÉTODOS 50 5.1 MATERIAL 50 5.2 PROCEDIMENTOS 51 5.2.1 IMUNO-HISTOQUÍMICA 51 5.3 ANÁLISE DO MATERIAL 54
5.3.1 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA 54
5.3.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA 55
6 RESULTADOS 56
6.1 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA 57
6.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA 63
6.2.1 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI-PCNA (ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR)
63
6.2.2 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI-KI-67 68 6.2.3 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO COM O ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
73
6.2.4 CORRELAÇÃO DAS IMUNOMARCAÇÕES COM OS ANTICORPOS ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
78 7 DISCUSSÃO 98 8 CONCLUSÕES 110 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 111 10 PRODUÇÃO CIENTÍFICA 126 11 ANEXOS 128 11.1 ANEXO 1 128
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: CARCINOSSARCOMA MAMÁRIO CANINO – COLORAÇÃO HE p.84
Figura 2: TUMOR MISTO MALIGNO MAMÁRIO CANINO – COLORAÇÃO
HE
p.85
Figura 3: ADENOCARCINOMA TUBULAR COMPLEXO MAMÁRIO CANINO
– COLORAÇÃO HE
p.86
Figura 4: ADENOCARCINOMA TUBULAR SIMPLES MAMÁRIO CANINO –
COLORAÇÃO HE
p.87
Figura 5: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO COMPLEXO MAMÁRIO
CANINO – COLORAÇÃO HE
p.88
Figura 6: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO SIMPLES MAMÁRIO CANINO
– COLORAÇÃO HE
p.89
Figura 7: CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES MAMÁRIO CANINO –
COLORAÇÃO HE
p.90
Figura 8: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO SIMPLES MAMÁRIO CANINO
– ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
p.91
Figura 9: ADENOCARCINOMA TUBULAR COMPLEXO MAMÁRIO CANINO
– ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
p.92
Figura 10: ADENOCARCINOMA PAPILÍFERO COMPLEXO MAMÁRIO
CANINO – ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
p.93
Figura 11: CARCINOMA SÓLIDO SIMPLES MAMÁRIO CANINO – ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
p.94
Figura 12: CARCINOSSARCOMA MAMÁRIO CANINO, ÁREA EPITELIAL – ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
Figura 13: TUMOR MISTO MALIGNO MAMÁRIO CANINO, ÁREA EPITELIAL – ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
p.96
Figura 14: CARCINOSSARCOMA MAMÁRIO CANINO, ÁREA
MESENQUIMAL – ANTI-PCNA, ANTI-KI-67 E ANTI-CASPASE-3 CLIVADA
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: FAIXA ETÁRIA DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS
MALIGNAS ESTUDADAS
p.56
Tabela 2: FREQÜÊNCIA DAS RAÇAS DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS
MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS
p.57
Tabela 3: FREQÜÊNCIA DOS DIAGNÓSTICOS HISTOPATOLÓGICOS DOS
ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS
p.58
Tabela 4: FREQÜÊNCIA DOS DIAGNÓSTICOS HISTOPATOLÓGICOS E A
FAIXA ETÁRIA DOS ANIMAIS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS ESTUDADAS
p.58
Tabela 5: FREQÜÊNCIA DAS MARGENS DE SEGURANÇA NAS
AMOSTRAS DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS
p.62
Tabela 6: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS
DAS CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-PCNA, DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO
p.65
Tabela 7: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE
NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-PCNA, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA
p.67
Tabela 8: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE NÚCLEOS
DAS CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-Ki-67, POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO
p.70
Tabela 9: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE
NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-KI-67, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA
Tabela 10: VALORES DA MÉDIA E MEDIANA DO NÚMERO DE CÉLULAS EPITELIAIS DOS DUCTOS, IMUNOPOSITIVAMENTE MARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA, POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO
p.75
Tabela 11: VALORES DA MÉDIA E DA MEDIANA DO NÚMERO DE CÉLULAS EPITELIAIS IMUNOMARCADOS PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA, DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS, DAS CÉLULAS EPITELIAIS,
MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI-PCNA POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO
p.66
Gráfico 2: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS
MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-PCNA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA
p.68
Gráfico 3: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS
MARCADOS IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI-KI-67 POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO
p.71
Gráfico 4: BOXPLOT DA MÉDIA DE NÚCLEOS DAS CÉLULAS EPITELIAIS
MARCADOS COM O ANTICORPO ANTI-KI-67 DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA
p.73
Gráfico 5: BOXPLOT DA MÉDIA DE CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS
IMUNOPOSITIVAMENTE PELO ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA POR CAMPO DOS CASOS ESTUDADOS DENTRO DE CADA TIPO NEOPLÁSICO
p.76
Gráfico 6: BOXPLOT DA MÉDIA DE CÉLULAS EPITELIAIS MARCADOS
COM O ANTICORPO ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS DE ACORDO COM AS MARGENS DE SEGURANÇA
p.78
Gráfico 7: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO
ANTICORPO ANTI-KI-67 X ANTI-PCNA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS
p.79
Gráfico 8: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO
ANTICORPO ANTI-PCNA X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS
p.80
Gráfico 9: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO
ANTICORPO ANTI-KI-67 X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA DAS CÉLULAS EPITELIAIS DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS MALIGNAS CANINAS
Gráfico 10: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-Ki-67 X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA NAS ÁREAS EPITELIAIS DOS ADENOCARCINOMAS TUBULARES SIMPLES
p.82
Gráfico 11: DIAGRAMA DE DISPERSÃO DA IMUNOMARCAÇÃO DO ANTICORPO ANTI-PCNA X ANTI-CASPASE-3 CLIVADA NAS ÁREAS EPITELIAIS DOS ADENOCARCINOMAS TUBULARES SIMPLES
LISTA DE ABREVIATURAS
APAF-1 Fator ativador de protease da apoptose-1
BSA Soro albumina bovina
°C Grau Celsius
CDK Quinase ciclina-dependente
cm Centímetros
DAB Diaminobenzidina
DP Desvio Padrão
Fase G0 Fase de repouso
Fase G1 Fase de pré-síntese
Fase G2 Fase de crescimento pré-mitótico
Fase M Mitose
Fase S Fase de síntese
Fig Figura Graf Gráfico HE Hematoxilina-eosina hs horas IHQ Imuno-Histoquímica kD Kilodaltons µµµµm micrômetros
OMS Organização mundial de saúde PC Papilífero complexo
PCNA Antígeno nuclear de proliferação celular
PEST Prolina-ácido glutâmico-serina-treonina
PS Papilífero simples
PST Tempo de sobrevivência pós-cirúrgica
SRD Sem Raça Definida
Tab Tabela
TNF-αααα Fator de necrose tumoral α
TNFR Receptor do fator de necrose tumoral
TC Tubular complexo
RESUMO
A neoplasia mamária na espécie canina é a mais comum na cadela e vem sendo muito pesquisada ultimamente, por servir como importante modelo para a carcinogênese mamária nas mulheres. A classificação é a característica essencial para uma avaliação diagnóstica, prognóstica e conseqüentemente no direcionamento de uma conduta clínico-cirúrgica adequada e como às vezes se torna difícil, outras técnicas como um auxílio são utilizadas. A utilização de marcadores de proliferação celular é um método objetivo e quantificável mais sensível e específico para avaliar a atividade mitótica em neoplasias, do que a contagem do número de mitoses na histologia convencional e a identificação da apoptose, é importante pois durante o crescimento tumoral existe um equilíbrio entre a proliferação e morte celular, no qual o processo de morte celular programada está envolvido. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade proliferativa e apoptótica em neoplasias mamárias malignas caninas associando-se os resultados. Neste trabalho foram utilizados 61 casos de neoplasias malignas mamárias de cadelas. As neoplasias foram classificadas de acordo com a Organização Mundial de Saúde e a técnica utilizada foi a imuno-histoquímica, através do método LSAB, sendo utilizados como anticorpos primários o anti-PCNA, anti-Ki-67, e anti-Caspase-3 clivada. Das 61 amostras através de histopatologia, foram observados cinco carcinossarcomas, nove carcinomas em tumores mistos, seis adenocarcinomas tubulares complexos, doze adenocarcinomas tubulares simples, treze adenocarcinomas papilíferos complexos, quinze adenocarcinomas papilíferos simples e um carcinoma sólido simples. Não houve pré-disposição racial e a maioria dos animais acometidos tinham entre cinco e dez anos de idade. Nas neoplasias mamárias malignas a expressão do PCNA e Ki-67 foi maior que a expressão da Caspase-3 clivada e existiu uma correlação positiva significativa entre as expressões de PCNA e Ki-67. Com relação aos adenocarcinomas tubulares simples o Ki-67 mostrou uma correlação negativa significativa com a Caspase-3 clivada e o PCNA evidenciou uma tendência de correlação negativa com a Caspase-3 clivada. O estudo da proliferação e morte celulares surge de forma a acrescentar mais informações sobre o comportamento neoplásico. A associação destes marcadores prognósticos à outros fatores comumente utilizados na rotina, podem complementar a classificação já existente das neoplasias e auxiliar de maneira bem expressiva na elaboração de um diagnóstico e prognóstico mais precisos das neoplasias mamárias e conseqüentemente contribuir para uma melhor sobrevida do paciente devido a possibilidade de um tratamento clínico mais adequado e individualizado, podendo desta forma também ser utilizado como modelo experimental nos estudos comparado a neoplasia mamária humana.
ABSTRACT
Canine mammary neoplasia is the most common found in the bitch. Researches are being carried out at present as they can be used as an important model for mammary carcinogenesis in women. Classification is the essential characteristic for prognosis and diagnostic evaluation, so that an adequate clinical-surgical conduct may be carried out, but, as this approach sometimes presents difficulties, other techniques are then used. The use of cell proliferation markers is an objective and quantifiable method, more sensitive and specific to assess the mitotic activity in neoplasia, rather than the mitosis count, as it is done in conventional histology, to identify apoptosis. Therefore, a balance between proliferation and cell death during tumor growth is an important factor, where the process of programmed cell-death is involved. The purpose of this work is to assess the proliferative and apoptic activity in canine malignant mammary neoplasia, associating the results. Sixty-one cases of bitches with malignant mammary neoplasia were used in this work. Neoplasias were classified according to the World Health Organization classification; the immunohistochemical technique was applied by means of the LSAB method; anti-PCNA, anti-Ki-67 were used as primary antibodies, as well as cleaved anti-Caspase-3. Considering 61 samples, by means of the histopathology procedure, five carcinosarcomas, nine carcinomas in mixed tumors, six complex tubular adenocarcinomas, 12 primary tubular adenocarcinomas, 13 complex papilliferous adenocarcinomas, 15 primary papilliferous adenocarcinomas and a primary solid carcinoma were observed. No breed predisposition was found and most of the animals with the disease were between 5 and 10 years old. In the malignant mammary neoplasia, the expression of PCNA and Ki-67 showed to be greater in number than the expression of cleaved Caspase-3 and a positive correlation among the expressions of PCNA and Ki-67 was observed. Regarding primary tubular adenocarcinomas, Ki-67 presented a significant negative correlation with the cleaved Caspase-3 and PCNA showed a negative correlation tendency, which was also significant with the cleaved Caspase-3. The proliferation and cell death study arises to add more information on neoplasic behavior. The association of these prognostic markers to other factors commonly used in routine procedures can complement the already existing classification of neoplasia, providing expressive support in the elaboration of a more precise diagnostic and prognosis of mammary neoplasia, thus contributing to the patient’s extra life, facilitating a more adequate and individualized clinical treatment. This may also be used as an experimental model in the studies that compare the human mammary neoplasia.
1 INTRODUÇÃO
O câncer na espécie humana e em animais domésticos é uma das patologias que mais levam ao óbito, sendo o de mama um dos mais importantes. A importância dos tumores de mama em cadelas tem aumentado, devido à freqüência com que casos desse tipo surgem na clínica dos animais de companhia, e devido às semelhanças que tem com os tumores de mama em humanos, oferecendo deste modo um relevante modelo para o câncer de mama em mulheres (RUTTEMAN ET AL, 1988, NERURKAR ET AL, 1989, JUBB ET AL, 1993 e FONSECA & DALECK, 2000). Devido a isso, pode-se entender por que o câncer de mama tem recebido uma grande publicidade e se tornado o centro de muitos estudos acerca de sua origem, métodos de diagnósticos e tratamento (ZUCCARI ET AL, 2001, FERRI, 2003, KARAYANNOPOULOU, ET AL, 2005, LESTER, 2006 e KING, 2007).
A classificação das neoplasias mamárias em cães tem sido uma controvérsia por causa de sua vasta complexidade, além disso, nenhuma das classificações propostas para as neoplasias mamárias caninas é universalmente aceita por todos
os patologistas veterinários, com isso numerosos esquemas de classificação têm sido realizados, mas cada um possui uma certa limitação (JONES ET AL, 2000).
A classificação é a característica essencial para a avaliação prognóstica, tendo uma grande importância para determinar métodos de tratamento e como às vezes se torna difícil, outras técnicas como um auxílio são utilizadas (KURZMAN & GILBERTSON, 1986, HELLMÉN ET AL, 1993, YAMAGAMI ET AL, 1996, CASSALI ET AL, 2000 e PIRES ET AL, 2004). Atualmente, novos fatores prognósticos em tumores mamários caninos estão sendo estudados (PÉREZ ALENZA ET AL, 1997, GERALDES ET AL, 2000, CASSALI, 2000, KARAYANNOPOULOU, ET AL, 2005, TERZIAN ET AL, 2007).
Técnicas especializadas como a imuno-histoquímica, para identificação e avaliação de marcadores prognósticos, podem servir como base para o diagnóstico e prognóstico na ausência de uma característica morfológica apropriada (KURZMAN & GILBERTSON, 1986, MALUF & KOERNER, 1994, CASSALI ET AL, 2000, PIRES ET AL, 2004, BRASILEIRO FILHO ET AL, 2006, TERZIAN ET AL, 2007 e KING, 2007).
A utilização de marcadores como o Ki-67 e PCNA é um método objetivo e quantificável mais sensível e específico para avaliar a proliferação celular em neoplasias, do que a contagem do número de mitoses na histologia convencional (ESPOSITO ET AL, 2000 e RIBEIRO JUNIOR ET AL, 2000) e a identificação da apoptose, através da caspase-3 clivada se faz importante pois durante o crescimento tumoral existe um equilíbrio entre a proliferação e morte celular, no qual
o processo de morte celular programada está envolvido. Este balanço entre proliferação, diferenciação e morte celulares determina o número de células numa população, bem como o seu tamanho ou mais precisamente o estágio de um tumor (SHEN ET AL, 1998, SIMÃO ET AL, 1999, GONZÁLEZ-CÁMPORA ET AL, 2000 e LIU ET AL, 2001). A mensuração da proliferação celular e da apoptose podem melhorar a confiabilidade do prognóstico do comportamento tumoral, auxiliando na caracterização biológica do tumor (DE JONG ET AL, 2000).
Isso justifica o grande interesse, atualmente, na identificação de marcadores com valor prognóstico e em parâmetros biológicos não subjetivos de mensuração como a proliferação celular e apoptose, para proporcionar uma informação diagnóstica e prognóstica mais precisa. Desta maneira, este trabalho, através da associação entre técnicas de imuno-histoquímica para a avaliação da atividade de proliferação celular e apoptótica, poderá contribuir para futuros estudos relacionados à conduta clínico-cirúrgica, o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas, imunoprofilaxia do câncer e proporcionar uma análise comparativa com o câncer de mama na mulher.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 NEOPLASIA MAMÁRIA
O câncer é uma das maiores causas de mortalidade entre os seres humanos e os animais domésticos. As neoplasias das glândulas mamárias ocorrem freqüentemente em cães, gatos, ratos e camundongos. Em outras espécies de animais domésticos e de laboratório, essas neoplasias não são freqüentes. As neoplasias mamárias em cadelas são as neoplasias mais comumente encontradas. (BRODEY ET AL, 1983, BIRCHARD & SHERDING, 1994, ROSTAMI ET AL, 1994, WITHROW & MACEWEN, 1996, COELHO, 2002, CASSALI, 2003 e KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005), no entanto, alguns pesquisadores apontam que essas neoplasias constituem a segunda forma mais comum em cães, sendo somente ultrapassado pelos tumores de pele, os tumores mamários representam de 25 a 50% de todas as neoplasias das cadelas (JONES ET AL, 2000, FONSECA & DALECK, 2000, SOUZA ET AL, 2001 e CUSTÓDIO, 2003).
As neoplasias mamárias são raras nos animais jovens (MIALOT, 1988). O risco para o desenvolvimento da neoplasia mamária em cadelas aumenta significativamente com a idade (JONES ET AL, 2000). A população de risco, no que se refere aos tumores mamários, é constituída por cadelas entre os cinco e doze anos de idade, sendo a idade de maior susceptibilidade entre os nove e os onze anos, não existindo predisposição racial (ETTINGER, 1992, BOLDIZSÁR ET AL, 1992, OLIVEIRA ET AL, 2003, CASSALI, 2003, ROSCIANI ET AL, 2003, MARIANO ET AL, 2006 e TROMPOWSKY, 2007).
A ovariohisterectomia nas cadelas jovens exerce um nítido efeito profilático (MIALOT, 1988 e SOARES E SILVA, 1998). Quando realizada antes do 1º cio reduz a incidência de neoplasia de mama para 0,5%; após o 1º cio diminui para 8% e após o 2º cio, para 26% (DALECK, 1996). Cadelas submetidas à ovariohisterectomia após os dois anos e meio de idade, ou concomitantemente à mastectomia, não são beneficiadas pelos efeitos profiláticos desse procedimento, nem tem efeito sobre o prognóstico, porque nessa idade, as glândulas mamárias já se desenvolveram plenamente (MOULTON, 1990, YAMAGAMI ET AL, 1996, MORRIS ET AL, 1998 e FONSECA & DALECK, 2000). O desenvolvimento de neoplasias malignas antes dos cinco anos de idade é raro, normalmente são neoplasias de caráter benigno (PEREZ ALENZA, 2000).
As neoplasias de mama possuem uma incidência três vezes mais alta nas cadelas do que na mulher e de forma semelhante à espécie humana, ocorre quase que exclusivamente em fêmeas (QUEIROGA E LOPES, 2002, CASSALI, 2003,
LESTER, 2006, CAVALCANTI & CASSALI, 2006, SILVA ET AL, 2007 e MONTAG & KUMAR, 2008).
As neoplasias mamárias em cadelas possuem uma estreita semelhança com a neoplasia humana (NERURKAR ET AL, 1989). Por isso, oferecem um importante modelo experimental para o estudo do câncer de mama em mulheres (RUTTEMAN ET AL, 1988, JUBB ET AL, 1993, PELETEIRO, 1994 e MOTTOLESE ET AL, 1994). Devido a isso, pode-se entender por que o câncer de mama tem recebido uma notória atenção e se tornado o centro de muitos estudos acerca de sua origem, métodos de diagnósticos e tratamento (ZUCCARI ET AL, 2001, FERRI, 2003, KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005, LESTER, 2006 e KING, 2007).
Nos caninos, os mais comuns são os tumores mistos (NELSON ET AL, 1972 e BRODEY ET AL, 1983). De acordo com MIALOT (1988), HELLMÉN e colaboradores (1993), DALECK e colaboradores (1998), OLIVEIRA e colaboradores (2003), CASSALI (2003) e MARIANO e colaboradores (2006), dentre os tumores malignos, os adenocarcinomas são os mais freqüentes. Os sarcomas de glândula mamária em cadelas são raros, inferior a 10% (ETTINGER, 1992).
Num estudo realizado por NERURKAR e colaboradores (1989), de 52 neoplasias mamárias caninas, 14 eram benignas e 38 malignas, sendo que destas apenas 3 foram classificadas como carcinossarcoma e 30 eram adenocarcinomas complexo. Resultados semelhantes também foram encontrados por HELLMÉN e colaboradores (1993), ZANINOVIC & SIMCIC (1994) e DALECK e colaboradores
(1998). Já num levantamento de 342 tumores mamários, 178 (52,05%) foram benignos e 164 (47,95%) foram malignos (CASSALI, 2000).
Na maioria dos casos, o tratamento da neoplasia primária é conseguido com êxito, mas complicações freqüentemente ocorrem e é devido ao alto poder invasivo e metastático de certos tipos de câncer. O comportamento clínico varia de nódulos bem circunscritos com um crescimento estacionário a amplo e algumas vezes nódulos ulcerados, os quais crescem rapidamente e se tornam bem aderidos aos tecidos adjacentes. A presença de ulceração na pele tem sido associada com malignidade e é considerada um fator independente fortemente ligado a um prognóstico desfavorável (PEREZ ALENZA, 2000).
A etiologia exata das neoplasias mamárias é desconhecida (OGILVIE, 1983 e HAHN & ADAMS, 1997). Em mulheres é aceitável a relação da doença com fatores próprios do hospedeiro, como a duração da atividade ovariana; a hereditariedade e com fatores ambientais, tais como a alimentação e a utilização de determinados medicamentos, não sendo estabelecida também nenhuma ligação direta entre vírus e o câncer de mama (LOPES ET AL, 1996, ROSEN, 1997 e CASSALI, 2003).
Clinicamente é impossível a distinção de certas displasias e uma neoplasia mamária, esta sendo encontrada em cerca de 10% dos casos. Por outro lado, é muito freqüente no exame histológico se evidenciar as displasias associadas a uma neoplasia (MIALOT, 1988). Da mesma forma, uma neoplasia mamária maligna pode muitas vezes apresentar um quadro clínico de uma neoplasia mamária benigna e a aparência clínica de um tumor mamário é extremamente diversa, não podendo
assim ser considerado como única ferramenta para elaboração de um prognóstico (MENDES ET AL, 2005).
Vários sistemas de classificação existem para neoplasias mamárias (MOULTON ET AL, 1970; MISDORP ET AL, 1971; MISDORP ET AL, 1972; MISDORP ET AL, 1973; FOWLER ET AL, 1974, MONLUX ET AL, 1977 e MOULTON, 1990), entretanto um dos mais adotados é o de MISDORP e colaboradores (1999), mas a classificação destas neoplasias em cães tem sido uma controvérsia por causa de sua vasta complexidade, pois nenhuma das classificações propostas para as neoplasias mamárias caninas é universalmente aceita por todos os patologistas veterinários, com isso há ausência de critérios uniformes para diferenciar os tipos neoplásicos. Numerosos esquemas de classificação têm sido realizados, mas cada um possui certa limitação (KURZMAN & GILBERTSON, 1986, JONES ET AL, 2000, CASSALI, 2003 e KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005).
Segundo GILBERTSON e colaboradores (1983), é difícil e muitas vezes impossível se comparar resultados de estudos realizados por pesquisadores de diferentes instituições e chegar a conclusões válidas sobre as características biológicas de diferentes tipos de neoplasias mamárias.
A avaliação histopatológica é realizada de uma forma subjetiva e nem sempre apresenta um resultado satisfatório em relação às neoplasias mamárias (PREZIOSI ET AL, 1995). Isso vem a justificar o grande interesse de investigação, através da imuno-histoquímica, de marcadores com valor prognóstico (SIRVENT ET AL, 1995, BODIS ET AL, 1996, SHEN ET AL, 1998, POPOVSKA ET AL, 1999, CASSALI,
2000, MACIOROWSKI ET AL, 2001, LIU ET AL, 2001, RUBIO, 2002, ZHAN ET AL, 2002, PIRES ET AL, 2004 e KING, 2007).
O diagnóstico tardio tem sido associado a uma diminuição no tempo de sobrevivência livre da doença e no tempo de sobrevivência total do animal após a excisão cirúrgica, este é um fator independente e fortemente relacionado a um diagnóstico desfavorável para cães com neoplasias mamárias (PEREZ ALENZA, 2000).
Determinar o prognóstico para o paciente canino com neoplasia mamária é difícil, pois o comportamento biológico dessas neoplasias varia muito. A considerável heterogeneidade das características histológicas e o comportamento desses tumores têm levado a conturbadas conclusões em relação ao critério prognóstico e administração terapêutica (GILBERTSON ET AL, 1983, KURZMAN & GILBERTSON, 1986 e KARAYANNOPOULOU ET AL, 2005).
O prognóstico para o tratamento depende de vários fatores, como o tipo histológico neoplásico, tamanho do tumor, grau de invasividade, grau de diferenciação nuclear, estado dos linfonodos, o tempo de demora em se fazer o diagnóstico, presença ou não de ulceração e estado dos receptores hormonais. A ovariectomia ou ovariohisterectomia realizada juntamente com a mastectomia não apresenta efeito sobre o prognóstico, em cães com neoplasias de glândulas mamárias já estabelecidas, assim como a localização da neoplasia e o número de nódulos presentes (YAMAGAMI ET AL, 1996 e WITHROW & MACEWEN, 1996).
No câncer de mama hoje em dia, não são somente estudados índices patológicos convencionais tal como, tamanho do tumor, grau histológico e estado de linfonodos, mas em especial técnicas de imuno-histoquímica, para a detecção de receptores hormonais, fração de proliferação celular, morte celular e amplificação de certos oncogenes. Esses dados são de suma importância na tentativa de prever o comportamento biológico dos tumores e por permitir a seleção de uma melhor conduta terapêutica pelo clínico (SIRVENT ET AL, 1995, CASSALI ET AL, 2000 e SILVA ET AL, 2002). Da mesma forma, o estudo da expressão de marcadores biomoleculares em tumores malignos de glândulas mamárias auxilia na detecção de pacientes com alto risco de novas recidivas (SILVA ET AL, 2002 e KUSHLINSKII ET AL, 2004).
2.2 PROLIFERAÇÃO CELULAR
Os processos-chave na proliferação das células são a replicação do DNA e a mitose. A seqüência de eventos que controla estes dois processos é conhecida como ciclo celular (KUMAR ET AL, 2008).
Durante o ciclo celular, as células têm três caminhos possíveis a percorrer: permanecer no ciclo e, portanto seguir para uma próxima divisão; permanecer viva sem divisões adicionais, ou seja, seguindo para fase G0; ou morrer por apoptose. As decisões sobre qual caminho a ser seguido acontecem em dois pontos cardinais, chamados “checkpoints”, o ponto onde há comprometimento com a replicação do DNA, chamado ponto de restrição, e aquele onde há comprometimento com a
divisão mitótica no final de G2 (ALVES ET AL, 1999). Estes pontos de controle permitem que quaisquer defeitos sejam editados e reparados, assegurando, assim, que as células-filhas recebam o complemento total da informação genética, idêntico ao da célula parental (CAUDELL, 2004 e RIBEIRO-SILVA ET AL, 2006).
As células na fase G1 (pré-síntese), estão se preparando para replicação do DNA e sofrem muitas alterações na expressão de genes, incluindo a síntese de proteínas ciclinas que são essenciais para iniciar a replicação normal do DNA. Múltiplas moléculas sensoras/efetoras também estão ativas durante essa fase do ciclo celular e podem detectar e reparar danos do DNA. A detecção de dano ao DNA desencadeia várias proteínas sensoras nucleares que sinalizam para bloquear a iniciação da síntese de DNA (fase S) ou iniciar apoptose para remover a célula danificada do reservatório em proliferação, este ponto de checagem é o chamado ponto de restrição, e como exemplo pode-se citar a proteína p53. Ao parar o ciclo celular em G1 a proteína p53 permite que os mecanismos de reparação atuem sobre os erros espontâneos ou induzidos no DNA. Se estes mecanismos falharem a p53 pode acionar eventos apoptóticos levando à destruição da célula danificada, através da estimulação de membros da família Bcl-2, encontrados na mitocôndria (CARROLL, 2004, RIBEIRO-SILVA ET AL, 2006, RUBIN ET AL, 2006 e KING, 2007).
Se a fase G1 progredir sem detecção de mutações, dá-se início a replicação do DNA. Uma vez iniciada a fase S, as ciclinas formam complexos com enzimas chamadas de quinases ciclina-dependentes (CDKs) e estas trabalham pela promoção da replicação do DNA e vários aspectos do processo mitótico e são
necessárias para a progressão do ciclo celular. A fase G2 (crescimento pré-mitótico), é uma fase de repouso na qual as células se preparam para divisão e separação cromossômica. Inibidores específicos da progressão do ciclo celular em G2/M (mitose) também podem ser desencadeados por vários estímulos internos e externos. Os bloqueios na progressão do ciclo celular em G1 e G2 freqüentemente provocam apoptose como uma via de correção (CARROLL, 2004, RIBEIRO-SILVA ET AL, 2006, RUBIN ET AL, 2006, KING, 2007 e KUMAR ET AL, 2008).
Uma característica crítica da maioria das neoplasias, principalmente, as malignas é a proliferação celular anormal, freqüentemente as células neoplásicas exibem uma perda do controle do ponto de restrição, ou seja, a gênese neoplásica é um processo complexo fundamentalmente relacionado a distúrbios no controle da proliferação celular, no qual uma célula normal sofre alteração na expressão gênica, o que lhe confere vantagens de crescimento sobre as demais células, sendo esta alteração herdada pelas células filhas (CUSTÓDIO, 2003, URRUTICOECHEA ET AL, 2005, RUBIN ET AL, 2006 e KING, 2007).
Quanto maior a atividade proliferativa de uma neoplasia, pior será seu comportamento biológico. Como conseqüência, muitos esforços têm sido feitos no desenvolvimento de métodos objetivos para avaliar a proliferação celular e estudar o significado desses métodos no estudo das neoplasias, sendo úteis como um auxílio à terapêutica e ao prognóstico de pacientes de maneira individual (BRUNO & DARZYNKIEWICZ, 1992). De acordo com SCHMITT & GOBBI (2006) e RODASKI & DE NARDI (2006), o índice proliferativo tem uma boa correlação com a sobrevida e período livre de doença, além de ser um bom indicador de resposta à quimioterapia.
Na verdade, estudar a dinâmica celular é vital para a compreensão de uma grande variedade de processos fisiológicos e patológicos. Os métodos imuno-histoquímicos, já se encontram entre os mais úteis e mais comumente utilizados para avaliação da proliferação celular, podendo servir como base para o diagnóstico e prognóstico na ausência de uma característica morfológica apropriada (KURZMAN & GILBERTSON, 1986; BAUER, 1990 e MALUF & KOERNER, 1994, KUSHLINSKII ET AL, 2004 e TERZIAN ET AL, 2007).
Os métodos imuno-histoquímicos que utilizam marcadores de proliferação celular baseiam-se na detecção de antígenos cuja expressão tenha relação qualitativa ou quantitativa com uma ou mais fases do ciclo celular. HOLFSTÄDTER e colaboradores (1995) propõem o agrupamento destes antígenos em duas categorias: enzimas e cofatores que estão envolvidos na síntese de DNA durante a fase S do ciclo celular, onde se enquadra o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA – Proliferation Cell Nuclear Antigen), mas também outros como a DNA polimerase alfa e a topoisomerase II alfa, e outras proteínas como Ki-67 (ALVES ET AL, 1999, KUSHLINSKII ET AL, 2004).
A proliferação celular tem sido por muitos anos, mensurada através da contagem de figuras mitóticas, pela coloração de rotina – hematoxilina e eosina, em cortes de tecidos. No entanto, isso proporciona menos informação do que os métodos mais recentes, devido ao período medido (fase M), ser considerado a menor porção do ciclo celular (PREZIOSI ET AL, 1995). Na maioria dos tecidos existem células que são encontradas no ciclo celular e fora dele, e a fração de
crescimento é a relação entre as células em divisão e o número total de células presentes no tecido (SCOTT ET AL, 1991).
Um balanço entre proliferação, diferenciação e morte celulares determina o número de células numa população, bem como o seu tamanho ou mais precisamente o estágio de um tumor (SHEN ET AL, 1998). Muitos pesquisadores acreditam que a mensuração da proliferação celular e da apoptose podem melhorar a confiabilidade do prognóstico do comportamento tumoral, caracterizando biologicamente o tumor (DE JONG ET AL, 2000).
2.2.1 MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO CELULAR
2.2.1.1 Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA)
Nos últimos anos o número de trabalhos que descrevem a aplicação dos anticorpos que reconhecem o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA – Proliferation Cell Nuclear Antigen), como um marcador de proliferação celular em materiais histológicos tem sido grande, tanto Medicina humana quanto na Medicina Veterinária (HALL ET AL, 1990, MC CORMICK & HALL, 1992, PREZIOSI ET AL, 1995, ESPOSITO ET AL, 2000, FUNAKOSHI ET AL, 2000 e KUSHLINSKII ET AL, 2004).
A disponibilidade de anticorpos monoclonais produzidos contra antígenos nucleares do ciclo celular se faz possível, por meio das técnicas de
imuno-histoquímica, um método rápido e fácil de avaliar a atividade cinética da neoplasia, juntamente com outros métodos como a medição do índice mitótico (SARLI ET AL, 1994 e SARLI ET AL, 1998).
Esse interesse é uma conseqüência da ampla crença em considerar que cada marcador pode demonstrar ser útil como um indicador objetivo do comportamento biológico de pelo menos algumas formas de tumores, juntamente com a resistência de alguns epítopos de PCNA na fixação e no processamento convencional (HALL ET AL, 1990 e MC CORMICK & HALL, 1992).
O PCNA é uma proteína altamente conservada, com homologia na seqüência de aminoácidos entre os mamíferos (ALMENDRAL ET AL, 1987). O gene para PCNA está presente não somente em mamíferos, mas também nas células de vegetais superiores (SUZUKA ET AL, 1989). Em 1978 MIYACHI e colaboradores, descreveram um soro autoimune de pacientes com Lupus Eritematoso Sistêmico, o qual reconheceu um antígeno nuclear distribuído nas células em proliferação, e foi conseqüentemente chamado de antígeno nuclear de proliferação celular (MC CORMICK & HALL, 1992), ou seja, o PCNA foi descrito como um auto-anticorpo (ALVES ET AL, 1999). Em 3% dos pacientes que sofrem de Lupus Eritematoso Sistêmico são encontrados anticorpos contra PCNA e foi através do uso do soro desses pacientes que a proteína foi primeiramente definida. Esses anticorpos policlonais têm sido usados para estudos “in vivo” e “in vitro” do PCNA (WASEEM & LANE, 1990).
O PCNA é uma proteína de 36 kD, reguladora do ciclo celular, detectada através da imunofluorescência (WASEEM & LANE, 1990). O PCNA é um auxiliar da DNA-polimerase-delta que atua na replicação celular (XIONG ET AL, 1992). A concentração de PCNA aumenta rapidamente no meio da fase G1 do ciclo celular, permanece elevado por toda fase S, então rapidamente diminui de G2/M para G1 (SARLI ET AL, 1994).
Alguns aspectos biológicos complicam a interpretação de reações para o PCNA, pois há uma superexpressão em alguns tipos de neoplasias malignas, não relacionada às fases do ciclo celular, células normais adjacentes a neoplasias e fora do ciclo celular, podem também apresentar expressão do antígeno (HALL ET AL, 1990). Além disso, um outro fator bem conhecido é a sua meia vida relativamente longa, cerca de 20 horas, que permite que células que há muito já deixaram o ciclo celular ainda persistam apresentando o antígeno (BRAVO & BRAVO, 1987 e SCOTT ET AL, 1991). Algumas proteínas não degradadas podem ainda restar nas células (SARLI ET AL, 1994 e PREZIOSI ET AL, 1995), resultando numa proporção de positividade imuno-histoquímica maior do que a esperada quando avaliamos outros marcadores de proliferação celular (ALVES ET AL, 1999).
O PCNA na imuno-histoquímica, mostra dois principais grupos de núcleos, fortemente marcados e menos intensamente marcados; quando o tecido é fixado em formol, somente a contagem dos núcleos fortemente marcados é sugerido por alguns autores para o uso, porque as células nas quais eles ocorrem estão incontestavelmente nas fases G1/S do ciclo celular (PREZIOSI ET AL, 1995). Desta forma, na avaliação do índice PCNA, alguns autores têm sugerido somente a
contagem desses núcleos para evitar a inclusão de células que não estão ciclando (SARLI ET AL, 1995).
Uma ampla variedade de anticorpos que reconhecem o PCNA estão disponíveis. Comercialmente os reagentes disponíveis incluem os anticorpos monoclonais 19A2, 19F4 e PC10 (MC CORMICK & HALL, 1992). Dois anticorpos monoclonais designados 19A2 e 19F4 têm sido produzidos contra PCNA de coelho. Por Western blotting eles reconhecem PCNA de diferentes espécies de mamíferos. Seus epítopos têm sido localizados na região central da molécula de PCNA (WASEEM & LANE, 1990). É aparente que os epítopos reconhecidos por esses anticorpos são diferentes e existem diferenças nos efeitos de fixação e processamento sobre a detectabilidade desses epítopos. Além disso, parece existir diferenças entre o comportamento imuno-histoquímico desses anticorpos em comparação com os autoanticorpos humanos. Isso talvez seja uma explicação parcial para discrepância entre informações sobre a relação entre a imunoreatividade do PCNA e outros marcadores do ciclo celular (MC CORMICK & HALL, 1992).
O clone PC10 reconhece epítopos de proteínas resistentes à parafina e ao formol, facilitando o uso de material reservado, que tem sido processado rotineiramente. Apesar de poder ser usado com recuperação de epítopos pelo calor (microondas, panela de pressão ou banho Maria), o PC10 é mais comumente usado sem este procedimento. O padrão de reação então parece ser fortemente influenciado pela fixação do tecido longos períodos de fixação em formol diminuem significativamente o percentual de células marcadas (ROWLANDS ET AL,
1991). Alguns autores têm sugerido que a fixação não deve ser maior que 48 horas (SARLI ET AL, 1995).
2.2.1.2 Marcador de Proliferação Celular – Ki-67
Em 1983, GERDES e colaboradores descreveram a preparação de um anticorpo monoclonal de camundongo, dirigido a um antígeno presente em células em proliferação, que foi chamado de Ki-67.
Ele reconhece um epítopo sobre um antígeno nuclear o qual é expressado nas células que estão no ciclo celular (YU & FILIPE, 1993). Essa proteína é considerada um componente da matriz nuclear (SARLI ET AL, 1994), e é um marcador que tem uma maior consistência biológica (ALVES ET AL, 1999 e URRUTICOECHEA ET AL, 2005).
Estudos sugerem que a distribuição do Ki-67 não é dependente da presença de DNA ou de histonas, o que indica que o antígeno é associado com uma estrutura não protéica, não histônica conhecida como “scaffold” cromossômico ou é parte integral dela (FONATSCH ET AL, 1991 e ALVES ET AL, 1999), é uma proteína nuclear altamente protease sensitiva, ou seja, possui alta suscetibilidade ao tratamento com proteases, reunida por cadeia polipeptídica, é um complexo bimolecular com um peso molecular evidente de 345 e 395 kD (CASTAGNARO ET AL, 1998). O gene responsável pela expressão do antígeno Ki-67 está localizado no
braço longo do cromossomo humano 10 (locus 10q25) (SCHONK ET AL, 1989 e FONATSCH ET AL, 1991).
A utilização do anticorpo Ki-67 tem sido proposta para determinar a fração de crescimento em neoplasias e em tecidos (GERDES ET AL, 1984 e KAMEL ET AL, 1989) e existem evidências que a imunomarcação deste anticorpo tem uma boa correlação com outros marcadores de proliferação celular (HALL & LEVISON, 1990 e URRUTICOECHEA ET AL, 2005). De acordo com ESPOSITO e colaboradores (2000), em carcinomas epidermóides do trato aerodigestivo superior em humanos, a expressão imuno-histoquímica do Ki-67 apresentou uma correlação positiva com a expressão do PCNA.
Segundo SIRVENT e colaboradores (1995), o Ki-67 é um seguro, rápido e objetivo indicador do grau de agressividade tumoral, ao mesmo tempo, dependendo do grau de diferenciação da neoplasia, tem sido mostrado ser de valor prognóstico para sobrevivência e recorrência do câncer de mama.
Em 1984, GERDES e colaboradores publicaram um estudo detalhado da expressão do Ki-67 nas diferentes fases do ciclo celular. A imunomarcação é expressada por todas as fases G1, S, G2 e M, do ciclo celular, com um pico de concentração na fase G2/M (SARLI ET AL, 1994 e SARLI ET AL, 1998). A expressão do Ki-67 é mínima no final da fase G1 e início da fase S e a sua taxa aumenta durante a segunda metade da fase S, e este antígeno desaparece rapidamente após a mitose (BRUNO & DARZYKIEWICZ, 1992). Este antígeno está localizado no nucléolo em G1, com uma distribuição, mais tarde, nucleoplásmica no
ciclo, aumentando sua intensidade durante as fases S e G2, atingindo um máximo na mitose. Com a progressão de S para G2, o antígeno Ki-67 está estreitamente associado com a cromatina e na mitose, toda imunoreatividade do Ki-67 está co-localizada com as cromátides (YU & FILIPE, 1993). Células que não estão no ciclo celular, ou seja, as que se encontram na fase G0, não mostram nenhuma reatividade para o anticorpo (SARLI ET AL, 1994). Também não foi encontrado nas células que estão entrando no ciclo celular, vindas de G0 para a parte inicial de G1 (CASTAGNARO ET AL, 1998).
A vida média deste antígeno detectável é muito curta, o que é uma vantagem, sendo degradado em 1 hora ou menos após a mitose (BRUNO & DARZYKIEWICZ, 1992), isso provavelmente é devido à presença de numerosos PEST (prolina-ac. glutâmico-serina-treonina) os quais facilitam um rápido catabolismo (YU & FILIPE, 1993). Isso garante que células que já tenham saído do ciclo celular não apresentem o antígeno (ALVES ET AL, 1999).
FALINI e colaboradores (1989) encontraram imunoreatividade do Ki-67 em tecidos de outros mamíferos além do homem, como por exemplo cordeiro, bezerro, cão, coelho e rato, mas a precisa extensão da qual ele é evolucionariamente conservado não é ainda determinado (YU & FILIPE, 1993).
De qualquer forma, tendo em vista todos estes dados, nos parece claro que a marcação do Ki-67 resulta numa avaliação bastante aproximada da fração de crescimento de uma população celular. Marcação mesmo que tênue pode ser
considerada positiva, ou seja, a célula mesmo minimamente marcada encontra-se dentro do ciclo celular (SCOTT ET AL, 1991).
CASTAGNARO e colaboradores (1998) investigaram a expressão imuno-histoquímica do antígeno Ki-67 em 48 carcinomas mamários felinos, para observar se o índice Ki-67 forneceria uma indicação do tempo de sobrevivência pós-cirúrgica (PST). Um ano depois, 50% dos gatos estavam ainda vivos (grupo A), enquanto os outros 50% foram a óbito (grupo B). Uma diferença estatística significante no Ki-67 foi encontrada entre os dois grupos e nenhuma outra diferença estatística foi encontrada. O Ki-67 não correlacionou com a idade ou diferente tipo histológico, de acordo com a classificação da organização mundial de saúde.
No carcinoma mamário em mulheres, a atividade proliferativa estudada através da expressão do anticorpo Ki-67, foi significativamente maior no carcinoma ductal infiltrativo do que no carcinoma ductal in situ (SHEN ET AL, 1998).
Segundo ZUCARI (2001), o Ki-67 é um excelente marcador de proliferação celular no diagnóstico e prognóstico de carcinomas mamários e para a malignidade em neoplasias mamárias em cadelas. Verificando que o Ki-67 está associado com a proliferação celular, estando a fração de células neoplásicas positivas ao Ki-67 correlacionada com a evolução clínica da doença.
Em relação ao diagnóstico histológico, marcadores proliferativos podem mostrar uma boa correlação com categorias histológicas, como por exemplo, distinguindo entre condições benignas e malignas, ou distinguindo entre
malignidades de alto e baixo grau. No entanto, estudos muitas vezes mostram um envolvimento considerável entre os grupos e não é, portanto, justificável na maioria dos casos usar índices de proliferação como um diagnóstico absoluto. O mais indicado é usar os marcadores de proliferação como um adjunto ao critério histológico convencional (YU & FILIPE, 1993).
A determinação da imunoreatividade dos marcadores Ki-67 e PCNA é um método objetivo e quantificável mais sensível e específico para avaliar a proliferação celular do que a contagem do número de mitoses na histologia e que pode subsidiar informações prognósticas (ESPOSITO ET AL, 2000 e RIBEIRO JUNIOR ET AL, 2000).
A identificação imuno-histoquímica de antígenos específicos para células em multiplicação, por anticorpos monoclonais como Ki-67 e PCNA oferece uma boa abordagem para a avaliação da fração de crescimento (SARLI ET AL, 1994, SARLI ET AL, 1998, PAPANTONIOU ET AL, 2003 e KUSHLINSKII ET AL, 2004). Segundo ALVES e colaboradores (1999) e URRUTICOECHEA e colaboradores (2005), o Ki-67, na forma do MIB-1, é o melhor marcador operacional da proliferação celular para o patologista cirúrgico.
2.3 MORTE CELULAR POR APOPTOSE
A apoptose, também denominada morte celular programada, refere-se a um mecanismo de suicídio celular. É uma via pré-organizada de morte celular,
desencadeada por diferentes sinais extracelulares e intracelulares. A apoptose detecta e destrói células que abrigam mutações, mantendo assim a consistência genética e prevenindo o desenvolvimento do câncer. Por outro lado clones de células tumorais freqüentemente desenvolvem mecanismos para impedir a apoptose (KERR ET AL, 1994, LIU ET AL, 2001, PORTH, 2004, PEREIRA, 2006 e RUBIN, STRAYER, 2006, GRIVICICH ET AL, 2007 e TERZIAN, 2007).
A apoptose foi primeiramente descrita por KERR e colaboradores (1972), e caracteriza-se por uma seqüência de eventos programados que incluem ativação de enzimas endógenas, resultando em endonucleólise e culminando com a fragmentação do DNA e de proteínas nucleares e citoplasmáticas (WYLLIE, 1980, ARENDS ET AL, 1990, DARZYNKIEWICZ ET AL, 1992, KAJSTURA ET AL, 1996, HENGARTNER, 2000 e KUMAR ET AL, 2008).
Através da análise histológica, nos tecidos corados com hematoxilina-eosina, a apoptose envolve células isoladas ou pequenos grupos de células, denominados corpos apoptóticos. A célula apoptótica aparece como uma massa redonda ou oval de citoplasma intensamente eosinofílico, com fragmentos de cromatina nuclear densa. Como a retração celular e a formação de corpúsculos apoptóticos ocorrem de forma acelerada e os fragmentos são rapidamente fagocitados, degradados ou expulsos para a luz, a apoptose pode ocorrer nos tecidos antes que se torne evidente em seções histológicas. Além disso, a apoptose, ao contrário da necrose, não apresenta reação inflamatória, dificultando a sua detecção histológica, pois o recrutamento de neutrófilos ou de linfócitos não é comum (HENGARTNER, 2000,
PEREIRA, 2006, MITCHELL, 2006, RUBIN & STRAYER, 2006 e KUMAR ET AL, 2008).
A pesquisa do processo de morte celular programada, resultando em apoptose, tornou-se uma das áreas em maior expansão na biologia celular nos últimos anos. Este processo vem evidenciando que a eliminação das células é um dos eventos mais importantes na biologia celular e que constitui o principal mecanismo de morte celular em vários processos fisiológicos ou patológicos. Esse mecanismo de morte celular é importante na maturação de certos sistemas orgânicos, tal como na involução tímica; na remoção de células maduras; também na senescência, como ocorre, por exemplo, na regressão prostática; eliminação de células com dano imposto ao DNA por infecção viral, irradiação ou agentes citotóxicos e eliminação de células neoplásicas em tumores, mais freqüentemente em tumores com crescimento celular ativo (WYLLIE, 1980, SANDFORD ET AL, 1984, SAVILL ET AL, 1989, KERR ET AL, 1994, KAJSTURA ET AL, 1996, STEVENS & LOWE, 2002, SOUZA ET AL, 2004, SCHÖNDORF ET AL, 2004 e GRIVICICH ET AL, 2007).
O crescimento da massa tumoral ocorre em função do aumento da taxa de proliferação celular em neoplasias, que é devido não somente ao crescimento descontrolado das células neoplásicas, mas também pela diminuição da taxa de morte celular programada, resultado da falta de células que sofrem apoptose; por outro lado, considera-se que, se o índice de apoptose apresenta-se alto, o tumor cresce muito lentamente (CARSON & RIBEIRO, 1993, CUELLO-CARRIÓN & CIOCCA, 1999, OKADA & MAK, 2004 e STRICKER & KUMAR, 2008). Apesar da
enorme variabilidade do câncer, evidências demonstram que a resistência à apoptose é uma das características mais marcantes da maioria dos tumores malignos (OKADA & MAK, 2004).
Levando-se em consideração que durante o crescimento tumoral existe um equilíbrio ou um balanço entre a proliferação e morte celular, no qual o processo de apoptose está envolvido, o alto número de células apoptóticas será proporcional a alta taxa de proliferação celular e um prognóstico desfavorável (SIMÃO ET AL, 1999, GONZÁLEZ-CÁMPORA ET AL, 2000, LIU ET AL, 2001, NAKOPOULOU ET AL, 2001 e URRUTICOECHEA ET AL, 2005)
Em um estudo realizado por PEREIRA e colaboradores (2003) com 30 casos de tumores mamários caninos, o número de células apoptóticas foi comparado ao prognóstico. Foi observado a possibilidade de um prognóstico desfavorável nos casos com uma alta taxa de células apoptóticas, sendo que nenhum tumor mamário canino, com prognóstico desfavorável apresentou menos que 30 células apoptóticas, contadas em 10 campos de maior aumento.
Muitas publicações têm demonstrado que cânceres de mama em mulheres, com um alto índice apoptótico apresentam um prognóstico favorável quando comparado com o mesmo tipo de câncer com um menor índice apoptótico ou nenhuma apoptose (LIPPONEN & AALTOMAA, 1994, BERARDO ET AL, 1998, DEL BUFALO ET AL, 2002, SCHÖNDORF ET AL, 2003 e SIRVENT ET AL, 2004). Taxas extremamente baixas de apoptose podem prolongar a sobrevida ou reduzir a
substituição de células anormais. Esse acúmulo de células pode originar neoplasias malignas, como as de mama, próstata e ovários (MITCHELL, 2006).
Embora a seqüência de eventos intracelulares responsáveis pela apoptose ainda não esteja totalmente conhecida, várias alterações bioquímicas foram implicadas no processo (STITES ET AL, 2000). O processo de apoptose é bastante complexo e regulado, em parte, por marcadores moleculares muitas vezes associados com a carcinogênese mamária, ou seja, um desequilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose pode contribuir para a carcinogênese e progressão tumoral (LIU ET AL, 2001). Dado o papel central da apoptose em muitos processos patológicos, a identificação das células apoptóticas vem se tornando um aspecto importante na investigação da patogênese da doença (POPOVSKA ET AL, 1999, SATOH ET AL, 2000, DEL BUFALO ET AL, 2002, SCHÖNDORF ET AL, 2003, PEREIRA ET AL, 2003 e SIRVENT ET AL, 2004).
O evento fundamental na apoptose é a ativação de enzimas denominadas caspases. O processo de apoptose pode ser dividido em uma fase de ativação, ou seja, onde as caspases tornam-se ativas e uma fase efetora, na qual as enzimas atuam provocando a morte celular (SATOH ET AL, 2000, MITCHELL, 2006, PEREIRA, 2006, GRIVICICH ET AL, 2007 e KUMAR ET AL, 2008).
As caspases proteolíticas que medeiam a fase de ativação são altamente conservadas entre as espécies: no termo caspase, o “c” refere-se a uma enzima que possui uma cisteína em seu local ativo e “aspase” refere-se à habilidade dessas
enzimas de clivar os resíduos do ácido aspártico (STITES ET AL, 2000, SATOH ET AL, 2000, GRIFFITHS ET AL, 2001, MITCHELL, 2006 e KING, 2007).
As caspases são divididas em dois grupos básicos – iniciadoras e efetoras – dependendo da ordem em que são ativadas durante a apoptose. As caspases iniciadoras incluem a caspase-8 e a caspase-9. Várias caspases, incluindo a caspase-3 e a caspase-6 são efetoras. Depois que uma caspase iniciadora é ativada, o programa de morte enzimática é iniciado pela ativação rápida e seqüencial das outras caspases, desta forma desencadeiam os processos nucleares e citoplasmáticos que levam à morte celular por apoptose. As caspases efetoras atuam em vários componentes celulares; elas clivam proteínas do citoesqueleto e da matriz nuclear, rompendo assim o citoesqueleto e levando à destruição do núcleo. No núcleo, as caspases clivam as proteínas envolvidas na transcrição, replicação e reparação do DNA. Em especial, a caspase-3 ativa uma DNAse citoplasmática que resulta na clivagem internucleossômica característica do DNA (PATEL ET AL, 1996, DE ROBERTIS, 2001, KIVINEN ET AL, 2005, PEREIRA, 2006 e MITCHELL, 2006).
O início da apoptose ocorre por sinais de duas vias distintas, porém convergentes: a via extrínseca ou iniciada por receptores, e a via intrínseca, ou mitocondrial (MITCHELL, 2006 e PEREIRA, 2006).
Os desencadeadores da apoptose mais bem conhecidos na membrana celular são o ligante do TNF-α (fator de necrose tumoral) a seu receptor (TNFR) e a
proteína ligante Faz/CD95 (Fas-L ou CD95-L) a seu receptor (Fas ou receptor Fas), ou seja, via extrínseca. O TNF-α, é com maior freqüência, uma citocina livre,
enquanto a proteína ligante Fas localiza-se na membrana plasmática. Receptores para TNF-α e a proteína ligante Fas tornam-se ativados mediante ligação com seus
ligantes. Essas proteínas transmembrana possuem seqüências de aminoácidos em suas caudas citoplasmáticas, denominadas “domínios de morte”, que operam como pontos de atracamento para os domínios de morte de outras proteínas que participam do processo sinalizador acarretando apoptose. Após se ligar aos receptores, estas últimas proteínas ativam moléculas sinalizadoras na seqüência, especialmente a pró-caspase-8, que é convertida a caspase-8. Por sua vez, a caspase-8 inicia uma cascata de ativação de outras caspases seqüenciais na via da apoptose. Essas caspases (3, 6 e 7) ativam muitas enzimas nucleares, como a PARP (poli-ADP-ribosil polimerase) que medeiam a fragmentação nuclear da morte celular apoptótica (YONISH-ROUACH ET AL, 1991, EVAN ETAL, 1992, NAGATA & GOLSTEIN, 1995, RUBIN & STRAYER, 2006 e KUMAR ET AL, 2008).
A apoptose também é mediada por proteínas mitocondriais, via intrínseca. A membrana mitocondrial é um regulador essencial do equilíbrio entre morte e sobrevida celular. A escolha entre a sobrevivência e a morte é determinada pela permeabilidade da mitocôndria, controlada por uma família de mais de 20 proteínas, cujo protótipo é a Bcl-2. As proteínas da família de Bcl-2 residem na membrana interna mitocondrial e são pró-apoptóticas ou anti-apoptóticas (pró-sobrevida). Quando há preponderância de homodímeros compostos de proteínas pró-apoptóticas, desta família, a cascata apoptótica é ativada. Este excesso de constituintes pró-apoptóticos da família bcl-2 promove a abertura dos poros mitocondriais, aumentando a permeabilidade da membrana mitocondrial, permitindo o extravasamento do citocromo C e outras proteínas mitocondriais para o citosol. O
citocromo C, em conjunto com alguns co-fatores, como APAF-1 (Fator Ativador de Protease da Apoptose-1), convertem a pró-caspase-9 em caspase-9. Esta ativa as caspases seqüenciais (3, 6, 7) da mesma forma que a caspase-8. Em muitos tipos celulares, a caspase-8 também pode clivar e ativar um membro pró-apoptótico da família Bcl-2, chamado Bid, portanto no interior da via mitocondrial. A ativação combinada de ambas as vias lança um golpe letal para a célula, logo a via mitocondrial parece ser a via responsável pela maioria das situações de apoptose (HOCKENBERY ET AL, 1990, SHEN ET AL, 1998, RUBIN & STRAYER, 2006 e KUMAR ET AL, 2008).
2.3.1 MARCADOR DE APOPTOSE – CASPASE-3
Um método para o estudo da apoptose, se dá através da pesquisa de marcação imuno-histoquímica da proteína caspase-3. A caspase-3 é uma enzima encontrada no citosol e é ativada somente em células acometidas pela apoptose, uma vez ativada, ela é essencial para a desintegração da estrutura nuclear, contribuindo para a fragmentação do DNA da célula, e é neste estágio que ocorre o desenvolvimento das características morfológicas clássicas da apoptose. A ativação da caspase-3 ocorre em resposta a uma variedade de indutores de apoptose (KUMAR, 1995, HADJILOUCAS ET AL, 2001 e KIVINEN ET AL, 2005). A detecção da forma ativa da caspase-3 no citoplasma de células em apoptose pela imuno-histoquímica, indica o início do evento, seguido do desenvolvimento das características morfológicas clássicas da apoptose, sendo uma maneira segura e
está fortemente correlacionada com a avaliação morfológica (HADJILOUCAS ET AL, 2001).
Devido à ampla expressão da caspase-3 e sua função na regulação da vida e morte dos vários tipos celulares, recentes dados sugerem que a taxa de sua expressão em neoplasias malignas está correlacionada com a progressão da carcinogênese (NAKAGAWARA ET AL, 1997 e VAKKALA ET AL, 1999). Esta molécula desempenha uma importante função no mecanismo de apoptose dos carcinomas mamários, sendo um valioso indicador prognóstico para esses carcinomas (NAKOPOULOU ET AL, 2001).
A marcação da caspase-3 pode ser usada no controle da resposta aos tratamentos quimioterápicos quanto a possível resistência da droga, onde a diminuição da expressão pode indicar um mecanismo importante de sobrevivência celular em pacientes com câncer de mama (NERURKAR ET AL, 1989, DE JONG ET AL, 2000, PARTON ET AL, 2002 e O’DONOVAN ET AL, 2003).
A avaliação da apoptose, é portanto de grande interesse para a avaliação biológica da cinética tumoral e no potencial prognóstico da resposta clínica à um tratamento (MACIOROWSKI ET AL, 2001 e SCHÖNDORF ET AL, 2004).
A correlação entre o índice apoptótico e a proliferação celular se mostrou bastante positiva, principalmente em carcinomas mamários, indicando que a apoptose está diretamente relacionada à taxa de proliferação tumoral na tentativa de controlar seu crescimento. Quanto à caspase-3, o alto número de células
