R ita M aRia L adeiRa P iRes
2*, R afaeL H eRReRa a LvaRez
3, J ackson B aRRos do a MaRaL
2, f áBio M oRato M onteiRo
4, a LfRedo J osé f eRReiRa de M eLo
5, e duaRdo t RevisoL
6, M aRia a PaRecida c assiano L aRa
21
Recebido para publicação em 09/05/14. Aceito para publicação em 22/10/14.
2
Instituto de Zootecnia, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Genética e Reprodução Animal, Nova Odessa, SP, Brasil.
3
Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA), Polo Centro Sul, Piracicaba, SP, Brasil.
4
Instituto de Zootecnia, Centro APTA Bovinos de Corte, Sertãozinho, SP, Brasil.
5
Instituto de Terras do Estado de São Paulo, Presidente Venceslau, SP, Brasil.
6
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Botucatu, SP, Brasil.
*Autor correspondente: pires@iz.sp.gov.br
RESUMO: Durante o processo adaptativo às condições locais as raças bovinas europeias introduzidas no Brasil na época da colonização, adquiriram características fisiológicas e fenotípicas que as diferenciaram das raças originais. O presente estudo teve como objetivo comparar a morfologia dos cromossomos sexuais de bovinos de quatro raças, naturalizadas brasileiras, bem como verificar a incidência de anomalias cromossômicas. Foi analisado o cariótipo de 332 animais de quatro raças: Caracu (115 fêmeas e 159 machos), Junqueira (13 fêmeas e 3 machos), Pantaneiro (8 machos) e Patuá (21 fêmeas e 13 machos), utilizando-se a coloração convencional de Giemsa. Os animais das raças estudadas apresentaram o complemento cromossômico normal da espécie (2n=60), constituído de 58 cromossomos autossomos de morfologia acrocêntrica e dois cromossomos sexuais X submetacêntricos nas fêmeas e um X e um Y nos machos. Na raça Caracu, as linhagens selecionadas para corte e para leite foram formadas por indivíduos portadores de cromossomo Y acrocêntrico e submetacêntrico, sendo que a linhagem de corte apresentou maior percentagem de cromossomo Y acrocêntrico (P<0,01). Em duas fêmeas e em dois machos nascidos de partos gemelares da raça Caracu, foi observado quimerismo 60,XX/60,XY. O cariótipo 60,XX/61,XXY foi observado em outra fêmea da mesma raça. Nas outras três raças, nenhuma anomalia cromossômica foi observada. A morfologia do cromossomo Y das raças Pantaneira e Patuá apresentou dimorfismo do cromossomo Y acrocêntrico e submetacêntrico. Na raça Junqueira, apenas a morfologia submetacêntrica foi observada.
Palavras-chave: anomalia cromossômica, cariótipo, cromossomo Y, raças naturalizadas.
CYTOGENETICAL CHARACTERIZATION OF BOVINE BREEDS CARACU, JUNQUEIRA, PANTANEIRO AND PATUA
ABSTRACT: During the adaptive process to Brazilian conditions, the native cattle breeds acquired physiological and phenotypic characteristics wich differs them from European breeds, from which they derive. The objectives of present study were to compare the sex chromosomes morphologies between four Brazilian native cattle breeds as well as the incidence of chromosomal abnormalities.
The karyotype of 332 animals from four breeds were analyzed: Caracu (115 females and 159
males), Junqueira (13 females and 3 males), Pantaneiro (8 males) and Patua (21 females and 13
males). The Giemsa coloring were used to read the chromosome. All cattle breeds studied showed
the normal chromosome (2n=60) consisting of 58 acrocentric autosomes and two submetacentric
X chromosomes in females, and one X and one Y in males. In Caracu breed, selected for dairy
or beef, it was developed by animals dimorphism carriers of Y chromosome (acrocentric and submetacentric), and the beef bloodlines showed higher percentage of acrocentric Y chromosome.
There was 1% significant difference in Chi-Square test. In two females and two male born from twin birth of Caracu breed it was observed chemerism 60, XX/ 60, XY, and in other female from same breed it was observed 60, XX/ 61 XXY. For other three breeds, no chromosomal abnormality was observed. The Y chromosome morphology of the Pantaneiro and Patua breeds showed dimorphism of Y chromosome (submetacentric an acrocentric). In the Junqueira breed, only submetacentric morphology was observed.
Keywords: chromosomal abnormalities, karyotype, Y chromosome, natives breeds.
INTRODUÇÃO
As raças bovinas naturalizadas brasileiras derivam de raças que foram introduzidas por colonizadores europeus. Essas raças evoluíram ao longo dos séculos, adaptando-se ao clima e ao manejo das diferentes regiões do País.
Nesse processo de seleção natural, muitas delas foram cruzadas com outras raças adquirindo características fenotípicas e fisiológicas próprias que as diferenciam umas de outras (e gito et al., 2002).
Segundo d oMingues (1961), as raças nativas brasileiras, atualmente denominadas naturalizadas, podem ser classificadas em dois grupos principais: as nativas naturais e as nativas melhoradas. Ao primeiro grupo, pertencem populações resultantes da ação do meio ambiente, destacando-se algumas raças bovinas, como a Curraleira, Franqueira, Junqueira, Patuá, Pantaneira, enquanto, ao segundo grupo, bovinos das raças Caracu e Mocho Nacional.
Após um processo de quase extinção, a raça Caracu foi recuperada pelo Instituto de Zootecnia (SAA-SP), inicialmente mantida em Nova Odessa, SP, depois transferida para Sertãozinho, SP, na década de 1970. Nesse período, após levantamento dos planteis particulares remanescentes, iniciou-se um programa de melhoramento genético, visando a seleção para características de desempenho ponderal (t Rovo e d uaRte , 1981), como ocorria com as raças Nelore, Guzerá e Gir. Todavia, alguns criadores entusiastas da raça mantiveram planteis isolados destinados ao aprimoramento das características leiteiras.
O cariótipo da espécie bovina é constituído de 29 pares de cromossomos autossomos
acrocêntricos, e o par sexual XX ou XY, sendo o X e Y submetacêntricos nos bovinos de origem europeia, enquanto que nos de origem zebuína o cromossomo Y é acrocêntrico (M eLandeR , 1959;
M onsieuR -c aMBon , 1964). Esta característica tem sido utilizada em estudos de caracterização cromossômica, permitindo identificar os grupos Bos taurus taurus e Bos taurus indicus.
Estudos de citogenética realizados com animais das raças Caracu, Crioulo Lageano, Junqueira, Pé-duro e Pantaneiro (t aMBasco et al., 1985; c aRvaLHo et al., 1994; J oRge , 1994; B Ritto
e M eLLo , 1999; P iRes et al., 2004, 2011; i ssa et al., 2006, 2008 e 2009), evidenciaram cariótipo 2n=60, típico da espécie bovina. Igualmente, a introdução de alelos zebuínos nessas raças foi inferida pela observação de dimorfismo no cromossomo Y, acrocêntrico e submetacêntrico. Por outro lado, a incidência de anomalias cromossômicas que podem afetar a fertilidade tem sido pouco relatada nessas raças.
O presente estudo objetivou descrever algumas particularidades cromossômicas, comparar a morfologia do cromossomo Y das raças naturalizadas, Caracu, Junqueira, Pantaneiro e Patuá, bem como verificar a incidência de anomalias cromossômicas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram estudadas amostras de 332 bovinos
das raças Caracu, Junqueira, Pantaneira e
Patuá, pertencentes aos plantéis do Instituto de
Zootecnia, criadores particulares dos Estados de
Minas Gerais, Mato Grosso e São Paulo além de
touros pertencentes a Centrais de Inseminação
Artificial do Estado de São Paulo (Tabela 1).
Abaixo seguem a descrição sumária e ilustrações das raças utilizadas no presente estudo:
1) Raça Caracu (Figura 1). É provavelmente ori- ginaria do antigo gado Minhoto e Alentejano que chegaram ao Brasil no período colonial. Este gado português modificou-se em nosso meio, tornando- se uma raça distinta (a tHanassof , 1957). A pelagem destes animais pode variar de amarelo claro a ver- melho alaranjado. Atualmente, o Caracu é a raça naturalizada que apresenta o maior tamanho efe- tivo populacional, devido, principalmente, às suas características produtivas de dupla aptidão (carne e leite); e, sobretudo às suas características de adapta- ção às condições tropicais.
2) Raça Junqueira (Figura 2). Possui semelhança com a raça Alentejana devido à sua pelagem amarela ou malhada, supondo-se que tenha havido uma seleção no sentido de obter animais com chifres muito grandes (a tHanassof , 1957).
3) Raça Pantaneira (Figura 3). Conhecida, também, como Tucura ou Cuiabano, específica do Pantanal Brasileiro e descendente de bovinos de raças europeias, que vieram para o Brasil na época colonial. Estes animais adaptaram-se formando um grupo genético distinto devido à seleção natural e às condições ecológicas do Pantanal (M azza et al., 1992).
4) Raça Patuá (Figura 4). Conhecida no Estado de São Paulo como Igarapé, deriva de bovinos anões do Cabo de São Vicente, variedade da raça Algárvia introduzida no Brasil na época colonial (a tHanassof , 1957). Em Minas Gerais, na Bacia do Jequitinhonha, é denominada de Patuá, que significa animais de pequeno porte.
Tabela 1. Resumo das amostras estudadas
Raça Nº de animais Fêmea Macho Procedência
1Caracu 32 7 25 Poços de Caldas, MG (P)
101 50 51 Nova Odessa, SP (IZ)
137 58 79 Sertãozinho, SP (IZ)
04 0 4 Centrais de IA, SP (P)
Junqueira 16 13 3 São Gotardo, MG (P)
Pantaneiro 08 0 8 Poconé, MT (P)
Patuá 34 21 13 São Gotardo, MG (P)
Total 332 149 183
1
IZ = Instituto de Zootecnia; P = criadores particulares.
Figura 1. Touro da raça Caracu.
Figura 2. Touro da raça Junqueira.
Figura 3. Touro da raça Pantaneira.
A análise dos cromossomos de animais das quatro raças estudadas foi realizada em metáfases obtidas de culturas de linfócitos de sangue periférico, de acordo com a técnica de M ooRHead et al. (1960), com modificações. Amostras de sangue foram coletadas assepticamente na veia jugular, em tubos vacutainer heparinizados e estéreis e enviadas ao laboratório no período máximo de 24 horas. Logo após a chegada, vinte gotas de sangue foram transferidas para cada frasco de cultura, previamente preparado com 4 mL de meio MEM, 1 mL de soro fetal bovino e 0,1 mL de fitohemaglutinina e antibióticos. Foram incubados a 38ºC, dois frascos de cultura por animal e, após 47 horas, foi adicionado, 0,1 mL de solução de colquicina 0,0016%, continuando com a incubação por mais uma hora. Após este período, o material foi centrifugado por oito minutos a 800 rpm e o sobrenadante desprezado.
A hipotonização das células foi realizada pela adição de 10 mL de solução aquecida de cloreto de potássio (0,075 M) e incubação por mais 8 minutos, a 38ºC. Para fixação, um volume de 0,5 mL de fixador (3 partes de metanol: 1 parte de acido acético) foi adicionado, inicialmente, ao material em suspensão hipotônica, em seguida, foi homogeneizado e centrifugado a 800 rpm, por 8 minutos, e o sobrenadante desprezado. Mais 5 mL de fixador foram acrescentados, o material ressuspendido e novamente centrifugado, desprezando-se o sobrenadante. Este último procedimento, foi repetido uma ou mais vezes, até se obter o material convenientemente lavado e fixado. Finalmente, foi acrescentado 0,5 ml de fixador e o material mantido na geladeira por duas horas, antes do preparo das laminas. O material obtido foi gotejado (8 gotas) sobre laminas de vidro geladas, destinadas à coloração convencional e técnica de obtenção de banda C.
Na coloração convencional, as preparações citológicas foram coradas, durante oito minutos,
com solução de Giemsa a 3%. A análise dos cromossomos, em metáfase, foi realizada em microscópio óptico trinocular, com objetiva de imersão e câmara clara para desenho e contagem dos cromossomos, as melhores células foram fotografadas para a montagem do cariótipo. Foram analisadas cerca de 30 células de cada animal.
Para a análise de banda C foi empregada a técnica descrita por s uMneR (1972), com algumas modificações. As preparações citológicas que tinham, no mínimo, sete dias foram submetidas a tratamento com solução de HCl 0,2N por 20 minutos e lavadas em água destilada, após secagem durante 5 minutos, as lâminas foram imersas em uma cuba contendo solução recém-preparada de Ba(OH)
28H
2O a 5%, a 50ºC por 20 minutos, em seguida as lâminas foram incubadas durante uma hora em solução de 2XSSC, a 60ºC e posteriormente coradas com solução Giemsa a 3% em tampão fosfato 0,2M, pH 6,8, por 20 minutos. A análise dos padrões de banda C foi realizada nas metáfases fotografadas no microscópio.
Para as análises das bandas R por incorporação de 5-bromodeoxiuridina (BrdU), utilizou-se o seguinte procedimento: em cada frasco de cultura foi adicionada uma solução de BrdU, na concentração de 20 µg/mL de meio, bem como uma solução de 5-fluordeoxiuridina, na concentração de 10µg/
mL de meio, 8 horas antes do término de cultivo. A solução de colquicina foi adicionada nos 20 minutos finais e, a seguir, as preparações citológicas foram processadas como descrito anteriormente. Para a diferenciação das bandas R, foi empregada a coloração FPG (Fluorchrome Plus Giemsa) descrita por D utRiLLaux e c outuRieR (1981), com algumas modificações. As lâminas foram coradas em solução Hoescht 33.258, na concentração de 10 µg/
mL, durante 20 minutos, à temperatura ambiente.
Em seguida, as lâminas foram incubadas com 2X SSC, em câmara úmida, sob luz negra, por duas horas. As preparações foram novamente incubadas em solução 2X SSC, a 60ºC, durante 20 minutos, lavadas e coradas em solução Giemsa. A análise dos padrões de Bandas R foi feita nas metáfases fotografadas no microscópio.
O teste qui-quadrado (g oMes , 1976) foi utilizado para análise de significância estatística das diferenças de morfologias do cromossomo Y.
RESULTADOS E DISCUSSÃO Raça Caracu
Os resultados obtidos no presente estudo
Figura 4. Fêmeas da raça Patuá.
confirmaram o número diplóide característico da espécie bovina (2n=60), com a constituição 60,XX para fêmeas e 60,XY para machos, sendo 58 autossomos acrocêntricos, cromossomo X submetacêntrico e o cromossomo Y com dimorfismo acrocêntrico e submetacêntrico (Figuras 5 e 6)
c aRvaLHo et al. (1994) analisaram bovinos Caracu oriundos de dois núcleos de criação, sendo um deles localizado em Poços de Caldas, MG e o outro em Papagaios, MG. No primeiro núcleo, os autores observaram os dois tipos de cromossomos:
morfologia acrocêntrica (75%) e submetacêntrica (25%), enquanto que no outro núcleo, apenas Y submetacêntrico. Em outro estudo, i ssa et al. (2008), analisando 29 machos desta raça, observaram 15 bovinos portadores de Y acrocêntrico e 14 de Y submetacêntrico. Como pode ser visto na Tabela 2, dos 159 machos da raça Caracu investigados no presente estudo, 84,3% eram portadores de cromossomo Y acrocêntrico, enquanto que o restante (15,7%) apresentou morfologia submetacêntrica.
Com relação aos animais da raça Caracu selecionados para corte (CC), 91,8% dos machos apresentaram o cromossomo Y acrocêntrico e 8,2%, submetacêntrico. Já os animais selecionados para leite (CL), a frequência de Y acrocêntrico foi de 44% e para Y submetacêntrico de 56% (Tabela 2).
Comparando estes resultados, o teste qui-quadrado revelou diferenças ao nível de 1%.
Em duas fêmeas da raça Caracu, nascidas de partos gemelares heterossexuais, foi observado quimerismo 60,XX/60,XY (uma com 89,1%
de células masculinas (XY) e 10,9% de células femininas (XX); e outra com 59,2% de XY e 40,8% de XX). Estas fêmeas apresentaram ainda, masculinização do fenótipo e aparelho genital, diagnosticadas como freemartins. Esta anomalia, também descrita por diversos autores (k Han e f oLey , 1994; P aduLa , 2005; P eRetti et al., 2008; P iRes et al., 2009), é característica de fêmeas bovinas estéreis, nascidas de partos gemelares heterossexuais, que apresentam quimerismo 60,XX/60,XY nas células sanguíneas e vários graus de masculinização sendo, provavelmente, a anomalia mais frequente do desenvolvimento do aparelho genital de fêmeas bovinas.
Os dois machos, irmãos das fêmeas descritas anteriormente, também apresentaram quimerismo 60,XX/60,XY, mas, fenótipos normais. O efeito da presença de células femininas em machos nascidos de gestação gemelares com uma fêmea é controverso, mas, há estudos mostrando a redução da fertilidade manifestada através da baixa qualidade do sêmen ou mesmo esterilidade (d unn et al., 1979; B ongso
et al., 1981; k Han e f oLey , 1994). v aLe f iLHo et al.
(1983) estudaram o desenvolvimento testicular de touros gêmeos dizigóticos em que seu par era uma novilha freemartin ou outro touro e observaram que o processo de espermatogênese foi retardado nos gêmeos dizigóticos, quando comparados com os animais nascidos de partos simples.
Em bovinos, as anomalias cromossômicas envolvendo duas ou mais linhagens de células são raras, a não ser o quimerismo 60,XX/60,XY, que ocorre em cerca de 90% dos produtos de partos gemelares heterossexuais (e dwaRds et al., 1994; P iRes et al., 2009). No presente estudo, o cariótipo 60,XX foi observado em uma fêmea oriunda de gestação gemelar com macho, esta fêmea tornou-se adulta com todas as características femininas e, inclusive, apresentou varias parições. Esta observação é indicativa que, em algumas situações, pode não ocorrer anastomoses vasculares entre os gêmeos.
Outra fêmea Caracu com 8 anos, nascida de parto simples, nulípara apresentou constituição Figura 5. Célula em metáfase de macho da raça Caracu,
2n = 60,XY. Seta indicando cromossomo Y submetacêntrico, seta indicando o cromossomo X.
Figura 6. Célula em metáfase de macho da raça Caracu,
2n = 60,XY. Seta indicando cromossomo Y
acrocêntrico, seta indicando o cromossomo
X.
cromossômica 60,XX/61,XXY, genitália externa feminina normal, porém, com aparência e comportamento masculino, apesar de apresentar aparelho reprodutivo normal pela palpação retal e exame ultrassonográfico. B uncH et al. (1991), estudando uma ovelha selvagem hermafrodita, com mosaico XX/XXY, produto de um parto simples, observaram que o animal apresentava aparência feminina, porém, com desenvolvimento de chifres semelhante aos machos e comportamento agressivo.
Com referência ao aparelho reprodutivo, esta ovelha apresentou ainda clitóris aumentado, genitália interna com cornos uterinos e cervix e, ainda, duas estruturas gonadais com componentes masculinos e femininos. d ain e B Ridge (1978) descreveram uma novilha gêmea de um macho natimorto, que apresentava mosaicismo XX/XXY nos tecidos da pele e nas gônadas, e quimerismo XX/XY/XXY nos linfócitos. O animal apresentava, também, alongamento da uretra, ausência de vulva e gônadas pequenas, mostrando desenvolvimento testicular precoce. M einecke et al. (2007) descreveram outra novilha com constituição cromossômica normal 60,XX nos linfócitos, enquanto que nas células do útero foi encontrado 60,XX/90,XXY. Este animal foi classificado como intersexo, pois apresentava vulva aplástica e uretra semelhante a do macho, abrindo-se em um pseudo prepúcio, localizada entre as glândulas mamárias. A genitália interna apresentava desenvolvimento normal, com ovários funcionais, evidenciando folículos e corpo lúteo.
Um caso de mosaicismo 60,XX/61,XXY/78,XXY foi encontrado em um touro de Central de Inseminação Artificial, num total de 2364 animais analisados,
sendo que o fenótipo deste animal apresentou-se normal (n icoLae e P oPescu , 2001).
Outros tipos de anomalias cromossômicas não foram detectados nos animais avaliados no presente estudo, resultado diferente do encontrado por i ssa et al. (2008) que relataram a translocação Robertsoniana 1/29 em um estudo com animais da raça Caracu. Este fato deve ser visto com atenção uma vez que este tipo de anomalia é herdável e associada à redução da fertilidade (s antos et al., 1989).
Raças Junqueira e Patuá
Os cariótipos nas raças Junqueira e Patuá foram semelhantes, diferenciando-se apenas na morfologia do cromossomo Y. Os machos da raça Junqueira apresentaram somente Y submetacêntrico e, os machos da raça Patuá, Y submetacêntrico e acrocêntrico.
Todos os 16 animais pertencentes à raça Junqueira foram analisados citogeneticamente pela coloração convencional. Observou-se número diplóide 2n=60, com 58 autossomos acrocêntricos, cromossomos X submetacêntricos e Y submetacêntrico, padrão típico da espécie Bos taurus taurus, segundo M eLandeR (1959). Assim, considerando que os bovinos zebuínos apresentam o Y acrocêntrico (M onsieur -C aMbon , 1964), os animais desta raça podem ser considerados de origem europeia. Em estudo de caracterização genética por meio de análises de polimorfismos de proteínas, L aRa et al. (2000) não detectaram os alelos Ca
Ze Alb
C, considerados marcadores de raças zebuínas, Tabela 2. Frequência de cromossomo Y submetacêntrico (Cr Y Sub) e acrocêntrico (Cr Y Acro) em bovinos das raças Caracu,
Junqueira, Pantaneiro, Patuá
Raça Nº de animais Procedência
1Cr Y Sub Cr Y Acro
Caracu CC
279 Sertãozinho, SP (IZ) 4 (5,1%) 75 (94,9%)
51 Nova Odessa, SP (IZ) 6 (11,8%) 45 (88,2%)
04 Centrais de IA, (P) 1 (25,0%) 3 (75,0%)
Total CC 134 11 (8,2%) 123 (91,8%)
Caracu CL
325 Poços de Caldas, MG (P) 14 (56%) 11 (44%)
Junqueira 3 São Gotardo, MG (P) 3 (100%) 0 (0%)
Pantaneiro 8 Poconé, MT (P) 1 (12,5% ) 7 (87,5%)
Patuá 13 São Gotardo, MG (P) 4 (30,8%) 9 (69,2%)
Total 183 33 (18,0%) 150 (82,0%)
1