UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CIRURGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA
JAMIL M. ZARUR
MODELO EXPERIMENTAL DE
QUIMIOEMBOLIZAÇÃO HEPÁTICA
JAMIL M. ZARUR
MODELO EXPERIMENTAL DE QUIMIOEMBOLIZAÇÃO
HEPÁTICA
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em cirurgia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Cirurgia.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Morais Filho.
EXPERIMENTAL DE QUIMIOEMBOLIZAÇÃO HEPÁTICA
Dissertação submetida à
Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em CIRURGIA, da
Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do
grau de MESTRE em CIRURGIA .
Aprovada em ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Morais Filho (Orientador)
Universidade Federal do Ceará-UFC
_____________________________________________
Prof. Dr. .José Huygens Parente Garcia Universidade Federal do Ceará-UFC
_____________________________________________
A minha esposa, Eveline Castro. Por sua paciência, compreensão e pelos bons momentos vividos juntos.
A meus pais, Elisiária e Abdalla Zarur, pelo apoio e educação que me proporcionaram.
“ A hipótese voa, a ação caminha; por vezes as asas tomam um rumo indevido, o pé pisa no chão firme; porém o vôo pode ser retificado, enquanto o passo nunca poderá voar.”
AGRADECIMENTOS
• Ao meu orientador, Prof. Dr. Manoel Odorico de Morais que fez com que uma simples idéia se concretizar, e que um sonho
tornasse realidade.
• A todos os funcionários do laboratório de oncologia experimental da UFC que contribuíram para a concretização deste trabalho. • Ao amigo, Dr. Paulo Ferdinando de Melo Oliveira, que incentivou,
orientou e tornou este trabalho possível.
• Ao Dr. Dalgimar pelas orientações e análises da microscopia.
• Aos alunos da UFC, Marjorie S. Façanha Barreto, Clarissa Alencar Diogenes, Germana Lopes do Nascimento, com a ajuda, espírito
científico e disposição destes alunos foi possível a realização do
trabalho.
• Ao Instituto do Câncer do Ceará pelo fornecimento do quimioterápico.
• À faculdade de medicina da UFC, em especial ao departamento de cirurgia, que com afinco de seus professores não deixam que a
pesquisa e a ciência fiquem esquecidos e renegada a segundo
plano.
Ficha Catalográfica
Zarur, Jamil Martins
Modelo experimental de quimioembolização hepática/ Jamil Martins Zarur. Fortaleza - 2004
Dissertação ( mestrado ) Universidade Federal o Ceará.
Titulo em Inglês : Experimental model of chemoembolization hepatic
RESUMO
MODELO EXPERIMENTAL DE QUIMIOEMBOLIZAÇÃO
HEPÁTICA
OBJETIVOS : Estabelecer um modelo de tumor no fígado de ratos para estudo do comportamento tumoral e avaliar o uso da quimioembolização transarterial .
METODOS : Utilizado setenta e sete ratos Wistar, fêmeas, adultos, pesando entre 175- 325 g . Realizado incisão abdominal de três centimetros e implantado o carcinossarcoma de Walker 256 no lóbulo esquerdo do fígado. Dividido em três grupos ( n=40 ) que receberam respectivamente 100x 103 , 200x 103 e 300x 103 células tumorais, avaliado a pega do tumor e a sobrevida. Em um segundo experimento com 39 animais inoculados com tumor de Walker foi avaliado a sobrevida dos animais após infusão do 5-Flourouracil (5-FU) por via intra-peritoneal e transarterial, na artéria hepática, juntamente com partículas embolizantes.
RESULTADOS : O implante do carcinossarcoma de Walker no fígado de ratos apresentou desenvolvimento em 100 %, teve um crescimento rápido e ocorrência de metástases tardiamente, levando os animais ao óbito entre o sétimo e décimo quinto dia. O método de quimioembolização transarterial é possível de ser realizada experimentalmente. O uso do 5-FU aumentou a sobrevida em comparação ao grupo controle, porém não ocorreu diferença na sobrevida entre os grupos tratados por via peritoneal e transarterial.
CONCLUSÃO : O modelo de implante do tumor de Walker no fígado de ratos é eficiente, de fácil reprodutibilidade, e sobrevida média de 9,96±0.3 dias. A quimioembolização transarterial hepática pode ser realizada experimentalmente para avaliar diversas drogas.
ABSTRACT
EXPERIMENTAL MODEL OF CHEMOEMBOLIZATION HEPATIC
OBJECTIVES: Try to do a animal model to study the behaivor of liver tumor in rat and its response after use of chemoembolization transarterial.
METHODS : We use 77 Wistar rats, all of them were females, adult, weight 175-325 g. Abdominal incisor of 3 cm and implanted the Walker carcinossarcoma 256 at left lobule of the liver. The animals were divide into 3 grups, that recieved 100x103 , 200x103, and 300x103 cells. Followed up the animas to avaliate life standing and development tumoral. In another experiment was use 39 animals which alredy had Walker 256 tumor and we study the survival of the animals after treatment with 5-FU IP or 5-FU IA.
RESULTS : The orevall tumor development rate were 100%. Tumor growth was fast, and devolopment metastases on old fase. The animals dead between 7o. and 15o. day. Its possible to do chemoembolization experimentaly, after the use of 5-FU the rate survival increased.
CONCLUSION : The model with Walker 256 tumor developed here is easy to repoduce, efficient, with high tumor development rate observed, the life standing is about 9,96 ± 0,3 days. The chemoembolization can make experiment to assess several drugs.
SUMÁRIO
PÁGINA
1. INTRODUÇÃO 1
1.1.Câncer 2
1.2.Tumor hepático 3
1.2.1.Tumor hepático primário 3
1.2.2.Tumor hepático secundário 4
1.3.Tipos de tratamento 6
1.3.1.Cirurgia 6
1.3.2.Quimioterapia 10
1.3.3.Ablação química percutânea 11
1.3.4.Radiofreqüência 11
1.3.5.Quimioembolização 12
1.4.Modelos experimentais de tumor hepático 19
2. OBJETIVOS 23
2.1.Objetivos específicos 24
3. MATERIAL E MÉTODOS 25
3.1.Material cirúrgico 26
3.2.Animais 26
3.3.Células neoplásicas 26
3.4.Técnica anestésica 27
3.5.Técnica do implante tumoral 27
3.6.Técnica de cateterização da artéria hepática 28
3.7.Fases experimentais 29
3.7.1.Experimento 1 : Estabelecer o número de células do
implante tumoral e a velocidade de crescimento tumoral
30
3.7.2.Experimento 2 : Estabelecimento da sobrevida dos
animais
31
3.7.3.Experimento 3 : Infusão do quimioterápico 31
3.8. Análise estatística 33
4. RESULTADOS 34
4.1.Resultados da técnica do implante tumoral 35
4.2.Crescimento tumoral e sobrevida dos animais 37
4.3. Analise estatística 39
4.4.Avaliação da quimioembolização 40
5. DISCUSSÃO 43
hepático com o carcinossarcoma de Walker
5.2.Avaliação da quimioembolização trans-arterial hepática 47
6. CONCLUSÕES 52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
8. ANEXO 1 71
LISTA DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1 : Arteriografia hepática pré-embolização 14
Figura 2 : Arteriografia hepática pós-embolização 14
Figura 3 : Tomografia computadorizada de metástase hepática de tumor neuroendócrino pré embolização
15
Figura 4 : Tomografia computadorizada de metástase hepática de tumor neuroendócrino pós embolização
16
Figura 5 : Inoculação do tumor de Walker 29
Figura 6 : Pedículo hepático 30
Figura 7 : Cateterização artéria hepática 30
Figura 8 : Histopatologia do tumor no fígado 37
Figura 9 : Histopatologia do tumor do tumor de Walker 37
Figura 10 : Curva de sobrevida de ratos com tumor de Walker 39 Figura 11 : Curva de sobrevida de ratos com tumor de Walker
tratados com 5-FU
42
LISTA DE TABELAS
PAGINA
Tabela 1 : Sistema de Estadiamento de Okuda 06
Tabela 2 : Estadiamento do tumor hepático 07
Tabela 3 : Resultado da ressecção cirúrgica para metástase de câncer coloretal
09
Tabela 4 : Resultados da quimioembolização hepática 18
Tabela 5 : Resultado da sobrevida após inoculação células tumoral.
1.1.Câncer
No Brasil, o câncer ocupou o segundo lugar em causa de morte em
2000. As neoplasias foram responsáveis por 12,7% dos óbitos no Brasil.
Os dados epidemiológicos disponíveis atualmente no Brasil, configuram o
câncer como problema de saúde pública (Brasil, Ministério da saúde,
2000 ). O aumento da urbanização principalmente em centros mais
industrializados propicia a exposição da população a maior quantidade de
carcinógenos, além do que, as tendências demográficas mostram que
teremos uma população mais idosa que sofre mais de doenças
degenerativas.
O câncer do fígado é a sétima maior causa de morte por câncer no
mundo, com uma incidência estimada de 300.000 – 1000.000 novos
casos por ano. Apresenta altas taxas de incidência na China ( 23 a
150/100.000 hab.), Japão ( 2 a 20/100.000 hab.) e países do sul da Ásia
e na África (Bosch e col., 1999 ). O fígado é também sede freqüente de
metástase de tumores do trato gastrointestinal e de outros locais, sua
falência é uma das principais causas de morte na doença neoplásica.
O conhecimento da carcinogênese e dos fatores de risco são de
grande importância para a prevenção e para o tratamento precoce do
câncer. Os avanços nos setores de diagnóstico e na terapêutica em
estágios iniciais possibilitaram a cura de diversos pacientes, porém o
tratamento das lesões mais avançadas ainda é um desafio. Novas
modalidades terapêuticas vem surgindo ou sendo aperfeiçoadas, e são
1.2.Tumor hepático
1.2.1. Tumor hepático primário
O Carcinoma hepatocelular é um dos tumores malignos mais
freqüentes no mundo. Infecções virais crônicas por hepatite B e C, cirrose
alcóolica, aflatoxinas e esteróides sexuais são fatores de riscos
reconhecidos na carcinogênese destes tumores ( Johnson, 1996). Países
que apresentam endemia de hepatite viral tipo B, como os países
orientais e africanos, apresentam também as maiores incidências de
carcinoma hepatocelular. Em países da África e Ásia o carcinoma
hepatocelular também está relacionado com a contaminação de aroz e
grãos por aflatoxina, uma toxina produzida pelo Aspergillus flavius, o qual
se acredita causar efeito carcinogênico no fígado ( Enwonwu, 1984).
Apesar das evidências demonstrarem que os vírus da hepatite são
causadores do carcinoma hepatocelular, os mecanismos patogênicos
ainda não estão completamente esclarecidos. A prevalência do antígeno
de superfície da hepatite B ( HbsAg ) e anticorpos da hepatite viral C
( anti-HVC ) em pacientes com carcinoma hepatocelular na China é de
63,2% e 11,2% respectivamente ( Tang, e col., 2001). A hepatite crônica
causa lesão aos hepatócitos com hiperplasia regenerativa, expondo as
células a maiores riscos de mutação. O aumento da expressão do
citocromo p450 pode levar a um aumento da produção de metabólicos
carcinogênicos ( Lau & Lai, 1990) . Alteração na proteína HBx provoca
dano ao controle normal do crescimento celular, induzindo mudanças
progressivas na morfologia dos hepatócitos com formação de adenoma e
carcinoma. ( WANG e col., 1995 ). A ingestão excessiva de álcool está
por causar cirrose hepática. Cerca de 80% a 90% dos pacientes com
carcinoma hepatocelular apresentam cirrose associada.
A grande maioria dos HCC se instala em portadores de cirrose
hepática, os quais apresentam risco da ordem de 20% de desenvolver o
tumor em cinco anos ( Bruix , 1997 ; Tsukuma, 1993).
O diagnóstico do tumor hepático é realizado através de meios de
imagens como o ultra-som, a tomografia computadorizada e a
ressonância magnética, em combinação com a medida da
alfa-fetoproteina ( AFP ) ( Wands & Blum, 1991). O exame histológico pode
ser realizado com biópsia percutânea, transjugular ou no ato cirúrgico. As
metástases extra-hepáticas ocorrem tardiamente, sendo o mais comum
as metástases para o pulmão e osso. A trombose da veia porta por
invasão direta é a condição mais comum. ( Pentecost, 1993 )
O acompanhamento de pacientes com hepatite viral crônica com
ultra-som e alfa-fetoproteina tem permitido o diagnóstico precoce de
lesões iniciais permitindo o tratamento com chances de cura ( Okuda,
1986). Pacientes com carcinoma hepatocelular tem um prognóstico ruím,
menos de 5% sobrevivem mais de cinco anos após sua descoberta. O
diagnóstico é na maioria dos casos realizado tardiamente,
impossibilitando a ressecção cirúrgica. Assim a média de sobrevida
nestes casos é de quatro a seis meses ( Okuda e col. ,1985 ).
1.2.2.Tumor hepático secundário
O fígado é um sítio freqüente de metástases, principalmente de
sistema porta, formado pelas veias mesentérica superior e esplênica, que
por sua vez é recebe ramos da veia mesentérica inferior e da veia
gástrica esquerda ( Bierman e col., 1951; Healy e col., 1965 ) .
O acometimento hepático por um tumor secundário é muito mais
comum do que por um tumor primário, chegando a ser vinte vezes mais
freqüente. Os principais sítios primários são cólon, pâncreas, mama,
ovário, reto, estômago, pulmões e rins ( Foster & Lundy, 1981).
Embora a via preferencial de metastatização seja a veia porta, as
metástases hepáticas são supridas quase que exclusivamente através da
artéria hepática. (Bredis & Young, 1954 )
O câncer coloretal é um dos mais freqüentes em todo o mundo, 25%
dos pacientes diagnosticados com câncer coloretal já apresentam
metástase hepática no momento do diagnóstico, e mais de 70% destes
pacientes apresentaram metástase hepática no decorrer de suas vidas.
Quando não tratados precocemente apresentam prognóstico ruim com
sobrevida média de seis meses, e em cinco anos a sobrevida é menor
que 2 % ( Fong e col.,1995).
Algumas características do tumor estão relacionadas com pior
prognóstico, como o número de metástases maior que três e o tamanho
da lesão maior que cinco centímetros, porém o fator mais importante
relacionado com a sobrevida é a presença de doença extra-hepática.
1.3.Tipos de tratamento
1.3.1.Cirurgia
A cirurgia é a melhor opção de tratamento para o carcinoma
hepático. O tratamento cirúrgico pode ser realizado pela ressecção do
tumor ou através do transplante de fígado, que é indicado em estágios I
e II. A cirurgia apresenta uma taxa de morbidade e mortalidade
considerável apesar das melhorias ocorridas no suporte anestésico,
cirúrgico, e pós-operatório. As taxas de sobrevida com a ressecção
cirúrgica variam de 39% a 51% em três anos e de 25% a 49% em cinco
anos ( Ryu e col., 1997; Lai e col., 1995 ). Porém a ressecção cirúrgica é
indicada em somente 15% a 30% dos casos, isso devido a vários fatores,
dentre os mais importantes está o estadiamento do tumor, que pode ser
feito pelo sistema de Okuda (Tabela 1) ou sistema TNM da International
Union Against Cancer ( Tabela 2 ).
Tabela 1
Sistema de Estadiamento de Okuda
Critérios Parâmetros
Tamanho do tumor * > 5% ( + ) < 5% ( - )
Ascite Detectável ( + ) Não detectável ( - )
Albumina sérica < 3 g/dl ( + ) > 3 mg/dl ( - ) Bilirrubina sérica > 3 mg/dl ( + ) < 3 mg/dl ( - )
* Maior área seccional do tumor / maior área seccional do fígado
Estágio I Zero positivo
Estágio II Um ou dois positivos
Estágio III Três ou quatro positivos
Com o crescimento silencioso, o diagnóstico é realizado tardiamente.
Grandes tumores ou vários nódulos tumorais impossibilitam a ressecção,
além da proximidade e invasão de vasos e estruturas biliares dificultam o
tratamento cirúrgico Em muitos casos a cirrose compromete a função
hepática e contra-indica a cirurgia de ressecção ( Hanazaki e col., 2001 ).
Tabela 2
Estadiamento do tumor hepático
T1 - Tumor solitário sem invasão vascular .
T2 - Tumor solitário com invasão vascular ou múltiplos tumores menor que 5 cm.
T3 - Múltiplos tumores maior que 5 cm ou tumor envolvendo um ramos maior da veia porta ou veia hepática .
T4 - Tumor(es) com invasão direta de órgãos adjacentes exceto a vesícula biliar ou com perfuração do peritôneo visceral .
T N M
Estágio I T1 N0 M0
Estágio II T2 N0 M0
Estágio III A T3 N0 M0
Estágio III B T4 N0 M0
Estágio III C qualquer T N1 M0 Estágio IV qualquer T Qualquer N M1
American Joint Commite on Cancer : Cancer Staging Manual, Sixth Edition.
A ressecção cirúrgica do carcinoma hepatocelular usualmente se restringe
aos pacientes com lesões solitárias, com função hepática bem preservada
e sem evidência de hipertensão portal (LLOVET,1999). Nessas condições
favoráveis, a sobrevida em cinco anos após a ressecção, pode chegar a
50%. Entretanto, a recorrência tumoral após a ressecção cirúrgica é
invariavelmente elevada, podendo exceder 50% em cinco anos. ( Fried ,
O achado de metástase hepática, mesmo quando aparentemente
única, proveniente de tumores de mama, pâncreas, estômago, órgãos
pélvicos da mulher e pulmões a ressecção do tumor primário por não
interferir com o prognóstico, diferente do que ocorre com os tumores
coloretais, onde a ressecção da metástase hepática pode melhorar a
sobrevida (Morrow e col.,1982).
A cirurgia é o tratamento com melhores chances de cura nas
metástases hepática do câncer coloretal, porém o tratamento cirúrgico só
é possível em 10% a 25% dos casos (Luna-perez e col., 1998). Os
resultados favoráveis do tratamento cirúrgico são encontrados também
nas grandes ressecções hepáticas com mortalidade peri-operatória de 8%
(Geoghegan e col. 1999). Atualmente, com uma seleção adequada dos
pacientes, a ressecção hepática é o tratamento de escolha para
metástases de câncer colorretal confinadas ao fígado e resulta em
sobrevida que varia de 25% a 40% em várias séries (Fong e col. 1997) (
Tabela 3 ).
A complexidade da ressecção causa importantes perdas de funções
metabólicas e imunológicas que levam as taxas de complicações
operatórias de 25%. Complicações de grande ordem, como insuficiência
hepática (3-8 %), hemorragia (2-5%), fistula biliar (4%), abscesso
perihepático (5-10%), requerem cuidados pós-operatórios intensivos,
devendo assim, serem tratadas em centros especializados. (Iwatsuki &
Tabela 3
Resultado da ressecção cirúrgica para metástase de câncer coloretal Estudo No. pacientes Mortalidade operatória (%) Sobrevida 1 ano (%) 3 anos (%) 5 anos (%) Média (Meses)
Adson e col.(1984) 141 2 82 40 25 24
Hughes e col.(1986) 607 - - - 33
-Sclag e col. (1990) 122 4 85 40 30 32
Doci e col.(1991) 100 5 - - 30 28
Scheele e col.
(1991)
219 6 - - 39
-Rosen e col. (1992) 280 4 84 47 25 34
Tabela 3 :FONG, Y., BLUMGART, L., COHEN, A . Ca Cancer J Clin 1995; 45: 50-62
O transplante ortotópico do fígado (TOF) para tratamento do
hapatocarcinoma esta indicado em pacientes selecionados. Os tumores
em estágio avançado não apresentam benefícios com o transplante
hepático, apresentam altas taxas de recidiva e mortalidade precoce
(Iwatsuki, 1985).
Assim o transplante de fígado deve ser somente recomendado em
pacientes com impossibilidade de ressecção cirúrgica ou com insuficiência
hepática progressiva. O transplante hepático é indicado em pacientes
cirróticos com tumores solitários com diâmetro <5 cm ou até 3 lesões de
diâmetro <3 cm cada e sem evidência de invasão vascular ou
disseminação extra-hepática. A taxa de recorrência é baixa, variando de
3% a 8% em 3 anos, e os índices de sobrevida de 75% em 4 anos são
muito semelhantes aos encontrados nos pacientes sem carcinoma
1.3.2.Quimioterapia
A quimioterapia sistêmica tem apresentado resultados
desapontadores no tumor primário do fígado e alguns tumores
metastáticos para o fígado. Drogas quimioterápicas, como agentes
alquilantes, antimetabólitos, plantas alcalóides, antibióticos antitumorais,
e antracíclicos têm sido extensivamente estudados para o combate do
carcinoma hepatocelular. Entre os muitos agentes estudados a
doxorubicina, 5-fluorouracil, mitomicina, e cisplatina apresentam
atividade antineoplásica limitada. Na maioria dos casos a taxa de
resposta usando estes agentes são menores que 20%, a sobrevida média
é comparável com pacientes não tratados. ( Moore, D. e col., 1993 ).
A doxorubicina é o agente mais comumente utilizado no tratamento
do carcinoma hepatocelular, resposta de 10% -13% são relatadas, com
sobrevida média de 3 a 6 meses. Análogos como o mitoxantrone também
foi utilizado com os mesmos resultados. Pobres resultados também foram
reportados com uso do idarubicin, epirubicin e esorubicin (Chlebowski e
col., 1984 ; Sciarrino, E. e col , 1985 ).
A cisplatina foi utilizada na terapia do carcinoma hepatocelular pelo
Southeastern Cancer Study Group e o Eastern Cooperative Oncology
group não apresentando bons resultados, assim como a etoposide,
neocarzinostatin, diclorometotrexate ( Ravry, M.J. e col. 1986; Falkson,
G. e col. 1987 ).
A utilização de terapias alternativas como a hormonal também foi
investigada, com uso do tamoxifen, acetato de megestrol e acetato de
mostrado pequena atividade contra o carcinoma hepatocelular. (Gerard,
B. e col, 2004 ; Colleoni, M. e col. 1994)
1.3.3.Ablação química percutânea
O tratamento percutâneo de ablação é um procedimento
minimamente invasivo que usa substâncias químicas, como o álcool e o
ácido ascético. A alcoolização percutânea causa destruição do tumor por
promover a desidratação e desnaturação das proteínas, além de ter um
efeito trombótico na vascularização do tumor ( Bartolozzi, 1996). É um
tratamento seguro, efetivo e barato. A principio era usado em tumores
volumosos com resultados limitados devido a não difusão do álcool na
massa tumoral com permanência de tumor residual na periferia da lesão
( Vilana, 1992). Com aumento da experiência passou-se a utilizá-lo em
tumores menores e com melhores resultados. A alcoolização percutânea
em hapatocarcinoma menores que 3 cm teve uma resposta completa em
70% e sobrevida em 5 anos de 50% (LIVRAGHI, 1995 )
1.3.4.Radiofreqüência
A radiofrequência é um tratamento alternativo para pacientes com
tumor primário ou secundário do fígado, com lesões únicas ou múltiplas.
Utilizando-se da hipertermia para causar destruição do tumor por
desnaturação das proteínas intracelulares e fusão da bicamada
fosfolipídica, resultando na morte direta das células tumorais ( Rossi e
col., 1990 )
A ablação por radiofreqüência utiliza corrente alternada que é
estimulação iônica induzida pela corrente em tecidos circunjacentes
produz um gradual aquecimento friccional elevando a temperatura
tecidual de 80o a 100o C, que resulta em necrose coagulativa dos tecidos
próximos ao eletrodo (Rhim e col., 1999 ).
O procedimento é geralmente realizado sob sedação endovenosa,
uma agulha é introduzida por via percutânea no fígado, guiada por meio
de ultra-som ou tomografia computadorizada, e posicionada dentro da
lesão. Um gerador promove energia na ponta da agulha, monitoriza-se a
temperatura e a impedância. O procedimento é rápido e muitas vezes
não necessita de hospitalização.
Os dados ainda são precoces para permitirem conclusões sobre o
método, com pequenas casuísticas e curto período de acompanhamento.
Livraghi e colaboradores (1997) trataram 11 pacientes com 17
metástases, obtiveram resposta completa em 12 lesões (67%) e resposta
parcial em 6 (33%) após 6 meses do tratamento, porém não
apresentaram resultados a longo prazo. Solbiati e colaboradores ( 1998)
apresentaram resultados em 52 pacientes com total de 101 metástases
hepáticas. A taxa de sobrevida foi de 92% em 1 ano, 56% em 2 anos e
32% em 3 anos.
1.3.5.Quimioembolização
O tratamento de tumores hepáticos através de administração
seletiva intra-arterial de substâncias embólicas e quimioterápicos foi
primeiro usado no Japão ha cerca de vinte anos ( Yamada e col., 1983 ).
Aproximadamente um terço do fluxo sangüíneo hepático provem da
oxigênio requerido pelo fígado é transportado pela veia porta ( Bierman e
col., 1951 ). Devido a dupla irrigação sangüínea do fígado, através do
sistema porta e da artéria hepática, a interrupção do fluxo sangüíneo por
embolização seletiva da artéria hepática que nutri o tumor não traz
conseqüências graves a função hepática, a não ser que haja obstrução da
veia porta ou a função hepática esteja comprometida ( Hatanaka e col.
1995 ).
O hepatocarcinoma geralmente recebe suprimento sangüíneo quase
que exclusivamente da artéria hepática, razão porque a desarterialização
hepática destrói o tumor mais seletivamente do que o parênquima
hepático normal. Wang e colaboradores (1994) demonstraram em
modelo experimental em ratos com tumor de Walker que o fluxo
sangüíneo portal contribui para a circulação do tumor em 16% quando o
tumor é pequeno ( < 30 g ) e decresce para 4% em tumores maiores, a
irrigação do tumor era realizada principalmente pela artéria hepática,
ocorrendo acentuada diminuição do fluxo no centro do tumor com a
desarterialização.
A quimioembolização é realizada em sala apropriada com
intensificador de imagem com programa para realizar angiografia com
subtração digital; por técnicas de punção percutânea da artéria
( Seldinger, 1953 ) introduz o cateter no sistema arterial até a artéria
hepática, e por cateterização seletiva é identificado o vaso que irriga o
tumor ( Fig. 1 ). O tumor é então irrigado com drogas antitumorais ,
emulsão de óleo da papoula com iodo e partículas para obstrução dos
Fig. 1 : Arteriografia hepática pré-embolização. (Zarur, J.M., 2003)
A injeção de óleo da papoula como meio de contraste e veículo para
diluição do agente quimioterápico tornou o método mais popular e com
melhores resultados. Consiste em um composto de monoiodo etil ester de
ácido gorduroso, contendo 480 mg/ml de iodo .
Quando o óleo etiodado é injetado na artéria hepática há uma
concentração seletiva nos vasos do tumor, e sinusóides peritumoral por
longo período. Isto acontece por mecanismo de retenção no sistema
reticuloendotelial, adesão a membrana celular e aprisionamento
microvascular ( Nakakuma, e col., 1983 ; Nakajo, e col., 1998 ). Utilizado
em combinação com drogas antineoplásicas com a finalidade de reter a
droga no tumor, é empregado também para realização de diagnósticos de
pequenos nódulos hepáticos, diferenciação entre câncer, nódulos
hiperplásticos e hemangioma, aumentando a sensibilidade da tomografia
computadorizada ( Yumoto, e col., 1985 ).
O uso do óleo etiodado é utilizado para aumentar a sensibilidade de
meios diagnósticos como a tomografia computadorizada ( Fig. 3 ), que
detecta nódulos com menos de 1cm; a tomografia computadorizada com
óleo etiodado apresenta a maior sensibilidade ( 83%- 95% ) dentre os
Fig.3:Tumor neuroendócrino. Pré-quimioembolização.(Zarur,J.M. ;2003)
Estudos experimentais e clínicos realizados por Nakakuma e
colaboradores (1989 ) demostram a concentração do óleo etiodado no
tumor após três dias.
Em um estudo realizado por Raoul e colaboradores ( 1992 ) a
doxorubicina marcada com tecnécio diluída em diferentes soluções e
injetada intra-arterial demostrou maior permanência da droga ao nível
do tumor quando se realizava emulsão com óleo etiodado e menor nível
da droga no sangue circulante, diminuindo o pico de concentração sem
no entanto modificar a biodisponibilidade da doxorubicina. Surgindo
assim vários benefícios na terapia, como a redução da cardiotoxicidade
que está relacionada com concentrações elevadas da droga no plasma. A
biodistribuição é otimizada ao nível do tumor, demostrou que após 3
horas após a infusão 40% da doxorubicina ainda permanecia no fígado o
que não ocorria sem o uso do óleo etiodado.
Várias drogas são utilizadas na quimioembolização, como medicação
única ou em combinação de duas ou três drogas. As mais utilizadas são
cisplatina (Ngan, 1996 ), doxorubicina, mitomicina e mais recentemente
irinotecan ( Sciarrino, e col., 1985; Solomon, e col.,1999).
A desvascularização seletiva dos vasos nutridores do tumor é
realizado com a utilização de substâncias embolizantes, entre as mais
utilizadas estão partículas de gelfoan e polivinil álcool ( PVA) . As
substâncias embolizantes melhoram a eficácia da quimioterapia por
lentificar o fluxo sangüíneo no tumor e por induzir hipóxia das células.
( Wei-jian e col., 2002 )
A embolização pode causar reações adversas e complicações; a
síndrome pós-embolização ocorre na maioria dos pacientes e é bem
ser um método invasivo pode ocorrer complicações referentes a
possibilidade de não acerto ao local desejado causando colecistite
isquêmica, infarto esplênico, lesão da mucosa gastrointestinal, embolia
pulmonar, ou ainda complicações infecciosas decorrente da necrose
podendo causar abscesso hepático; em pacientes com função hepática
ruim pode precipitar a falência hepática. (Leung e col., 2001 )
Os resultados da quimioembolização são questionados e
controversos, na maioria utilizada em pacientes com grandes tumores e
estágios avançados não tem aumentado a expectativa de vida. Porém em
pacientes selecionados e associados com outras modalidades de
tratamento apresenta benefícios ( Tabela 4 ).
Tabela 4
Resultados da quimioembolização hepática
Estudo Tumor No. pacientes Sobrevida
Média (meses) 1 ano (%) 3 anos (%) 5 anos (%)
Tung-Ping e col(2000) HCC 484 - 49 23 17
Ryu e col. (1997) HCC 1067 - - 26 9,4
Hatanaka e col. (1995) HCC 138 83.3 41.7 27.1
Kamada e col (2001) HCC 108 24 81 41 19
Kim e col (2002) HCC 253 28,6 75 50
-Bronowicki e col(1994 ) HCC 127 18 64 27
-Solomon e col (1999) HCC 38 20 60 16
Rajan e colaboradores (2001) realizaram quimioembolização em
metástase de sarcomas para o fígado em 16 pacientes com sobrevida de
81% em 1 ano, 54% em 2 anos e 40% em 3 anos. Mavligit e
cisplatina e vinblastina, em 14 pacientes com leiomiosarcoma
gastrointestinal com metástases para o fígado com regressão significativa
do tumor ( > 50% ) em 10 pacientes ( 70% ).
Estudo randomizado realizado por Rougier e colaboradores ( 1992 )
em pacientes com metástases inressecáveis de carcinoma coloretal
comparou o tratamento com floxuridine por infusão arterial hepática com
o tratamento sistêmico com fluorouracil em 166 pacientes, mostrou
melhora da sobrevida no grupo com infusão intra-arterial , 64% versos
44% em 1 ano e de 23% versos 13% em 2 anos .
Stokes e colaboradores ( 1993) realizaram quimioembolização para
metástases hepática de tumor neuroendócrino e obtiveram decréscimo do
1.4.Modelos experimentais de metástase hepática
Modelos experimentais tem sido idealizados para compreensão dos
fatores carcinogênicos, da oncogênese e para avaliar métodos
diagnósticos e terapêuticos.
Modelos de camundongos expostos a aflatoxina B1 causaram
mutação nos cromossomos 249 do gene supressor tumoral p53 causando
tumor hepático. Em ratos a alimentação com N-dietilnitrosamina causa
tumor hepático ( Pavone e col. 1989)
A realização de um modelo experimental através da inoculação de
células tumorais em suspensão no parênquima do baço de camundongos
demostrou serem de boa eficiência e facilidade. Após a inoculação as
células migram através do sistema porta para o fígado ocorrendo
crescimento tumoral, o baço é extirpado após alguns minutos da
inoculação. (Lafreniere e col., 1986 ) .
De forma semelhante modelos experimentais de implantes no fígado
foram desenvolvidos pela inoculação de células tumorais na veia iliocólica
de camundongos, através da exteriorização do ceco. Os implantes
tumorais eram encontrados a partir do 11o. dia e apresentavam sobrevida
média de 53,3 dias. (Goldrosen , 1986 )
Diferentes tipos de células tumorais foram utilizados para implantes
no fígado de camundongos, ratos e coelhos. Tumores de diferentes locais
e histologia podem ser transplantados para o fígado, assim modelos de
do pulmão, células de Novikoff em ratos Sprague-Dawley, Morris
Hepatoma 3924A, células de carcinoma do colon DHD K 12. 9 ( Chen e
col., 1989; Gutt e col. 2000; Kopper e col., 1982 )
O carcinoma VX-2 é amplamente utilizado em modelo de tumor
hapático em coelhos. Mantido em implantes no peritôneo, as células são
colhidas e implantadas no fígado. O crescimento tumoral ocorre com
freqüência e em tempo curto, o tumor permanece localizado e apresenta
metástases somente a longo prazo. (Thorstensen . , 1994 )
A utilização de células do tumor carcinosarcoma de Walker para
modelo experimental de tumor no fígado já foi utilizado por outros
autores, os implantes são realizados por inoculação direta no fígado na
forma de solução com suspensão de células ou implante de fragmento
sólidos dentro do parênquima hepático, a inoculação através da veia
esplênica e veia mesentérica também foram realizados com sucesso
(Yang e col., 1992 ; Murphy e col., 1991).
Os modelos de implantes no fígado são de grande utilidade para
avaliação de métodos de diagnóstico por imagem, principalmente a
ressonância magnética que tem boa acurácia na detecção de pequenos
nódulos hepáticos. (Chen, 1989) A ressonância magnética foi capaz de
detectar nódulos de até 1mm de diâmetro e realizar cálculo de volumetria
do tumor em modelo animal com precisão, e assim realizar uma curva de
crescimento tumoral . (Qin , 1992 )
A embolização de tumor no fígado, idealizado experimentalmente
com implante de células de Novikoff em ratos Sprague-Dawley, foi
marcados com fluorescência infundidas na artéria hepática . Após exame
por microscopia de fluorescência foi observado que partículas menores
que 40 micras eram encontrados em outros órgãos como o pulmão e
baço, e não causavam completa embolização, porém as partículas de 40
micras permaneciam no sistema capilar próximo do tumor e não
migravam para outros órgãos. (Bastian e col., 1998)
Modelos de quimioembolização foram realizados para avaliar a
eficácia do método, utilizando ratos e coelhos. O tumor de Walker provou
ser um bom modelo por reproduzir características comuns ao carcinoma
hepatocelular em humanos, como o crescimento rápido e restrito ao
fígado e por apresentar grande neovascularização com nutrição
proveniente dos vasos arteriais hepáticos (Li e col., 2002 ).
Modelos experimentais de tumor de Walker no fígado foram
desenvolvidos para avaliar a ação de agentes inibidores de angiogênese
TNP-470 administrados via artéria hepática, os resultados indicam
remarcada ação antitumoral. (Yanai e col., 1994 ).
O bloqueio da artéria hepática através de sua ligadura em modelo de
carciosarcoma de Walker em ratos foi utilizado para avaliar a influência
sobre o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e a matrix
metalloproteinase-1 (MMP-1), ocorrendo decréscimo da perfusão e
causando hipóxia, com aumento do VEGF; podendo ser um fator
estimulador de metástase. (Guo e col., 2002 )
O uso de citocinas imunomoduladoras como o fator de necrose
tumoral alfa (TNF- alfa ) exibe ação antitumoral em vários modelos
experimentais, porém sua aplicação sistêmica causa toxicidade que limita
crescimento tumoral do adenocarcinoma mamário em ratos foi superior a
O objetivo deste estudo é desenvolver um modelo de tumor hepático
com características semelhantes ao carcinoma hepatocelular em
humanos, que seja de fácil reprodução, conhecer sua evolução e suas
características.
Através deste modelo desenvolver um método cirúrgico para realizar
quimioembolização através de artéria hepática, e avaliar a ação
antitumoral do quimioterápico
2.1.Objetivos específicos
• Desenvolver um modelo de tumor hepático em ratos com o carcinossarcoma de Walker.
• Avaliar o crescimento e evolução do tumor carcinossarcoma em fígado de ratos.
• Desenvolver método de infusão de drogas diretamente na artéria hepática de ratos.
3.1.
Material cirúrgico
O material cirúrgico e de laboratório utilizados para os experimentos
encontram-se descritos no anexo 1.
3.2.Animais
Foram utilizados para o trabalho ratos Wistar, fêmeas, com peso de
175 g a 325 g. Os animais eram provenientes do biotério central da
Universidade Federais do Ceará (UFC) e mantidos no laboratório de
Oncologia Experimental do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
UFC, abrigados a 24o C em ciclo luz-escuro de 12 horas e com acesso a
água e alimento ad libitum.
3.3.
Células neoplásicas
O tumor utilizado foi o Carcinossarcoma 256 de Walker, mantido em
laboratório por inoculações intramusculares sucessivas.
O tumor de Walker vem sendo mantido no Laboratório de Oncologia
Experimental da Universidade Federal do Ceará através de transplantes
sucessivos a cada 10 dias, por inoculação via intramuscular na pata
traseira de ratos Wistar. O tumor é retirado dos animais doadores e
colocado em uma placa de Petri contendo 9ml de Ringer com lactato e 1
ml de gentamicina ( 10mg/ml). O tecido é separado de focos necróticos e
triturado em pequenos fragmentos, em seguida colocados em um frasco
solução é então filtrada em uma peneira de metal e mantida em
temperatura de 4 oC. Colhido 106 células tumorais para nova manutenção
do tumor ou experimentos.
3.4.
Técnica anestésica
Foi utilizado o Hidrato de cloral a 10% na dose 0,1 ml a cada 30
grama de peso. Administrados por via intraperitoneal com agulha, caso
necessário repetia-se 20% da dose inicial.
3.5. Técnica de implante tumoral
Os animais anestesiados eram colocados em decúbito dorsal,
fazia-se uma incisão de 3 cm de comprimento, a fazia-seguir era exposto o lobo
esquerdo do fígado. Com uma seringa de 1 ml e agulha de 27G contendo
a suspensão de células tumorais, estas eram implantadas diretamente no
parênquima do lobo esquerdo do fígado a uma profundidade de 0,5 cm(
Fig. 5 ). Realizado a hemostasia por compressão, quando necessária,
realizava-se o fechamento da cavidade abdominal em plano único com
sutura contínua com nylon 4.0.
Para o implante foram utilizadas três quantidades de células
tumorais, que eram quantificadas através do microscópico óptico. Usado
Figura 5 : Inoculação do tumor de Walker
3.6.Técnica de cateterismo da artéria hepática
Após a inoculação de células tumorais no fígado dos animais, estes
eram submetidos a novo procedimento cirúrgico, no 6o. dia pós implante,
com abertura da cavidade peritonial, identificava-se o pedículo hepático e
cateterizava-se a artéria hepática com cateter de 0,85mm de diâmetro
(Figura 6 e 7 ), era então infundido a solução. Após, realizava-se retirada
do cateter e sutura do orifício de entrada com fio cirúrgico prolene 7.0 e
fechamento da cavidade abdominal.
3.7.Fases experimentais
Utilizado 88 ratos Wistar fêmeas, com peso que variou de 175 g a
325 g com peso médio de 240,55 gramas , foram divididos em três fases
experimentais. O primeiro experimento (n = 09), foi idealizado para
avaliar o freqüência de desenvolvimento do tumor. O segundo
experimento (n = 40) avaliou-se o crescimento tumoral e a sobrevida dos
animais e o terceiro experimento (n = 39 ) foi realizado para comparar e
avaliar a ação do quimioterápico infundido intra-arterial seguido da
embolização hepática.
3.7.1. Experimento 1 : Estabelecer o número de células do
implante tumoral e a velocidade de crescimento tumoral
Este experimento teve a finalidade de avaliar a pega tumoral com
diferentes quantidades de células tumorais. Foram utilizados nove
animais, divididos aleatoriamente em três grupos com três animais em
cada grupo, que receberam respectivamente, por inoculação direta no
lobo esquerdo do fígado, 1 x 105 células tumorais, 2 x 105 células e 3 x
105 células.
Após o sexto dia do implante os animais eram sacrificados e
necropsiados, realizado abertura e inventário da cavidade abdominal com
retirada do fígado e tecidos que poderiam estar comprometidos pelo
tumor. Realizava-se medidas da massa tumoral em seus dois diâmetros
com um paquímetro e cálculo do volume do tumor em cm3 ( D2xd/3 ),
após fixação com formol tamponado à 10% realizava-se cortes para
exame histopatológico.
Cálculo do volume tumoral : D2xd/3
*D – diâmetro maior
3.7.2.Experimento 2 : Estabelecimento da sobrevida dos
animais
Este experimento também foi dividido em três grupos (n = 40) os
quais foram implantados no lobo esquerdo do fígado 1 x 105 células
tumorais ( n = 13 ), 2 x 105 células ( n = 15 ) e 3 x 105 células (n = 12 )
respectivamente. Mantidos no biotério e acompanhados até as suas
mortes. Logo após suas mortes, realizava-se necropsia com abertura da
cavidade abdominal inventário dos órgãos e retirava-se o fígado e tecidos
que poderiam estar comprometidos pelo tumor, e ainda realizava-se
medidas dos diâmetros do tumor com um paquímetro e exame
histopatológico.
Este experimento tem como objetivo avaliar a sobrevida dos animais
com as diferentes quantidades de células neoplásicas e o crescimento
tumoral.
3.7.3. Experimento 3 : avaliação da quimioembolização
Administração de solução salina por via intra-arterial
O grupo controle foi criado utilizando doze ratos que foram
inoculados no lóbulo esquerdo do fígado com 1x 105 células tumorais pela
técnica já descrita, no sexto dia após a inoculação os animais eram
submetidos a novo ato operatório sob anestesia com hidrato de cloral,
com abertura da cavidade abdominal, identificava-se a artéria hepática e
com uma seringa contendo 1ml de solução salina e um cateter de 0,85
mm de diâmetro cateterizava-se a artéria hepática e infudia-se a solução
com fio cirúrgico prolene 7.0. Após sutura da cavidade abdominal, eram
mantidos no biotério até a suas mortes. Os animais que morreram no
ato operatório ou com 24 horas do procedimento eram retirados do
grupo. Após suas mortes, os animais eram necropsiados e colhidos
tecidos para exames histopatológico.
Administração do quimioterápico 5-Fluorouracil por via peritoneal
Nesta etapa do experimento criou-se um grupo para avaliar o efeito
anti-tumoral do 5-Fluorouracil por via intra-peritoneal. Foram utilizadas
12 ratas fêmeas, com peso de 210 a 325 g, que foram implantados 100 x
103 células tumorais no lobo esquerdo do fígado. No sexto dia
administrava-se 5-Fluorouracil intra-peritoneal da dose de 130 mg/massa
corporal (m2), onde a massa corporal é calculada pela fórmula seguinte
( Wernicke, 1949):
Superfície corporal (m2 ) = 0.01672 √peso (kg ) X Altura ( cm )
Os animais eram então seguidos até suas mortes naturais para
avaliar suas sobrevidas, após o óbito eram realizados necropsia e exames
histopatológico.
Administração do quimioterápico 5-Fluorouracil por via
intra-arterial e embolização hepática
O terceiro grupo, com quinze ratas, foi inoculado com 1x 105 células
tumorais no lóbulo esquerdo do fígado, pela técnica já descrita. No sexto
sob anestesia com hidrato de cloral, com abertura da cavidade
abdominal, identificava-se a artéria hepática e com uma seringa e um
cateter de 0,85 mm de diâmetro cateterizava-se a artéria hepática ( Fig.
6 e fig. 7 ) e infundia-se o líquido com 5-Fluorouracil na dose de 130
mg/superfície corporal (m2), juntamente com 200mg/kg de partículas de
polivinil álcool (PVA) de 50 micras de diâmetro. Logo após realizava-se
sutura do orifício de entrada do cateter com fio cirúrgico prolene 7.0.
Suturado da cavidade abdominal com nylon 4.0. Após recuperação
anestésica eram mantidos no biotério até a suas mortes. Os animais que
tiveram óbito no ato operatório ou com 24 horas do procedimento eram
retirados do grupo. Após suas mortes eram necropsiados e colhidos
tecidos para exames histopatológico.
3.8.Análise estatística
As taxas de sobrevida foram calculadas pelo teste de Kaplan-Meier e
a diferença de sobrevida entre os grupos pelo teste de Log-Rank. Os
dados foram analisados pelo programa estatístico StatView em um
computador pessoal, sendo os valores de p < 0,05 considerados
4.1 Resultados da técnica do implante tumoral
A técnica de implante tumoral é de fácil execução, o uso do hidrato
de coral por via peritoneal propiciou um bom tempo anestésico com boa
sedação, facilitando o manuseio do animal, assim tivemos poucos óbitos
decorrentes do ato anestésico.
No primeiro experimento foi realizado o implante de células tumorais
com objetivo de avaliar a pega do tumor utilizando nove animais
divididos em grupos de três animais, foram infundidos com 1x 105, 2x105
e 3x105 células respectivamente. No sexto dia foi realizado o sacrifício
dos animais com abertura da cavidade abdominal e torácica. Encontrado
nódulo tumoral em todos os nove animais (100%), circunscrito ao lóbulo
esquerdo do fígado, de coloração clara e consistência endurecida, com
diâmetros maiores variando de 0,7 a 1,2 cm e volume médio de 0,165
cm3. Não foi encontrado ascite, implantes no peritôneo ou tumor no
tórax.
Realizado exame histopatológico com coloração de
hematoxilina-eosina em todos os animais (Fig. 8 e 9 ), encontrado células do tumor de
Walker agrupadas irregularmente, com hipercromatose e pleomorfismo,
apresentando hipervascularização e em alguns casos a presença de
Fig. 8 : Cél. de Walker no Fígado . Aumento 100x
Índice de pega tumoral
O índice de pega tumoral foi de 100% para todos os grupos que
foram inoculados com o carsinossarcoma de Walker.
4. 2. Crescimento tumoral e sobrevida dos animais
O segundo experimento realizado com 40 animais que foram
divididos em três grupos, teve a finalidade de avaliar a evolução do
tumor e a sobrevida dos animais, assim cada grupo foi inoculado com
1x105( grupo Ia ), 2x105 ( grupo IIa )e 3x105 células tumorais ( grupo
IIIa ) respectivamente, e acompanhados até suas mortes. Após o óbito
realizou-se a necropsia e microscopia das lesões tumorais. Realizado
medidas manual do tumor com utilização de um paquímetro (diâmetros
maior e menor) e o volume dos tumores calculado em cm3 ( Dxd2 /2 )
No grupo IA a sobrevida variou de nove a quinze dias, com média
de 10,23 dias, não ocorreu modificações significativas no peso dos
animais. Realizado a necropsia e encontrado o tumor restrito ao lóbulo
esquerdo do fígado, em 5 animais havia implantes tumorais por
contiguidade em estruturas vizinhas e 3 animais apresentavam ascite. O
No grupo IIA a vida média foi de 9,73 dias com variação de 9 a 11
dias, não ocorreu variação no peso dos animais. Com a morte dos
animais realizou-se a necropsia sendo encontrado tumor no lóbulo
esquerdo do fígado em todos os animais, invasão de estruturas vizinhas
em 8 animais e ascite em 3. O volume do tumor foi em média de 0,158
cm3. A microscopia confirmou a presença do tumor nas amostras
colhidas.
O grupo IIIA apresentou sobrevida média de 9,917 dias, com
variação de 7 a 14 dias. Também não apresentou variação no peso. Na
necropsia o tumor também era restrito ao lóbulo esquerdo do fígado, com
invasão de estruturas vizinhas em 5 casos e presença de ascite em 4
casos. O volume do tumor em média foi de 0,1854 cm3.
Grupos Qt.
Células
N Sobrevida
média (dias)
Volume Tumor(cm3
)
Achados
Grupo IA 1x105 13 10,23 (9-15) 0,1773 3 ascite
5 invasão contigüidade Grupo IIA 2x105 15 9,73 (9-11) 0,1588 3 ascite
8 invasão contigüidade Grupo IIIA 3x105 12 9,917 (7-14) 0,1854 4 ascite
5 invasão contigüidade
4.3. Análise estatística
Na análise de sobrevida entre os grupos foi verificado que não
ocorreu diferença estatística entre os três grupos ( teste de Log Rank : p
> 0,050 ) de animais que foram inoculados com o tumor de Walker.
(Figura 10 ).
Tempo (dia) 16 14 12 10 8 6 S o b re v id a ( % ) 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 -,2 Grupos (experimento) 300000 cel 200000 cel 100000 cel
4. 4 . Avaliação da quimioembolização.
A realização do terceiro experimento teve como objetivo avaliar a
sobrevida dos animais quando administrado 5- Fluorouracil por via
intra-peritoneal e por via intra-arterial, na artéria hepática, juntamente com
substâncias embolizantes. Foi utilizado um total de trinta e sete animais,
implantado 1x105 células por não haver diferença nas sobrevidas entre os
grupos. No 6º. dia realizava-se o tratamento proposto, devido ao tumor
ainda estar restrito ao fígado neste momento.
Grupo controle
Criado o grupo controle ( Grupo IB ) , consistindo de 12 ratas, que
foi implantado 1x105 células do tumor de Walker no lóbulo esquerdo do
fígado, pela técnica já descrita. No 6o. dia após o implante, foi realizada
nova intervenção cirúrgica com isolamento da artéria hepática e infusão
solução salina intra-arterial. Após o procedimento os animais foram
seguidos até a sua morte. Este grupo teve sobrevida média de 10,58
dias.
Ação do 5-Fluorouracil por via peritoneal .
Foram utilizado 12 ratas fêmeas implantados 1 x 105 células tumorais
no lobo esquerdo do fígado( grupo IIB ) . No sexto dia administrou-se
5-Fluorouracil intra-peritoneal da dose de 130 mg/superfície corporal (m2).
Acompanhado até a suas mortes, neste grupo a sobrevida média foi de
Ação do 5-Fluorouracil por via intra-arterial
Utilizado 15 ratas fêmeas ( grupo IIIB ) implantados com 1 x 105
células tumorais no lobo esquerdo do fígado. No sexto dia realizou-se
novo procedimento cirúrgico com abertura da cavidade abdominal,
identificado à artéria hepática, cateterizada e injetado 5-Fluorouracil
juntamente com polivinil álcool (PVA), após término do procedimento,
foram acompanhados até a suas mortes.
A sobrevida média do grupo foi de 12,27 dias.
Análise estatística
Realizado estudo comparativo das sobrevidas entre os três grupos
através da análise estatística de Kaplan – Meier e teste de diferença de
sobrevida entre os grupos pelo teste de Log Rank com significância
estatística quando p < 0,05.
O grupo IIB tratado com 5-FU por via peritoneal apresentou curva de
sobrevida maior que o grupo controle com p = 0,0208 .
O grupo IIIB tratado com 5-FU por via intra-arterial e embolização
hepática, a curva de sobrevida foi maior que o grupo controle com p =
0,0063. No estudo comparativo entre o grupo IIB e IIIB não houve
Survival Functions
Tempo (dia) 16 15 14 13 12 11 10 9 8 S o b re v id a ( % ) 1,2 1,0 ,8 ,6 ,4 ,2 0,0 -,2 Grupos (experimento) 5-FU ia 5-FU ip Infusão salinaFigura 11 : Curva de sobrevida de ratos com tumor de Walker
5.1.Estabelecimento de modelo experimental de tumor
hepático com o carcinosarcoma de Walker
O carcinoma hepatocelular apresenta um prognóstico ruim, assim
como as metástases hepáticas. O tratamento com melhores resultados é
a hepatectomia, porém a maioria dos casos são considerados inoperáveis
devido a extensão do tumor no momento do diagnóstico ( Iwatsuki e col.,
1989; Hanazaki e col. , 2001; Geoghegan e col., 1999). Tratamentos
convencionais como a radioterapia e a quimioterapia sistêmica não
apresentam resultados positivos, apesar dos diversos esquemas
terapêuticos utilizados ( Moore e col. 1993).
A quimioembolização trans-arterial desponta como um tratamento
promissor em tumores avançados no fígado. Porém a seleção de
pacientes, as diferentes formas de quimioembolização e a grande
variação de métodos existentes entre os dados da literatura não
permitem uma comparação entre eles, além de não existir trabalhos
randomizados que comprovem a sua eficácia , o que desacredita o
método terapêutico ( Vnook e col., 1990; Ravry e col., 1986).
Para avaliar e estudar o método em um tempo mais curto, sem
expor os pacientes aos riscos e complicações possíveis é necessário um
modelo animal apropriado e reprodutível.
Vários métodos têm sido introduzidos para desenvolver modelos de
tumor intra-hepático. Os pequenos animais como os camundongos, ratos
e coelhos são os mais utilizados devido a facilidade de aquisição e
manutenção em laboratórios experimentais. As induções de tumores com
tumores mutifocais no fígado, além de um prolongado tempo para o
surgimento dos tumores. O implante de células tumorais tem se
mostrado de grande eficácia, a injeção de células tumorais no sistema
porta , através de veias ilio-cólicas, no baço e diretamente na veia porta
propicia o surgimento de tumor no fígado, porém podem ser encontradas
em diversos segmentos do fígado. O implante de tumor diretamente no
fígado é uma técnica simples, utilizada para diversos tipos de tumores
com bons resultados, causa nódulos uniformes e únicos. Os tumores tipo
hepatoma de Novikoff e carcinoma do cólon DHD K 12 podem ser
reproduzido por essa técnica, porém apresentam necrose central precoce,
metástase sistêmica precoce e são pouco vascularizados, o que não
ocorre com o carcinoma hepático em humanos. ( Yang e col, 1992 )
O implante de células do tumor de Walker no fígado apresenta
comportamento semelhante aos tumores hepáticos em humanos. O
tumor é usualmente hipervascularizado e recebe seu suprimento
sangüíneo quase exclusivamente da artéria hepática ( Li e col., 2002).
Como ocorre com os tumores hepáticos que tem seu suprimento
sangüíneo proveniente primariamente da artéria hepática ( Bierman e
col., 1951; Healy e col., 1965 ). Apesar do tumor de Walker ser bastante
agressivo, ele usualmente causa invasão de estruturas vizinhas,
surgimento de ascite e lesões a distâncias somente em fases avançadas,
assim como o tumor hepático em seres humanos.
No modelo do presente trabalho o implante de células do tumor de
Walker por inoculação direta no parênquima hepático, de forma
semelhante como realizou Silva e colaboradores (2002) em rins de ratos,
não apresentou dificuldades. Após uso de vários tipos de anestésicos, em
fase inicial, foi optado pelo uso do hidrato de cloral por ser de ação rápida
animais decorrentes da ação anestésica. A abertura da cavidade
abdominal foi realizada através de incisão mediana de 3 cm, com fácil
exposição do lóbulo hepático esquerdo. Entre os animais selecionados
para o estudo não ocorreu infecção ou deiscência da ferida cirúrgica.
A fim de avaliar a pega tumoral, foi realizado sacrifício dos animais
no sexto dia e comprovada a presença do tumor em 100% dos casos. Os
métodos de imagens podem ser utilizados para o acompanhamento do
crescimento tumoral e avaliar a pega tumoral, dentre os métodos de
imagem o que mostra de maior utilidade é a ressonância magnética, por
não causar danos ao animal devido ao uso do contraste e por poder
visualizar nódulos de pequeno diâmetro, infelizmente não podemos
utilizar tal recurso no trabalho.
A ressonância magnética foi utilizada por Geschwind e colaboradores
(2000) para demostrar a eficácia da quimioembolização em modelo
experimental em coelhos com tumor VX2, mostrando áreas de diferentes
difusão entre o parênquima hepático normal, o tumor e áreas de necrose
tumoral nos animais submetidos a quimioembolização. Li e
colaboradores (2002) também utilizaram a ressonância magnética em
ratos com tumor de Walker e demostraram área de hipointensidade
tumoral após a quimioembolização, correspondendo a área de necrose
tumoral, em seu modelo foi demostrada a presença do tumor no oitavo
dia após a inoculação.
Para conhecer o comportamento do tumor foram utilizadas
diferentes quantidades de células para implantes, e acompanhados até
suas mortes. Foi verificado que a sobrevida média entre os três grupos
não apresentou diferença estatística, que foi de 10,23 dias, 9,73 dias e
cél e 300x103 cél., demostrando a agressividade do tumor de Walker.
Oliveira e colaboradores (1998) usando células do tumor de Walker
implantadas no estômago de ratos, relataram sobrevida média de 13,2
dias. Gomes e colaboradores (2001) também usando células do tumor
de Walker implantadas no pulmão relataram sobrevida média de 10,1
dias.
No presente trabalho o tumor de Walker cresceu como nódulo único,
com invasão de estruturas vizinhas e causando ascite em alguns casos.
Nos cortes histológicos foi observada a irrigação abundante do tumor,
fato comum aos tumores primários do fígado. Estas características e a
facilidade de desenvolvimento tumoral em um tempo precoce fazem
deste tipo de tumor um excelente modelo experimental para pesquisa de
tumor no fígado.
5.2.Avaliação do modelo de quimioembolização trans-arterial
hepática
A quimioembolização combina a embolização da artéria hepática com
a infusão simultânea de uma dose concentrada de drogas
quimioterápicas. Existem vantagens teóricas desta técnica, a embolização
causa isquemia no tumor, privando de nutrientes e oxigênio. A
concentração da droga é maior ao nível do tumor do que a infusão
endovenosa, além do fluxo ser lento devido a embolização, prolongando o
tempo da quimioterapia e reduzindo a toxicidade sistêmica ( Ngan e col,
